כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת רמות m⁶A גלובליות באופן חצי-כמותי באמצעות נקודת כתם נקודות. ה-RNA הכולל מופק, מנותק, מנוקד על ממברנת ניילון, נבדק בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצג באמצעות כימילומינסנציה. עוצמת האות, שנמדדה על ידי ניתוח גווני אפור של ImageJ, משקפת שפע מתילציה יחסי, ומספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור למחקר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיקת נקודת כתם לזיהוי רמות שינוי RNA גלובליות של N 6-מתילאדנוזין
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
N 6-מתילאדנוזין (m⁶A) הוא השינוי הפנימי השכיח ביותר ב-RNA שליח אאוקריוטי (mRNA) ומשמש כרגולטור מרכזי לביטוי גנים לאחר שעתוק. שיטות לחקירת m⁶A יכולות להיות מיושמות ברמות שונות של רזולוציה, כולל כימות גלובלי, גילוי ספציפי לנוקלאוטידים וניתוח תמלילים מסוימים בעלי עניין. מבין אלה, בדיקת dot blot מספקת גישה פשוטה, מהירה וחסכונית להערכה חצי-כמותית של רמות שינוי גלובליות ב-m⁶a. במבחן זה, תאים מעובדים תחילה להפקת RNA כולל, אשר מדולל ומפורק. דגימות ה-RNA מסומנות על ממברנת ניילון, נבדקות בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצגות באמצעות כימילומינציה, כאשר עוצמת האות מצביעה על שפע יחסי של מתילציה. לבסוף, כימות והשוואת עוצמות האות מתבצעים על ידי מדידת ערכי גווני גווני אפור באמצעות ImageJ. בהשוואה לשיטות ריצוף או שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה, כתם נקודות דורש מינימום מכשור ומומחיות טכנית, מה שהופך אותו למתאים במיוחד לסינון שגרתי, מחקרים תפקודיים ראשוניים וניתוחים השוואתיים. פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מפורט וניתן לשחזור ליישום מבחן נקודת הכתם m⁶A הן במחקר בסיסי והן ביישומים תרגומיים.
מבוא
N 6-מתילאדנוזין (m⁶A) הוא השינוי הפנימי הנפוץ ביותר ב-RNA שליח אאוקריוטי (mRNA) ומשחק תפקיד חיוני בוויסות לאחר שעתוק, כולל יציבות, חיבור, פירוק, תרגום וייצוא 1,2,3. דיסרגולציה של שינוי m⁶a הייתה מעורבת בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים מגוונים, כולל התחלה, התקדמות וגרורה של גידול. באוסטאוסרקומה, רמות m⁶a גבוהות נצפו הן בקווי תאים והן ברקמות, מה שמרמז על תפקיד למתילציה חריגה של RNA בביולוגיה של מחלה 6,7. לכן, הערכה שיט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול מאורגן לשלושה חלקים: הכנת RNA, בדיקת נקודת כתם וכימות. טבלת החומרים מסכמת את החומרים הנדרשים, טבלה משלימה 1 מפרטת את נוסחאות התגובה, ואיור 1 ממחיש את תהליך הניסוי.
1. הכנת RNA
- הכנת תאים
- הסר 143B תאי SNHG21-knockdown יציבים (shSNHG21), תאי ביקורת שליליים (shCtrl), ותאים שטופלו ב-3-דיאזאדנוזין (3-DAA; [100 מיקרומטר, 24 שעות]) וחומצה מקלופנמית (MA; [100 מיקרומטר, 24 שעות]) מהאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- ודאו שהמפגש התאים הוא בערך 80-90% והתאים במצב טוב תחת מיקרוסקופ. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לאמת בקפדנות את ביצועי בדיקת dot blot ולבחון את תפקיד SNHG21 בוויסות רמות גלובליות של m6 A, תאי 143B היו נתונים להפרעות פרמקולוגיות שמדכאות או מחזקות את מתילציה שלm 6 A, ועקבו אחר שפע m6 A בשני הכיוונים.
כימות כתם נקודה של שפע גלובלי m6 A
תחילה הערכנו את יכולת הבדיקה לזהות ירידות ברמותm 6 A על ידי עיכוב מתילציהשל m 6 A (איור 2). כפי שמוצג
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה, הפחתת SNHG21 בתאי אוסטאוסרקומה 143B הביאה לירידה בעוצמת האות m⁶A, מה שהדגים את ערך הבדיקה הזו להערכת האם שינויים גנטיים משפיעים על מתילציה של RNA. בנוסף, בדיקה זו משמשת ככלי ליישומים רבים, כולל: 1) מחקרים פונקציונליים ואימות מכניסטי: בדיקה זו יכולה לשמש לסינון ראשוני מהיר כדי לקבוע האם רמות m⁶A גלובליות קשורות לתהליכים ביולוגיים מסוימים, כגון התמיינות תאים, תגובת לחץ או התקדמות גידול16. הוא גם משמש להערכת התפקידים הפונקציונליים של רגולטורים של m⁶A ("כותב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה במענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע (82174408, 82374477 ו-82474535). איור 1 נוצר עם BioRender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3-דאזאדנוזין (3-DAA) | MCE | היי-W013332A | 1 מ"ג |
| נוגדן מונוקלונלי אנטי-m6A | פרויטנטק | 68055-1-Ig | 50 & mu; L |
| אלבומין סרום בקר (BSA, Fraction V) | BioFroxx | 4240GR100 | 100 גרם |
| מערכת הדמיה MP של ChemiDoc | BIO RAD | 12003154 | |
| רמת סוכר גבוהה DMEM | בהכרח | 319-005-CL | 500 מ"ל |
| ספקטרופוטומטר DS-11 | DeNOVIX | DS-11 | |
| ערכת טיהור RNA EZ-press | EZB | B0004DP | 100 Preps |
| FBS - איכות מעולה | בהכרח | 086-150 | 500 מ"ל |
| IgG נגד עכבר עזים עם HRP קונצוגטי (H+L) | ביוטיים | A0216 | 1 מ"ל |
| מצע HRP כימילומינסנטי מערבי של Immobilon | מיליפור | WBKLS0500 | 2 &פעמים; 250 מ"ל |
| חומצה מקלופנמית (MA) | MCE | HY-117275 | 1 מ"ג |
| תמיסת צביעת מתילן כחולה | סולרביולוגיה | G1300 | 0.1%, 100 מ"ל |
| ממברנת העברת ניילון | LABSELECT | TM-NY-XS-45 | 7.4 & פעמים; 8.5 ס"מ, 0.45 & מיו; זכר, 10 PCS/BAG |
| PBS buffer (אבקה יבשה מוכנה לשימוש) | ביושארפ | BL601A | pH: 7.2-7.4, 2 ליטר לשקית |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | סיגמא | L5750-500G | 500 גרם |
| אבקת TBS Buffer Premix | סאנגון | A510025-0001 | 1EA (אבקה 243.9 גרם) |
| אנזים TrypLE Express | גיבקו | 12604-021 | 1&פי;, 500 מ"ל |
| טווין-20 | סאנגון | A600560-0500 | 500 מ"ל |
| קרוסלינקר UV | UVP | CL-1000 |
מקורות
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Zhang, Z., Wei, W., Wang, H., Dong, J. N6-methyladenosine-sculpted regulatory landscape of noncoding RNA. Front Oncol. 11 (1), 743990....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
