מאמר מחקר
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מאפשר שילוב של רצף מהדור הבא ואימונופלואורסצנציה רב-צבעונית לפרופיל אדנוקרצינומה ריאתית. מטרתו לנתח את הקשר בין הטרוגניות גנומית לבין צפיפות תאי החיסון החודרים לגידולים. גישה רב-ממדית זו מאפשרת הערכה מקיפה של מיקרו-סביבת הגידול להערכה פרוגנוסטית לאחר הניתוח.
הפרוגנוזה של אדנוקרצינומה ריאתית (LUAD) נבדקת באופן מסורתי באמצעות שלב TNM (גורום של קשרי גידול, שאינו מתחשב במצב החיסוני של המטופל. פרוטוקול זה משלב פרופיל גנומי וניתוח מיקרו-סביבה חיסונית כדי להקל על הערכה פרוגנוסטית מקיפה יותר לאחר הניתוח. השיטה כוללת ניתוח רטרוספקטיבי של רקמות גידול מוטמעות בפרפין באמצעות שתי טכניקות עיקריות. ראשית, ריצוף הדור הבא (NGS) מתבצע באמצעות לוח מותאם של 37 גנים לזיהוי מוטציות בגני המניע ובווריאנטים בעלי משמעות לא ודאית. שנית, אימונופלואורסצנציה מולטיפלקס (mIF) משמשת למיקוד בסמנים הכוללים HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 ו-PanCK. דבר זה מאפשר לכימות את התפלגות המרחבית והצפיפות עבור תת-אוכלוסיות תאי חיסון ספציפיות באזורים שונים של גידול. גישה משולבת זו מאפשרת הערכה סימולטנית של הטרוגניות גנומית ותכונות תאי חיסון החודרים לגידולים. הנתונים המתקבלים מזהים שילובים ספציפיים של פרופילים מוטציוניים — כגון מצב EGFR — וצפיפויות תאי החיסון. שילובים משולבים אלו מאפשרים חקר השפעתם המשותפת על הישרדות המטופלים, ומציעים גישה מבטיחה לפיתוח מודלים פרוגנוסטיים עתידיים לסרטן הריאות. פרוטוקול זה מדגים שיטה איתנה לאפיון המאפיינים הביולוגיים המורכבים של מיקרו-סביבת הגידול של LUAD.
LUAD הוא תת-הסוג השכיח ביותר של סרטן ריאות, אך שיעור ההישרדות הממוצע לחמש שנים נשאר נמוך בכ-15%1. ההערכה הפרוגנוסטית הנוכחית מתבססת בעיקר על מערכת השלב של TNM; עם זאת, שיטה זו לעיתים מתעלמת ממצב החיסון הכללי של המטופל, מה שעלול להגביל את דיוק החיזוי שלה. הראיות מצביעות על כך שגם ההטרוגניות הגנומית וגם מיקרו-סביבת הגידול (TME) ממלאות תפקידים קריטיים ביצירת גידולים ב-LUAD ובהתקדמות המחלה 2,3.
בשנים האחרונות, המעבר מריצוף סנגר מסורתי ל-NGS ממוקד אפשר ניתוח ברגישות גבוהה וסימולטני של גנים מרובי דרייברים, כגון EGFR, TP53 ו-KRAS 4,5. בעוד ש-NGS מספק מפה ברזולוציה גבוהה של שינויים גנטיים, נתונים גנומיים לבדם אינם יכולים ללכוד את האינטראקציות התאיות המורכבות והארגון המרחבי בתוך ה-TME.
כדי להתמודד עם מורכבויות אלו, mIF מציע יתרונות משמעותיים על פני שיטות פרופיל חיסוני מסורתיות. בעוד שאימונוהיסטוכימיה סינגל-פלקס (IHC) מוגבלת לסמן אחד לכל חתך, mIF מאפשרת זיהוי סימולטני של מספר סמנים חלבונים תוך שמירה על הארכיטקטורה המרחבית של הרקמה. בניגוד ל-IHC רציף, שעשוי לגרום לפירוק רקמות, או ציטומטריית זרימה וריצוף RNA בכמויות גדולות, שמובילים לאובדן מיקום מרחבי ורזולוציה תאית בודדת 6,7,8, mIF בשילוב עם אנוטציה אזורית מרחבית מאפשרת אפיון מקומי ורב-פרמטרי של נוף החיסון9.
פרוטוקול זה יוצר זרימת עבודה משולבת המשלבת NGS ממוקדת, mIF והערכת אזור מרחבי (הכוללת את כל הרקמה, גבול הגידול וליבת הגידול). גישה רב-ממדית כזו נחוצה לחקירת האינטראקציה בין שינויים גנומיים לצפיפות תאי החיסון — קשר שגישות חד-מודליות לעיתים קרובות אינן מצליחות ללכוד. על ידי הערכת מאפיינים משולבים אלו, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה משלימה לאפיון התכונות הביולוגיות של LUAD ומציע מסגרת יציבה יותר לשכבות פרוגנוסטיות לאחר ניתוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר רטרוספקטיבי זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים קונמינג יאנאן (אישור מס' 2021-140-01). התקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים.
עיצוב מחקר ואיסוף דגימות
קבוצה של 63 מטופלים עם LUAD מאומת פתולוגית או היסטולוגית, שעברו כריתה כירורגית בין 2015 ל-2021 נרשמו. קריטריוני ההדרה כללו קבלת כימותרפיה נאו-אדג'ובנטית, רדיותרפיה או אימונותרפיה לפני הניתוח. בנוסף, מטופלים עם ממאירות מקבילה, מחלות נלוות חמורות, איכות רקמה ירודה או רשומות קליניות לא שלמות הוצאו מהניתוח. בלוקי גידול מוטמעים עם פרפין (FFPE) בפורמלין מקובע עובדו לחתכים בגודל 1 מ"מ לצורך דה-פרפיניזציה. כפי שמודגם בזרימת העבודה (איור 1), דגימות אלו עברו ניתוח משולב באמצעות mIF ו-NGS ממוקד. גישה משולבת זו מאפשרת הערכה סימולטנית של שינויים גנומיים ומאפייני מיקרו-סביבה חיסונית, ומספקת מסגרת רב-ממדית לאפיון ביולוגיית הגידול.
המשך
התרופות הממוקדות של המטופל, האימונותרפיה, והתקדמות המחלה או המוות נמדדו במעקב טלפוני, והתקבל מידע מפורט לגבי מצב ההישרדות של המטופלים, התקדמות או חזרת המחלה, טיפולים משניים שקיבלו לאחר הניתוח, וכל מחלה נלווית שאובחנה חדשה. זמן המעקב הסתיים ביולי 2023, ונקודת התצפית הסופית הייתה התקדמות מחלה או מוות. הישרדות כוללת הוגדרה כזמן מתחילת הניתוח ועד מותו של המטופל. לא היו מטופלים שאבדו במעקב. זמן המעקב המינימלי היה 21 חודשים.
הכנת ספריית NGS וריצוף
חילוץ DNA מחתכי רקמת FFPE
השגת חתכי רקמת FFPE (עובי 3–10 מיקרון) מדגימות פתולוגיות. הניחו חתכים בצינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים. הוסיפו קסילן לכל צינור ודגרו במשך 5–10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הפרפין. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x g למשך 5 דקות וזרוק בזהירות את הסופרנטנט. חזור על טיפול הקסילן פעם אחת כדי להבטיח דה-פרפיניזציה מלאה. שטוף את הכדור ברצף עם 100% אתנול פעמיים כדי להסיר שאריות קסילן. ייבשו באוויר את הכדור בטמפרטורת החדר עד ששאריות אתנול מתאדות לחלוטין. הוסיפו בופר ליזיס מתאים וחלבונאאז K (המופיעים בערכת חילוץ ה-DNA) ודגרו בטמפרטורה של 56°C למשך שעה עד שלוש שעות (או לילה במידת הצורך) עד שהרקמה מתפרקת לחלוטין. בצע דגירה נוספת ב-90 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להפוך את קישור הפורמלין. חלצו DNA גנומי באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית של FFPE (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. איכות ה-DNA מדגימות FFPE לעיתים קרובות מפורקת; לכן, איכות ה-DNA צריכה לעמוד בספי שלמות מינימליים (למשל, DIN ≥ 5) כדי להבטיח הכנה מוצלחת בספרייה ל-NGS ממוקדים.
כימות ונרמול DNA
כימות DNA באמצעות שיטה פלואורומטרית כדי להבטיח מדידת ריכוז מדויקת. נרמול דגימות DNA לריכוז סופי של כ-5–10 ng/μL באמצעות בופר Tris-HCl (pH 8.5). בצע שלבי דילול בהדרגה במידת הצורך כדי להבטיח דיוק ויציבות בריכוז ה-DNA.
הכנת ספרייה והעשרת יעדים
הכינו ספריות ריצוף באמצעות NGS ממוקד מבוסס לכידה היברידי על DNA שהופק מרקמת FFPE10. לבצע העשרת מטרה באמצעות לוח בדיקה מותאם אישית המכסה אזורים אקסוניים של גנים נבחרים הקשורים להתפתחות הגידול. להעריך את איכות הספרייה ואת התפלגות גודל המקטעים באמצעות שיטות סטנדרטיות (למשל, מערכות מבוססות אלקטרופורזה), במידת הצורך.
איסוף וריצוף ספריות
כימות כל ספרייה באמצעות מבחן פלואורומטרית. ספריות בריכה בריכוזים אקווימולריים בהתאם לדרישות ערכת הרצף. טעין ספריות מאגדות על פלטפורמת הריצוף של Illumina ובצע רצף עם דפוס רצף זוגי של 150 bp.
עיבוד נתונים וזיהוי וריאנטים
קריאות ריצוף גולמיות עובדו באמצעות צינורות ביואינפורמטיקה סטנדרטיים, כולל חיתוך מתאמים, סינון איכות והתאמה לגנום הייחוס האנושי (GRCh37/hg19). מדדי בקרת האיכות היו: Q20 > 85%, עומק רצף ממוצע > 2500x, שיעור יעד > 65%, וקנס בסיס Fold 80 ≤ 2. בקרת איכות ויישור: נתוני FASTQ גולמיים עברו בקרת איכות באמצעות FastQC ו-Trim Galore (או Trimmomatic) להסרת זיהום מתאם ורצפים באיכות נמוכה. הקריאות הנקיות הותאמו לגנום הייחוס האנושי GRCh37 (hg19) באמצעות מיישר Burrows-Wheeler (BWA). עיבוד לאחר היישור: בוצעו מיון, סימון כפול וכיול מחדש של ציון איכות הבסיס (BQSR) באמצעות פיקארד וערכת ניתוח גנום (GATK) כדי למזער קריאות חיוביות שגויות. קריאות וריאנט: פולימורפיזמים חד-נוקלאוטידיים (SNPs) ו-InDels זוהו באמצעות BWA MEM (0.7.16a - r1181). SNVs סומטיים ו-InDels זוהו באמצעות גישה קונצנזוס באמצעות Mutect2 ו-VarScan2. מוטציות בתדירות נמוכה הוערכו בהרחבה באמצעות מודל הסטטיסטי של Freebayes (v 1.3.2). הערות וסינון: הוריאנטים הוסמכו באמצעות ANNOVAR, תוך שילוב נתונים מ-gnomAD, ClinVar ו-COSMIC. וריאנטים של קו הנבט הובחנו ממוטציות סומטיות על ידי סינון SNPs בתדירות גבוהה של אוכלוסיות וערכת תדירויות אללים וריאנטיות (VAF). ספי VAF: סף VAF של ≥5% שימש לאירועים שיבוטיים (למשל, ROS1 ו-ALK), בעוד ש-1% הוחל על מוטציות גנטיות (למשל, EGFR) כדי להבטיח גילוי שינויים בתדירות נמוכה, מה שהתאפשר בזכות עומק ריצוף ממוצע גבוה של >500x. מוטציות בקו הנבט הובחנו לבין מוטציות סומטיות באמצעות נתוני פרויקט 1000 הגנומים (1000G) ומאגר בסיס מקומי של אנשים בריאים מהאן סינים שהוקם במעבדתנו. הערכת פתוגניות של וריאנטים סומטיים שזוהו בוצעה בהתאם למסגרת AMP/ASCO/CAP11, אשר משפרת את דירוג הראיות עבור וריאנטים סומטיים באמצעות גישה מדורגת ומבוססת ראיות. וריאנטים פתוגניים/סבירים פתוגניים (P/LP) נשמרים, כאשר הסיווג שלהם מבוסס על קריטריוני Tier I/II הדורשים ראיות A/B (FDA, ניסויים קליניים) או C/D (פרה-קליניים/מחקרי מקרה) לצורך דירוג. Tier III (VUS) חסר ראיות חד-משמעיות, בעוד שדרגה IV מצביעה על וריאנטים שפירים דרך תדירות אוכלוסייה (למשל, gnomAD) או מחקרים פונקציונליים; מוטציות אלו אינן כלולות בניתוחים מאוחרים יותר. הערכת פתוגניות של וריאנטים של קו הנבט שזוהו בוצעה בהתאם להנחיות ACMG/AMP12. במחקר זה נרשמו וריאנטים של פתוגני (P), סביר שהיה פתוגני (LP) ומובהקות לא ודאית (VUS). רק וריאנטים בעלי ביטחון גבוה שעומדים בקריטריוני בקרת איכות נכללו בניתוחים במורד הזרם (QUAL ≥1; עומק כיסוי >10 למוטציה בקו הנבט ועומק כיסוי >500 פעמים למוטציה סומטית)
הכנת דגימה מרקמת FFPE
הכנת חתכי פרפין
חתכו בלוקי רקמה של FFPE לחלקים בעובי 3 מיקרון באמצעות מיקרוטום. חתיכות ציפה באמבט מים בטמפרטורה של 40–45 מעלות צלזיוס כדי ליישר את הרקמה. התקן חתכים על מחסניות מיקרוסקופ דביק וייבשו בטמפרטורת החדר. הניחו מחסניות בתנור ייבוש בטמפרטורה של 65°C למשך שעה כדי להבטיח הידבקות יציבה של חלקי הרקמה למחסניות ולהמיס את הפרפין העודף.
דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש
הנח את הסליידס במתקן צביעה וטבול אותן בתמיסת ניקוי 1 למשך 5 דקות. העברה מחליקה ברצף לתמיסת ניקוי II ותמיסת ניקוי III, 5 דקות כל אחת, כדי להמיס לחלוטין את הפרפין. העבר את הסליידס ל-100% אתנול למשך 3 דקות כדי להסיר שאריות של תגובת ניקוי. הידר מחדש את חלקי הרקמה דרך סדרת אתנול מדורגת: 95% אתנול ל-3 דקות ו-80% אתנול ל-3 דקות. שטיפת השטיפה פעמיים במים מזוקקים, ומאפשרת 3 דקות בין השטיפה. הקסילן והאתנול ששימשו במהלך דה-פרפיניזציה טופלו במכסה אדים כימי בשל נדיפותם ורעילותם. כל תמיסות הפסולת המכילות ממסים אורגניים נאספו בנפרד והושלכו בהתאם להנחיות מוסדות לפינוי פסולת מסוכנת.
מחיצת צביעת HE
צביעת המטוקסילין ואאוזין
יש לטבול את הסליידס לאחר דה-פרפיניזציה והידרציה בתמיסת המטוקסילין למשך 5–10 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף את המגלשות מתחת למים זורמים מהברז למשך 5 דקות. הבדלו שקופיות באלכוהול חומצה כלורית 1% למספר שניות (3–10 שניות). שטוף מיד במי ברז זורמים. גרעינים כחולים על ידי הטבלת שקופיות במי ברז או תמיסת הכחולה למשך 5 דקות. הטמינו שקופיות בתמיסת אאוזין למשך 1–3 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף בקצרה במים מזוקקים במידת הצורך.
התייבשות ופינוי
התייבשות דרך אתנול מדורג: 80% אתנול למשך דקה; 95% אתנול לדקה אחת, ו-100% אתנול פעמיים למשך דקה. שקופיות שקופות בקסילן I–II, 2–5 דקות כל אחת.
הרכבה
מרח טיפה של בלסאם נייטרלי. הניחו כיסוי בזהירות כדי למנוע בועות אוויר. תן לסליידים להתייבש בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה.
צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס של חתכי רקמת FFPE
בוצעה צביעת אימונופלואורסצנציה מרובה ברצף כדי לזהות מספר סמנים חיסוניים וגידולים באותו חתך רקמה. גישה זו מאפשרת ויזואליזציה במקום של אוכלוסיות תאים מגוונות תוך שמירה על הקשר מרחבי13. שליפת אנטיגן: מלא צנצנת צביעה בבופר לשליפה אנטיגנים. הכניסו את הצנצנת למיקרוגל וחממו בעוצמה גבוהה למשך 3-5 דקות עד שהתמיסה מתחילה לרתוח. העבר בזהירות את המחסניות לאחר דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש אל בופר השליפה המחומם, כדי לוודא שחלקי הרקמה שקועים לחלוטין. מחליקים חום בעוצמת מיקרוגל נמוכה למשך 15 דקות כדי לאפשר הסרת אנטיגנים יעילה. לאחר החימום, אפשר למחסניות להתקרר באופן טבעי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. העבר את המחסניות למים קרים למשך 5 דקות כדי לעצור את תהליך שליפת האנטיגן.
שטיפה והכנת מחסום הידרופובי
שטוף פעם אחת עם מים מזוקקים כדי להסיר את שאריות הבופר לשאיבה. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר מעגל סביב כל חלק רקמה. השטיפה מחליקה שוב לזמן קצר עם מים מזוקקים. לשטוף מחסניות פעמיים עם בופר TBST. לאחר כל שטיפה, הנח את המחסניות אופקית למשך 3 דקות כדי להבטיח הסרה מלאה של הבופר.
חסימה
יש להניח בופר חוסם כדי לכסות במלואו את חלק הרקמה (~100 מיקרוליטר לכל שקופה). דגירה בתא לח בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
דגירה ראשונית של נוגדנים
הסר את הבופר החוסם על ידי נגיעה עדינה בקצה הסלייד על נייר סופג. נוגדנים ראשוניים נגד HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 ו-PanCK יושמו בדילול עבודה אופטימלי שנע בין 1:100 ל-1:400. מרחו ~100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית מדוללת על כל חתך רקמה. דגירה בתא לח: 37 מעלות צלזיוס לשעה אחת, או 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לרגישות מוגברת.
כביסה
שטיפת סליידים 3 פעמים עם בופר TBST, 3 דקות בכל כביסה. הנח מחסניות אופקית אחרי כל שטיפה כדי לאפשר ניקוז בופר.
דגירה משנית של נוגדנים
הכינו את תמיסת הנוגדן המשני על ידי דילול 1:3 בבופר TBST. מרחו כ-100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית על כל שקופית. דגירה מחליקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתא לח. שטיפת סלייד 3 פעמים עם TBST, 3 דקות כל כביסה.
הגברת אות פלואורסצנטי
מדלל את מגיב ההגברה הפלואורסצנטי ביחס 1:100 בבופר ההגברה. מרחו 100 מיקרוליטר של תגובת מדוללת על כל שקופית. הדגר את הסליידס בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך כדי למנוע הלבנת פוטו. שטיפת סלייד 3 פעמים עם TBST, 3 דקות כל כביסה.
שליפת אנטיגנים בין סמנים
בצע שליפת אנטיגנים במיקרוגל כפי שתיאר. לאחר החימום, החלקה בקירור ברצף: 5 דקות במים חמים ו-5 דקות במים קרים.
צביעה רציפה של סמנים נוספים
חזור על שלבי דגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים עבור כל סמן נוגדן נוסף. ודא שאיבת אנטיגנים מתבצעת לאחר צביעת כל סמן לפני המעבר לנוגדן הבא.
צביעת נגד גרעינית
שטיפת סלייד פעם אחת עם בופר TBST. מרח צבע גרעיני DAPI. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בחושך. שטוף את המחסניות 3 פעמים עם מים מזוקקים. קביעת נקודת קצה: הגרעינים צריכים להיראות מוכתמים בבירור תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
צביעת טוש סופית בלבד
מרחים תמיסת ביוטין מדוללת ב-1:200 בבופר הגברה, דגרו 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטיפו סליידס 3 פעמים עם בופר TBST. בצע שליפת אנטיגנים כפי שתואר. שטיפו סליידס 3 פעמים עם בופר TBST. מרחו תגובת חוסם ביוטין אנדוגנית, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מרחי צבע צביעה ב-1:100 ב-TBST ודגרו 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שטוף את הסליידים פעם אחת עם TBST ותן לניקוז 3 דקות.
הרכבה
הוסיפו טיפה של מדיום Antifade Mount על חלק הרקמה. הנח בזהירות כיסוי מעל המגלשה. תן למחסניות להתייבש לפני ההדמיה.
רכישת תמונות של מקטעי H&E ו-mIF
תמונות שקופיות שלמות (WSI) של חתכי רקמה מוצבעים ב-H&E ו-mIF FFPE צולמו באמצעות סורק שקופיות. סריקת Brightfield בוצעה עבור חתכי H&E, בעוד שסריקת פלואורסצנציה שימשה לחלקי mIF. מטרה: הגדלה של פי 20 לסריקת סקירה; הגדלה פי 40 להדמיה אזורית ברזולוציה גבוהה. הגדרות עירור ופליטה: מותאם לכל פלואורופור בהתאם למפרט היצרן. זמן החשיפה והרווח: מותאם אוטומטית על ידי תוכנת הדמיה כדי להבטיח עוצמת אות מספקת ללא רוויה.
בקרת איכות mIF והערכת תמונה
כדי להבטיח את אמינות תוצאות ה-mIF, יושם פרוטוקול בקרת איכות קפדני לפני סיווג רקמות וכימות תאים באמצעות מערכת הפתולוגיה הדיגיטלית HALO. הסרת חפצים והגדרת שטח הערכה: תמונות שקופיות שלמות (WSIs) נבדקו בקפידה כדי להוציא ידנית אזורים המכילים קפלי רקמה, ארטיפקטים של צביעה ואותות רקע לא ספציפיים. שלב זה היה חיוני למניעת אותות חיוביים שגויים ולהבטחת דיוק הניתוח המרחבי. לאחר סקר זה, בממוצע 80% (טווח: 50%–95%) משטח הרקמה בכל הדגימות הוגדר כאזור mIF ערך. אימות פתולוגי וחלוקה: כדי להבחין במדויק בין מחלקות הגידול והסטרומל, חתכי mIF הושוו עם חתכים סדרתיים סמוכים שצובעו ב-H&E. ההערות נבדקו באופן עצמאי על ידי שני פתולוגים מנוסים, כאשר כל אי-התאמות נפתרו בהסכמה. דגימות עם שטח רקמת גידול של פחות מ-30% הוצאו מהמחקר לשמירה על קפדנות אנליטית. אימות לאחר כמות: לאחר פנוטיפינג וכימות אוטומטי של תאים, ההתפלגות המרחבית ודפוסי הביטוי של תת-אוכלוסיות תאי החיסון הוערכו מחדש על ידי פתולוגים. סקירה זו הבטיחה שהנתונים הכמותיים הדיגיטליים תואמים את המאפיינים ההיסטומורפולוגיים הבסיסיים, ובכך הבטיחה את האמינות והדיוק של הממצאים.
ניתוח פתולוגיה דיגיטלית והערות אזוריות
התמונות הפנורמיות הסרוקות יובאו לפלטפורמת ניתוח תמונות הפתולוגיה הדיגיטלית לעיבוד. תוסף ה-Seg-Plugin של HALO AI Nuclei שימש לחלוקה וזיהוי תאים. בהתבסס על צביעת H&E כהפניה, האזורים הרלוונטיים (ROIs) הוסמנו ידנית: אזור הגידול השלם (WSIT); גבול הגידול (TB); ליבת הגידול (TC). זיהוי אות חיובי נקבע על סמך ספי עוצמת הפלואורסצנציה והמיקום התת-תאי הצפוי של כל סמן. גישה ספציפית לתחום זו יושמה כדי למזער הפרעות רקע ולשפר את דיוק זיהוי תאי החיסון. צפיפות תאי החיסון נמדדה כמספר התאים החיוביים לסמן בכל אזורי גידול נבחרים. יישר תמונות mIF עם הערות תואמות שמקורן ב-H&E בהתבסס על מורפולוגיית רקמות. החולים חולקו לקבוצות צפיפות גבוהה ונמוכה לפי הערך החציוני של צפיפות תאי החיסון לכל סמן.
ניתוח סטטיסטי
תוכנת SPSS 17.0 שימשה לניתוח. נתונים מבוזרים נורמלית הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ±, ונתונים כמותיים שאינם מבוזרים נורמלית הוצגו כחציוני (טווח כמותים של 25%-75%). המתאם בין כל סוג מוטציה גנטית, צפיפות תאי החיסון והמאפיינים הקליניים נותח על ידי מודל רגרסיית הסיכונים הפרופורציונליים של קוקס באמצעות מודל קווי החיים של פייתון. בהתאם לגודל המדגם והאם הנתונים עמדו בהתפלגות נורמלית, נעשה שימוש במבחן סטודנט או מבחן מאן-וויטני U להשוואה בין משתנים רציפים. מבחן דירוג חתום בוילקוקסון שימש להשוואת משתני דרגה. מבחן חי-בריבוע או מבחן פישר המדויק נבחר לניתוח משתנים קטגוריים לא מסודרים בהתאם לגודל המדגם ולתדירות התיאורטית. מבחן ספירמן או מבחן פירסון שימשו לניתוח קורלציה. שיעור ההישרדות הכולל של המטופלים הושג בשיטת קפלן-מאייר, ומבחן Log-rank שימש לבדיקות. עקומות הישרדות צוירו באמצעות שפת R המבוססת על תוכנת RStudio. ערך P <0.10 נחשב מובהק סטטיסטית.
יישום מעשי ומגבלות
ליישום אמין של תהליך עבודה משולב זה, בלוקי רקמת FFPE חייבים לעמוד בסטנדרטים מחמירים של איכות, כולל תאי גידול אידיאלי של ≥30% והיעדר נמק נרחב או ארטיפקטים משמעותיים ברקמה. ההצלחה הטכנית של mIF תלויה מאוד בשימור רקמות; גורמים כמו קיבוע יתר, נזק מופרז או אוטופלואורסצנציה ברקע גבוהה עלולים לגרום לחדירת נוגדנים לקויה ועוצמת אות לא אופטימלית. יתרה מזאת, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות מהותיות של מחקר זה. ראשית, הניתוח מבוסס על קבוצה רטרוספקטיבית, מרכז יחיד של 63 מטופלים, מה שעשוי להגביל את הכוח הסטטיסטי ואת ההכללה הרחבה של הממצאים לאוכלוסיות אחרות. שנית, היקף ההערכה מוגבל לפאנל NGS קבוע של 37 גנים ולסט ספציפי של סמנים חיסוניים (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1, ו-PanCK; טבלה משלימה 1). כפי שצוין במקורות, בעוד שהגישה המשולבת הזו מספקת מסגרת יציבה יותר לסטרטיפיקציה פרוגנוסטית, נדרשים מחקרים פרוספקטיביים ורב-מרכזיים גדולים יותר כדי לאמת את הקשרים הללו ולחדד את התועלת החיזוי של הסמנים הביולוגיים שזוהו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאפיינים קליניים של מטופלים עם אדנוקרצינומה ריאתית
בסך הכל נאספו במחקר זה 63 מטופלים שאובחנו עם LUAD ועברו טיפול כירורגיבבית החולים שלנו בין השנים 2015 ל-2021 ועמדו בקריטריוני ההכללה. המאפיינים הקליניים של המטופלים הכלולים מוצגים בטבלה 1. מבין המטופלים הרשומים, גיל החציון היה 60 שנים (47-73 שנים), כולל 30 מתוך 63 מטופלים גברים (46.2%) ו-33 מתוך 63 נשים (53.8%). היו 23 מתוך 63 מטופלים עם היסטוריה של עישון (35.4%). הסוג הפתולוגי של כל המטופלים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרופיל אימונולוגי משולב של LUAD באופן גנומי ומרחבי
מחקר זה מדגים תהליך עבודה משולב המשלב NGS ממוקד ו-mIF כדי לאפיין את הנוף הרב-ממדי של LUAD. הממצאים הגנומיים שלנו תואמים לספרות קודמת, במיוחד בנוגע לשונות אתנית בתדירות המוטציות. שיעור המוטציות של EGFR שנצפה (כ-40%-60%) תואם את התדירות המדווחת באוכלוסיות אסייתיות, שהן גבוהות משמעותית מאלו שבקבוצות מערביות (15-20%)15,16,17,18,19,20.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין קשרים מסחריים או פיננסיים שניתן לפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה הרפואית והרפואית של מחוז ג'ג'יאנג (2022KY1237); פרויקט קרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של יונאן (2025Y0387); תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של יונאן (202403AC100002).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת IHC של AlphaTSA Multiplex | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| מדיום הרכבה נגד פייד | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, חלקה 0525A17 | צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| CD163 | בייג'ינג ג'ונגשאן גשר הזהב ביוטכנולוגיה בע"מ | ZM0428 | RRID:AB_3714707; צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| CD206 | אבקאם, בע"מ | קטגורוג# 5307-1 | RRID:AB_10896526; צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| CD68 | בייג'ינג ג'ונגשאן גשר הזהב ביוטכנולוגיה בע"מ | ZM0060 | RRID:AB_2904190; צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| פאנל גני סרטן מותאם אישית | TWIST Co., Ltd. | הכנת ספריית NGS | |
| דה-פרפיניזציה באף | QIAGEN בע"מ. | 19093 | צביעת HE, חילוץ DNA; צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס מחתכי רקמת FFPE |
| Dynabead M-270 סטרפטאווידין | Thermo Co., Ltd. | 65602 | הכנת ספריית NGS |
| פלואורומטר | חברת ThermoFisher Scientific בע"מ. | קיוביט 4.0 | הכנת ספריית NGS |
| פלטפורמת ניתוח תמונות הפתולוגיה הדיגיטלית של HALO | Indica Labs, Inc., אלבקרקי | גרסה 3.6.4134 | צביעת HE וניתוח צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| ערכת צביעת המטוקסילין-אאוזין | ווהאן elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | הוא מכתים |
| ערכת DNA HiPure FFPE | גואנגג'ואו מאגן ביוטכנולוגיה בע"מ. | D6323 | חילוץ DNA מחתכי רקמת FFPE |
| HLA-DR | HUABIO בע"מ | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| סיקוונסר DNA של Illumina | Illumina, בע"מ | 550DX | רצף |
| בלסם נייטרלי | מדעי הסולארביולוגיה של בייג'ינג חברת טכנולוגיה בע"מ. | G8590 | הוא מכתים |
| פאנק | בייג'ינג ג'ונגשאן גשר הזהב ביוטכנולוגיה בע"מ | ZM0069 | RRID:AB_2941997; צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| PD-L1 | מערכות מחקר ופיתוח | קטלוג # AF1019 | RRID:AB_354540; צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| בופר TBST | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | צביעת HE וצביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| UN-Blocker | Homgen Co., Ltd. | הכנת ספריית NGS | |
| חרוזים נקיים של VAHTS DNA | חברת ואזימה בע"מ. | N411 | הכנת ספריית NGS |
| ערכת הכנה לספריית ה-DNA האוניירסלית של VAHTS לאילומינה. | חברת ואזימה בע"מ. | ND610 | הכנת ספריית NGS |
| מערכת הדמיית שקופית שלמה | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 גרסה 3.3 | צביעת HE וניתוח צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס |
| מערכת היברידיזציה ושטיפה של xGen | IDT בע"מ. | 1080577 | הכנת ספריית NGS |
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה