הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m6A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה

861 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

30 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק גישה מפורטת להערכת רמות שינוי m6A של RNA ספציפי באמצעות MeRIP-qPCR.

תקציר

שינוי אפיטרנסקריפטומי של RNA ממלא תפקיד קריטי ביוזמה ובהתפתחות סוגי סרטן שונים, ביניהם N 6-מתילאדנוזין (m6A) הוא השינוי הנפוץ והמגוון ביותר מבחינה תפקודית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור המשתמש ב-MeRIP-qPCR להערכת רמות שינויm-6Aשל תמלילים ספציפיים בתאי אוסטאוסרקומה. במבחן זה, הופק רנ"א כולל, ואחריו נבצע דגירה עם נוגדן אנטי-m-6A ספציפי ל-RNA אימונוקליפס של m6A. לאחר מכן, ה-RNA פוצל, והושגה העשרת m6מקטעי RNA מותאמים על ידי A באמצעות חרוזי חלבון מגנטיים G. ה-RNA המועשר שוחרר על ידי עיכול פרוטאנאז K וטוהר על ידי חרוזי קישור RNA. לבסוף, ה-RNA עבר שעתוק הפוך ותגובת שרשרת פולימראז כמותית (PCR) להערכת רמות m6A בגנים המועמדים. התוצאות הראו כי שיטה זו מבחינה יעילה בהבדלים במתילציה ומספקת כלי אמין לחקר המנגנונים התפקודיים של שינויm-6A בתאי אוסטאוסרקומה. לסיכום, MeRIP-qPCR מציע גישה פשוטה וספציפית מאוד לחקר שינוי m6A בתאי אוסטאוסרקומה. פרוטוקול זה טומן בחובו פוטנציאל רב להבהרת רשתות רגולטוריותשל m 6A ולזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

מבוא

המחקר האחרון על אפיטרנסקריפטום מגלה כי שינוי RNAN 6-מתילאדנוזין (m6A), המתילציה של מיקוםN6 באדנוזין, הוא השינוי הכימי הפנימי השכיח ביותר הידוע של mRNA בתאים אאוקריוטיים1. m6A מעורב במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל יציבות mRNA, חיבור, ייצוא גרעיני ויעילות תרגום2. חשוב לציין כי מצטברות ראיות מצביעות על כך שהפרעת ויסות של שינוי M6A תורמת להתחלה ולהתפתחות של סוגי סרטן שונים, כולל אוסטאוסרקומה, גידול עצם ממאיר אגרסיבי במיוחד הפוגע בעיקר במתבגרים וצעירים3.

חקר שינוי m6A דורש מתודולוגיות אמינות וחזקות. פותחו מספר גישות לזיהוי רמות שינוי m6A, כולל m6A dot blot, m6AELISA, ו-MeRIP-seq. מבחןm-6A dot blot הוא פשוט וחסכוני, אך הוא סובל מרגישות מוגבלת וכימות לקוי. הוא מספק את רמת השינויm-6Aשל RNA כולל, במקום רמת השינוי m6Aשל RNA4 ספציפי. m6A ELISA מציע זיהוי נוח יחסית ובקצב תפוקה גבוה; עם זאת, תגובתיות צולבת ודיוק נמוך נותרו דאגות מרכזיות, והיא גם חסרה את היכולת לחשוף שינויים ספציפיים לתמלול או לאתר5. MeRIP-seq מאפשר מיפוי רחב של m6A; עם זאת, דרישותיו לקלט RNA גדול, רזולוציה יחסית נמוכה ותלות בנוגדנים מגבילים דיוק ושחזור MeRIP-seq6. לעומת זאת, MeRIP-qPCR משלב אימונופרציפיטציה עם PCR כמותי, ומספק רגישות וספציפיות גבוהות יותר לזיהוי ממוקד של m6Aעל RNA7 ספציפי. שיטה זו מאפשרת גילוי רגיש וממוקד של העשרת m6A שונה בגנים מועמדים, מה שהופך אותה למתאימה במיוחד למחקרי אימות במחקרי סרטן הקשורים ל-m6A. שיטה זו מציעה אלטרנטיבה חסכונית ונגישה למעבדות השואפות לחקור מנגנוני רגולציה מתווכים על ידי m6A.

כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט (איור 1) להערכת רמות השינוי שלm-6A של c-Myc בתאי אוסטאוסרקומה, תוך שימוש ב-MeRIP-qPCR כדוגמה. MeRIP-qPCR, המתבסס על העשרה מבוססת נוגדנים של קטעי RNA מתילטים, בשילוב עם שעתוק הפוך ו-PCR כמותי, מעריך את נוכחות ושפע יחסי של m6Aעל RNA ספציפי. הראינו כי גישה זו מבחינה יעילה בין הבדלים במתילציה ב-c-Myc וסיפקה פלטפורמה אמינה לחקירת התפקיד התפקודי שלm6A בתאי אוסטאוסרקומה. מחקר זה מדגיש את הפוטנציאל של MeRIP-qPCR ככלי מעשי וספציפי למחקר שינויm6A באוסטאוסרקומה ומכין את הבסיס לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ה-RNA

הערה: חילוץ RNA מתבצע באמצעות ערכת חילוץ RNA. עבוד בתוך ארון בטיחות ביולוגית נקי כאשר מטפלים בתאים ומגבים של RNA. לבש ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות, משקפי מגן). קרר את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס לפני ההתחלה.

  1. הכינו את התאים.
    1. הסר את מדיום התרבית מהצלחת של 3.5 ס"מ ושוטף בעדינות את התאים פעם אחת עם PBS מקורר מראש. הוסף נפח מתאים של בופר ליזיס RNA ישירות לצלחת כדי לעבור את התאים במלואם ופיפטה עדינה להומוגניזציה.
    2. העבר את מתלה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    3. צנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ודאו שהרוטור מאוזן והמכסה סגור היטב.
    4. הוציאו בזהירות את צינור המיקרוצנטריפוגה לאחר הצנטריפוגה.
    5. שאפו את הסופרנטנט במלואו באמצעות פיפטה של 1 מ"ל מבלי להפריע לפלט בתחתית.
      הערה: אין לגעת בכדור התא עם קצה הפיפטה.
  2. תאי לייזה.
    1. הוסף 300 מיקרוליטר של בופר ליזיס לגלגלת התא.
    2. ערבבו היטב על ידי הפיכת הצינור 30 פעמים עד שהתמיסה נראית צלולה וצמיגה ללא גושים נראים לעין.
    3. דגור את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  3. RNA משקע.
    1. הוסף 300 מיקרוליטר של 100% אתנול לליזאט (נפח שווה של בופר ליזיס).
    2. מפעילים בעדינות פיפטות למעלה ולמטה מיד (בערך 8-10 פעמים) כדי לערבב במלואו.
  4. בצע קישור עמודות RNA.
    1. הניחו עמודת טיהור RNA בתוך צינור איסוף של 2 מ"ל שסופק.
    2. העבר את כל התערובת לעמוד הטיהור.
      הערה: הימנעו מלגעת בקרום הלבן במרכז.
    3. סגור את המכסה והצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך דקה.
    4. השליכו את הנוזל התחתון והקישו בעדינות את צינור האיסוף הפוך על נייר סופג כדי להסיר נוזל שנותר.
    5. החזיר את עמודת הטיהור לצינור האיסוף.
  5. שטוף זיהומים.
    1. הוסיפו 500 מיקרוליטר של בופר שטיפה (מים ללא נוקלאז) לעמוד הטיהור.
      הערה: הימנעו מלגעת בקרום הלבן במרכז.
    2. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך דקה אחת וזרוק את הנוזל התחתון.
    3. צנטריפוגה שוב ב-12,000 × גרם למשך דקה אחת כדי להסיר נוזל שנותר.
    4. העבר את עמוד הטיהור לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מ"ל.
    5. פתח את המכסה ותן לעמוד לעמוד במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. RNA נמוך.
    1. הניחו את עמוד הטיהור בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    2. הוסיפו 25 מיקרוליטר של בופר שחרור ישירות למרכז הממברנה.
    3. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך דקה אחת לאיסוף RNA בצינור התחתון.
    5. מרחים שוב את האלואט על הממברנה והצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך דקה אחת כדי למקסם את התפוקה.
      הערה: תמיד הוסיפו בופר שחרור ישירות למרכז ממברנת העמודה. הימנעו מהוספה לדופן הצדדית, שכן זה עלול למנוע המסה של RNA ולהפחית משמעותית את התפוקה. בנוסף, אל תנקב את הממברנה עם קצה הפיפטה.
  7. למדוד ריכוז RNA.
    1. שטוף את פתח הדגימה של הספקטרופוטומטר עם 1.5 מיקרוליטר של בופר שחרור.
    2. השתמשו ב-1.5 מיקרוליטר של בופר Elution כבופר ריק. אשר שהקריאה קרובה לאפס.
    3. טעינו 1.5 מיקרוליטר של דגימת RNA ומדדו את הריכוז.
    4. הערך את איכות דגימות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר (A260/A280 = 1.8-2.2, A260/A230 = 2.0-2.5) ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.

2. אימונופרציפיטציה של RNA מתילציה (MeRIP)

  1. הכנת תערובת אימונוקליפס
    1. קבל צינור PCR חדש בנפח 0.2 מ"ל.
    2. הוסף רכיבים כפי שמפורט בטבלה 1 (דוגמה לתגובה אחת).
  2. אימונוקליפס
    1. סגור את פקק הצינור היטב. הנח את צינור ה-PCR על סיבוב או שייקר מתגלגל.
    2. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות.
      הערה: ודאו שהתמיסה מעורבבת ברציפות ובעדינות רבה.
  3. חיתוך RNA
    1. לאחר הדגירה, הוסף לכל צינור 10 מיקרוליטר של משפר עיכול גרעיני (NDE) ו-2 מיקרוליטר של תערובת אנזימי חיתוך (CEM).
    2. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 5 עד 6 פעמים.
    3. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות.
    4. הכנת בקרת ה-RNA הקלט
      1. כדי להבטיח עקביות בין אימונופרציפיטציה (IP) לדגימות קלט, עבדו חלק מה-RNA במקביל כבקרת קלט.
      2. העבר 1 מיקרוגרם של RNA כולל (10% קלט) מכל דגימה לצינור PCR נפרד. הוסף 20 מיקרוליטר של בופר לכידת חיסון (ICB), 1.5 מיקרוליטר של NDE, 1 מיקרוליטר CEM, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
  4. העשרה מגנטית ושטיפה
    1. הנח את צינור ה-PCR על מעמד מגנטי.
    2. תן לצינור לעמוד 2 דקות עד שהתמיסה מתבהרת והחרוזים נתפסים על קיר הצינור.
    3. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים.
    4. השאירו את הצינור על מעמד מגנטי והוסיפו 150 מיקרוליטר של בופר כביסה (WB).
    5. הסר את הצינור מהמעמד המגנטי והטה אותו הפוך בעדינות כדי לתלות את החרוזים במלואם.
    6. החזיר את הצינור למעמד המגנטי. חכו דקה עד שהתמיסה מתבהרת, ואז זרקו את הסופרנטנט.
    7. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
    8. שטפו את החרוזים שוב עם 150 מיקרוליטר של Protein Digition Buffer (PDB) באותה שיטה.
  5. שחרור והתאוששות של RNA מועשר
    1. הכינו תמיסת עבודה לעיכול חלבון על ידי ערבוב פרוטאנאז K ו-PDB ביחס של 1:9. (לכל תגובה, יש להכין 20 מיקרוליטר: 2 מיקרוליטר של פרוטינאז K + 18 מיקרוליטר של PDB).
    2. הסר את הצינור מהסטנד המגנטי אחרי הכביסה הסופית.
    3. הוסף 20 מיקרו-ליטר של תמיסת עבודה לחלבון טרי לכדור החרוזים ומערבב בעדינות.
    4. הניחו את צינור ה-PCR במחזור תרמי ודגרו בטמפרטורה של 55°C למשך 15 דקות.
    5. תחזיר את צינור ה-PCR למעמד המגנטי. חכה עד שהתמיסה תתבהר (בערך 2 דקות).
    6. העבר בזהירות את כל הסופרנטנט (כ-20 מיקרוליטר) לצינור PCR חדש בנפח 0.2 מ"ל.
      הערה: ה-RNA נמצא כעת בסופרנטנט. זרוק את החרוזים.
  6. טיהור RNA
    1. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת טיהור RNA (RPS) לכל צינור דגימה, צינור בקרה שלילי וצינור קלט.
    2. הוסיפו 160 מיקרוליטר של 100% אתנול.
    3. חרוזי קשירת RNA של מערבולת כדי להחזיר אותם.
    4. הוסיפו 2 מיקרוליטר של חרוזי קישור RNA שהוחזרו לכל צינור.
    5. ערבב היטב למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.
    6. דגרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי לאפשר קישור RNA.
    7. הנח את הצינור על המעמד המגנטי. חכה עד שהתמיסה תתבהר (בערך 2 דקות).
    8. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים.
    9. השאר את הצינור על מעמד מגנטי והוסיף 150 מיקרול של אתנול טרי שהכין 90%. דגרה במשך 30 שניות.
    10. זרוק את 90% האתנול. חזור על השטיפה עם 90% אתנול פעם נוספת (שתי שטיפות בסך הכל).
    11. הסר את הצינור מהסטנד המגנטי.
    12. הוסיפו 13 מיקרו-ליטר של בופר אילושן לחרוזים המיובשים.
    13. דגרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי לשחרר RNA.
    14. הנח את הצינור חזרה על המעמד המגנטי. חכה עד שהתמיסה תתבהר (בערך 2 דקות).
    15. העבר בזהירות את כל הסופרנטנט (כ-13 מיקרוליטר) לצינור PCR חדש ללא RNase.
    16. השתמש מיד או אחסן RNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

3. RT-qPCR

  1. תמלל הפוך את ה-RNA המועשרב-m 6A ל-cDNA
    1. השתמש ב-RNA מטוהר מקבוצתm6A-IP, קלט או IgG לשעתוק הפוך.
    2. הגדר את תגובת השעתוק ההפוכה (RT).
      הערה: יש להבטיח קלט RNA שווה בכל הקבוצות כדי לאפשר השוואה אמינה בניתוח qPCR במורד הזרם.
  2. הגברה של qPCR
    1. הכינו תגובות qPCR באמצעות כימיה ירוקה של SYBR. הוסף 10 מיקרוליטר של SYBR Green Master Mix (2×), 0.5 מיקרוליטר פריימר קדמי (10 מיקרומון), 0.5 מיקרוליטר פריימר הפוך (10 מיקרומון), 7 מיקרוליטר ddH2O, ו-2 מיקרוליטר cDNA לכל צינור, ערבב היטב וצנטריפוגה קצרה לפני טעינה למכשיר ה-qPCR.
      הערה: קבע שלושה בארות שכפול לכל דגימת cDNA (קלט, IgG, m6A-IP). עיין בטבלה 2 לרשימת המקרים.
    2. הרץ את תוכנית qPCR.
      1. בצע את תגובות qPCR על מחזור תרמי בזמן אמת באמצעות התוכנית הבאה: להגדיר את הדנאטורציה הראשונית ב-95 °C למשך 30 שניות; הרץ 40 מחזורים הכוללים דנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, אנילינג ב-58 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
      2. לאחר ההגברה, יש לבצע ניתוח עקומת התכה על ידי קביעת דנאטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, קירור ב-60 מעלות צלזיוס למשך דקה, ולאחר מכן העלאת הטמפרטורה בהדרגה ל-95 מעלות צלזיוס בקצב רמפה של 0.5 מעלות צלזיוס לשנייה עם רכישת פלואורסצנציה רציפה לאישור הספציפיות של התוצרים המוגברים.
  3. ניתוח נתונים
    1. נתחו את ערכי ה-Ct של קבוצות היעד וקבוצת הביקורת.
    2. חשב העשרה באמצעות אחת מהשיטות הבאות:
      1. שיטות 1: שיטת קלט אחוז
        %קלט = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100%
        הערה: Ct (קלט) ו-Ct (IP) מייצגים את ערכי סף המחזור של דגימות הקלט וה-IP, בהתאמה, ומקדם הדילול (DF) הוא ההפך של שבר הקלט המשמש ל-qPCR (למשל, אם 10% מסך ה-RNA שימש כקלט, אז DF = 10).
      2. שיטות 2: שיטת Ct השוואתית (שיטת 2^-ΔΔCt )
        ΔCt sample=CtIP−CtIgG
        Ct=ΔCtמטופל−בקרת ΔCt, Fold=2−ΔΔCt.
        הערה: שמרו על כמויות קלט RNA, הגדרת תגובה ויעילות הפריימר עקביות בכל הדגימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן אנו מספקים תוצאה מייצגת של ניתוח MeRIP-qPCR, רמת השינויm-6Aשל c-Myc בתאי hFOB1.19 ו-143B. כפי שמוצג באיור 2, ההעשרה של c-Myc בנוגדן אנטי-M6A הייתה גבוהה משמעותית בהשוואה לביקורת IgG, שהציגה רק רמות רקע, מה שמרמז כי נוגדן אנטי-m-6A A הוא גם יעיל וגם ספציפי. כמו כן, שמנו לב שרמת השינויm-6Aשל c-Myc הייתה גבוהה משמעותית ב-143B מאשר בתאי hFOB1.19 (P < 0.001). ממצא זה מצביע על כך ש-c-Myc עובר יותר שינויים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

MeRIP-qPCR הפך לכלי חשוב לחקר שינויים ב-RNAm 6A עם יישומים רחבים. הוא שימושי במיוחד באימות תוצאות ריצוף בתפוקה גבוהה ובמיקום אתרי שינוי מדויקים בתוך אזורים מסוימים של גני המטרה במהלך מחקרים מכניים. יתרה מזאת, שיטה זו ניתנת ליישום בקלות ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית בזכות עלותה הנמוכה יחסית ופשטותה התפעולית, מה שהופך אותה לגישה יעילה ומעשית למחקר אפיטרנסקריפטומי8.

כדי להבטיח הצלחה, שיטה זו מתבססת על מספר שלבים קריטיים. ראשי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך במענקים מקרן המדע הלאומית לטבע (82174408, 82374477, 82474535 ו-82205145).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100% אתנולשנגחאי טיטאן סיינטיפיק בע"מ, אמריקה1158566
143BATCC, אמריקהATCC CRL-8303TM
2× תערובת qPCR ירוקה של SYBRבייג'ינג צ'יהנגשינג ביוטכנולוגיה בע"מ, סיןFS-Q1002
Denovix DS-11 דנוביקסDS-11 ספקטרופוטומטר
מדיום DMEMתאגיד ויזנט, סין319-005-CL
DMEM/F-12 בינוניגיבקו, אמריקה11320033
EpiQuik CUT& ערכת העשרת RNA (MeRIP) של RUN m6Aאפיגנטק, אמריקהP-9018-24
סרום בקר עובריתאגיד ויזנט, סין086-150
hFOB1.19בנק התאים של האקדמיה הסינית למדעים, סיןGNHu14
m6ערכת בדיקת מתילציה של RNAאבקאם, אנגליהAB185912
ערכת שעתוק הפוך של microRNAEZBioscience-EZB, אמריקהA0010CGQ
מערכת בזמן אמתביו-רד, אמריקהCFX96
ערכת חילוץ RNA כוללתEZBioscience-EZB, אמריקהB0004DP
אנזים TrypLE Expressגיבקו, אמריקה12604021

מקורות

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
  10. Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNAN6 MethyladenosineRNAProtein GRT PCRRNA
מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m6A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.