מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m6A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה

Binghan Yan; Junli Chang; Suxia Guo; Peng Zhao; Fulai Zhao; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Mengchen Yin; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69880

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m⁶A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה

996 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

30 בדצמבר 2025

Binghan Yan^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Suxia Guo¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Mengchen Yin¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק גישה מפורטת להערכת רמות שינוי m⁶A של RNA ספציפי באמצעות MeRIP-qPCR.

תקציר

שינוי אפיטרנסקריפטומי של RNA ממלא תפקיד קריטי ביוזמה ובהתפתחות סוגי סרטן שונים, ביניהם N 6-מתילאדנוזין (m⁶A) הוא השינוי הנפוץ והמגוון ביותר מבחינה תפקודית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור המשתמש ב-MeRIP-qPCR להערכת רמות שינוי^m-6Aשל תמלילים ספציפיים בתאי אוסטאוסרקומה. במבחן זה, הופק רנ"א כולל, ואחריו נבצע דגירה עם נוגדן אנטי-m-6A ספציפי ל-RNA אימונוקליפס של m⁶A. לאחר מכן, ה-RNA פוצל, והושגה העשרת m⁶מקטעי RNA מותאמים על ידי A באמצעות חרוזי חלבון מגנטיים G. ה-RNA המועשר שוחרר על ידי עיכול פרוטאנאז K וטוהר על ידי חרוזי קישור RNA. לבסוף, ה-RNA עבר שעתוק הפוך ותגובת שרשרת פולימראז כמותית (PCR) להערכת רמות m⁶A בגנים המועמדים. התוצאות הראו כי שיטה זו מבחינה יעילה בהבדלים במתילציה ומספקת כלי אמין לחקר המנגנונים התפקודיים של שינוי^m-6A בתאי אוסטאוסרקומה. לסיכום, MeRIP-qPCR מציע גישה פשוטה וספציפית מאוד לחקר שינוי m⁶A בתאי אוסטאוסרקומה. פרוטוקול זה טומן בחובו פוטנציאל רב להבהרת רשתות רגולטוריות^{של m 6}A ולזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

מבוא

המחקר האחרון על אפיטרנסקריפטום מגלה כי שינוי RNA^{N 6-מתילאדנוזין} (m⁶A), המתילציה של מיקום^N6באדנוזין, הוא השינוי הכימי הפנימי השכיח ביותר הידוע של mRNA בתאים אאוקריוטיים¹. m⁶A מעורב במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל יציבות mRNA, חיבור, ייצוא גרעיני ויעילות תרגום². חשוב לציין כי מצטברות ראיות מצביעות על כך שהפרעת ויסות של שינוי M⁶A תורמת להתחלה ולהתפתחות של סוגי סרטן שונים, כולל אוסטאוסרקומה, גידול עצם ממאיר אגרסיבי במיוחד הפוגע בעיקר במתבגרים וצעירים³.

חקר שינוי m⁶A דו....