מאמר שיטה

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

DOI:

10.3791/69814

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרודיסקציה בלייזר (LCM) מספקת גישה מרחבית לאוכלוסיות תאים ספציפיות בתוך רקמות מורכבות באמצעות ויזואליזציה במקום . כדי לאפשר ניתוח טרנסקריפטומי של אזורים המוגדרים היסטולוגית ברקמה קבועה, מוצג פרוטוקול LCM מפורט להפקת RNA מחלקי כבד עכבר המוטמעים בטמפרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). הפרוטוקול מפרט את זיהוי ואיסוף דגימות בקנה מידה מיקרו (כ-1,000 תאים) באמצעות תהליך עבודה הכולל קיבוע רקמות, ייבוש סוכרוז, הטמעת OCT, קריוחתך, צביעת המטוקסילין ולכידת אזורים היסטולוגיים ממוקדים בלייזר. באמצעות שיטה זו, התקבל RNA טהור גבוה (A260/A280: 1.9-2.1). מספר שלמות ה-RNA (RIN) היה 6.7 ± 0.9, המשקף את הפיצול הצפוי הקשור לקיבוע PFA. עם זאת, PCR כמותי עבור β-אקטין הניב ערכי Ct של 17-19, וריצוף RNA שבוצע באמצעות הכנת ספרייה מותאמת לפיצול יצר קריאות איכותיות, כאשר >90% מהבסיסים עמדו בספי Q20 ו-Q30, מה שמאשר כי ה-RNA מתאים לניתוחים רגישים במורד הזרם. לכן, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביטוי גנים ממוקד ומפוזר במרחב על ידי מתן RNA בעל טוהר ושלמות מוגדרים מאזורים היסטולוגיים ספציפיים ברקמת כבד קבועה ב-PFA.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רכישה מדויקת של פרופילי ביטוי גנים מרחב היא קריטית להבנת ההטרוגניות של הרקמות בבריאות ובמחלה. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מציע רזולוציה תאיתגבוהה 1,2, אך הוא מאבד את ההקשר המרחבי הטבעי ועלול לשנות פרופילי שעתוק במהלך פירוק רקמות 3,4. עבור סוגי תאים שאין להם סמנים ספציפיים מזוהים בפומבי, השגת אוכלוסיות טהורות באמצעות מיון מבוסס אימונופלואורסצנציה או בידוד איממונומגנטי נותרת קשה 5,6. טכנולוגיות טרנסקריפטומיקה מרחבית כמו Visium ו-GeoMx מאפשרות לכידת נתוני ביטוי גנים במהירות גבוהה במקום, אך הרזולוציה המרחבית שלהן מוגבלת ברמת התא היחיד או התת-תא 7,8. לעומת זאת, טרנסקריפטומיקה מרחבית מבוססת הדמיה יכולה להגיע לרזולוציה ברמת ננומטר אך מוגבלת בקצב זיהויגנים 9. דבר זה מדגיש פער מתמשך בניתוח מונחה השערות של אזורים מורפולוגיים מסוימים.

מיקרודיסקציה בלייזר (LCM) מאפשרת בחירה ובידוד מונחית מיקרוסקופ של תאים ספציפיים מחתכי רקמה או תרביות תאים חיות בהתבסס על פנוטיפ נצפייה. גישה זו שומרת על מבנה תאי ומידע מרחבי10. טכניקה זו יושמה רבות במחקר מחלות כבד לניתוחים במורד הזרם. לדוגמה, LCM שימש לאיסוף תאי אפיתל מרה מביופסיות כבד כדי להבהיר את תפקידם המוסד החיסוני בכולנגיטיס ראשוני של מרה11. בנוסף, הוא שימש לבידוד רקמה חיובית ל-γ-גלוטמיל טרנספראז (GGT) ממודלים ניסיוניים לאישור ביטוי גן Ggt1 ספציפי לאתר12. אך מחקרים אלו התמקדו בעיקר ברקמות קפואות טריות, שלרוב חסרות הערות קליניות או מעקב ארוך טווח13. לעומת זאת, רקמות קבועות כימית מציעות יתרונות לאבחון היסטופתולוגי14. למרות שריצוף RNA מבוסס LCM (RNA-Seq) יושם בהצלחה על דגימות כבד מאוחסנות בקנה מידה גדול, מקובע בפורמלין ומוטמע בפרפין (FFPE)15. עם זאת, חסר פרוטוקול לפרופיל ביטוי גנים מבוסס LCM, המיועד לדגימות בקנה מידה מיקרו מרקמות כבד מוטמעות, פרפורמלדהיד (PFA) קבועות וטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).

כדי להתמודד עם הצורך הבלתי מסופק הזה, אופטימיזציה של פרוטוקול מקיף באמצעות קירו-חתכים המוטמעים ב-PFA ומוטמעים ב-OCT. פרוטוקול זה מתמודד עם מגבלות זרימות העבודה של FFPE (למשל, עיבוד ממושך וכימיקלים קשים) עבור יישומי LCM-RNA רגישים16. לעומת זאת, תהליך הקיבוע וההטמעה עבור דגימות מקובעות ב-PFA ומוטמעות-OCT הוא פשוט וגמיש יותר, ומאפשר הכנה מהירה של חתכים איכותיים השומרים הן על שלמות ה-RNA והן על מורפולוגיית הרקמות. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מבוצע באמצעות מערכת LCM מבוססת לייזר אולטרה-סגול (UV). בהשוואה למערכות אינפרא-אדום, UV-LCM מספק רזולוציית חיתוך עדינה יותר ומאפשר איסוף דגימות ישיר וללא מגע, מה שמפחית זיהום ומתאים לבידוד מדויק של אזורים מיקרוסקאלה מארכיטקטורות רקמות מורכבות17,18. לכן, הערך התפעולי של פרוטוקול זה טמון ביכולתו לבצע לכידה משמרת מורפולוגיה של אזורים מיקרוסקלאיים (~1,000 תאים) מחתכי כבד קבועים ב-PFA. הוא מספק RNA המתאים לניתוח ביטוי גנים ממוקדים, ומאפשר קורלציה ישירה בין תכונות היסטופתולוגיות לפרופילים טרנסקריפטומיים מקומיים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול למיקרודיסקציה בלייזר של רקמות בקנה מידה מיקרו (~1,000 תאים) מחלקי כבד עכבריים המוטמעים ב-PFA ומוטמעים ב-OCT, ואחריו חילוץ RNA וניתוח המשך באמצעות PCR וריצוף RNA כמותי של שעתוק הפוך. ניתן להשלים את ההליכים הללו בתוך חמישה ימים.

כדי להנחות את הקוראים בהערכת היישום של פרוטוקול זה, היקף המפתח והמגבלות מסוכמים להלן. פרוטוקול זה מותאם במיוחד לדגימה מונחית השערות ומונחית מורפולוגיה של אזורים היסטולוגיים ספציפיים מרקמות מקובעות PFA ומוטמעות, עם יישום עיקרי בכבד העכבר. היא מתאימה לחוקרים שצריכים לקשר בין נתונים טרנסקריפטומיים מפוזרים במרחב לבין תכונות היסטופתולוגיות מדויקות שנשמרו בדגימות קבועות. תהליך העבודה בעל ערך מיוחד בעבודה עם רקמות קבועות מאוחסנות או קליניות עם הערות קליניות, שבהן דגימות מוקפאות טריות אינן זמינות. עם זאת, פרוטוקול זה אינו אידיאלי למחקרים הדורשים RNA בעל שלמות גבוהה ולא מפורק (למשל, מספר שלמות RNA (RIN) > 8), שכן הפיצול הטבעי מקיבוע כימי מגביל את השימוש בו ביישומים התלויים בתמלילים באורך מלא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לטיפול וטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות אתיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים באוניברסיטת סאות'רן לרפואה. השיטה שתוארה השתמשה בעכברים זכרים בוגרים מסוג C57BL/6J ונשמרה על תזונה עתירת שומן, סוכר וחסרת כולין, כדי למודל דלקת כבד מטבולית (MASH). לפני קציר רקמת הכבד, בעלי החיים הושמתו באמצעות כריתת ראש.

1. הכנת דגימה קבועה ל-PFA

  1. קיבעו דגימות רקמת כבד טריות (אונות בודדות, בעובי 5 מ"מ או פחות) ב-30 מ"ל של PFA קר 4% (מוכן) בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות.
    הערה: מומלץ לפרפיוז את הכבד בתמיסת מלח מפוזר פוספט (PBS, 1×, המורכב בדרך כלל מ-137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na₂HPO₄, ו-1.8 מ"מ KH₂PO₄, pH 7.4) בריכוז 1× למשך 5 דקות, ולאחר מכן קיבוע פרפוזיה עם 4% PFA למשך 5 דקות. לחילופין, ניתן גם לקובע את הרקמה בתמיסת פורמלין של 10%.
    אזהרה: קיבוע PFA הוא רעיל. כל פסולת PFA חייבת להיאסף במיכל פסולת כימית מיועד, מסומן כראוי, בהתאם לתקנות המוסדיות והמקומיות.
  2. שטפו את דגימות הרקמה הקבועות 3× פעמים למשך 5 דקות עם תמיסת PBS 1× ללא RNase.
  3. הניחו את רקמת הכבד הקבועה בצינור של 50 מ"ל מלא ב-50 מ"ל של 30% סוכרוז (שהוכן טרי ב-1× PBS סטרילי). שמור על הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-12 שעות.
  4. הסר את דגימות הרקמה מתמיסת הסוכרוז. גזמו את הדגימות כדי לקבל בלוקים שקל לטיפול בהם (כ-5 מ"מ × 3 מ"מ × 5 מ"מ), ואז הטמיעו את הדגימות בקריומולד (7 מ"מ × 7 מ"מ × 5 מ"מ) המכיל תרכובת OCT.
    הערה: התאימו את כיוון הרקמה עם מלקחיים במידת הצורך.
  5. הוסיפו תרכובת OCT מעל כדי לכסות את דגימות הרקמה במלואן, ואז מיד הניחו את בלוק הרקמה המוטמע ב-OCT על חנקן נוזלי או קרח יבש כדי להקפיא במהירות את תרכובת ה-OCT וליצור בלוק מוצק. הקפאה מהירה זו חיונית לקבלת ניתוחי קריוסקציה איכותיים.
    זהירות: לבשו כפפות עמידות לקריוגניה כדי להגן על הידיים בעת טיפול בחומרים קריוגניים.
  6. הניחו את הבלוקים המוטמעים ב-OCT בטמפרטורה של -80°C עד לקרויסקציה.

2. קריוסקציה למיקרודיסקציה ללכידת לייזר

  1. חשפו את מחלקות ממברנת הפוליאתילן נפתלאט (PEN) לאור UV למשך 30 דקות, ואז צפו את הסליידס ב-0.1 מ"ג/מ"ל פולי-אל-ליזין, ולאחר מכן ייבוש באוויר. לאחר מכן, אטום את קצוות מגלדת ממברנת ה-PEN עם מדיום התקנה נייטרלי.
    הערה: הקרנת UV וטיפול בפולי-L-ליזין במגלגלי ממברנת PEN יכולים לשפר את ההיצמדות של דגימות רקמה למגלשי ממברנת PEN. איטום ההיקף באמצעות מדיום התקנה נייטרלי מונע חדירת מים או יצירת בועות מתחת לממברנה, דבר קריטי לשמירה על יעילות LCM.
    זהירות: הגנו על העור והעיניים מאור UV. הלבשו משקפי בטיחות החוסמים UV או מגן פנים (המדורג להגנה מפני UV), וכן חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ושרוולים ארוכים לכיסוי עור חשוף.
  2. נגב את כל המשטחים הנגישים של הקריוסטאט וכל הכלים עם חומר ניקוי RNase, ונקה את המברשת עם 75% אתנול.
    אזהרה: יש להיפטר ממגבוני אתנול ותמיסות משומשים בהתאם לפרוטוקולי הבריאות והבטיחות הסביבתית המקומיים המוסדיים.
  3. אפשר למכשיר להגיע ולהתייצב בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
  4. שלפו את דגימות הכבד מ-80 מעלות צלזיוס והניחו אותן בקריוסטט למשך מינימום של 15 דקות.
  5. מרחו שכבה דקה (2-3 מ"מ) של תרכובת OCT על פני שלב הדגימה. הניחו את שלב הדגימה על מדף הקפאה מהיר (או בתא הקריוסטט) כדי להתקשות מראש את שכבת ה-OCT.
  6. מרח כמות קטנה של OCT על שכבת ה-OCT המוצקה מראש בשלב הדגימה. הוציא את בלוק הרקמה המאוזן (משלב 2.4) ומניח מיד את הבלוק אופקית על ה-OCT, החזק אותו במקום במשך 10-15 שניות כדי לאפשר הקפאה חלקית והיצבוקה. לאחר ההיבטחות, התקן את שלב הדגימה (עם בלוק הרקמה המחובר) לראש דגימת הקריאוסטט.
  7. הכנס בזהירות את הלהב בין לוחות ההידוק ללוחות האחוריים מצד אחד של הקריוסטט, ואז מהדק את ידית ההידוק.
  8. כוון את עובי הקריוסטט ל-10 מיקרון.
    הערה: כוונן את עובי הפרוסה לפי הצורך עבור הרקמה, אך שמור על עובי בין 5-15 מיקרון19.
  9. חתכו והתקינו את החלקים ישירות על מחסניות ממברנת PEN מטופלות מראש בתוך תא הקריוסטט שנשמרו על טמפרטורה של -20°C.
    הערה: כל מגרש ממברנה PEN יכול להכיל 6-8 חתכי רקמה. מומלץ להשלים את כל תהליך החתך בתוך שעה. הגבלת זמן החתך ממזערת את חשיפת הרקמות לתנאים סביבתיים, ובכך מפחיתה את הסיכון לפירוק RNA, התייבשות רקמה ותמצים מורפולוגיים, שהם קריטיים לשמירת איכות ה-RNA ושלמות היסטולוגית לניתוח LCM ולניתוח במורד הזרם.

3. צביעת המטוקסילין ללכידת מיקרודיסקציה בלייזר

  1. הפשיר את המחסניות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות לפני השימוש.
  2. שטוף את השקופיות עם PBS 1× ללא RNase (3 פעמים, 10 שניות כל אחת).
  3. טבלו את שקופיות הרקמה בתמיסת ההמטוקילין המסוננת של מאייר (המורכבת מ-1.0 גרם לליטר המטוקסילין, 0.2 גרם יוד נתרן (נתרן יוד), 50 גרם לליטר אלומיניום סולפט דודקהידרט, 50 גרם לליטר כלורל הידראט ו-1.0 גרם לחומצה ציטרית) למשך 5-10 שניות.
    הערה: העבירו את תמיסת ההמטוקסילין דרך ממברנת סינון מזרק של 0.22 מיקרון לפני הצביעה.
  4. שטוף את המחסניות במים ללא RNase (3 פעמים, 10 שניות כל אחת) כדי להסיר שאריות תמיסת המטוקסילין.
  5. העריך את איכות הצביעה תחת מיקרוסקופ.
    הערה: גרעינים מוצבעים בצורה אופטימלית צריכים להיראות כחול-סגול חד על רקע שקוף. צביעה לא מספקת מייצרת גרעינים חלשים, בעוד שצביעת יתר מטשטשת את פרטי התאים. רק שקופיות שעומדות בקריטריוני הצביעה האופטימליים הללו צריכות להמשיך לשלב הבא.
  6. ייבשו את השקופיות עם נייר סופג ואז ייבשו באוויר לגמרי (10-15 דקות).
    הערה: ודאו שהשקופיות יבשו לחלוטין לפני שממשיכים ב-LCM. לאחר מכן מניחים את המחסניות בתוך צינורות הצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל ואחסנו אותן זמנית על הקרח עד לביצוע LCM (LCM).

4. מיקרודיסקציה בלייזר

הערה: משך ניסוי ה-LCM לכל שקופית צריך להישמר בין 30 דקות לשעה. מומלץ להשלים את כל ניסוי ה-LCM בתוך 4 שעות. גבול זה נקבע כדי למזער את התדרדרות ה-RNA ב-RT ולמנוע אידוי של בופר האיסוף במכסה הצינור, דבר קריטי לשליפת דגימה יעילה. בפועל, תפוקת היעד של כ-1,000 תאים מאזורים מוגדרים מורפולוגית ניתן לקצור באופן אמין בתוך 4 שעות.

  1. נגב את משטחי שולחן המעבדה באמצעות חומר ניקוי RNase.
  2. הפעל את הבקר ואפשר למיקרוסקופ להשלים את תהליך האתחול שלו.
  3. סובב את המפתח בכיוון השעון ממצב כבוי למצב הפעלה כדי להפעיל את מערכת הלייזר.
    הערה: מערכת הלייזר דורשת כ-10 דקות להתחמם.
  4. הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ה-LCM, ואז חכה להשלמת תהליך האתחול.
  5. הכנס צינור PCR סטרילי בנפח 0.2 מ"ל (צינור איסוף) למכשיר האיסוף.
  6. הוסיפו 10 מיקרוליטר של בופר עיכול מסוג פרוטאינאז K (ראו טבלת החומרים) לכיסוי צינור ה-PCR.
    הערה: הנפח הכולל של בופר העיכול K של פרוטאנאז יגיע ל-150 מיקרו ליטר בשלב הבא (ראו שלב 5.4.1) כחלק מההליך המלא של הליזה.
  7. טען את מכשיר האיסוף לתוך מחזיק הדגימה של המיקרוסקופ.
  8. בתוך חלון שינוי מכשיר אספן , תחילה בחר בכפתור 'העבר לנקודת ייחוס '. לאחר מכן, כוון את פוקוס המצלמה כדי להבטיח מבט ברור על נקודת הייחוס. אם צריך, השתמש בחצים בחלון כדי למרכז את נקודת ההתייחסות בשדה הראייה.
  9. טען חתך רקמה לתוך מחזיק הדגימה, וודא שהחתך ממוקם כלפי מטה, והתווית נמצאת מימין.
  10. בחר את עדשת 10× אובייקטיבית, זהה ומשרטט אזורים מעניינים המציגים תכונות פתולוגיות ספציפיות, כגון סטיטוזיס מיקרווסיקולרי (המאופיין בכבדים עם וואקואולות ציטופלזמיות קטנות ושקופות רבות וגרעינים ממוקמים במרכז). לאחר מכן, עברו לתפריט הלייזר ולחצו על כפתור הכיול . אשר את ההודעה על המסך על ידי בחירת כן והמשך בכיול.
    הערה: עדשת האובייקטיב 10× אינה בלעדית למיקרודיסקציה; עדשות הגדלה אחרות (למשל, 20×) יכולות להיבחר בהתבסס על בהירות הדגימה והרזולוציה הרצויה.
  11. בלוח הבקרה של הלייזר, הגדר את פרמטרי החיתוך ל: עוצמת לייזר = 50, פתח (קוטר קרן לייזר) = 5, ומהירות = 9.
    הערה: ערכי הפרמטרים שצוינו לעיל משמשים כהפניה למערכת UV-LCM עם דגימות הרקמה המשמשות בפרוטוקול זה. משתמשי מערכות UV-LCM אחרות צריכים לשקול זאת כנקודת התחלה וסביר להניח שיצטרכו להתאים את ההגדרות באופן אמפירי. הגדרות אופטימליות עשויות להשתנות בהתאם לסוג הרקמה, עובי החתך ומערכות LCM אחרות.
  12. צייר עיגול סביב אזור היעד באמצעות סרגל הכלים הגרפי. בחר את הצורה היחידה, לחץ על כפתור Start Cut כדי לבצע LCM, ואז מקם את מכשיר האיסוף כדי לאסוף את הרקמה שנחתכה.
    הערה: ניתוק מוצלח מסומן על ידי הפרדה של האזור הנבחר, לעיתים עם פער נראה לעין או תנועת שבר. לצורך עקביות, אספו ממספר מוגדר מראש של אזורים בגודל דומה לכל מדגם. אם אזור היעד לא מתנתק אוטומטית, לחץ על כפתור Move and Cut כדי לחתוך את הדגימה ידנית באמצעות העכבר. להערכה מדויקת יותר של מספר התאים, תוכנת LCM יכולה לתעד אוטומטית את שטח החיתוך הכולל. ערך זה ניתן לחלק בשטח החתך הממוצע של תא המטרה כדי להעריך את סך כל התאים שנלכדו.
    זהירות: במהלך תהליך ה-LCM אין להסתכל ישירות על קרן הלייזר כדי להימנע מחשיפה לקרינת לייזר.
  13. באופן אופציונלי, ניתן לצלם תמונה לפני ואחרי של אתר הניתוח על ידי בחירת הפקודה Save Image As בתפריט הקובץ . בתיבת הדו-שיח, בחר מיקום, שם קובץ ושמור בפורמט מועדף (למשל, .tif).
  14. לאחר איסוף מספר התאים הרצוי, לחץ על כפתור ה-Unload כדי להסיר את האוסף מהבמה. לפני סגירת צינור ה-PCR, יש לוודא שנפח בופר העיכול של פרוטאנאז K במכסה נשאר על 10 מיקרוליטר; למלא מחדש את הבופר אם התרחש אידוי במהלך LCM (ראו שלב 4.6).
    הערה: הוספת 10 מיקרוליטר של הבופר מבטיחה שמשטח הכיסוי רטוב לחלוטין, מה שמקל על העברת כדור הרקמה המיקרו-מפורק במהלך הצנטריפוגה בשלב 4.16.
  15. תסחרר את צינורות האיסוף ביסודיות.
  16. סובבו את צינורות האיסוף לזמן קצר ואחסנו את צינורות הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד להוצאת ה-RNA.
    הערה: חזרו על שלבים 4.5 עד 4.16 לדגימה הבאה. ניתן להשהות את הפרוטוקול עד להוצאת ה-RNA.

5. חילוץ RNA כולל של דגימות מיקרו-מפורקות

  1. נגב את משטחי שולחן המעבדה באמצעות חומר ניקוי RNase.
  2. העבר את דגימות ה-LCM ממקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C לאמבט קרח. אם רוצים, אסוף קבוצות שונות של אותן דגימות שנלקחו.
  3. דגרו את צינורות הדגימה המיקרו-מפורקים הפוך בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: היפוך זה מבטיח שכל רקמה שנותרה דבוקה לפקק לאחר צנטריפוגה קצרה (שלב 4.16) משתחררת אל בופר העיכול. זה מבטיח העברת דגימה מקסימלית לבופר לפני התאמת הנפח והצנטריפוגציה במהירות גבוהה בשלב 5.4.1.
  4. בידוד RNA כולל מדגימות LCM באמצעות ערכת חילוץ RNA סטנדרטית המותאמת לרקמות קבועות (ראו טבלת חומרים).
    1. כוונו את הנפח בכל צינור דגימה ל-150 מיקרוליטר סופיים באמצעות בופר העיכול K של פרוטאנאז (ראו טבלת החומרים). סובבו את הצינורות ב-11,000 × גרם (דקה אחת), ואז העבירו את הדגימות לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל.
    2. הוסיפו 10 מיקרוליטר פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל) לכל צינור, ואז ערבבו בעדינות את הדגימות באמצעות פיפטציה חוזרת. כתוצאה מכך, נפח סופי של 160 מיקרו-ליטר וריכוז סופי של פרוטנאאז K של כ-1.25 מ"ג/מ"ל בתגובת העיכול לכל דגימה.
    3. בצע דגירה דו-שלבית: תחילה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחריה 15 דקות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. במהלך כל דגירה, יש לסחרור קצר של הצינורות כל 5 דקות.
      הערה: לזרימת עבודה מיטבית, השתמש בשתי אמבטיות מים מחוממות מראש. אם משתמשים באמבטיה אחת, עצרו לאחר הדגירה של 56 מעלות צלזיוס: החזקו את הדגימות ב-RT בזמן שהאמבטיה מתחממת ל-80 מעלות צלזיוס, ואז המשיכו.
    4. מניחים את הדגימות על הקרח למשך 3 דקות, ולאחר מכן בצנטריפוגציה ב-20,000 × גרם (15 דקות).
    5. שאיפת הסופרנטנט המובהר לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל, תוך זהירות להימנע מהכדור.
    6. הוסף לכל דגימה 16 מיקרוליטר של בופר דגירה של DNase ו-10 מיקרוליטר של אנזים DNase I (2.73 יחידות למיקרוליטר, ראו טבלת החומרים). לאחר מכן, ערבבו את התכולה היטב על ידי הפיכת הצינורות בעדינות. כתוצאה מכך, נפח סופי של 186 מיקרוליטר וריכוז סופי של DNase I של כ-0.15 יחידות למיקרוליטר בתגובת העיכול לכל דגימה.
    7. בצע סיבוב מהיר כדי לאסוף נוזל שנותר מדפנות הצינור.
    8. דגור את צינורות הדגימה ב-RT למשך 15 דקות.
    9. העבר 320 מיקרוליטר של בופר שטיפה עתיר מלח (ראו טבלת החומרים) לכל דגימה וערבב אותן היטב. כתוצאה מכך, נפח סופי של 506 מיקרוליטר לכל דגימה.
    10. העבר 720 מיקרוליטר של אתנול מוחלט לכל צינור, ערבב את הדגימות באמצעות פיפטינג (ללא צנטריפוגה), וממשיך מיד. כתוצאה מכך, נפח סופי של 1,226 מיקרוליטר לכל דגימה.
      אזהרה: אתנול מוחלט הוא דליק מאוד. איסוף פסולת אתנול במיכל פסולת אורגנית ללא הלוגן ייעודי להטמנה נכונה.
    11. העבר 700 מיקרוליטר מתערובת הדגימה לעמוד טיהור (מונח בצינור איסוף בנפח 2 מ"ל, ראו טבלת החומרים). סגרו בעדינות את המכסה, ובצנטריפוגה ב-8,000 × גרם (15 שניות).
    12. השליכו את הזרימה של צינור האיסוף. שמור על עמודת הטיהור.
    13. חזור על שלבים 5.4.11 עד 5.4.12.
    14. הוסף 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה מבוסס אתנול (ראו טבלת החומרים) לכל צינור דגימה. סגרו בעדינות את המכסים ופתחו צנטריפוגה ב-8,000 × גרם (15 שניות). לאחר מכן, השליכו את הזרימה דרך צינור האיסוף.
    15. חזרו על שלב 5.4.14 במלואו, עם השינוי היחיד של הארכת זמן הצנטריפוגה ל-2 דקות ב-8,000 × גרם.
    16. העבר כל עמוד טיהור לצינור חדש בנפח 2.0 מ"ל. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם (5 דקות) עם הפקק פתוח, ואז להשליך את הצינור והנוזל שנותר.
    17. העבר כל עמוד טיהור לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל. פיפט 16 מיקרוליטר מים ללא RNase על הממברנה, סגור את המכסה ובצנטריפוגה ב-14,000 × גרם (5 דקות) כדי להקל על שחרור ה-RNA הכולל.
      הערה: השאירו את כל דגימות ה-RNA המוחלטות על הקרח בשלבים 5.5 ו-5.6 כדי למנוע התדרדרות.
  5. כמת את דגימות ה-RNA ובדוק את הטוהר (יחס260/A280 ) באמצעות ספקטרופוטומטריה.
    הערה: מדידת הריכוז והטוהר (יחס260/A280 ) בשלב זה, יחד עם הערכת שלמות בשלב 5.6, משמשת כנקודת ביקורת כמותית סופית להצלחה בהתאוששות RNA. צפוי ל-RNA eluate ברור.
  6. לבצע אלקטרופורזה בג'ל אגרוז בריכוז ג'ל של 1% וקבעו את מספר שלמות ה-RNA (RIN) באמצעות מערכת ביואנלייזר להערכת איכות ה-RNA.
  7. אחסן את דגימות ה-RNA בטמפרטורה של -80°C עד לביצוע qRT-PCR או RNA-Seq.

6. ניתוח RNA

הערה: qRT-PCR מתואר בשלבים 6.1 ו-6.2, ו-RNA-Seq מתואר בשלב 6.3.

  1. הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוכה והוספו 50 ng של RNA כולל לכל תגובה על הקרח. המשך בתגובת השעתוק ההפוכה באמצעות מחזור תרמי לפי ההוראות (ראו טבלת החומרים).
  2. על הקרח, יש להכין תערובת PCR כמותית ל-β-אקטין לפי הוראות היצרן (ראו טבלת חומרים לרצפי פריימר). בצע הגברה בזמן אמת של PCR על מערכת PCR כמותית באמצעות פרוטוקול המחזור המומלץ על ידי היצרן, עם 10 ng של cDNA בכל תגובה.
  3. באמצעות ערכת חוטים עם קלט נמוך (ראו טבלת החומרים), בנו ספריות RNA-Seq מתוך 50 ng של RNA כולל. קבעו את גודל וריכוז הספרייה באמצעות מערכת ביואנלייזר (ראו טבלת החומרים) ולאחר מכן לבצע ריצוף זוגי על פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה (ראו טבלת החומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך העבודה הניסיוני, הכולל קיבוע PFA, התייבשות של 30% סוכרוז, הטמעת OCT וקריוחתך, צביעת המטוקסילין, זיהוי ואיסוף מדויק של אזור היעד (~1,000 תאים) באמצעות LCM, ניתוח תאים, בידוד RNA, מדדי בקרת איכות RNA ושני היישומים האנליטיים המרכזיים, מתוארת באיור 1. קטע הכבד המוצבע בהמטוקסילין על שקופית PEN מוצג תחת מיקרוסקופ לפני (איור 2A) ואחרי (איור 2B) לכידת רקמת כבד בקנה מידה מיקרו בלייזר. אזורים מעניינים ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוזק של ה-LCM טמון בלכידת תאים או אזורים נבחרים במקום, המסייע בלימוד אזורים ספציפיים בתוך רקמה הטרוגנית. אך תפוקת הדגימות הנמוכה, התהליך הארוך, העלות הגבוהה והצורך בציוד מיוחד מגבילים את השימוש הנרחב של טכניקה זו במעבדות23. במחקר זה, הוקם פרוטוקול LCM-RNA כדי להתגבר על מגבלות היסטוריות מרכזיות. פרוטוקול זה יישם שלב צביעת המטוקסילין מהיר (~10 שניות), ובשימוש בהטמעת PFA/OCT במקום FFPE, ביטל את שלבי דה-פרפיניזציה של הקסילן הנדרשים בפרוטוקולים רבים של רקמות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070589), קרן המדעים הטבעיים של גואנגדונג (2022A1515010218), ופרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (206077078001) לפרופ' יאן וואנג. אנו מודים למרכז המחקר הביו-רפואי באוניברסיטת הרפואה הדרומית על התמיכה הטכנית והגישה למערכת לכידת המיקרו-דיסקציה בלייזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרי
0.2 מ"ל צינורות דפנות דקותאקסיגןPCR-02-Cצינורות לאיסוף LCM
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לאקסיגן339653
4% פאראפורמלדהידליאג'ןDF0135
צינור צנטריפוגה 50 מ"לתרמופישר סיינטיפיק339653
DEPC (דיאתיל פירוקרבונט)סיגמאD-5758
מערכת העיכול DNase Iקיאגן73504רכיב בערכת RNeasy FFPE כולל תמיסת DNase I ו-DNase Booster Buffer
אתנול (100%)תרמו פישר סיינטיפיקBP2818מטוהר לביולוגיה מולקולרית
בופר שטיפה מבוסס אתנולקיאגן73504Buffer RPE (רכיב בערכת RNeasy FFPE)
בופר שטיפה עתיר מלחקיאגן73504Buffer RBC (רכיב בערכת RNeasy FFPE)
להבי מיקרוטום פרופיל נמוךLeica Biosystems819
מאייר' s המטוקסיליןליאג'ןDH0001
תרכובת OCTסאקורה4583
שקופית מצופה ממברנה PENלייקה11505188
מלח עם בופר עם פוספטליאג'ןCC0010ללא DNase/RNase
פולי-אל-ליזיןמקליןP875131S
בופר העיכול של פרוטינאאז Kקיאגן73504Buffer PKD (רכיב בערכת RNeasy FFPE)
עמודת טיהורקיאגן73504עמודת הספין RNeasy MinElute (רכיב בערכת RNeasy FFPE)
מיקס מאסטר PCR כמותיביוגרפיה של טקרהRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
ערכת תמלול הפוךקיאגן205411ערכת תמלול הפוך של QuantiNova
ערכת חילוץ RNAקיאגן73504ערכת RNeasy FFPE
ערכת ריצוף RNA (קלט נמוך, תקוע)ביוגרפיה של טקרה634412ערכת RNA-seq כוללת עם SMARTer stranded - קלט פיקו יונק v2
חומר ניקוי זיהום RNaseסולרביולוגיהSR0040ניקוי
סוקרוזהמקליןS818049
<חזק>בעלי חיים ותזונה
עכבר: C57BL/6Jמרכז בעלי החיים המעבדה של מחוז גואנגדונג03
<חזק>דיאטה מיוחדת ודיאטה מיוחדת מים לשתייה< חזקים>
דיאטה עתירה שומן וחסרה בכולין (דיאטה בסיסית)חברת TROPHIC Animal Feed High-Tech בע"מTP36310Mמאקרונוטריינטים: חלבון, 14 קלוריות; פחמימות, 26 קקלוריות; שומן, 60 ק"ל)
מי שתייה עם תוספת סוכרמקליןלא זמין (מוכן פנימית)תערובת של D-גלוקוז (Macklin, Cat# F87500) ו-D-פרוקטוז (Macklin, Cat# S818049) נוספה למי שתייה מאוטוקלבים בריכוז סופי של 42 גרם לליטר, עם יחס גלוקוז-פרוקטוז של 55:45 (w/w)
<חזק>פריימרים לעכברים
β-actin (קדימה: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC)רצף BGIמותאם אישיתHPLC מטוהר
β-actin (הפוך: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)רצף BGIמותאם אישיתHPLC מטוהר
<חזק>ציוד
מיקרוטום קריוסטטLeica BiosystemsCM3050 S
מערכת ביואנלייזראג'ילנטG2939BA
פלטפורמת רצף בתפוקה גבוההאילומינה; בע"מ.מערכת NovaSeq 6000
מערכת מיקרודיסקציה ללכידת לייזרלייקה מיקרוסיסטמסלייקה LMD6500
מערכת PCR כמותיתמערכות ביולוגיות יישומיותמערכת PCR בזמן אמת QuantStudio 5
ספקטרופוטומטרתרמופישר סיינטיפיקNP80ננודרופ
תרמי סייקלרBioRadT100
<חזק>תוכנה
Adobe Illustrator CC 2019 (גרסה 23.0.2)אדוביhttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (גרסה 8.3.0)תוכנת GraphPadhttps://www.graphpad.com

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Laser Capture MicrodissectionParaformaldehyde Fixed TissueMouse Liver TissueRNA ExtractionCryosectioningHematoxylin StainingOCT EmbeddingRNA SequencingHepatocyte ProfilingReal Time PCR

מאמרים קשורים