הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השפעות טיפוליות של גרגירי גואלו גויז'י אנטי-ספאזמודיים על עוויתות ו-PANoptosis במודל עכברוש של פגיעת חוט השדרה

225 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69894

⸱

10 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation for Medical Institutions in Fujian Province (Fujian University of Traditional Chinese Medicine), 3Department of Rehabilitation, Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ultrasound, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מעריך את השפעות גרנולות גואלו גויז'י אנטי-ספזמודיות (GLGZ) על ספסטיות הנגרמת מפגיעת חוט השדרה (SCI) באמצעות שיטות התנהגותיות, ביומכניות, דימות והיסטולוגיות, ובוחן מנגנונים הקשורים ל-PANoptosis.

תקציר

ספסטיות שרירים לאחר פגיעת חוט השדרה (SCI) פוגעת קשות באיכות החיים, עם טיפולים יעילים מוגבלים. גרנולים אנטיספאזמודיים של גואלו גויז'י (GLGZ), נוסחה של רפואה סינית מסורתית (TCM) שפותחה על ידי בית חולים, יכולה להקל על עוויתות. מחקר זה נועד להעריך את יעילות GLGZ בספסטיות הנגרמת מ-SCI ואת הקשר שלה ל-PANoptosis (מוות תאים מתוכנת חדש הכולל אפופטוזיס, נקרופטוזיס ופירופטוזיס).

נעשה שימוש בעכברי ספרג-דולי זכרים במשקל 180-200 גרם. SCI הושרתה באמצעות שיטת אלן-ירידת משקל. חולדות המודל המוצלחות הוקצו באקראי לקבוצת מודל או לאחת מקבוצות המינון של GLGZ: גבוה, בינוני או נמוך. חולדות שמה עברו למינקטומיה ללא פגיעה בחוט השדרה. ההתערבויות נמשכו 4 שבועות. לאחר ההתערבות, הוערך תפקוד המוטורי של הגפה באמצעות סולם Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). נוקשות שרירי הירך הוערכה באמצעות אלסטוגרפיית גלי גזירה באולטרסאונד (SWE), בעוד שנקבעה שלמות חוט השדרה באמצעות הדמיית תהודה מגנטית (MRI). בוצעו צביעות המטוקסילין-אאוזין (HE), Nissl ו-Luxol מהירים בכחול כדי לצפות בשינויים היסטופתולוגיים. צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס שימשה לסימון חלבון דמוי נקודה הקשור לאפופטוזיס המכיל CARD (ASC, ירוק), Caspase-8 (כתום) וקינאז סרין/תראונין-חלבון 3 (RIPK3, צהוב) האינטראקטיבי לקולטנים כדי להעריך PANoptosis.

GLGZ שיפר את ציוני BBB בהתאם למינון: מזויף (21.00 ± 0.00), מודל (5.8 ± 1.1), מינון גבוה (10.6 ± 1.3), מינון בינוני (8.5 ± 1.2), מינון נמוך (7.1 ± 1.0). SWE הראו ירידה בנוקשות השרירים: מודל (6.68 ± 0.74 מ'/שנייה), מינון גבוה (2.19 ± 0.36 מ'/שנייה, P < 0.001), מינון בינוני (3.04 ± 0.45 מ'/שנייה, P = 0.002), מינון נמוך (4.08 ± 0.65 מ'/שנייה, P = 0.031) לעומת מודל. בהשוואה לקבוצת המודל (3.65 ± 1.03 מ"מ²), GLGZ הפחיתה בהתאם למינון את גודל הנגע בחוט השדרה בכל קבוצות המינון (כל ה-P < 0.05), (1.33 ± 0.79 מ"מ² במינון גבוה, 1.94 ± 0.67 מ"מ² במינון בינוני, 2.50 ± 0.79 מ"מ² בקבוצת המינון הנמוך. היסטולוגיה גילתה שנוירונים משומרים ב-GLGZ וקידמו תיקון מיאלין. GLGZ הפחיתה בהתאם למינון את ביטוי ASC, Caspase-8 ו-RIPK3.

מבוא

עווית שרירים היא סיבוך נפוץ בפגיעת חוט השדרה (SCI), המשפיעה קשות על איכות החיים של המטופלים. התהליך הפתולוגי שלו כולל פגיעה מכנית ראשונית, דלקת משנית, לחץ חמצוני, אפופטוזיס ופגיעה בהתחדשות עצבים, בין היתר 1,2. הטיפולים הנוכחיים (דקומפרסיה כירורגית, פרמקותרפיה, שיקום) בעלי יעילות מוגבלת, כאשר תרופות לטווח ארוך גורמות לתופעות לוואי כמו עמידות לתרופות3. לכן, חקירת מנגנונים וטיפולים חדשים היא קריטית.

מחקרים עדכניים זיהו את PANoptosis, מוות תאי מתוכנת המשלב אפופטוזיס (תלוי בקספאז), נקרופטוזיס (תלוי ב-RIPK3/MLKL), ופירופטוזיס (תלוי ב-Caspase-8/GSDMD)4 כמנגנון פתולוגי מרכזי לפציעה משנית ב-SCI. הפעלה לא תקינה של (ASC, caspase-8 ו-RIPK3) גורמת לאובדן נוירונים ולהיווצרות צלקת גליאלית, ומחריפה ספסטיות5. המיקוד ב-PANoptosis הפך לאסטרטגיה מבטיחה להפסקת רצף הפציעות המשניות של SCI4.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) זכתה לתשומת לב בשל מחלות נוירולוגיות בשל השפעות רב-מטרה (למשל, נוגדי דלקת, לחץ נוגד חמצון)6. גרנולות אנטי-ספאזמודיות של גואלו גויז'י (GLGZ) נגזרות מסיכום החדר הזהב של ג'אנג ג'ונגג'ינג ומותאמות כהכנה לבית חולים7. רכיביו כוללים את Trichosanthes kirilowii (טיאנהוואן), Cinnamomum cassia (גויז'י), Paeonia lactiflora (ביישאו), Glycyrrhiza uralensis (גנקאאו), Jujube, וג'ינג'ר8. מחקרים ראשוניים הראו ש-GLGZ מקל על עוויתות לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית על ידי ויסות נוירוטרנסמיטרים ועיכוב דלקת. עם זאת, השפעותיו על ספסטיות הנגרמת על ידי SCI והקשר הפוטנציאלי ל-PANoptosis נותרו בלתי ברורות.

בניגוד לתרופות קונבנציונליות למטרה אחת, אופיו הרב-רכיבי של GLGZ תואם את הרשת הפתולוגית המורכבת של SCI – מטפל בדלקת, אובדן נוירונים, נזק במיאלין ואולי גם ב-PANoptosis בו-זמנית. מחקר זה משער כי GLGZ משפר את עווית השרירים בעכברי SCI על ידי קידום תיקון פתולוגי של חוט השדרה (הפחתת דלקת, שימור נוירונים, תיקון המיאלין) ועיכוב PANoptosis. על ידי אימות השערה זו, אנו שואפים לספק ראיות ניסיוניות ל-GLGZ כטיפול מבטיח המשלב הקלה בתסמינים ותיקון פתולוגי ליבה ל-SCI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הדגמת בעלי חיים
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השני המסונף של אוניברסיטת פוג'יאן לרפואה סינית מסורתית (אישור מס' FJPSPH-IAEC2024114) והתבצעה בהתאם להנחיות רווחת בעלי החיים. זכרים של חולדות ספרג-דולי במשקל 180-200 גרם הוחזקו בתנאים מבוקרים בטמפרטורה של 22-26°C ו-40-70% לחות. SCI הושרה על ידי שיטת ירידת המשקל של אלן10: הרדמה בשאיפה איזופלורנית 3-4%, חתך בקו האמצע ב-T10, חשיפה למקטעי T9-T11, למינקטומיה (דורה מטר שלם), ופגיעה (קצה 2 מ"מ, מהירות 0.5 מ'/שנייה, עומק 1.3 מ"מ, משך של שנייה). חולדות שמה עברו כריתת למינקטומיה ללא פגיעה. קריטריוני הכללה: ציון BBB < 8 ב-24 שעות לאחר הניתוח; קריטריונים להחריג: זיהום, כריתת חוט השדרה. טיפול לאחר הניתוח: הקלה בכאבים (בופרנורפין, 0.1 מ"ג/ק"ג סקר, כל 12 שעות למשך 3 ימים), ביטוי שלפוחית השתן (כל 6 שעות במשך שבוע), וטיפול בפצע סטרילי. חולדות המודל המוצלחות חולקו באקראי לקבוצת מודל, ולקבוצות GLGZ גבוהות (2.32 גרם/ק"ג, n = 10), בינוניות (1.16 גרם/ק"ג, n = 10), במינון נמוך (0.58 גרם/ק"ג, n = 10).

ניתוח פונקציה מוטורית
ההלחנה של באסו, ביטי וברסנהן (BBB) בוצעה בעיוורון. העכברים נצפו בשדה פתוח במשך 5 דקות, כשהם מצליחים לתנועת מפרק האחוריים, נשיאת משקל, הליכה ותיאום.

אלסטוגרפיה בגלי גזירה למדידת נוקשות ברקטוס פאמוריס
שימש מערכת אולטרסאונד דופלר עם גלאי מערך ליניארי (18L6). העכברים הוכנסו למצב שכיבה לרוחבית (שרירים רפויים). SWE בוצע כאשר הגשושית ממוקמת בזווית של 90° לשריר, בעומק של 1-2 ס"מ. אזור העניין (ROI) נקבע ל-0.5 × 0.5 ס"מ, ונרכשו עשר מסגרות לכל מדידה. ערך הקשיחות הסופי ייצג ממוצע של שלוש מדידות תקפות. נרשמה מהירות גלי גזירה (SWV); בקרת איכות ירוקה הצביעה על תמונות תקינות11.

בדיקת MRI
MRI בוצע באמצעות סורק 7.0T עם רצף מדכא שומן משוקלל T2 וסליל ייחודי לבעלי חיים. פרמטרי הרכישה היו כדלקמן: זמן חזרה (TR) 3,800 מילישניות, זמן הד (TE) 72 מילישניות, עובי פרוסה 1 מ"מ, גודל ווקסל 0.1 × 0.1 × 1 מ"מ, מטריצה 256 × 256, שדה ראייה (FOV) 25.6 × 25.6 מ"מ, ארבעה ממוצעים של אותות, ומעבר נשימה. שטח הנגע נמדד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.

צביעה היסטולוגית
צביעת HE בוצעה באמצעות דה-פרפיניזציה סדרתית, הידרציה מחודשת, צביעת המטוקסילין למשך 5 דקות, שטיפה במים זורמים, התמיינות בחומצה כלורית-אתנול 1% למשך 30 שניות, צביעת אאוזין למשך 2 דקות, ייבוש, ניקוי והרכבה. כנקודת ביקורת ויזואלית, קטעים מוכתמים הראו גרעינים כחולים וציטופלזמה אדומה.

צביעת Nissl בוצעה באמצעות דה-פרפיניזציה, הידרציה מחדש, דגירה ב-0.1% טולואידין כחול בטמפרטורה של 50-60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפה במים מזוקקים, התמיינות אתנול, ייבוש, ניקוי והרכבה. כנקודת ביקורת ויזואלית, גופות ניסל כחולות כהות נראו בבירור בקבוצת המזויפת.

צביעת Luxol Fast Blue-Cresyl Violet בוצעה על ידי דה-פרפיניזציה, הידרציה מחודשת, דגירה ב-Luxol fast Blue בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, שטיפה ב-95% אתנול, התמיינות בליתיום קרבונט למשך 30 שניות, ואחריה התמיינות של 70% אתנול, צביעת נגד קרסיל סגול למשך 10 דקות, ייבוש, ניקוי והרכבה. ריכוז העבודה של קרסיל סגול היה 0.1%. כנקודת ביקורת ויזואלית, נצפה מיאלין כחול כהה בקבוצת המזויפת.

צביעת אימונופלואורסצנציה במולטיפלקס בוצעה החל מהסרת פרפיניזציה, הידרציה מחדש ושאיבת אנטיגנים באמצעות בופר ציטראט (pH 6.0) בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הקטעים טופלו ב-3% מי חמצן למשך 10 דקות, ולאחר מכן חסימה עם 5% BSA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הנוגדנים הראשוניים הודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C (ASC: 1:500; קספסה-8: 1:400; RIPK3: 1:500). לאחר שטיפה עם PBS-T (0.1% Tween-20, 3 פעמים 5 דקות), הקטעים הועברו לדגירה עם נוגדנים משניים מסומנים על ידי HRP (1:1000) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הוחל תיוג פלואורוכרום: YTR520 Plus ל-ASC, TYR570 Plus ל-Caspase8, ו-TYR690 Plus ל-RIPK3 (30 דקות), ואחריו צביעת DAPI גרעינית למשך 5 דקות. הורכבו שקופיות, והדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בחשיפה של 500 מילישניות, רווח 1.0, הגדלה ×200, עם מערכות פילטר התואמות לפלואורוכרומים המתאימים.

עבור קסילן ואתנול, כל הניתוחים בוצעו באמצעות מכסה אדים, וכפפות ומשקפי מגן נענדו במהלך השימוש. לגבי כתמים, נמנע בהחלט ממגע ישיר עם העור. כל החומרים הפסולת הושלכו במיכלים מסוכנים ייעודיים. לחומרים ביו-מסוכנים, בוצעה חיטוי יסודי באוטוקלבה לפני ההשלכה הסופית כדי למנוע זיהום ביולוגי פוטנציאלי.

ניתוח סטטיסטי
בדיקת ANOVA חד-כיוונית עם LSD שימשה להשוואות קבוצתיות. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ציון BBB
ציון BBB של קבוצת שמה היה 21.00 ± 0.00, גבוה משמעותית מזה של המודל (5.8 ± 1.1, P < 0.001). ציוני BBB מוגברים בהתאם למינון GLGZ: מינון גבוה (10.6 ± 1.3, P < 0.001), מינון בינוני (8.5 ± 1.2, P = 0.003), מינון נמוך (7.1 ± 1.0, P = 0.028) לעומת מודל (איור 1).

ניתוח אלסטוגרפיה בגלי גזירה של נוקשות הרקטוס פמוריס
אלסטוגרפיית גלי גזירה (SWE) יכולה לשקף שינויים בנוקשות השריר באמצעות מיפוי צב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה העריך באופן שיטתי את ההשפעות המשפרות של GLGZ על ספסטיות שרירים בחולדות עם SCI וחקר את הקשר שלו לנוירופרוטקציה ו-PANoptosis. התוצאות הראו כי GLGZ יכול לשפר את ציוני BBB ולהפחית נוקשות שרירים בעכברי SCI באופן תלוי במינון. המחקר גם מצא שמנגנון הפעולה של GLGZ עשוי להיות קשור להגנה עצבית, תיקון מיאלין ועיכוב של PANoptosis. נכון להיום, טיפולים פרמקולוגיים קליניים לספסטיות שרירים לאחר SCI מקלים בעיקר על התסמינים מבלי לטפל בבעיות הפתולוגיות המרכזיות של פגיעות בחוט השדרה. מחקר זה, באמצעות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי פרויקט מחקר מדעי מרכזי של ועדת הבריאות של מחוז פוג'יאן (2024ZD01006), פרויקט פתוח של מכון המחקר הקליני בשנת 2023 (מכון LC2023001), קרן המדעים הטבעיים של מחוז פוג'יאן (2024J01733), פרויקט מחקר חדשנות רפואית של ועדת הבריאות של פוג'יאן (2022CXA052), פרויקט גיוס מנהיגות-רשימה של פרויקטים מרכזיים במדע וטכנולוגיה באוניברסיטת פוג'יאן לרפואה סינית מסורתית (XJB2022003-3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול חסר מים 240403A1 התייבשות
אתנול חסר מים 241101A1כתמים
חומר ציפוי סרט מוחלש נגד פלואורסצנציה (המכיל DAPI) MA0221   צביעת אימונופלואורסצנציה
נוגדן ASCBs-6741Rניתוח PANoptosis (1:300)
נוגדן קספס-813423-1-APניתוח PANoptosis (1:400)
מיקרוסקופ פלואורסצנצי ניקוןECLIPSECi-L 
סורק זכוכית דיגיטלי אוטומטי לחלוטין  GCell-60סורק שקופיות
ערכת המטוקסילין-אאוסיןR23718צביעת המטוקסילין-אאוזין (HE)
תוכנת ניתוח תמונותNIHImageJ 1.53k
לוקסול פאסט בלוR23193צביעת Luxol Fast Blue-Cresyl Violet
סורק MRIברוקר7.0T
ערכת צביעת פלואורסצנציה מרובה  240522  צביעת אימונופלואורסצנציה
ערכת צביעת מיאלואידים  G3245 צביעת מיאלואידים 
נייטרל  Balsam   MB9899 התקנה לאחר צביעה
ערכת צביעת NisslR23093 צביעת Nissl
נוגדן RIPK3Bs-3551Rניתוח PANoptosis (1:400)
SPSS 22.0תוכנת ניתוח סטטיסטי 
עכברי ספרג-דולי  חברת האנגי ביוטכנולוגיה בפוז'ואו
חומצה טרטרית, נתרן טריפוליפוספט10019418כתמים
מערכת אולטרסאונדSIEMENS Acuson גלאי מערך ליניארי (18L6)
קסילן240904A2כתמים

מקורות

  1. Sezer, N., Akkuş, S., Uğurlu, F. G. Chronic complications of spinal cord injury. World J Orthop. 6 (1), 24(2015).
  2. Quadri, S. A., et al. Recent update on basic mechanisms of spinal cord injury. Neurosurg Rev. 43, 425-441 (2020).
  3. Huang, H., et al. Clinical neurorestorative therapeutic guidelines for spinal cord injury (IANR/CANR version 2019). J Orthop Transl. 20, 14-24 (2020).
  4. Li, P., et al. PANoptosis: cross-talk among apoptosis, necroptosis, and pyroptosis in neurological disorders. J Inflamm Res. 2025, 8131-8140 (2025).
  5. Lou, J., et al. TRIM56 modulates YBX1 degradation to ameliorate ZBP1-mediated neuronal PANoptosis in spinal cord injury. Adv Sci. 11 (42), 2407132(2024).
  6. Lu, Y., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine for treatment of spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 127, 110136(2020).
  7. Application of Gualou Guizhi decoction in treatment of post-stroke spasm. Chinese Patent. , CN201210254594.X (2012).
  8. Huang, J., Tao, J., Xue, X., et al. Gua Lou Gui Zhi decoction exerts neuroprotective effects on post-stroke spasticity via modulation of glutamate levels and AMPA receptor expression. Int J Mol Med. 31 (4), 841-848 (2013).
  9. Han, J., et al. Gualou Guizhi decoction promotes neurological functional recovery and neurogenesis following focal cerebral ischemia/reperfusion. Neural Regen Res. 13 (8), 1408-1416 (2018).
  10. Yang, Z., et al. Hypoxic-preconditioned mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles promote recovery of spinal cord injury by affecting astrocyte phenotype through the miR-21/JAK2/STAT3 pathway. CNS Neurosci Ther. 30 (3), e14428(2024).
  11. Taş, S., et al. Shear wave elastography is a reliable and repeatable method for measuring the elastic modulus of the rectus femoris muscle and patellar tendon. J Ultrasound Med. 36 (3), 565-570 (2017).
  12. Zhang, Y., et al. Neuroprotective effects of Gualou Guizhi decoction in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 158, 76-84 (2014).
  13. Wenting, C. H., et al. Effect mechanism of Gualou Guizhi granule on neurological function and synaptic plasticity in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. Chin Pharm. 35 (16), 1951-1956 (2024).
  14. Chakraborty, A., Sankaran, V., Murugan, R., Chellappan, D. R. Comparative spasmolytic effect between Cinnamomum tamala and Cinnamomum verum leaf essential oils and eugenol through in vitro and in silico approaches. Z Naturforsch C. 76 (9-10), 383-391 (2021).
  15. Li, B., et al. Machine learning and experiments revealed key genes related to PANoptosis linked to drug prediction and immune landscape in spinal cord injury. Mol Neurobiol. 62 (6), 7364-7379 (2025).
  16. Wang, L., et al. Mechanisms of PANoptosis and relevant small-molecule compounds for fighting diseases. Cell Death Dis. 14 (12), 851(2023).
  17. Yang, J., Zhu, X., Hu, H., Lin, X. The inhibitory effect of Gualou Guizhi decoction on post-ischemic neuroinflammation via miR-155 in MCAO rats. Ann Palliat Med. 10 (2), 1370-1379 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ספסטיות של השריריםגרנולות Gualou Guizhiמוות תאי מתוכנןגל גזירה אולטרסונידימות תהודה מגנטיתאימונופלואורסצנציה רב-שלביתתיקון מיאליןביטוי Caspase-8
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.