מאמר שיטה

מודל טרשת עורקים בעכברים שנגרם הן על ידי קשירת קרוטיד חלקית והן על ידי ביטוי יתר של PCSK9

550 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69862

⸱

27 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Department of Pathophysiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Qinghai Cardio-Cerebrovascular Specialty Hospital, Qinghai High Altitude Medical Research Institute, 4Research Center of High Altitude Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מודל עכבר ניתן לשחזור גורם לטרשת עורקים קרוטידית על ידי שילוב של וירוס אדנו-קשור ל-PCSK9 (PCSK9-AAV) - תזונה עתירה שומן עם היפרכולסטרומיה מתווכת עם קשירת עורק עורק שמאל חלקית (PCL), המשחזר את הפתופיזיולוגיה האנושית. דבר זה מאפשר השראה מהירה של נגעים טרשת עורקים דמויי אדם בעכברים מסוג בר ללא עריכה גנומית, ומספק כלי סטנדרטי להקל על מחקר טרשת עורקים קרוטידית.

תקציר

היעדר מודלים מהירים וניתנים לשחזור של טרשת עורקים ספציפיים לעכברים מסוג בר מגביל מחקרים תרגומיים של ביולוגיית פלאקים וטיפולים. פרוטוקול זה מתאר שיטה חסכונית וללא ערוך גנומי, לגרימת טרשת עורקים קרוטידית שניתנת לשחזור בעכברים C57BL/6, על ידי שילוב ביטוי יתר PCSK9 בתיווך וירוס אדנו-קשור (AAV), תזונה אתרוגנית עתירה שומן, וקשירת עורקים חלקית שמאלית (PCL). המטרה היא לספק זרימת עבודה סטנדרטית המשחזרת תכונות פתופיזיולוגיות מרכזיות של מחלת התרדמה האנושית – היפרליפידמיה והפרעות זרימה – מבלי לדרוש בעלי חיים מהונדסים גנטית. השיטות כוללות מינון ומתן PCSK9-AAV, הכנה סביב הניתוח, קשירה כירורגית שלב אחר שלב של הקרוטיד השמאלי, טיפול לאחר ניתוח, שגרת תזונה, איסוף רקמות והערכה היסטולוגית הכוללת צביעת Oil Red O ו-Verhoeff-Van Gieson. התוצאות מצביעות על רמות גבוהות של כולסטרול במחזור הפעולה ורמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה בהשוואה לערכי ייחוס. פלאקים אטרוסקלרוטיים בולטים מתפתחים בעורק הקרוטיד הקשור השמאלי, עם הצטברות שומנים מוגברת משמעותית ועיבוי משמעותי בעורק העורקי הפנימי ביחס לעורק הביקורת הימני הלא-קשור. פרוטוקול סטנדרטי זה משפר את השחזוריות והנגישות לחוקרים החוקרים את היווצרות, התקדמותו, אסטרטגיות התערבות, ומאפשר השוואות בין מעבדות של טיפולים ניסיוניים.

מבוא

מחלות לב וכלי דם (CVDs) ממשיכות להיות הגורם המוביל לתמותה עולמית, כאשר טרשת עורקים משמשת כבסיס פתולוגי משותףלהן 1. העורק הקרוטידי הוא אתר קריטי לנגעים אטרוסקלרוטיים; חקר טרשת עורקים קרוטידית הוא חיוני להבנת הפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות2. מודלים של בעלי חיים הם כלים חיוניים למחקר טרשת עורקים במצב חי , אך למודלים קיימים לעיתים קרובות מגבלות מבחינת נוחות ויכולתם לשחזר תכונות פתופיזיולוגיות אנושיות.

בהשוואה לטרשת עורקים באתרים עורקיים אחרים (למשל, אאורטה, עורק הירך), היווצרות טרשת עורקים קרוטידית מושפעת חזק יותר מהמודינמיקה. העורק התרדמי חווה עומס גזירה גבוה (10-15 דין/ס"מ², דינים לסנטימטר רבוע), שני רק לעורק הכלילי (6-45 דין/סמ"ר)3. במיוחד בפיצול הקרוטיד, מתרחשת זרימת מערבולת, המאופיינת במאמץ גזירה תנודתי מופרע. הסביבה ההמודינמית הלא תקינה הזו מפעילה הפעלה פרו-דלקתית מתמשכת של תאי אנדותל מקומיים, המאופיינת בביטוי מוגבר של מולקולות הידבקות וכמוקינים המאפשרים גיוס מונוציטים והתחלת טרשת עורקים3. בנוסף, נגעים בעורקים הקרוטידיים בסיכון גבוה בבני אדם לעיתים מראים רמת היצרות העולה על 70%, ההגדרה כאחוז ההפחתה בקוטר הלומינל הנגרמת על ידי הפלאק4. לכן, מודלים של בעלי חיים המסוגלים לגרום להיצרות טרשת עורקים חמורה הם חשובים.

מודל קשירת התרדמת החלקית (PCL) הוא מודל של טרשת עורקים הנגרם מהפרעות זרימת דם מתמשכת, אשר בעל יתרונות של זמן מידול קצר ונגעים חמורים5. אפוליפופרוטאין E (ApoE) הוא חלבון מרכזי המעורב במטבוליזם ובניקוי כולסטרול וטריגליצרידים עשירים בשומנים במחזור הדם, ומשחק תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס השומנים בפלזמה. עם זאת, המודל המסורתי של PCL המשתמש בעכברי ApoE-knockout (ApoE⁻/⁻) קשה ויקר ליצירת5. כאשר נדרש ניקוי גן מטרה, יש צורך בכיבוי כפול גנטי (גם של גן המטרה וגם של גן ApoE), מה שמסבך עוד יותר את תהליך המידול. לעומת זאת, כאשר משתמשים רק בעכברים מסוג פראי C57BL/6 ל-PCL, המודל חסר היפרכולסלורמיה, גורם סיכון מרכזי לטרשת עורקים אנושית, ולעיתים נדירות נוצר נגעים טרשת עורקים עשירים בשומנים 6,7. מודלים אחרים, כגון ApoE⁻/⁻ או LDLR-knockout (LDLR⁻/⁻) שקיבלו תזונה עתירת שומן (HFD), נמצאים בשימוש נרחב במחקר טרשת עורקים לחקר טרשת אאורטה. עם זאת, מודלים אלו אינם מצליחים לשלב את השפעת זרימת הדם המופרעת ואינם יכולים ליצור טרשת עורקים חמורה בפרק זמן קצר. מחקרים קודמים הראו כי לאחר 3 חודשים של האכלה ב-HFD, עכברים מסוג ApoE⁻/⁻ או LDLR⁻/⁻ מפתחים פלאקים אטרוסקלרוטיים קלים רק באזורים האאורטליים או העורק הברכיוצפלי, בעוד שאין נגעים ברורים בחולקים הקרוטידיים 8,9.

פרופרוטאין קונברטיין קונברטאז' סובטיליזין/קקסין סוג 9 (PCSK9) הוא רגולטור מרכזי של חילוף החומרים של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-C): הוא מקדם את התדרדרות קולטני LDL, ובכך מעלה את רמות LDL-C בסרום10. וירוס אדנו-משויך רקומביננטי המבטא PCSK9 (PCSK9-AAV) מאפשר היפרכולסטרומיה הנשלטת במינון בעכברי WT ללא צורך בשינויים גנטיים11. שילוב של היפרכולסטרומיה הנגרמת על ידי PCSK9-AAV, HFD (שמחמיר עוד יותר הפרעות חילוף חומרים של שומן) ו-PCL (שגורם להפרעה הדינמית מקומית) מאפשר בניית מודל בעלי חיים הכולל שני גורמי סיכון מרכזיים לטרשת עורקים אנושית: היפרכולסטרומיה והפרעות זרימה.

בהתבסס על התקדמות מחקריתקודמת 12, פרוטוקול זה קובע שיטה סטנדרטית לגרימת טרשת עורקים קרוטידית בעכברי C57BL/6. בהשוואה לפרוטוקולי מודל קיימים, הוא מציע שלושה יתרונות מרכזיים: (1) רלוונטיות פתופיזיולוגית: הוא משחזר בו-זמנית היפרכולסטרומיה והפרעות זרימה, מה שמוביל לנגעים קרוטידיים המציגים תכונות דומות לטרשת עורקים אנושית בשלב בינוני-מאוחר; (2) שחזוריות: פרמטריזציה מפורטת של מינון AAV, הליכים כירורגיים ובקרת תזונה מפחיתה שונות בין-מעבדתית; (3) זמניות: תקופת הדוגמנות הכוללת היא 5 שבועות, מה שמקצר משמעותית את הזמן הנדרש להקמת הדגם.

פרוטוקול זה מתאים לחוקרים החוקרים ביולוגיה של דפנות כלי דם, מעריכים את יעילות התרופות האנטי-טרשת עורקים, וחוקרים את האינטראקציה בין המודינמיקה למטבוליזם של שומנים בטרשת עורקים. ראוי לציין כי פרוטוקול זה הוא מודל ממוקד קרוטיד, שאינו יכול לשחזר במלואו את כל ההיבטים של גורמי סיכון אנושיים מערכתיים לטרשת עורקים, כולל אך לא מוגבל לעישון, סוכרת, יתר לחץ דם והשמנה. להלן מדריך שלב אחר שלב להקמת מודלים והערכת נגעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים במכללת הרפואה של Peking Union (ACUC-A02-2024-006) ועומדים במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה.

1. הכנה ניסיונית לבעלי חיים

  1. רכש עכברים זכרים C57BL/6 בגיל 6-8 שבועות (משקל גוף: 22-25 גרם).
  2. עכברי בית בסביבה מסוימת ללא פתוגנים (SPF) בתנאים מבוקרים בקפדנות: טמפרטורה (23 ± 1°C), לחות (50 ± 5%), ומחזור אור/חושך של 12 שעות (תאורה: 07:00-19:00).
  3. לפני הניסוי, יש לספק לעכברים דיאטת צ'או סטנדרטית (יחס אנרגיה של 10% שומן) ומים סטריליים, עם גישה חופשית למזון ומים, לתקופת הסתגלות של שבוע.

2. הכנה וניהול PCSK9 -AAV

זהירות: התייחסו ל-AAV כסיכון ביו-בטיחותי ובצעו את כל ההליכים ברמת הבטיחות הביולוגית המוסדית המתאימה (בדרך כלל BSL-2). ללבוש כפפות כפולות, מגן עיניים וביגוד מגן. הימנעו מיצירת אירוסולים במהלך הטיפול. ניקו חומרים מזוהמים ב-AAV עם חומרי חיטוי מתאימים (למשל, 10% אקונומיקה) ופעל לפי פרוטוקולי אחריות ותגובה לאירועים מוגדרים היטב. כל הפסולת המזוהמת בנגיף חייבת להיות מושבלת על ידי טבילה בחומרי חיטוי המכילים כלור.

  1. רכש PCSK9-AAV רקומביננט (rAAV8-HCRApoE/hAAT-D377Y-mPCSK9).
  2. אימות טיטר AAV באמצעות PCR כמותי בזמן אמת המכוון למקדם CMV: הטיטר הסופי היה 6.10×10¹³ vg/mL (גנום וקטורי למיליליטר). אחסן AAV בטמפרטורה של -80°C והימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים (≤3 מחזורי הקפאה-הפשרה).
  3. הפשיר את ה-AAV על קרח למשך 15-20 דקות, ואז הפוך בעדינות את צינור הצנטריפוגה 3-5 פעמים כדי לערבב (הימנע ממערבולת).
  4. דילל PCSK9-AAV עם מי מלח סטריליים עם בופר פוספאט (PBS) לריכוז סופי של 2×10¹¹ vg/200 מיקרוליטר לעכבר.
  5. הזרקה באמצעות הזרקת וריד זנב (i.v.): מקבע את העכבר באמצעות מחזיק הזרקת זנב עכבר המדגיש ומזריק לאט 200 מיקרו-ליטר של AAV מדולל באמצעות מזרק אינסולין (קצב הזרקה: 10 מיקרוליטר/שנייה). נקודת זמן ההזרקה היא שבוע לפני PCL (איור 1A).

3. הכנה לפני הניתוח לקשירת תרד-קרוטיד חלקית

אזהרה: טריברומואתנול הוא תגובת מבוקרת עם סיכון למנת יתר. יש לתת בהתאם למשקל הגוף, להימנע מהזרקות חזרתיות, ולתעד במדויק את זמן ונפח המינון. אחסן במיכל נעול וודא שההכנה והשימוש מתבצעים על ידי צוות מיומן בלבד. במקרים של חשד למנת יתר, יש להתחיל בניהול חירום ולתעד את האירוע.

  1. הרדמו עכברים באמצעות הזרקה תוך-פריטונאלית (i.p.) של טריברומואתנול (2.5% אוורטין, 0.18 מ"ל/10 גרם) עד שהרפלקס המתיישר יאבד (כ-2-3 דקות). לאחר מכן, העבר את העכבר לכרית חימום (37 ± 0.5°C). בדוק את אפקט ההרדמה על ידי צביטת האצבעות.
    הערה: הרדמה היא קריטית לניתוח מוצלח. כדי למזער סיכוני הרדמה, יש להימנע מזריקות הרדמה מרובות. לפני תחילת הניתוח, יש לקבוע את מינון ההרדמה בהתאם למשך הניתוח הצפוי. בנוסף, זמן הניתוח לכל עכבר מומלץ להיות <30 דקות כדי להפחית סיכונים הקשורים לפרוצדורות ממושכות.
  2. במהלך הניתוח, בדקו את קצב הנשימה של העכבר (תקין: 40-60 נשימות לדקה) ואת רפלקס כף הרגל על ידי צביטה עדינה של כרית כף הרגל האחורית עם מלקחיים כל 5 דקות.
  3. מרחו היטב קרם הסרת שיער על עור הצוואר הקדמי של העכבר. אחרי 2-3 דקות, הסירו את שיער צוואר הרחם הקדמי עם מטליות כותנה ונקו את השיער שנותר עם תמיסת מלח רגילה. חטא את העור החשוף עם 5% פובידון-יוד שלוש פעמים.
  4. בצע ניתוח בארון בטיחות ביולוגית בחדר עכברים אספיטי. סטריליזציה של חלל הניתוח באור אולטרה סגול כדי לשמור על אספסיס ככל האפשר ואוטוקלבה על כל כלי המתכת.
    הערה: סביבה אספטית וחיטוי יסודי חיוניים להבטחת הישרדות לאחר הניתוח ויציבות פיזיולוגית של העכבר.

4. קשירת קרוטיד חלקית - הליך כירורגי

  1. בצע חתך בקו אמצעי (כ-1.0-1.5 ס"מ) בצוואר העכבר באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים; מפרידים רקמות תת-עוריות ואת שריר הסטרנוקליידומסטואיד באמצעות מלקחיים קהים כדי לחשוף את עורק הקרוטיד השמאלי (LCCA).
    הערה: יש להרטיב את אזור הניתוח באופן רציף במי מלח רגילים מחוממים כדי למנוע טראומה נוספת הנגרמת מייבוש כלי דם/רקמות.
  2. הפרדו באופן ישיר את ה-LCCA מהעצב הוואגוס (הסמוך לעורק) כדי למנוע נזק לעצב הואגוס (שעלול לגרום לדיכוי נשימתי).
  3. נתח כלפי מעלה לאורך ה-LCCA כדי לחשוף את עורק הקרוטיד הפנימי (ICA), העורק הקרוטידי החיצוני (ECA), העורק העורפי (OA) ועורק בלוטת התריס העליון (STA) (איור 1B).
  4. השתמש בתפרי משי סטריליים 6-0 כדי לקשור את עורק הקרוטיד החיצוני השמאלי מעל ה-STA. לאחר מכן, השתמשו בתפר משי סטרילי נוסף בקוטר 6-0 כדי לקשור את שורשי ה-ICA וה-OA בו-זמנית.
    הערה: הימנעו מקשירת עצבים ורקמות נוספות מסביב. חסום לחלוטין את זרימת השנט של ECA/ICA/OA תוך שמירה על מידה מסוימת של זרימה רטרוגרדית ב-LCCA. אפקט הקשירה יוערך על ידי התבוננות במצב הדימום/זרימת הדם ודופק העורקי הדיסטלי.
  5. בדוק דימום באתר הניתוח. אם מתרחש דימום, לחץ בעדינות עם מטשיות כותנה סטריליות למשך 30-60 שניות כדי להשיג המוסטזיס. תפרו את העור עם דבק רקמה או תפר כירורגי.
    הערה: הימנע מחדירת דבק רקמה מופרז לרקמה התת-עורית.

5. טיפול לאחר קשירת קרוטיד חלקית והתערבות בדיאטה עתירה שומן

  1. מתן 0.5 מ"ל של מי מלח חמים נורמליים באמצעות הזרקה תוך-צפיקית להחלפת נוזלים לאחר הניתוח.
  2. הקלה על הכאב באמצעות הזרקה תת-עורית של מלוקסיקאם (0.1 מ"ג/ק"ג) מיד לאחר הניתוח ו-12 שעות לאחר הניתוח.
  3. הנח את העכבר בכלוב התאוששות מחומם (37°C) עד שהרפלקס המתיישר ישוחזר (כ-15-30 דקות). עקבו אחרי העכבר להתנהגויות חריגות (למשל, עייפות, קוצר נשימה) בתוך 24 שעות לאחר הניתוח.
  4. ספק אנטיביוטיקה למניעת זיהום לאחר הניתוח לפי המלצת הווטרינרים, כגון מי שתייה המכילים אנטיביוטיקה למשך 7 ימים לאחר הניתוח.
  5. האכלו עם HFD בסגנון מערבי (עם יחס אנרגיית שומן של 40% ותכולת כולסטרול של 1.25%) עד להערכת הנגע (4 שבועות לאחר הניתוח).
    הערה: שמרו את ה-HFD בטמפרטורה של 4°C כדי למנוע חמצון שומן והשתמשו בו תוך שבועיים מהפתיחה. החלף את ה-HFD כל יומיים כדי להבטיח טריות ולפקח על צריכת המזון של העכברים מדי יום (צריכת מזון רגילה: כ-4-5 גרם לעכבר ביום). סנכרון האכלה ב-HFD עם היפרכולסטרומיה הנגרמת על ידי PCSK9-AAV ממקסם את הצטברות השומנים בעורק התרדמת; עיכוב בהתחלת HFD יפחית את חומרת הנגע.

6. איסוף ועיבוד דגימות

אזהרה: פאראפורמלדהיד פולט אדים רעילים. ההכנה, השימוש וההסרה חייבים להתבצע באמצעות מכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (כפפות, משקפי מגן וחלוק מעבדה). סילוק פסולת באמצעות נהלי נטרול ואיסוף פסולת כימית מוכרים. יש לנטרל ולאסוף את הקיבסטיבים באופן מרכזי בהתאם לפרוטוקולי טיפול מוסדי בפסולת נוזלית.

הערה: הדגימות האתרוסקלרוטיות של עורקי הקרוטיד במחקר זה נאספו ממטופלים עם היצרות עורק התרדמה שעברו כריתת עורקים קרוטידית. מחקר זה עומד בהצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים הרפואי של Peking Union Medical College (PUMCH) (מס' JS-2966). כל משתתפי המחקר נתנו הסכמה מדעת בכתב.

  1. 4 שבועות לאחר הניתוח, הרדימו עכברים באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של טריברומואתנול.
  2. לבצע תורקוטומיה דו-צדדית על עכברים מורדמים ולנקב את הלב כדי לאסוף דגימות דם לבדיקות שומנים בדם. לאחר מכן, יש לחלף את החדר השמאלי 20 מ"ל של PBS קר כדי לשטוף את שארית הדם מכלי הדם ב-3-6 מ"ל לדקה. צפו בשינויים בצבע הרקמה כאינדיקטור חזותי להשלמת הפרפוזיה.
    הערה: אם הדבר מותר על ידי אתיקה/תקנות מוסדיות, ניתן להשתמש בשיטות חלופיות אם הן מפורטות בבירור ומבוצעות בהתאם לדרישות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית המקומית (IACUC). גופות בעלי חיים חייבות להישרף על ידי צוות הווטרינריה המוסדי או קבלנים מורשים בהתאם לתקנות פסולת ביולוגית או לעבור עיבוד באמצעות הליכי סילוק ביולוגית מאושרים.
  3. נתח וקוצר את עורקי הקרוטיד יחד עם הלב, בודד את עורק הקרוטיד הדו-צדדי תחת מיקרוסקופ, וקבע אותו ב-4% פאראפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות.
  4. העבר את עורק הקרוטיד הקבוע לתמיסת סוכרוז של 30% (מומס ב-PBS) ודגר בטמפרטורה של 4°C במשך 24 שעות (עד שהרקמה שוקעת). הטמיעו את העורק בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
  5. השתמש בקריוסטט לחיתוך חתכים בעובי 5 מיקרומטר של עורק הקרוטיד השמאלי הנפוץ (מיקום חתך: 1 מ"מ קרוב לאתר הקשירה; טמפרטורת חיתוך: -20°C ~-22°C, כוונון מדויק לפי תכולת המים ברקמה). באמצעות מברשת עדינה מקוררת מראש, העבירו בעדינות את החלק לפלטת האנטי-רול של הקריוסטט כדי להבטיח שהוא ישר שטוח. החזק סלייד מצופה פולי-אל-ליזין בזווית כמעט אנכית והביא אותו לאט למגע עם החתך.
    הערה: שלב הפרפוזיה הוא קריטי להסרת שאריות דם; אחרת, זה יפריע לצביעת נגעים. קיבוע עורקי מלא תוך 30 דקות לאחר המתת חסד לשמירת מורפולוגיית הרקמות.

7. הערכת נגע טרשת עורקים 1 - צביעת שמן בצבע O אדום

  1. ייבשו את החלקים בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות; השרו ב-60% איזופרופנול למשך דקה, ואז דגרו בתמיסת Oil Red O (מדוללת 3:2 עם 60% איזופרופנול) בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
  2. להבדיל על ידי טבילה מלאה של הסלייד ב-60% איזופרופנול בטמפרטורת החדר למשך ~5-10 שניות עם ערבוב עדין להסרת צבע לא קשור; צביעה עם המטוקסילין למשך 30 שניות; שטוף במי ברז במשך 5 שניות (כדי לכחול את גרעיני התא).
  3. לכידת תמונות מקטעים באמצעות סורק שקופיות או מיקרוסקופ אופטי עם הגדלה פי 5, 10x ו-20x; ניתחו כמותית את שטח ההפקדה של השומנים באמצעות תוכנת ImageJ (גרסה 1.54p) - חישבו את אחוז שטח ה-O-חיובי של שמן אדום ביחס לשטח האינטימי הכולל.
  4. תמונת J נהלי כימות
    1. פתח את התמונה; בחר את כלי הבחירה ביד חופשית כדי לתאר ידנית את אזור המדיה האינטימה. עבור לכלי ניתוח > > ROI Manager ולחץ על הוסף.
    2. עבור לתמונה > כוון את סף הצבע >; כוון את פרמטרי הגוון והבהירות כך שיתאימו לאזורי ה-O-חיוביים בצבע אדום שמן. לחץ על select, ואז הוסף למנהל ה-ROI.
    3. בחר גם את ה-ROI של המדיה האינטימית וגם את התשואה המוכתמת, לחץ על ו - כדי לקבל את אזור Oil Red O-positive באזור המדיה האינטימה.
    4. לחץ על Add and Measure כדי לחשב את אזורי ה-intima-media והאזורים Oil Red O-חיובי.
    5. נוסחת חישוב:
      שמן אדום אזור O (%) = (שמן אדום O_positive_area / intimal_media_area) × 100

8. הערכת נגע טרשת עורקים 2 - כתמי ואן גיסון של ורהוף

  1. שלפו קטעים קפואים מוטמעים בתרכובות OCT על שקופיות.
  2. טבלו במים מזוקקים בטמפרטורת החדר (20-25°C) למשך 10-15 דקות עם ערבוב עדין (2-3 פעמים) כדי להמיס את תרכובת ה-OCT לחלוטין.
  3. זרקו מים המכילים תרכובת OCT, ואז שטפו חלקים במים מזוקקים טריים למשך 2 דקות כדי להסיר שארית תרכובת OCT.
  4. דגרו את החלקים בצבע ורהופ (המכיל המטוקסילין, יוד וכלוריד ברזל) בטמפרטורת החדר (20-25°C) למשך 15 דקות, תוך ניעור עדין של מתקן המחסנית 2-3 פעמים במהלך הדגירה כדי להבטיח צביעה אחידה.
  5. שטוף את החלקים במהירות במים מזוקקים פעמיים, 10 שניות בכל פעם.
  6. התמיינות בתמיסת כלוריד ברזל 2% למשך 30-60 שניות; התבונן תחת מיקרוסקופ עד שהסיבים האלסטיים נראים כחול-שחור והרקע נראה אפור. שטוף במים מזוקקים פעמיים, דקה בכל פעם.
  7. טפלו בחתכים בתמיסת נתרן תיוסולפט של 5% למשך 1-2 דקות כדי להסיר את שאריית היוד.
  8. שטוף במים מזוקקים במשך 2 דקות, ואז צבע נגד עם צבע Van Gieson (חומצה פוקסין + חומצה פיקריקית) למשך 5 דקות כדי לצבוע סיבי קולגן באדום בוהק.
  9. התייבש ברצף ב-95% אתנול (פעמיים, דקה אחת כל אחד) ו-100% אתנול (פעמיים, דקה אחת כל אחד); נקי עם קסילן ל-5 דקות; החלקים הוחלפו באמצעות מדיום הרכבה סינתטי שרף.
  10. תמונות לכידת מקטע; השתמש בתוכנת ניתוח תמונות דיגיטלית למדידת עובי או עובי אינטימלי של פלאקים בארבעה כיוונים (קדמיים, אחוריים, שמאליים, ימינים) באמצעות כלי מדידת האורך, ואז חישבו את הערך הממוצע.
    1. פתח את השקף, זום לחתך הכלי המטרה, ולחץ על כלי המדידה.
    2. לחץ על פנים האינטימה ועל הקצוות החיצוניים של האינטימה/מדיה בכיוונים הקדמיים, האחוריים, השמאליים והימניים ברצף, ורשמו את ארבעת ערכי העובי.
    3. חשב את הערך הממוצע ורשום את המדידות.
      ערך ממוצע = (קדמי + אחורי + שמאל + ימין) ÷ 4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות צביעת Oil Red O הראו כי העורקים הקשורים הראו היווצרות רובד טרשת עורקים חמורה, ליבות שומן ברורות ואזורים נקרוטיים. שיעור אזורי השומן היה גבוה משמעותית בעורק התרדמה השמאלי מאשר בבקרת עורק התרדמה הימני (p < 0.001) (איור 2A). צביעת VVG חשפה הרס או היעלמות של סיבי האלסטיות באינטימה, יחד עם עיבוי משמעותי של הפלאק אינטימה. גם עובי האינטימה-מדיה (IMT) וגם עובי האינטימי (IT) הוגדלו משמעותית בעורק הקרוטיד השמאלי בהשוואה לעורק התרדמה הימני (p < 0.001) (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית להקמת מודל טרשת עורקים קרוטידית בעכברים C57BL/6 על ידי שילוב של היפרכולסטרומיה הנגרמת על ידי PCSK9-AAV, תזונה עתירת שומן (HFD), וקשירה חלקית של עורק הקרוטיד הנפוץ (PCL).

בהשוואה למודלים מסורתיים כמו ApoE -/- או LDLR-/- או מודלים PCL המשתמשים בעכברWT 5, מודל זה מציע יתרונות ייחודיים במחקר טרשת עורקים. ראשית, העכברים מקבלים PCSK9-AAV ומקבלים HFD כדי לגרום להיפרכולסטרומיה, בעוד ש-PCL מבוצע ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו קיבלה מימון מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82470516, 8227022021), קרן מחקר מיוחדת לאוניברסיטאות מרכזיות, מכללת הרפואה של איחוד פקין (3332025111), מימון מחקר קליני ברמה גבוהה לבתי חולים לאומיים (2025-PUMCH-A-181, 2025-PUMCH-D-001), וקרן המדע הטבעי של מחוז סצ'ואן (2024NSFC0715).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפר ניילון סטרילי 6-0ג'ינחואן מדיקלF602NA
עכברים C57BL/6מרכז האורגניזמים המודל של שנחאי, בע"מ (SMOC)SM-001NA
צ'או דיטביוגרפיה של שייטונגלא. XT93GNA
Cryostat Leica CM1950NA
קרם הסרת שיערVeetRB Health LLCNA
דיאטה עתירת שומןביוגרפיה של שייטונגXT108cNA
אוקטוברסאקורה4582NA
Oil Red O Solutionservicebio G1017-100mLNA
מיקרוסקופ אופטילייקהDM4BNA
Paraformaldehyde Servicebio G1101-500mLNA
PCSK9-AAVWZBioscience AV208001-AV8NA
שקופיות מצופות פולי-L-ליזיןסיגמאP0425NA
סורק שקופיות3DHISTECHסריקת פאנורמיתNA
סולפמתוקסאזולסלקS1915 NA
דבק רקמה3M ווטבונד1469SBNA
מחזיק הזרקת זנב עכבר עם ויזואליזציה של ורידים  מדע וג'ינאן ייאן חברת פיתוח טכנולוגיה בע"מYLS-Q9GNA

מקורות

  1. Vaduganathan, M., Mensah, G. A., Turco, J. V., Fuster, V., Roth, G. A. The global burden of cardiovascular diseases and risk: A compass for future health. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2361-2371 (2022).
  2. Saba, L., et al. Carotid artery atherosclerosis: Mechanisms of instability and clinical implications. Eur Heart J. 46 (10), 904-921 (2025).
  3. Soehnlein, O., Lutgens, E., Döring, Y. Distinct inflammatory pathways shape atherosclerosis in different vascular beds. Eur Heart J. 46 (33), 3261-3272 (2025).
  4. Aburahma, A. F., et al. Society for vascular surgery clinical practice guidelines for management of extracranial cerebrovascular disease. J Vasc Surg. 75 (1s), 4s-22s (2022).
  5. Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), e1861(2010).
  6. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
  7. Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), e66-e73 (2010).
  8. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. Apoe-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  9. Ma, Y., et al. Hyperlipidemia and atherosclerotic lesion development in ldlr-deficient mice on a long-term high-fat diet. PLoS One. 7 (4), e35835(2012).
  10. Maxwell, K. N., Fisher, E. A., Breslow, J. L. Overexpression of pcsk9 accelerates the degradation of the ldlr in a post-endoplasmic reticulum compartment. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (6), 2069-2074 (2005).
  11. Keeter, W. C., Carter, N. M., Nadler, J. L., Galkina, E. V. The aav-pcsk9 murine model of atherosclerosis and metabolic dysfunction. Eur Heart J Open. 2 (3), oeac028(2022).
  12. Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in c57bl6 mice by overexpressing aav-mediated pcsk9 and partial carotid ligation. Lab Invest. 97 (8), 935-945 (2017).
  13. Gogulamudi, V. R., Durrant, J. R., Adeyemo, A. O., Ho, H. M., Walker, A. E., Lesniewski, L. A. Advancing age increases the size and severity of spontaneous atheromas in mouse models of atherosclerosis. Geroscience. 45 (3), 1913-1931 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCSK9C57BL 6Adeno Associated VirusOil Red OVerhoeff Van Gieson

מאמרים קשורים