הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת היווצרות מושבה לזיהוי יכולת ההתרבות של תאי האוסטאוסרקומה שנגרמו ל-LncRNA

420 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69910

⸱

16 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול ניסויי זה מספק שיטה יציבה, חסכונית ויעילה המשלבת הפלת lncRNA עם בדיקות ליצירת מושבות כדי לכמת את השפעת ה-lncRNA על התרבות תאי האוסטאוסרקומה.

תקציר

ביטוי RNA ארוך וחריג (lncRNAs) משפיע עמוקות על התרבות תאי האוסטאוסרקומה, מה שמרמז שהם עשויים לשמש מטרות טיפוליות פוטנציאליות. עם זאת, מחקרים פונקציונליים של lncRNA נשארים בעיקר תיאורטיים ומוגבלים למספר אימותים בודדים. בדיקות היווצרות מושבות, המשקפות במיוחד את גורל ההתרבות הסופי של תאים בודדים, נחשבות לסטנדרט הזהב להערכת פוטנציאל רבייה ארוך טווח. כאן, פרוטוקול זה ייסד פרוטוקול ניסיוני אמין המשתמש בבדיקות יצירת מושבות בתאי lncRNA-knockdown להערכת השפעת ה-lncRNA על יכולת התרבות תאי האוסטאוסרקומה. פרוטוקול ניסויי זה מספק בדיקה יציבה, חסכונית ויעילה להערכת ההשפעות הרגולטוריות של lncRNA על התרבות תאי אוסטאוסרקומה. גישה זו מתאימה לא רק למחקר על תאי אוסטאוסרקומה, אלא גם משמשת ככלי מעשי ליכולת רבייה של תאים מבוקרים על ידי lncRNA בגידולים אחרים. מחקר זה כלל פרוטוקול גילוי מפורט של בדיקות הרס lncRNA ויצירת מושבות, עם דוגמה להפחתת גן המארח 6 של RNA גרעיני קטן (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה (143B). תוצאות הניסוי אישרו דיכוי יעיל של ביטוי SNHG6, בליווי ירידה משמעותית הן במספר והן בגודל המושבות. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-SNHG6 חיוני לשימור הפוטנציאל ההתרבות ארוך הטווח של תאי האוסטאוסרקומה (143B).

מבוא

RNA לא מקודד ארוך (lncRNAs), המוגדרים כתעתלים ארוכים מ-200 נוקלאוטידים ללא פוטנציאל קידוד חלבון, הפכו לרגולטורים חשובים של תהליכים ביולוגיים מגווניםבשנים האחרונות 1,2. הם ממלאים תפקידים קריטיים ביוזמה ובהתפתחות של סוגי סרטן שונים, כולל אוסטאוסרקומה, סרטן הערמונית וסרטן הריאות 3,4,5. באוסטאוסרקומה, מצטברות ראיות מצביעות על כך שביטוי RNA ארוך לא מקודד חריג (lncRNA) משפיע עמוקות על התרבות תאים. לדוגמה, השתקת lncRNA POU3F3 דיכאה משמעותית את ההתרבות וקידמה את האפופטוזיס של תאי אוסטאוסרקומה (MG63 ו-U2OS)6. באופן דומה, הפחתת LNCRNA HOXA-AS3 הפחיתה את היווצרות המושבה ועיכבה את הצמיחהבתאי U2OS ו-SW1353. בהינתן שהתרבות בלתי מבוקרת היא סימן ההיכר של ביולוגיית הסרטן וגורם מרכזי באסטרטגיות טיפוליות, הבהרת התרבות תאים מבוקרת על ידי lncRNA בגידולים, במיוחד באוסטאוסרקומה, נותרה בעלת חשיבות והכרח מאוד.

למרות שקיימות מספר גישות להערכת התרבות תאים, כל אחת מהן נושאת מגבלות מובנות. בדיקות צבעוניות או מטבוליות, כמו CCK-8 ו-MTT, הן נוחות, מהירות ובעלות תפוקה גבוהה. עם זאת, הם מספקים בעיקר קריאות קצרות טווח וקל להתבלבל על ידי תנודות מטבוליות, ויש להם סיכונים נוספים להפרעות אופטיות או פוטוכימיות מהריאגנטים המשמשים8. שיטות מבוססות סינתזת DNA, כולל שילוב BrdU ו-EdU, מציעות ספציפיות גבוהה יותר תוך הגבלת ניתוחי תמונת מצב של כניסה לשלב S מבלי לשקף תוצאות רבייה ארוכות טווח 9,10. באופן דומה, צביעת חיסון לסמני רבייה כמו Ki-67 מצביעה רק על פעילות מיידית במחזור התא ואינה מצליחה לחזות קיבולת קלונוגנית10. מערכות ניטור בזמן אמת, כמו RTCA, מאפשרות ניתוח עקומות צמיחה רציף עם שחזוריות גבוהה, אך העלות הגבוהה שלהן וההגבלה להערכה קצרה או בינוניים מפחיתות את הפרקטיותשלהן. לעומת זאת, הבדיקה הקלונוגנית לוכדת באופן ייחודי את היכולת של תא יחיד לעבור התרבות בלתי מוגבלת וליצור מושבות נראות לעין, ובכך משקפת ישירות את גורלו הסופי. למרות שהוא דורש עבודה וגוזל זמן, הבדיקה הקלונוגנית נותרה הסטנדרט הזהב להערכת פוטנציאל רבייה ארוך טווח, ומציעה תובנות שאינן ניתנות להשגה באמצעות בדיקות קצרות טווח או חלופיות12.

כאן, מאמר זה כולל פרוטוקול זיהוי מפורט לבדיקות הרס ויצירת מושבות של lncRNA, עם דוגמה ל-SNHG6-knockdown בתאי אוסטאוסרקומה 143B. גישה זו אינה רק רלוונטית למחקר אוסטאוסרקומה, אלא גם משמשת ככלי מעשי לחקירת התרבות המתווכת על ידי lncRNA בגידולים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. טרנספקציה של פלסמיד

  1. זרעים 5 × 105 תאי 143B לכל צלחת תרבית של 10 ס"מ (סה"כ שתי מנות), תרב את התאים במדיום מלא (DMEM + 10% FBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5%CO2 .
  2. הכינו תגובות טרנספקציה 24 שעות לאחר מכן, כולל פלסמידים (shNC ו-shSNHG6), PEI ו-Opti-MEM.
    הערה: Vortex וודא שכולם מאוזנים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. הוציאו ארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, סמנו את הפלסמידים (shNC ו-shSNHG6) ואת PEI (שני צינורות) באמצעות עט סימן.
  4. הוסף 500 מיקרוליטר Opti-MEM לכל צינור.
  5. הוסיפו 10 מיקרוגרם פלסמידים לצינור הפלסמיד (shNC או shSNHG6) והוסיפו 30 מיקרו-ליטר PEI (1μg/μL) לכל צינור PEI.
  6. מערבבים בעדינות למעלה ולמטה, דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  7. מערבבים את צינור הפלסמיד וצינור ה-PEI, ערבבו בעדינות, ודגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  8. הוצא תאי 143B מהאינקובטור ושאף בעדינות את מדיום התרבית. הוסיפו 7 מ"ל מדיום ללא סרום לכל מנה. יש לסמן את הצלחות כדי לציין את הפלסמידים שיש להוסיף (143B shNC או 143B shSNHG6).
  9. הוסיפו את תערובת הטרנספקציה המוכנה מראש טיפה למנה המתאימה.
    הערה: הוסיפו את התערובת לאט, באמצעות פיפטה בתנועה מעגלית, ופזרים אותה באופן אחיד מהקצה החיצוני לכיוון מרכז התערובת. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5%CO2.
  10. השליכו את הסופרנטנט 8-12 שעות לאחר מכן, והוסיפו 10 מ"ל מדיום DMEM מלא לכל תבנית תרבית של 10 ס"מ. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 .
  11. צפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה ב-72 שעות לאחר שהסופרנטנט הושלך והוחלף במדיום DMEM מלא.

2. מבחן היווצרות מושבות

  1. הוציאו את המדיום מהצלחת של 10 ס"מ (shNC ו-shSNHG6), הוסיפו 1.5 מ"ל טריפסין-EDTA לעיכול התאים, הוספו בעדינות פיפטה לניתוקם, ואז מוסיפים 5 מ"ל מדיום שלם לסיום העיכול.
  2. העבר את מתלה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
  3. הוציאו 20 מיקרול של תליית תאים וספרו את מספר התאים.
    הערה: יש לבצע את ספירת התאים מספר פעמים כדי להבטיח שמספרי התאים בקבוצת shNC ובקבוצת shSNHG6 עקביים. כאן אנו אוספים 3 ×-10תאים לצורך אימות RT-PCR של יעילות ההנכה של SNHG6.
  4. זרעים 2 ×10 3 תאים בכל באר בפלטת 6 בארות. הוסף את מדיום ה-DMEM המלא לנפח סופי של 2 מ"ל ותרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 .
    הערה: החליפו את המדיום במדיום DMEM מלא טרי כל יומיים.
  5. לעקוב אחרי היווצרות מושבה מדי יום.
    הערה: סיימו את התרבית כאשר רוב המושבות בקבוצת הביקורת (shNC) מכילות ≥50 תאים, או לאחר 10-14 ימים של דגירה, המוקדם מביניהם.
  6. תוציא תאים מהאינקובטור ותזרוק את הסופרנטנט.
  7. שטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל PBS לכל באר, וזרוק את ה-PBS אחרי כל שטיפה.
  8. מקבע תאים עם 1 מ"ל של תמיסת פורמלין 10% למשך 15 דקות, ואז זרוק את תמיסת הפורמלין של 10%.
  9. שטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל PBS לכל באר, וזרוק את ה-PBS אחרי כל שטיפה.
  10. תאי צביעה עם 1 מ"ל של תמיסת צביעה סגולה קריסטלית של 0.5% למשך 10-30 דקות, ואז זרקו את תמיסת הצביעה.
  11. שטפו תאים בעדינות עם מי ברז זורמים לאט.
  12. ייבוש תאים באוויר בטמפרטורת החדר.
  13. לצלם תמונות באמצעות מצלמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך את השפעת nncRNA SNHG6 על יכולת ההתרבות של תאי האוסטאוסרקומה, הקמנו בהצלחה מערכת הפיכה בתיווך פלסמיד וביצענו בדיקות היווצרות מושבה. תהליך הניסוי כלל טרנספקציה של תאי 143B בפלסמיד ובדיקת יצירת מושבות (איור 1).

יעילות הטרנספקציה של תאי 143B אושרה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנציה 72 שעות לאחר ההעברה (איור 2). התוצאות הראו כי עוצמת הפלואורסצנציה של 143 תאים בקבוצת הביקורת (shNC) ושל קבוצת SNHG6 (sh...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מיקוד טיפולי ב-lncRNA הקשורים לסרטן, בנוסף לניצול השימושיות האבחנתיות שלהם כסמנים ביולוגיים, מהווה גישה מתפתחת בניהול סרטן. הגדרת תפקידי lncRNA בפתוגנזה של אוסטאוסרקומה היא קריטית לקידום האבחון, הטיפול והפרוגנוזה.

יש לנקוט צעדים קריטיים כדי להבטיח את הצלחת הבדיקה. ראשית, קביעת השעיה חד-תאית היא תנאי מובלט לבדיקות קלונליות אמינות, שכן נוכחות של אגרגטים של תאים עלולה להוביל למושבות שגויות ולפגוע בתוקףהתוצאות. כדי לקבוע תלייה חד-תאית אמינה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה במענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע (82174408, 82374477, 82474535 ו-82205145).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוטיופוז 1.5 מ"למרקAXYMCT150C
10% פורמלין נייטרלי עם בופרויקטרקס5205000
100 - 1000 & mu; L Extended Gradd Blue TipsShanghai BioScience Co., LtdBS10401ML
מעבדת צלחות תרבית תאים בקוטר 100 מ"מווקסי NEST ביוטכנולוגיה בע"מ704001
143BATCCATCC CRL-8303TM
צינור צנטריפוגה 15 מ"לShanghai BioScience Co., LtdBL2002150
לוח תרבית תא 6 בארותווקסי NEST ביוטכנולוגיה בע"מ703001
חממת CO2Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd.300583057
קריסטל ויולטTCI שנגחאיC0428
מדיום DMEMתאגיד ויזנט319-005-CL
אפנדורף ריסרץ' פלוסאפנדורף3123000233
FBS - איכות מעולהתאגיד ויזנט086-150
עט סימןזברה טריידינג (שנזן) בע"מ  YYST5
אופטי-MEMגיבקו31985070
פסטר פיפטלבאג'יקBS-XG-O3L
בופר PBS (אבקה יבשה)לבאג'יקBL601A
PEIמדעים פולי-מדעיים24765
טיפים של פיפטהמרקAXYT200Y
אנזים TrypLE Expressגיבקו12604021
טריפסין/EDTAגיבקוR001100

מקורות

  1. Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
  2. Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
  3. Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
  4. Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
  5. Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
  6. Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
  7. Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
  8. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
  9. Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
  10. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
  11. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  13. Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
  14. Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
  15. Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SNHG6RNART qPCR
בדיקת היווצרות מושבה לזיהוי יכולת ההתרבות של תאי האוסטאוסרקומה שנגרמו ל-LncRNA
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.