מאמר שיטה

פרוטוקול לאיסוף תלייה חד-תאית מקרנית עכברים

DOI:

10.3791/69844

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת תליות חד-תאיות איכותיות מקרניות עכבר שלמות באמצעות עיכול רציף עם קולגנאז A וטריפסין. שיטה זו מניבה תאים בודדים ברי קיימא עם שלמות RNA גבוהה, מה שהופך אותם לתואמים ליישומים בהמשך כמו ריצוף RNA חד-תאי וציטומטרי זרימהy.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כשכבה החיצונית ביותר של גלגל העין, הקרנית ממלאת תפקיד קריטי בשמירה על ההומאוסטזיס והראייה של פני העיניים. התקדמות אחרונה בריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) אפשרה ניתוח ברזולוציה גבוהה של הטרוגניות תאית בקרנית, אך הכנת תליות חד-תאיות איכותיות מרקמת הקרנית נותרה מאתגרת בשל המבנה הצפוף והמורכב שלהן. במחקר זה, אנו קובעים פרוטוקול חזק ליצירת תליות חד-תאיות מקרנית שלמות של העכברים. ההליך כולל פירוק הקרניות לחתיכות דקות, ולאחר מכן עיכול אנזימטי רציף באמצעות קולגנאז A וטריפסין. ההשעיה התאית שהתקבלה הוערכה לאיכות באמצעות מדדים שונים: צביעת כחול טרייפן שימשה להערכת כחיות וספירת התאים; צביעת אימונופלואורסצנציה עבור פנסיטוקרטין וקרטוקן אפשרה זיהוי וכימות של סוגי תאי קרנית עיקריים; ושלמות ה-RNA אושרה באמצעות ביואנלייזר. פרוטוקול זה מניב בעקביות תכשירים לתאי יחיד עם מספר תאים גבוה, קיימות מצוינת (≥ 94.6%), ושיעור גבוה של תאים בודדים (96.3%), וממלא את הדרישות התואמות ליישומים תובעניים במורד הזרם, כולל scRNA-seq.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנית, הממוקמת בשכבה החיצונית ביותר של גלגל העין, חיונית לתפקודי המחסום והשבירה שלה, בזכות ארכיטקטורה מאורגנת מאוד הכוללת חמש שכבות מובחנות: האפיתליום, שכבת בואמן, הסטרומה, ממברנת דסקמט, והאנדותל1. אפיתל הקרנית הוא מבנה קשקשי שכבתי לא קרטיני, המספק מחסום פיזי מפני פתוגנים חיצוניים ומפגין יכולות אנטימיקרוביאליות והתחדשות חזקות. הסטרומה, המורכבת מסיבי קולגן מיושרים במדויק, שומרת על שקיפות בקרנית ומקדם שבירה אחיד2. האנדותליום, שכבה מונותאלרית, מווסת את העברת הנוזלים בין הסטרומה לנוזל מימי, ובכך שומרת על הידרציה בקרנית ואספקת חומרים מזינים3. עם זאת, המורכבות המבנית והתאית המורכבת הזו הציבה היסטורית אתגרים משמעותיים בחקר תפקודים ביולוגיים של הקרנית והמנגנונים הבסיסיים4.

כדי לחקור אינטראקציות בין-תאיות ולזהות סמנים ספציפיים לסוג תא, נעשה שימוש נרחב בטכניקות כמו מיון ציטומטריית זרימה5 וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq)6 . מכשול טכני מרכזי משותף לשתי הגישות, עם זאת, הוא הכנת מתלים חד-תאיים איכותיים. פרמטרים הכוללים את תפוקת התאים הכוללת, יחס התאים הבודדים ועמידות התאים הם קריטיים לאמינות היישומים במורד הדרך שמטרתם לאפיין את תפקוד תאי הקרנית וביטוי הסמן על פני השטח7. למרות חשיבותה, עדיין קיימת מחסור בפרוטוקולים סטנדרטיים ויעילים ליצירת תליות חד-תאיות מקרניות עכבר שלמות.

הוכחו מספר שיטות להשגת השענות חד-תאיות מרקמת קרנית. עיכול אנזימטי רציף באמצעות קולגנאז A, טריפסין או TrypLE שימש לבידוד תאים בודדים הן מקרנית אנושית והן מקרנית עכברים. טריפסיניזציה חוזרת שימשה גם לפירוק קרנית⁷. בנוסף, ערכות פירוק רב-רקמיות מסחריות, כמו אלו של Miltenyi Biotec, יושמו בהצלחה ליצירת תליות חד-תאיות בקרנית9. במחקר ההשוואתי הקודם שלנו על שיטות עיכול קרנית שונות, הראינו כי טיפול רציף בקולגנאז וטריפסין מהווה את הגישה האופטימלית. שיטה זו מניבה בעקביות מספר תאים גבוה, חיוניות מצוינת (≥94.6%), אחוז גבוה של תאים בודדים (96.3%), ושלמות RNA משומרת היטב10.

בפרוטוקול זה, אנו מספקים הליך מפורט ושלב אחר שלב ליצירת תליות חד-תאיות איכותיות מקרניות עכבר שלמות, באמצעות אסטרטגיית עיכול אנזימטית אופטימלית זו, בהתבסס על הניסיון והממצאים הקודמים שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים נקבות C57BL/6 (B6), בגיל 6-8 שבועות, סופקו על ידי מרכז הניסויים לחיות באוניברסיטת גויג'ואו לרפואה. החיות אוחסנו במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך עם גישה חופשית למזון ולמים. כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסיונית של אוניברסיטת גויג'ואו לרפואה (אישור מס' 2305185) ובוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

1. הכנה

  1. הכנת כלי ניתוח: נקה שני זוגות מספריים עיניים, שני זוגות מלקחיים עיניים, זוג מלקחיים רקמתיים אחד, וצינור צנטריפוגה אחד בנפח 2 מ"ל על ידי שטיפה פעמיים במים מזוקקים כפולים (DDW). חטא את הכלים והצינור באמצעות אוטוקלאב בקיטור. ייבשו את כל הפריטים ללילה בתנור רגיל בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת תמיסה
    1. מדיום אפיתל הורמונלי משלים (SHEM): הכין SHEM על ידי תוספת למדיום DMEM/F12 עם הרכיבים הבאים: 5% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS), 0.5% (v/v) דימתיל סולפוקסיד (DMSO), 10 ng/mL מקדם גדילה אפידרמלי של עכבר, 5.5 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין).
      הערה: SHEM משמש לשמירה על חיוניות התאים במהלך העיבוד. ניתן להחליפו במדיות חלופיות כמו DMEM בסיסי או תמיסת מלח עם מאגר פוספט (PBS) המכילה לפחות 10% (v/v) FBS.
    2. סליין ממוגן בפוספט (PBS)
      1. המיס 22.4 גרם אבקת PBS ב-2 ליטר מים מזוקקים כפול (DDW) תחת ערבוב באמצעות ערבוב מגנטי כדי לקבל 1× PBS.
      2. אוטוקלב את פתרון ה-PBS יום אחד מראש ואפשר לו להתקרר.
      3. בתנאים סטריליים, העבר 47.5 מ"ל של 1× PBS סטרילי לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל והוסף 2.5 מ"ל של 1% (v/v) של פניצילין-סטרפטומיצין.
        הערה: נוסחת 1× PBS (2 ליטר) מכילה 137 מילימטר NaCl, 8 מילימטר Na2HPO4, ו-2 מילימטר NaH2PO4, pH 7.2.
    3. פתרונות קולגנאז A
      1. תמיסת המלאי: המיס 1 גרם אבקת קולגנאז A ב-40 מ"ל DDW. מסנן סטריליזציה דרך פילטר של 0.2 מיקרון ואחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C.
      2. תמיסה עובדת: דילל 1 מ"ל של קולגנאז תמיסת מלאי ב-4 מ"ל DDW סטרילי כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל.
    4. תמיסת טריפסין: הפשרת תמיסת טריפסין/EDTA של 0.25% (עם וולט) מסחרית (המכילה 0.91 mM EDTA) על קרח לפני השימוש.
    5. תמיסת טרייפן בלו (0.4%): ממיסים 0.4 גרם של טרייפן בלו ב-100 מ"ל DDW. סיננו באמצעות נייר פילטר ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: תמיסת Trypan Blue של 0.4% משמשת להערכת סך ספירת התאים, יחס תא יחיד וכדאיות. ניתן להחליף אותו בערכות צביעה מסחריות חיות/מתות או במערכות ספירת תאים אוטומטיות.

2. הכנת קרניות עכברים

  1. סטריליזציה של המיקרוסקופ ואזור העבודה על ידי ניגוב עם 75% אתנול, ואז חשפו את האזור לאור UV בתוך ארון בטיחות ביולוגי למשך 30 דקות.
  2. הכינו את הדברים הבאים בתנאים סטריליים: צלחת פטרי 60 מ"מ אחת עם 5 מ"ל מדיום SHEM, שלוש צלחות פטרי 60 מ"מ כל אחת עם 5 מ"ל של 1× PBS בתוספת 5% פניצילין-סטרפטומיצין (P-S), שלוש צלחות פטרי 60 מ"מ כל אחת עם 5 מ"ל של 1× PBS פשוט, וצינור צנטריפוגה סטרילי אחד בנפח 2 מ"ל
  3. המית את העכבר באמצעות חנקCO2 , ואחריו ניתוק צוואר הרחם.
  4. שטוף היטב את ראש העכבר ועפעפיו הסגורים על ידי טבילה שלוש פעמים ב-PBS המכיל 5% P-S לפני שממשיכים בהסרת העבירה.
  5. באמצעות מספריים עיניים, בצעו חתך לאורך הקוטב האחורי של כל גלגל עין והניחו בזהירות את העיניים המבודדות בתוך צלחת פטרי המכילה מדיום SHEM קר (איור 1A).
    הערה: כדי למקסם את חיוניות התא, כל התמיסות צריכות להיות מקוררות מראש ל-4 מעלות צלזיוס וכל שלבי הניתוח חייבים להתבצע על קרח.
  6. העבר מיד את צלחת הפטרי עם העיניים לארון בטיחות ביולוגי. שטפו את גלגלי העיניים שלוש פעמים ב-1× PBS שמכיל 5% P-S, תוך דגירה של 5 דקות בכל שטיפה.
  7. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הפרדו בזהירות את רקמת הקרנית: באמצעות מספריים עיניים ומלקחיים, בצעו חתך מהקוטב האחורי לכיוון הלימבוס של הקרנית. נתק בעדינות את הקרנית מהלבן והלחמית לאורך הגבול הלימבלי. הסר את העדשה והקשתית לחלוטין באמצעות שני זוגות מלקחיים (איור 1B).
  8. באמצעות מלקחיים עיניים, העבירו את רקמת הקרנית לצלחת פטרי המכילה 1× PBS ושוטפים שלוש פעמים (5 דקות כל אחת) להסרת רקמה שאינה קרנית ואנטיביוטיקה.
    הערה: הקשתית לעיתים קרובות נדבקת היטב לקרנית. ודאו שהוא מוסר בעדינות ובאופן מלא באמצעות מלקחיים כדי למנוע זיהום, ולהשאיר רק רקמת קרנית נקייה.
  9. באמצעות מלקחיים עיניים, העבר את רקמת הקרנית הנקייה לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל והוסיף 1 מ"ל של קולגנאז תמיסה עובדת (5 מ"ג/מ"ל).
  10. באמצעות מספריים עיניים, טחנו את רקמת הקרנית לכ-0.5 מ"מ × חתיכות של 0.5 מ"מ ישירות בתוך הצינור.
  11. דגרו את הצינור המכיל את שברי הקרנית ותמיסת הקולגנאז A באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה (איור 2A-C).
  12. במהלך עיכול קולגנאז A, יש לעקוב אחרי הרקמה כל 10 דקות. סיימו את העיכול כאשר לא נותרו שברי רקמה גדולים על ידי המשך לצנטריפוגה. צנטריפוגה את הדגימה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה. שאפו בזהירות את הסופרנטנט.
  13. תלה מחדש את הכדור ב-200 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין/EDTA של 0.25%.
  14. דגרו את הצינור באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לעיכול שברי רקמה שנותרו.

3. בידוד תאים בודדים בקרנית

  1. יש לפרק בעדינות את התערובת (רקמה ותמיסת טריפסין/EDTA) שוב ושוב באמצעות פיפטה P1000 עם קצה רחב קוטר כדי להפריד את הרקמה לתלייה חד-תאית.
  2. צנטריפוגה את מתלי התא ב-300 x g למשך 5 דקות וזרוק את הסופרנטנט. החזירו את כדור התא ל-1 מ"ל PBS המכיל 0.04% אלבומין סרום בקרי (BSA) כדי לקבל תלייה חד-תאית.
    הערה: עבור תאים המיועדים לריצוף או לציטומטריית זרימה, יש להשעות מחדש ב-PBS ללא סרום. לתאים שיתרבו, השתמשו ב-1x PBS עם תוספת של 0.04% BSA.
  3. סנן את תליית התא דרך מסננת תאים רטובה מראש בנפח 40 מיקרון לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מ"ל כדי להסיר גושי תאים ופסולת.
    הערה: הרטיב מראש את מסננת התא עם PBS כדי למזער אובדן תאים. במידת הצורך, ניתן לצנטריפוג את התאים המסוננים שוב ולהשעות אותם בנפח רצוי לריכוז.

4. ספירת תאים

  1. מערבבים 9 מיקרוליטר מתלה תא עם 1 מיקרוליטר של תמיסת Trypan Blue 0.4% ומערבבים בעדינות.
  2. טעינו את התערובת לאט לתא ההמוציטומטר דרך ערוץ הטעינה המיועד. ספירת התאים בשיטת ארבעת הרבעים כדי לקבוע את מספר התאים הכולל, הקיימות ויחס התאים הבודדים. בצע לפחות שני שכפולים טכניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איכות התלייה החד-תאית הוערכה על סמך תפוקת תאים כוללת, יחס התאים הבודדים ויכולת הקיימות של התאים. המתלה צובע ב-Trypan Blue ונותח באמצעות מיקרוסקופ פאזה-ניגודיות במספר שדות (איור 3). מארבע עיני עכבר (שמונה קרניות), התקבלו סך הכל 1.05 ×-10תאים , עם עמידות תאית ממוצעת של 94.6% ויחס תאים בודדים מעל 96.3%. תוצאות אלו מאשרות כי המתלה המוכן מתאים ליישומים במורד הזרם כגון מיון ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאים.

כדי לקבוע את הה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנסת ריצוף RNA חד-תאי הגדילה משמעותית את השימוש בטכנולוגיות גנומיות, טרנסקריפטומיות, אפיגנטיות ופרוטאומיות במחקר עיני 9,10,11,12. כתוצאה מכך, הכנת תללים חד-תאיים איכותיים הפכה לקריטית יותר ויותר, שכן היא מאפשרת זיהוי שונות באיתות בין תאים בודדים ומספקת תובנות עמוקות יותר לגבי הטרוגניות תאים, יתרונות שאינם ניתנים בפרופיל ביטוי גנים קונבנציונלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להביע את תודתם וכבודם לכל בעלי החיים שתרמו לתאים שלהם במחקר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי פרובינציית המדע והטכנולוגיה של מחוז גוויז'ואו (QKHJC-ZK[2024]ZD043 [ל-S.O.]); קרן המדע של מחוז פוג'יאן לחוקרים צעירים מצטיינים (2023J06053 [ל-S.O]); קרן המדע הטבעי של סין (מס' 82101084 [ל-S.O.]; תוכנית המחקר הבסיסי של מחוז גוויז'ואו (מדעי הטבע)(QKHJC-ZK[2025]MS-473) [ל-S.O.]; קרן איגוד המחקר הרפואי לפיתוח בריאות איכותי של מחוז גויג'ואו (2024GZYKYJJKM0043) [ל-S.O.].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלקסה פלואר 594 נגד ארנב לחמוראבקאםab150064
אנטיקרטיןאבקאםab230175
אנטי-פנציטוקרטיןתרמו פישר סיינטיפיקAE1/AE3, Alexa FluorTM 488
סטריליזר אוטוקלבאן שןLDZH-100KBS
אלבומין V. סרום בקרסולרביולוגיהA8020
מסנן תאNEST25836940 & mu; m
מכונה צנטריפוגליתאפנדורף AG22331 המבורג
קולגנאז Aרוש10103578001
מיקרוסקופ קונפוקלי  אוברכוכןצייס LSM 880
לוח ספירהמריינפלדM407859
צינור צנטריפוגליNEST6206112 מ"ל, 50 מ"ל
קאברסליפמריינפלדM407859
DAPIסולרביולוגיהC0065
מיקרוסקופ ניתוחקרל צייסVISU150
DMEM/F12  מדיהגיבקו11320033
DMSOסולרביולוגיהD8371
Fetal  bovine  סרוםגיבקו16140071
הידרוקורטיזוןסולרביולוגיהIH0100
ITSגיבקו23337619
גורם גדילה אפידרמלי בעכברInvitrogenPMG8041
כירורגי עיניים  מלקחייםדומוט0208-5-PO
מספריים כירורגיים עינייםFST15021-15
תנורAISITEDH6000 II
פניצילין & סטרפטומיציןגיבקו15070063100 מ"ל
צלחת פטריNEST70520160 מ"מ
מלח עם בופר עם פוספטסולרביולוגיהP1010
חממה תרמוסטטיתתרמו פישר סיינטיפיק3111
טריטון-X 100סולרביולוגיהT8200
Trypan Blue סולרביולוגיהT8070
טריפסין/EDTA גיבקוR001100
שולחן ניקוי אולטרה-יו צ'יVS-840-2
4% פאראפורמלדהידסולרביולוגיהP1110

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eghrari, A. O., Riazuddin, S. A., Gottsch, J. D. Overview of the cornea:structure, function, and development. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 7-23 (2015).
  2. Delmonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. J Cataract Refract Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
  3. Zhang, X., et al. Dry eye management:targeting the ocular surface microenvironment. Int J Mol Sci. 18 (7), 1398(2017).
  4. Dou, S., et al. Molecular identity of human limbal heterogeneity involved in corneal homeostasis and privilege. Ocul Surf. 21, 206-220 (2021).
  5. Adan, A., et al. Flow cytometry:basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 37 (2), 163-176 (2017).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Altshuler, A., et al. Discrete limbal epithelial stem cell populations mediate corneal homeostasis and wound healing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1248-1261.e8 (2021).
  8. Kaplan, N., et al. Single-cell RNA transcriptome helps define the limbal/corneal epithelial stem/early transit amplifying cells and how autophagy affects this population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (10), 3570-3583 (2019).
  9. Collin, J., et al. A single cell atlas of human cornea that defines its development, limbal progenitor cells and their interactions with the immune cells. Ocul Surf. 21, 279-298 (2021).
  10. Liu, X., et al. Optimization of method for achieving a single-cell suspension from mouse corneas. Exp Eye Res. 233, 109544(2023).
  11. Espana, E. M., Birk, D. E. Composition, structure and function of the corneal stroma. Exp Eye Res. 198, 108137(2020).
  12. Topouzi, H., et al. Methods for the isolation and 3D culture of dermal papilla cells from human hair follicles. Exp Dermatol. 26 (6), 491-496 (2017).
  13. Zhang, T., et al. The effect of amniotic membrane de-epithelialization method on its biological properties and ability to promote limbal epithelial cell culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 3072-3081 (2013).
  14. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods Mol Biol. 1430, 61-76 (2016).
  15. Chen, W., et al. Existence of small slow-cycling Langerhans cells in the limbal basal epithelium that express ABCG2. Exp Eye Res. 84 (4), 626-634 (2007).
  16. Song, Z., Tsai, C. H., Mei, H. Comparison of different methods to isolate mouse limbal epithelial cells. Exp Eye Res. 212, 108767(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ARNA

מאמרים קשורים