הידרוג'לים של פוליאקרילאמיד ZrOH לדגימה מרחבית של קרבוקסילטים המופרשים משורשים הגדלים בקרקע

Summary

בפרוטוקול זה אנו מפרטים את השימוש בהידרוגלים הידרוקסיד זירקוניום פוליאקרילאמיד (הידרוג'לים ZrOH) כשיטה לא הרסנית, במקום לדגימת קרבוקסילטים המופרשים מהשורשים שגדלו בקרקע שלמים בשלבי התפתחות שונים של הגידולים. הפרוטוקול גם מתאר מיפוי מקומי וכימות של קרבוקסילטים אלו באמצעות כרומטוגרפיית יונים-ספקטרומטריית מסה (IC-MS).

Abstract

דגימה וכימות אמין של פלישות שורשים משורשי צמחים שגדלו בקרקע לא מופרעים עדיין מאתגרים. פיתחנו שיטה לא הרסנית לדגימה, מיפוי דו-ממדי וכימות של שבעה קרבוקסילטים (אקוניט, ציטראט, פומראט, לקטט, מלט, אוקסלט, סוקסינט) המופקים משורשי צמחים שגדלו בקריזובוקס. השיטה המתוארת כאן משתמשת בהידרוגלים הידרוקסיד זירקוניום פוליאקרילאמיד (ZrOH) הסופגים את כל הקרבוקסילטים שנבדקו וניתן להסירם ביעילות הנעה בין 95.3% ± 3.12% עד 111% ± 1.99%. ההידרוג'לים של ZrOH בעלי יכולת קשירה גבוהה לקרבוקסילטים, עד 1.82 מיקרומול ס"^מ-2, בהתאם ל-pH בתמיסה ולמיני קרבוקסילטים, ריכוז גבוה מזה הזמין בדרך כלל בריזוספירה. יתרה מזאת, הקרבוקסילטים הקשורים על ההידרוג'לים של ZrOH נשארים יציבים וניתן לאחסן אותם מספר שבועות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. לצורך היישום, צמחים מגודלים בבוקסי קרקע מלאים באדמה המאפשרים גישה נוחה עם הפרעה מינימלית למערכת השורשים. לדגימת קרבוקסילטים משוחררים מהשורש, הידרוגלים של ZrOH מוחלים בקפידה באזור הרצוי למשך 24 שעות. לאחר איסוף ההידרוגלים של ZrOH, הם נחתכים לצורכי מיפוי, וחתיכות הג'ל מוסרות לניתוח קרבוקסיליאט נוסף (למשל, באמצעות כרומטוגרפיית יונים-ספקטרומטריית מסה). ממצאינו מצביעים על כך שהידרוג'לים של ZrOH יעילים ללכידה וקביעת ריכוזי קרבוקסילטים בריזוספירה. החידוש בשיטה זו טמון ביכולתה לדגום פליטות שורשים משורשי צמחים שלמים שגדלו בקרקע, וכן באפשרות לדגימה לפי זמן רב, בהשוואה לשיטות מסורתיות (שיטת הידרופונית של קרקע) שלרוב הן הרסניות ומאפשרות דגימה חד-פעמית בלבד. החשוב מכל, היא מאפשרת יצירת תמונות דו-ממדיות כמותיות, ברזולוציה גבוהה, בקנה מידה מילימטר, ומקלה על המחשת הפרשות קרבוקסילאט לאורך ציר השורש וההתפלגות המרחבית שלה בתוך הריזוספירה. בנוסף, שיטה זו מאפשרת דגימת פרשי שורש בשלבי גדילה שונים במהלך מחזור הצמיחה.

Introduction

שורשי הצמח פולטים תרכובות שונות אל תוך הריזוספירה, ומעצבים את תכונותיהם הפיזיקליות, הכימיות והביולוגיות¹. כאשר צמחים נחשפים לתנאי לחץ א-ביוטיים וביוטיים, הפרשת שורשים מתעוררת במיוחד. הפרשות שורשים עשויות למעשה להשפיע על זמינות וניידות של חומרים מזינים ומתכות, קהילות ופעילות מיקרוביאלית, יציבות הצטברות הקרקע וההגנות של הצמחים מפני פתוגנים ישירות^או בעקיפין ^1,2,3. בין הפרשות השורש החשובות ביותר נמצאים קרבוקסילטים בשל תפקידם במסיסות חומרים מזינים (כולל זרחן (P), ברזל (Fe), נחושת (Cu) ואבץ (Zn)), סבילות למתכות כבדות, והגברת מיקרואורגניזמים מועילים בריזוספירה 2,3,4,5.

ראוי לציין כי קרבוקסילטים המופרשים כוללים ציטראט, לקטט, אוקסלט, מלט, סוקסינאט ופומרט ^6,7,8. לדוגמה, ציטראט ממלא תפקיד חיוני ברכישת P על ידי גיוס P הקשור ל-Fe או אלומיניום (Al) (הידר)אוקסיד ^7,9. עם זאת, דגימה וכמותית מדויקת של פלישות שורשים מצמחים שגדלו בקרקע נותרת אתגר ניסיוני, בעיקר בשל הקושי להשיג גישה פיזית למערכות שורשים שגדלו בקרקע לא מופרעות ובהשגת דגימות פלישה שורשים^10,11. בנוסף, תרכובות המופרשות עוברות במהירות פירוק מיקרוביאלי (תוך דקות עד שעות⁾ וסופגות בחוזקה את פני המינרלים בקרקע ^1,10. אתגר נוסף במחקרי הפרשה שורשים הוא ניטור ההפרשה לאורך זמן, שכן רוב שיטות האיסוף מפריעות לשורשים או דורשות קציר צמחים שגדלו באדמה, מה שמקשה על הערכת אותו שורש שוב ^1,11. לכן, דגימה, כימות ומעקב מדויקים של הפרשות שורש דורשים טכניקה שתופסת שונות מרחבית ומקלה על דגימה חוזרת במהלך צמיחת הצמח¹¹.

במחקר הנוכחי, אנו מציגים שיטה לא הרסנית, במקום, שפותחה במקור עבור ציטראט על ידי Tiziani ואח' ¹², אשר כעת שופרה ויושמה לדגימה, מיקום מרחבי מדויק וכימות של שישה קרבוקסילטים נוספים (אקוניט, פומראט, לקטט, מלט, אוקסלט וסוקסינט) שפרשו משורשי צמחים שלמים שגודלו בקרקע בריזובוקס. השיטה עושה שימוש בהידרוגלים פוליאקרילאמידיים מבוססי זירקוניום הידרוקסיד (ZrOH) לדגימת הפרשות שורש¹³. הידרוג'לים של ZrOH מציגים יכולת קשירה חזקה לאניונים (כולל קרבוקסילטים) שניתן להסירם בקלות 12,13,14. הידרוג'לים של ZrOH (1) מאפשרים דגימת קרבוקסילטים מהשורשים של צמחים שגדלו בקרקע על ידי הנחת ההידרוג'ל על מערכת השורשים עם הפרעה מינימלית, (2) מספקים הגנה יעילה על קרבוקסילטים קשורים מפני מינרליזציה מיקרוביאלית למשך לפחות 6 שבועות, (3) התפלגות המרחבית של קרבוקסילטים בריזוספירה נשמרת בעת הקישור לג'ל, ו-(4) מאפשרים מיפוי דו-ממדי בקנה מידה מילימטר של קרבוקסילטים ¹².

שיטות קיימות לדגימת פלישות שורש מסווגות כטכניקות מבוססות קרקע מצמחים שגודלו בקרקע (למשל, שטיפת שורשים או היבריד הידרופוני, מכשירי איסוף ההפרשה (SOIL-REC), כוסות יניקה מיקרו, נייר סינון/אגר, מלכודות הפרשה וטכניקת RHIZOtest) או כשיטות דגימה הידרופוניות. שטיפת שורשים או גישה הידרופונית הידרופונית כוללת הסרה זהירה של כל הצמח מהקרקע, שטיפת מערכת השורשים, וטבילתו בתמיסת הדגימה לאיסוף הפרשות שורש¹⁵. זו השיטה הנפוצה ביותר לדגימת הפרשות מצמחים שגדלו בקרקע בשל פשטותה. עם זאת, חילוץ השורשים מהקרקע מסכן שערות שורש ושורשים דקים יותר. יתרה מזאת, נדרש ניקוי יסודי של השורשים, מה שעלול להזיק לשורשים, לפגוע באיכות ובכמות של הפרשות השורש, ולמנוע דגימה עם פתרון זמן ^8,11. שיטת SOIL-REC כוללת גידול צמחים במערכת ריזובוקס מיוחדת עם שורשים הגדלים בין שתי רשתות ניילון נקבוביות (≤ 30 מיקרון) ואיסוף הפרשות שורש באמצעות כלי איסוף פלישות שורש^16,17. גישה זו משמרת על מערכת השורשים, מזערת זיהום קרקע ומאפשרת איסוף חוזר של הפרשות שורש. עם זאת, יש לו מערכת מסובכת (עם מעט שכפולים בלבד), דילול גבוה יותר של הפרשות מנפחים גדולים יותר המשמשים לדגימה, ועדיין דורש אופטימיזציה, שכן השחזוריות שלו מאתגרת, וקיימים וריאציות עצומות בין הרפליקטים⁸.

יישום חתיכות קטנות של שרפים, דפי ג'ל אגר או נייר סינון המסוגלים לאזן את התמיסה הסובבת או לספוג פלישות על מקטעי שורש רלוונטיים של שורשים שלמים שגדלו בקרקע (כלומר, באמצעות ריזובוקס או חלונות שורש)^18,19. שיטה זו מאפשרת דגימה בזמן ומדידה חלקית של הרכב ההפרשה המקומי, אם כי ברזולוציה מרחבית נמוכה. מצד שני, היא רגישה לחומרים ממינרליזציה מיקרוביאלית ומגושמת לטיפול. באופן דומה, מלכודות הפרשה משמשות לדגימת פלישות שורש ממקטעי שורש בודדים, כאשר שורש יחיד כלוא בתאי צד אופקיים, עם טבעות פרספקס אטומות המכילות את תמיסת הדגימה, הממוקמות מקומית⁸. השיטה מתאימה הן לשורשים הידרופוניים והן לשורשים שגדלו בקרקע, ומאפשרת דגימה מקומית¹². עם זאת, נאספים נפחים נמוכים, דגימה בפרק זמן כמעט בלתי אפשרית, ובידוד שורשים בודדים חשוף ללחץ מכני, שעלול להשפיע על מטבוליזם השורש וההפרשה⁸. כוסות יניקה מיקרו משמשות לאיסוף תמיסת קרקע בקרקע בריזוספירה, ומאפשרות דגימה במקום משורשים שגדלו בקרקע²⁰. עם זאת, נאספים נפחים קטנים, הדגימה מתבצעת חלקית בזמן, וההפרשות נוטות לספיגה ופירוק מיקרוביאלי¹⁶. טכניקת RHIZOtest כוללת גידול שורשים הידרופוניים בצילינדרים קטנים כאשר התחתית מכוסה ברשת ניילון של 30 מיקרון, ואז העברתם לדיסק קרקע, מה שמאפשר חילופי מומסים בין השורש לקרקע ^8,21,22. ההפרשות נאספות על ידי השקיעת מחצלת השורשים בתמיסת דגימה. שיטה זו שומרת על מגע עם השורשים והקרקע אך משתמשת בתנאי גדילה מלאכותיים. היא מוגבלת לניסויים קצרים וחסרה דגימה בזמן. בין השיטות הללו, ניתן להשתמש רק בשרפים, דפי ג'ל אגר, נייר סינון, מלכודות הפרשה וכוסות יניקה מיקרו כדי לקבוע דפוסי הפרשה מרחביים.

שיטות דגימת הפרשה הידרופוניות כוללות טכניקות הידרופוניקה וחצי-הידרופוניקה. הידרופוניקה היא שיטה פשוטה ונפוצה לאיסוף הפרשות שורשים, שבה צמחים גדלים בתמיסת תזונה, שמוחלפת בתמיסת דגימה (H₂O, CaSO₄, CaCl₂, micropur) כדי לקבל דגימות הפרשה ^15,23. השיטה פשוטה ומפעילה לחץ מכני מינימלי על השורשים. השיטה מאוד ניתנת לשחזור וסטרילית במידת הצורך, מה שמעלה את איכות הפרשות השורש ומאפשר דגימה בטווח זמן ^5,16. עם זאת, מדובר במערכת מלאכותית מאוד שיכולה לשנות את הפיזיולוגיה של הצמח, המורפולוגיה (למשל, התפתחות שיער שורש) ותהליכי הפרשת שורש ^6,15. בסמי-הידרופוניקה, צמחים מגודלים על חרוזי זכוכית, חול או ורמיקוליט עם תמיסת תזונה שמחלחלת באופן רציף, וההפרשות נאספות בתמיסת החדירה ^8,18. גישה זו מעט פחות מלאכותית בהשוואה להידרופוניקה ומאפשרת דגימה בזמן. עם זאת, המערכת כמעט רוויה במים ולכן דורשת צמחים עמידים לתנאים אנאירוביים חלקיים.

בהשוואה לגישות חלופיות, שיטת ההידרוג'ל של ZrOH מציעה מספר יתרונות. הידרוג'לים של ZrOH מאפשרים דגימה להפרשות שורשים בגידול קרקע (קרוב לתנאים טבעיים) עם הפרעה מינימלית למערכת השורשים, דגימה מדויקת לאורך מחזור חיי הצמח, ואיסוף פליטות שורש למשך יותר מ-24 שעות אפשרי בשל הפחתת התפרקות מיקרוביאלית ויכולת קשירת קרבוקסילאט גבוהה¹². יתרה מזאת, אין צורך בביוצייד (למשל מיקרופור, NaN₃) לדגימה/שימור ההידרוגלים, שיש להם השפעה פוטנציאלית על המכשיר האנליטי בטווח הארוך ומפריעים לניתוח הכימי. הסיבה לכך היא שהקרבוקסילטים קשורים כימית להידרוג'ל של ZrOH. בנוסף, ניתן לאחסן את הדגימות למשך מספר שבועות עד חודשים לפני הניתוח, ולכן ניתן לאסוף דגימות רבות ממערכת ניסוי אחת¹², וניתן לייחס זאת לתכונות האנטי-מיקרוביאליות של ה-Zr בהידרוג'ל^24,25. בנוסף, הידרוג'לים של ZrOH מאפשרים מיפוי ברזולוציה דו-ממדית של תרכובות מופרשות ואניונים אחרים בריזוספירה, עם אפשרות לדגום את כל מערכת השורשים 12,14,26. הידרוג'לים של ZrOH תופסים פחות מקום אחסון במקרר (4 מעלות צלזיוס) לעומת נפחים גדולים הנדרשים בשיטות הקלאסיות, שבדרך כלל מאוחסנים במקפיא (-20°C). המגבלה העיקרית היא ההסתגלות לייצור הידרוג'לים איכותיים מסוג ZrOH עם בועות אוויר מינימליות או ללא בועות אוויר, וכן העובדה שקרחי הקריצה נשארים מערכות גידול מלאכותיות. מגבלה נוספת היא שהשיטה פותחה רק לשבעה קרבוקסילטים (אקוניטט, ציטראט, פומראט, לקטט, מלט, סוקסינאט ואוקסלט)¹², סולפונמידים (סולפדיאזין, סולפמתאזין, סולפקלורופירידאזין וקלינדמיצין)²⁷, ואניונים אנאורגניים (סולפידים ואוקסיאניאניונים של P, V-ונדיום, אס-ארסן, Se-סלניום, מו-מוליבדן, Sb-אנטימון)14,26,28,29. ההידרוג'ל ZrOH שימש גם בשילוב עם תגובת חלקיקים תלויים – חומצה אימינודיאצטית לדגימה ומיפוי קטיונים בשטח (אלומיניום, Fe, Ca-סידן, Mg-מגנזיום, Mn-מנגן, ניקל-ניקל ואבץ-אבץ) בריזוספירה 28,29,30.

כאן אנו מספקים שיטה מבוססת הידרוג'ל של ZrOH לאפשר דגימה זמנית ומרחבית במיקום של קרבוקסילטים ממערכות שורשים שגדלו בקרקע. אנו מספקים תיאור מפורט של אופן ביצוע ניסוי ריזובוקס, כולל דגימה ומיפוי דו-ממדי של הפרשות שורש בטכניקת ZrOH. הניסוי כולל הכנת הידרוג'ל, מילוי תיבת הריזובוקס, גידול צמחים, יישום הידרוג'ל, שליפה וחיתוך, שחרור קרבוקסילאט מההידרוג'ל וניתוח, ואחריו יצירת תמונה דו-ממדית. בנוסף, הוא מספק הערות על שלבים קריטיים, כגון ניתוח קרבוקסילאט באמצעות כרומטוגרפיית יונים-ספקטרומטריית מסה (IC-MS).

Protocol

1. הכנת הידרוג'ל ב-ZrOH

הערה: נדרשים סביבה נקייה וחומרים להכנת הג'ל כדי למנוע זיהום. יש להשתמש רק במים מדרגה I במעבדה (≤18 MΩ·cm) בעת הכנת התמיסות, שטיפת ג'ל והידרציה לצורך הבטחת איכות. ודאו שמיכלי הפסולת הרעילה (נוזלית ומוצקה) כבר מונחים במכסה האדים לפני תחילת הכנת ההידרוג'ל. חממו את התנור לכ-42─45 מעלות צלזיוס למשך שעה לפני תחילת הכנת הג'לים. פרטים על החומרים והכימיקלים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מכלול זכוכית
   1. הכינו אמבטיה חומצית של 10% (עם HNO₃) על ידי הוספת 153.8 מ"ל של 65% HNO₃ ל-846.2 מ"ל של מים מעבדתיים בדרגת I בתוך מכסה אדים.
   2. השרו את לוחות הזכוכית (6.1 על 17 ס"מ), פינצטה, מרווחים בצורת U בטפלון (0.25 מ"מ או 0.4 מ"מ), וקליפסים מפלסטיק באמבט חומצה למשך לפחות 4 שעות.
   3. הסר את לוחות הזכוכית, פינצטה, קליפסים מפלסטיק ומרווחי טפלון מהאמבטיית החומצית, ואז שטוף לפחות שלוש פעמים עם מים מדרגה I למעבדה. לאחר מכן אפשר להם להתייבש באוויר היטב בזרימה למינרית או ספסל נקי.
      הערה: יש להכין את לוחות הזכוכית באותו יום של הכנת הג'ל ולהימנע מייבוש בנייר כדי למזער זיהום.
   4. הנח את המרווח בצורת "U" על הפלטת הזכוכית היבשה, הוסף את השנייה, וקבע אותם יחד באמצעות קליפסים. הזז את לוחות הזכוכית בכ-~1 מ"מ כדי להקל על פיפטינג (ראו איור 1A).
   5. הנח את מערך לוח הזכוכית על נייר כסף פלסטיק נקי מתחת למכסה הסרט לפני יציקת תמיסת הג'ל.
2. הכנת ג'ל פוליאקרילאמיד³¹
   1. תמיסת ג'ל: הכינו תמיסת ג'ל של 100 מ"ל על ידי ערבוב 15 מ"ל גרדיאנטים דיפוזיביים בג'ל דילינקר DGT עם 47.5 מ"ל מים מעבדה דרגה I בבקבוקון פלסטיק נקי, ואז הוסיפו 37.5 מ"ל תמיסת אקרילאמיד (40%). ערבבו היטב את התערובת לאחר הוספת כל תמיסה. ניתן לאחסן את תמיסת הג'ל במקרר (4°C) לפחות שלושה חודשים.
      הערה: הקפידו על פיפט/שקילת הכמויות הנכונות של כל תמיסה והשתמשו רק בתמיסת אקרילאמיד ללא ביס-אקרילאמיד, שכן היא מייצרת ג'לים רכים כאשר מונחים בבופר של חומצה אתאנסולפונית (MES).
   2. הכינו תמיסת APS של 10% אמוניום פרסולפט (ללא ערך) על ידי המסה של 0.1 גרם APS ב-1 גרם_H2O. הכינו את התמיסה טרייה מדי יום וודאו שהיא מומסת לחלוטין לפני השימוש.
   3. הכינו קוקטייל ג'ל על ידי ערבוב תמיסת ג'ל של 4 מ"ל עם 28 מיקרוליטר 10% APS, ואז מוסיפים 10 מיקרוליטר 99% N,N'N'N'-טטרמתילתילנדיאמין (TEMED) לבקבוקי פלסטיק נקיים. ערבבו לאחר הוספת כל תמיסה. ניתן להכין את התמיסה עד ל-3 ג'לים כאשר התערובת מתפשטת במהירות. נפח הקוקטייל ניתן לכוונון בהתאם לגודל הצלחות והמרווחים שישמשו.
      הערה: הימנעו מבועות וקצף בעת ערבוב התגובות השונות.
   4. הפיפט באיטיות את תערובת הג'ל בין מכלול לוחות הזכוכית מהאמצע, כפי שמוצג באיורים 1B,C ²⁶. במקרה שיש בועות אוויר, הסר אותן על ידי הטיית מכלול הזכוכית בעדינות או דפיקה על לוחות הזכוכית בעט.
      הערה: כדי לקבל ג'לים ללא בועות, הימנעו משימוש בלוחות זכוכית שרוטות ואחסנו אותן באמבט חומצי לאחר השימוש, תוך שטוף אותן רק לפני השימוש הבא במקום לאחסן בשקיות פוליאתילן. השתמשו בפיפטה של 1 מ"ל או 5 מ"ל עם קצה קטן ליצוק הג'ל ומוסיפים את קוקטייל הג'ל לאט מהמרכז כך שיתפזר באופן אחיד תוך הטיית הצלחות בזווית של 45°.
   5. הניחו את ההרכבה בתנור המחומם מראש ושמרו על טמפרטורה של 42─46 מעלות צלזיוס למשך לפחות שעה אחת כדי להבטיח שהג'ל יתייצב לחלוטין (אין נוזל מטפטף).
   6. הרים בעדינות את ההרכבה בעזרת להב גילוח נקי וללא חלודה מהפינות, ושוטף את הג'לים מפלטות הזכוכית באמצעות מים מדרגה I במעבדה בבקבוק כביסה (איור 1D–F). להסרה קלה של הג'ל, השרו אותו במים לכמה דקות ואז שטפו אותו לבקבוק בנפח 1 ליטר המכיל מים מדרגה I למעבדה.
      הערה: יש להימנע מלמשוך את הג'ל עם פינצטה במקרה שהוא נדבק לצלחת, כי זה עלול לגרום לעיוות הג'ל. לאחר הפולימריזציה, כל הבועות הנראות נמצאות בדרך כלל בין הג'ל לפלטת הזכוכית ולא בתוך הג'ל עצמו, מה שמתבהר לאחר הסרת הלוח.
   7. החליפו את המים לפחות 3–4 פעמים בתוך 24 שעות מההידרציה (רצוי במרווחים של שעתיים לאחר ההכנה) כדי לשטוף את כימיקלים הפולימריזציוניים שנותרו. על ידי החלפה חוזרת של המים במהלך ההידרציה, זיהומים כמו תגובות לא מגיבים מתפזרים החוצה, וה-pH מופחת, מה שמונע הצטברות מטען בתוך הג'ל.
   8. יש לאחסן את הג'לים במים מדרגה I במעבדה (לתקופה קצרה של כ-24 שעות) או ב-0.01 מול, ^L-1 NaCl או NaNO₃ במקרר (4 מעלות צלזיוס), אם יריעות הג'ל אינן בשימוש מיידי להשקעת ZrOH. ניתן לאחסן ג'לים אלה ב-NaCl עד חודש לפני המשקעים.
      הערה: אנו ממליצים להשקע את הג'לים מיד לאחר הפולימריזציה כדי למזער זיהום שעלול להיגרם במהלך הכביסה.
3. השקיעה של ג'לים ZrOH¹⁴
   1. המיס 3.22 גרם של אוקטהידרט דיכלוריד זירקוניום (ZrOCl 2.8H ₂O) ב-40 מ"ל מים מעבדתיים בדרגת I בכוס פלסטיק בנפח 250 מ"ל.
   2. הנח עד 4 יריעות ג'ל ומלא עד 100 מ"ל. חלופה נוספת היא להמיס 1.66 גרם ZrOCl_{2.8H 2}O ב-20 מ"ל מים מעבדתיים דרגה I, להוסיף 2 ג'לים ומלא עד 50 מ"ל.
   3. השרו את דפי הג'ל לפחות שעתיים כדי להבטיח פיזור אחיד של Zr בג'לים.
   4. העבר כל ג'ל ל-100 מ"ל של חומצה אתאנסולפונית (MES) של 0.05 מול, ^L-1 2-(N-מורפולינו)-אתאנסולפוניק (MES) עם בופר ב-pH 6.7 (pH מותאם עם 1 מול, ^L-1 NaOH) לצורך השקיעה. ערבבו את הג'ל בעדינות עם פינצטה במהלך 30-60 השניות הראשונות כדי לקבל משקעים הומוגניים.
   5. נערו בעדינות על שייקר צלחת במהירות ≤100 סל"ד למשך 40 דקות לשקיעה מלאה של Zr(OH)₄ בג'ל.
      הערה: מהירות ניעור איטית יותר מועדפת כדי למנוע מהג'לים להידבק זה לזה.
   6. הניחו את הג'לים במים מדרגה I במעבדה בכוס של 1─2 ליטר למשך 24 שעות להסרת ^יוני קלרום והחלפת מים לפחות 3 פעמים במרווחים של 2 שעות^ו-32. הסרה יסודית ^{של יוני הקל} יכולה להיבדק על ידי מדידת מוליכות תמיסת השטיפה או ביצוע בדיקת כלוריד.
   7. אחסן את הג'ל ב-0.03 מול, ^L-1 NaNO₃ או NaCl, אך NaCl מועדף לניסויים בקרקע כי ניטראט משפר במהירות את פעילות המיקרוביאלית בקרקע והוא גם חומר מזון מרכזי לצמח^13,32.
   8. הידרוג'לים של ZrOH נבדקו עד 60 שבועות (נשמרו במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) והוכח כי הם שומרים על תכונותיהם וביצועיהם הטובים (±10% מערכי היעד)³².
4. חיתוך ג'ל
   1. נקה את פלטת הפלקסיגלס הלא שרוטה, את הפינצטה ולהב סכין חד וללא חלודה. בהיעדר פלטת פלקסיגלס, ניתן להשתמש בכל פלטת זכוכית עבה וחזקה.
   2. הרטיב את פלטת הפלקסיגלס במים מדרגה I במעבדה כדי לעזור בפיזור לוחות ההידרוג'ל של ZrOH.
   3. מרחו את יריעת ההידרוג'ל ZrOH על פלטת הפלקסיגלס באמצעות פינצטה, תוך שמירה על שכבה שטוחה ללא בועות. זהו את האזורים עם חורים בלוחות; יש להימנע מאזורים אלה בעת החיתוך.
   4. חתכו בדיוק את יריעות ההידרוג'ל של ZrOH עם להב גילוח חד לגודל הרצוי. הסרת המים מהפלטה לאחר החיתוך עוזרת לראות בבירור את חלקי החיתוך.
      הערה: לזיהוי קל יותר של הצדדים למיפוי דו-ממדי, אנו ממליצים לחתוך חלקי הידרוג'ל של ZrOH לטרפז בזווית ישרה, כאשר הצד הארוך ביותר ממוקם בפינה השמאלית העליונה.
   5. אחסן את ההידרוג'לים של ZrOH במים מדרגה I במעבדה (לאחסון קצר טווח ולפני יישום הג'ל) או ב-0.03 מול ^L-1 NaNO₃/NaCl לאחסון ארוך טווח (>24 שעות).

2. הקמת ניסוי ריזובוקס

הערה: הצמחים מגודלים בתיבות ריזובוקס מלאות אדמה, שעיצובן משתנה. אנו ממליצים להשתמש בקריזובוקס המצוידות בחור בתחתית או בגב כדי להקל על ההשקיה ולהבטיח פיזור מים אחיד (ראו איור משלים 1). פרטים על החומרים והכימיקלים מפורטים בטבלת החומרים.

1. קביעת קיבולת מילוי ריזובוקס ואגיאת מים²⁶
   1. מסננת אדמה מיובשת באוויר באמצעות מסננת של 2 מ"מ והומוגנית את הקרקע. אנו ממליצים להשתמש בקרקע בעלת מרקם בינוני, אך ניתן גם להשתמש בקרקע חולית או חרסיתית, בתנאי שנעשה שימוש בטכניקות טיפול ספציפיות (למשל, סוג ריזובוקס, מילוי, פתיחה והשקיה).
   2. שקלו את כל רכיבי תיבת הריזובוקס (ריקה) יחד עם המהדקים ונייר הפלסטיק ורשמו את המשקל (ראו איור משלים 2C). הוסף 2–3 ריזובוקס נוספים למספר הנדרש לקביעת קיבולת אחסון מים (WHC).
   3. הערכו את מסת הקרקע היבשה הנדרשת למילוי הקופסה. בדרך כלל, הקופסת מתמלאת עד 2 ס"מ מתחת לחלק העליון. צפיפות הגזירה המומלצת היא כ-1.0–1.4 גרם סמ^"ק.
   4. בהתאם לסוג הקרקע ולנוחות הטיפול, יש למלא בזהירות את הקרקע היבשה. במהלך ואחרי המילוי ניתן ליישר את האדמה באמצעות פלטה שטוחה מבלי לדחוס אותה. ניתן גם להשתמש בקרקע מעט לחה למילוי הקרקע, תוך שמירה על מבנה הקרקע, במיוחד בקרקעות עם מרקם דק או כבד (ראו Wagner ואח' ²⁶ לתיאור מפורט).
   5. לחלופין, אם הקריזובוקס מלא מלמעלה, מקבע את נייר הפלסטיק על הקופסה, כסו אותו בלוח הקדמי, ואז מהדקים (ראו איור משלים 2A–D).
   6. לנוחות, מותקן ממברנת נוקלפור במהלך תהליך המילוי וודא שהיא שוכבת שטוחה על פני השטח. נדרש ממברנת נוקלפורה בעת דגימת שורש מפרישה.
   7. רשמו את משקל הקריזובוקס המלאים באדמה יחד עם המהדקים. מחשבו את מסת הקרקע היבשה (_{m אדמה יבשה}) עבור כל ריזובוקס על ידי חיסור משקל הקריזובוקס הריקות מאלו המלאות באדמה, ורשמו את המשקל.
   8. קיבולת אגירת המים נקבעת תחילה על ידי ריווי הקרצונים במים דה-יוניים ואז מתן ניקוז למשך ~8 שעות. שקלו את הקריזובוקס וחשבו את מסת המים (m_w) על ידי הפחתת משקל הקריזובוקס המלאים בקרקע שנרשמו בשלב 2.1.7 מהמשקל הנוכחי. לאחר מכן קבעו את WHC (g ^g-1) על ידי חלוקת m_{w ב-m קרקע יבשה}, התוצאה היא יחס.
      הערה: אל תשתמשו בריזובוקס המשמשים לקביעת WHC למיפוי בפועל, שכן רוויה במים עלולה להוביל לאנאירוביה וכך ליצירת חמצון אדום.
   9. תכולת המים האופטימלית לרוב הצמחים במהלך הגידול צריכה להישמר ב-50%─60% WHC (כלומר, מקדם WHC, f_WHC = 0.5─0.6), בהתאם לסוג הקרקע ולמיני הצמח. הערך את כמות המים שיש להוסיף (m_{w loss}) לכל ריזובוקס כך: m_{w add} = WHC x f_{WHC x} m_{קרקע יבשה}.
   10. השקה את הקרח לפני השתילה עם _הוסף. אם ההשקיה נעשית דרך החורים, הוסף 5-10 מ"ל מים לפני השטח.
   11. רשמו את מסת הקריזובוקס המושקים, הנדרשות להשקות הצמחים במהלך צמיחת הצמח.
2. גידול וניהול צמחים ^12,26
   1. חטא את הזרעים לפני הנביטה או השתילה. נוהג נפוץ הוא לשים אותם ב-70% אתנול למשך 3 דקות ואז ב-1% NaClO למשך 15 דקות כדי למנוע צמיחת פטריות. לאחר מכן לשטוף את הזרעים במים דה-יוניים (בערך 6─7 פעמים).
   2. הנביטה מראש של הזרעים בין ניירות סינון או גלילי נביטה שהורטבו במים או 0.05 מ"מול L⁻¹ CaSO₄ עד שהרדיקל יוצא.
   3. העבר שתיל אחד לכל ריזובוקס, הנח אותו קרוב לצלחת הקדמית, כסה במעט אדמה, ואז הוסיף מים.
   4. עטוף את תיבות הריזובוקס בנייר אלומיניום כדי למנוע הפחתה פוטוכימית בקריזוספירה, למנוע צמיחת אצות ומיקרואורגניזמים פוטוסינתטיים אחרים, וכן להימנע מהעמסה על השורשים בעת חשיפה לאור. חלופה נוספת היא זמינות לוחות חזיתיים שחורים שאינם מאפשרים מעבר אור דרכם וניתן להשתמש בהם במקום נייר אלומיניום.
   5. הניחו את הקריזובוקס על מתקן כך שהקריזובוקס יהיו מוטות בתא הצמיחה או בחממה עם טמפרטורה מבוקרת, לחות יחסית ועוצמת אור. אנו ממליצים על הטיה של 25°─35°.
   6. משקים את הקריזובוקס באופן גרבימטרי לפחות 2─3 פעמים בשבוע, בהתאם לצרכי הצמחים. זה נעשה על ידי שקילת הקריזובוקס, הוספת מים כדי לפצות על ההבדל מהמשקל שנרשם בשלב 1.2.11. עם זאת, כאשר הביומסה של הצמח משמעותית והביקוש למים עולה, יש לקחת בחשבון את הביומסה ולהתאים את נפח ההשקיה בהתאם.
   7. שיטות ניהול גידולים ספציפיות (למשל, דישון) מתבצעות בהתאם למבנה הניסוי, מאפייני הקרקע, מיני הצמחים המעובדים, והצרכים הרווחים לבקרת מחלות ומזיקים במהלך צמיחת הצמח.
   8. תקופת הגידול ודגימת השורשים תלויים בעיקר בגודל הקנים, מיני הצמחים ומטרות המחקר.

3. דגימת שורש הפרשה^12,26

הערה: כאן אנו מספקים פרטים על דגימה לא הרסנית של הפרשות שורש. ודאו שכל החומרים הנדרשים מוכנים לפני הדגימה והחלקים הניסויים כלולים במהלך הדגימה. הפרטים על החומרים והכימיקלים מופיעים בטבלת החומרים.

1. בהדרגה הביאו את תכולת המים בקריזובוקס ל-90%─95% WHC (80% לגידולים רגישים מאוד ללחץ חמצן) ביום או לפחות שעתיים לפני הדגימה. ניתן להשיג זאת במדויק על ידי חישוב כמות המים שיש להוסיף (m_{w pl}) בשלב 2.1.9 באמצעות 90%─95% WHC, ואז חישוב מחדש את המשקל הכולל של הקרח, הקרקע הרטובה והערכת משקל הצמח. באמצעות איזון, מוסיפים מים דה-יוניים עד שהקריזובוקס מגיע למשקל המחושב מחדש.
2. פתח את נייר האלומיניום מתיבת הריזובוקס, זהה ושרטט את האזור המעניין על הפלטה הקדמית. שלב זה נדרש רק אם יש לדגום רק את קטעי השורשים או הצמחים הצעירים.
3. חתכו נייר כסף מפלסטיק והידרוג'ל ZrOH (ראו שלב 1.3) למידות שנקבעו בהתאם לאזור העניין ולגודל תיבת הריזובוקס. אם ממברנת הנוקלאופור לא הותקנה במהלך תהליך המילוי, חתכו אותה למידות הרצויות, מעט גדולות יותר מההידרוג'ל של ZrOH.
4. הניחו את קופסאות הריזובוקס על מעמד שטוח עם הפלטה הקדמית הנשלפת פונה כלפי מעלה ופתחו אותן בזהירות (ראו איור 2A). הוציאו לאט את נייר הפלסטיק תוך שמירה על כך שהשורשים והאדמה אינם מופרעים.
5. מקם סרגל באזור העניין וצלם תמונות ברזולוציה גבוהה, שיידרשו לעיבוד הנתונים לאחר מכן. סרגל משמש כנקודת ייחוס לקביעת גודל מדויקת ישירות מהתמונה במהלך העיבוד, במיוחד אם יש לדגום מספר ריזובוקסים.
6. הוסף כמות קטנה של מים לשורש היעד עד ששכבת מים דקה מופיעה על פני השטח (ראו איור 2B). תכולת לחות גבוהה יותר (רצויה 90%–95% WHC או 80% לגידולים רגישים מאוד ללחץ חמצן) של הקרקע מאפשרת מגע טוב עם הקרקע עם ג'ל במהלך הדגימה. נדרשת תכולת לחות גבוהה יותר כדי שיהיה זרימה קבועה של מולקולות אל ההידרוג'ל.
7. הנח את ממברנת הגרעין החתוך מראש ישירות על פני הקרקע/אזור השורש הרלוונטי וודא שהיא מונחת שטוחה על ממשק הקרקע-שורש (ראו איור 2C).
8. הנח את ההידרוג'ל של ZrOH ישירות ובצורה שטוחה ככל האפשר על ממברנת הגרעין באזור העניין וצלם יחד עם הסרגל הממוקם בצד השמאלי של ההידרוג'ל של ZrOH (ראו איור 2D). הסרגל יכול לסייע בקביעת גודל ההידרוג'ל של ZrOH, ובמקרה של שינוי בתכונות במהלך הדגימה, את אזור הדגימה, ולזהות את הצדדים במהלך אחסון ממושך (>שנה אחת).
9. הגנו על ההידרוג'ל של ZrOH מהפלטה הקדמית על ידי הנחת נייר כסף מפלסטיק על ההידרוג'ל של ZrOH (ראו איור 2D).
10. סגור בעדינות את תיבת הריזובוקס כדי להפחית את תנועת ההידרוג'ל של ZrOH. תנועה מינימלית של ההידרוג'ל של ZrOH בעת סגירת תיבת הריזובוקס יכולה גם להתבצע על ידי חיבור סנדוויץ' הג'ל (ממברנת גרעין + הידרוג'ל ZrOH + נייר פלסטיק) לפלטה קדמית נקייה של תיבת הריזובוקס באמצעות סרט חשמלי מוויניל, כפי שתואר על ידי וגנר ואח'²⁶.
11. עטוף שוב את קופסת הריזובוקס בנייר אלומיניום והחזיר אותו לתא הצמיחה/חממה למשך 24 שעות. ניתן לאסוף הפרשות שורשים לתקופות ארוכות או קצרות יותר, בתנאי שהג'ל לא מתייבש, ובהתאם למבנה הניסוי ולמטרות המחקר.
12. לאחר תקופת היישום, פתח בעדינות את תיבת הריזובוקס, הסר בזהירות את הסרט והממברנה, ושלף את ההידרוג'ל. הנח את ההידרוג'ל בשקית סטרילית אטומה לאוויר, הוסיף כמה טיפות מים לפני הסגירה, ואז אחסן במקרר (4 מעלות צלזיוס) עד לניתוח. אחסן ג'לים ריקים בדומה לבקרה. לצורכי מיפוי דו-ממדי, הרם את ההידרוג'ל ZrOH יחד עם יריעת פלסטיק וסימן את החלק העליון.
13. הסר את השורשים וקבע את הפרמטרים המורפולוגיים של השורש, משקל טרי ומשקל יבש לנרמול נתוני הפרשה אם לא נערכו ניסויי רזולוציית זמן.
14. סגור את תיבת הריזובוקס והחזיר אותו לתא האקלים או החממה אם מתבצעים מחקרים מדויקים.

4. שחרור ומדידת קרבוקסילטים¹²

הערה: נדרשים מים טריים מדרגה I במעבדה, ותקנים אנליטיים של טוהר גבוה להכנת הריקים והתקנים. כאבטחת איכות, יש להשתמש בתקני בקרת איכות מוסמכים. ודא שהתמיסות (דגימות ותקנים) נקיות מחלקיקים על ידי סינון הדגימות דרך מסנני ניילון של 0.2 מיקרון או 0.45 מיקרון לפני הניתוח כדי למנוע סתימת צינורות. פרטים על החומרים והכימיקלים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הסר את ההידרוג'לים הטעונים והריקים של ZrOH מהמקרר, מדוד את המידות באמצעות סרגל, ואז חשב את נפח כל אחד בעובי של 0.4 מ"מ למרווח של 0.25 מ"מ ו-0.64 מ"מ למרווח 0.4 מ"מ. למיפוי דו-ממדי, חתך את ההידרוג'לים של ZrOH לגודל הרצוי באמצעות להב גילוח נקי. יש לזכור שהגבול התחתון הוא כ-2x2 מ"מ בגלל קושי בחיתוך חתיכות קטנות וטיפול בנפחי ההסרה המתאימים.
   הערה: במקום סרגל, השתמשו בנייר גרף (נייר גרף מילימטר) בצד אחד של לוח הפלקסיגלס המשמש לחיתוך, מה שמקל על חיתוך ההידרוג'לים של ZrOH לחתיכות כמעט מושלמות. עובי ההידרוגלים של ZrOH אישר שימוש בקליפר ורנייה.
2. הניחו את ההידרוג'לים של ZrOH או חלקי הידרוג'ל ZrOH בבקבוקי פלסטיק, הניחו אותם על ידי הוספת 0.5 מול ^L-1 NaOH בהתאם ליחס של 1 מ"ל נוזל ל-0.196 ס"מ³ ZrOH הידרוג'ל ונער על מנער פלטה למשך 24 שעות ב-150 סל"ד.
3. במקרה שנפח השחרור נמוך במקרה של חתיכת הידרוג'ל ZrOH קטנה מאוד (למשל 2 על 2 מ"מ), יש להוסיף מים מדרגה I במעבדה לפי משקל כדי להגיע ל-45-60 מיקרוליטר, בהתאם לנפח המינימלי הנדרש לשיטה האנליטית המשמשת לכימות קרבוקסילטים (לדוגמה, IC-MS זקוק לפחות ל-45 מיקרולטר דגימה עבור האוטוסמפלר, תלוי במכשיר). רשום את כמות המים המדויקת שנוספה כדי להביא את הנפח ל-45-60 מיקרוליטר, שכן זה יידרש לחישוב גורם הדילול והריכוז בפועל.
4. סננו את הדגימות (מסנני ניילון בגודל 0.2 מיקרון או 0.45 מיקרון) והעבירו אותן לבקבוקונים. אנו ממליצים להשתמש בבקבוקי פלסטיק IC בנפח 1.5 מ"ל, שכן ניתן להקפיא אותם מבלי להישבר. ניתן להשתמש גם בבקבוקי 330 מיקרוליטר בנפחים קטנים יותר, אך יש להקפיד שלא יהיו בועות אוויר.
5. כמת קרבוקסילטים בתמיסת ההסרה באמצעות השיטה האנליטית המועדפת (למשל, IC-MS, HPLC). אנו ממליצים להפריד אותם באמצעות IC בשילוב עם זיהוי MS. חלופה נוספת היא להשתמש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או אולטרה-בעלות (HPLC או UHPLC) בשילוב עם גלאים שונים, כולל גלאי MS מתקדמים (למשל, זמן טיסה או Orbitrap) או גלאים ספקטרופוטומטריים.
6. בסיום המדידה, ניתן לאחסן את הדגימות, יחד עם התקנים, במקפיא. אנו ממליצים לאחסן את כל התמיסות המכילות קרבוקסילטים בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך תקופה מקסימלית של שנה. לתקופות אחסון הארוכות משנה, ניתן להכין ולמדוד תקנים חדשים כבדיקת איכות.
7. חשב את הכמות הכוללת של כל קרבוקסילאט בנפח הכולל של האלואט (כלומר, נפח NaOH + נפח הידרוג'ל + מים מוספים) ונרמל לפי משקל שורש או שטח שורש וכפל בגורמי יעילות השטיפה: 0.94 לאקוניטאט, 1.00 לציטראט, 0.90 לפומרט, 1.02 ללקטט, 1.05 למלאט, 0.91 לאוקסלט ו-1.00 לסוקסינאט (ראו טבלה משלימה 1). ודא שגורמי הדילול נלקחים בחשבון אם בוצעו במהלך השחרור והמדידה.

5. מיפוי דו-ממדי

הערה: אין תוכנה ספציפית ליצירת תמונות דו-ממדיות של נתוני ההפרשה. המיפוי ניתן לבצע באמצעות Microsoft Excel ו-Python.

1. הכנס את הנתונים שהתקבלו בשלב 4.7 מכל חתיכת ג'ל לתא המתאים בתוך הרשת הדו-ממדית (שורות x עמודות). הרשת נוצרת מעל התמונות שנלקחו מהשורשים במהלך הדגימה (ראו שלב 4.1).
2. הגדר את גודל הרשתות ווודא שהנתונים תואמים.
3. בחר את סולם הצבעים וציין קודי צבע המייצגים את הערכים הנמוכים והגבוהים ביותר.
4. ציין את טווח הנתונים המספרי עבור המיתג כדי לוודא שהוא תואם במדויק את הסולם הנבחר.
5. צור מפת חום וודא שאין לה תוויות או קווי רשת. ניתן ליצור את מפת החום בקלות בתוכנת R באמצעות סקריפט R לדוגמה שמופיע בקובץ המשלים 1.
6. עבדו את התמונה ומקמו אותה בסמוך לתמונה של השורשים שהתקבלו בדגימה כדי לפרש את ההתפלגות המרחבית של הקרבוקסילאטים.
   הערה: כיום ניתן לבצע מיפוי גם באמצעות כלי בינה מלאכותית. התהליך פשוט: פשוט העתק ומדביק את הרשת המספרית מאקסל לצ'אט, ואז בקש מפת חום עם מידות חלקי הג'ל הרצויים וגודל הצבע של המיתוג. יש לזכור שהפלט לא תמיד מושלם בניסיון הראשון, אך חזרה על התהליך בדרך כלל מניבה תוצאות מדויקות. גישה זו מציעה את היתרון של מהירה בהרבה משיטות ידניות.

Results

שיטת ההידרוג'ל של ZrOH פותחה במקור לדגימת ציטראט משורשי צמחים שגדלו בקרקע ושימשה בהצלחה לפתרון התפלגות מרחבית של הפרשה¹¹. לפני שאימצו שיטה זו עבור קרבוקסילטים אחרים, אפיינו הידרוג'לים של ZrOH כדי להבטיח שהם מתאימים לשימוש עם קרבוקסילטים אחרים (ראו טבלה משלימה 1). בנוסף, פילחנו וניתחנו הידרוג'לים מאוחסנים של ZrOH מניסוי ריזובוקס שנערך ב-2019. הידרוג'לים של ZrOH יכולים לתפוס 100% מהכמות הטעונה בתוך 5 שעות (~0.2 מיקרומול, 10 מ"ל) עבור אקוניטט, ציטרט, פומראט, לקטט, מלט, אוקסלט וסוקסינט, תוך שימוש באותם פרמטרים של שחרור שנקבעו על ידי Tiziani ואח' ⁽1 מ"ל, 0.5 מול ^L-1 NaOH). הידרוג'לים של ZrOH יכולים להיקשר עד 3.29 מיקרומול-ס"^מ-2 ± 0.40 מיקרומול-2 קרבוקסילטים (ראו טבלה משלימה 1), הרבה יותר מהריכוזים (לעיתים בטווח ננומול) שנמצאים בדרך כלל בריזוספירה. יתרה מזאת, הידרוג'לים טעונים בקרבוקסילאט ZrOH נשארים יציבים וניתן לאחסן אותם מספר שבועות לפני הניתוח, ובכך למזער את הפירוק המיקרוביאלי במהלך ואחרי הדגימה.

התוצאות באיור 3 מציגות ויזואליזציה דו-ממדית של התפלגות מרחבית של פליטת ציטראט לאורך שורש אשכולות של צמח Lupinus albus L (לופין) שגדל בקרקע וגודל בקרקע חסרת P. המפה כוללת 48 מדידות בודדות שבוצעו על חתיכות ג'ל בגודל 5x2 מ"מ, אליהן חולק ג'ל ZrOH באוגוסט 2025 לאחר דגימת ציטראט באוגוסט 2019. ברור שההידרוג'לים של ZrOH ספגו ביעילות ציטראט מופרש, עם תוצאות ניתנות לכימות אפילו על ג'ל קטן (0.10^{ס"מ 2}), ללא צורך בריכוז מוקדם של האלואאט. שיעורי ההפרשה הגבוהים ביותר של ציטראט נמצאו בשורשי האשכול (עד 2.8 ננומול ס"^מ-2 ג'ל ^h-1), מה שמוביל ל-67.2 ננומול ס"^מ-2 ג'ל ביום ^הראשון, בעוד שהשיעורים הנמוכים ביותר נצפו רק בחתיכות הג'ל במגע עם הקרקע. אורך שורשי האשכול נע בין 0.2 מ"מ ל-15.6 מ"מ, עם אורך כולל של 250 מ"מ. תוצאות אלו מאשרות את התאמת ההידרוגלים לדגימת קרבוקסילאט משוחרר מהשורשים למשך 24 שעות. הידרוג'לים של ZrOH הצליחו גם להיקשר לקרבוקסילטים אחרים, כגון לקטט, פומראט, מלט ואוקסלאט, בנוסף לציטראט (טבלה 1). גילוי רוב הקרבוקסילטים מההידרוגלים של ZrOH, שנאגרו בטמפרטורה של 4°C במשך 6 שנים, מצביע על פירוק מינימלי של הקרבוקסילטים. עם זאת, ניסויים נמשכים לאיסוף מידע משמעותי נוסף על שבעת הקרבוקסילטים שנבדקו ממינים שונים של צמחים.

איור 1: שלבים קריטיים להכנת ג'ל פוליאקרילאמיד. (א) יישור מכלול לוח הזכוכית עם הזזת ~1 מ"מ. (ב) יציקת ג'ל ו-(ג) פיזור אחיד של תמיסת הג'ל בפלטת ממרכז הצלחת. (ד) הנעת פלטת הזכוכית באמצעות להב גילוח מהפינה. (ה) השריית הג'לים כדי לסייע בהפרדה מפלטת הזכוכית. (ו) שטיפת הג'ל לתוך בקבוק. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דגימת פליטת שורשים ממקטע של מערכת שורשי צמחים שגדלה בקריזובוקס באמצעות הידרוג'לים של ZrOH. (א) פתיחת ריזובוקס לאחר הסרת הפלטה הקדמית והפלסטיק. (ב) הרטבה מתאימה של ממשק הקרקע-שורש באמצעות מים דה-יוניים בבקבוק שטיפה. (ג) ממברנת עקיפת גרעין מחוברת לממשק קרקע-שורש רטוב. (ד) ריזובוקס עם הידרוג'ל ZrOH שהונח על אזור העניין, מכוסה בנייר אלומיניום מפלסטיק להגנה ג'לית מפני הפלטה הקדמית. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

איור 3: דגימת פליטת שורש באמצעות הידרוג'ל ZrOH ותמונה דו-ממדית בקנה מידה מילימטר של פליטת ציטראט. (A) תמונה של הידרוג'ל ZrOH מונח על אזור השורש הרצוי במהלך הדגימה ליצירת רשתות המשמשות למיפוי. (B) תמונה דו-ממדית בקנה מידה מילימטר המציגה את התפלגות קצב ההפרשה של ציטראט (nmol ^cm–2 ג'ל h^–1) שורש אשכול לבן מסוג Lupinus albus L. (לופין) שגדל בקרקע חסרת זרחן. כל רשת מייצגת חתיכת ג'ל בגודל 5 על 2 מ"מ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

מפעל	טיפול	אקונייט	ציטראט	פומרטה	לקטט	מלטה	אוקסלט	סוקסינאט
	קרקע mg P ק"ג-1	NMOL CM-2 H-1
לופין	50		0.02	0.21	0.15		0.06
לופין	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
לופין	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
לופין	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
רייס (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
רייס (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
רייס (נריקה4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

טבלה 1: קצב הפרשה אקוניטטי, ציטרט, פומראט, לקטט, מלט, אוקסלט וסוקסינאט של צמחי אורז שגדלו בקרקע Lupinus albus L. (לופין) ו-Oryza sativa L. (אורז) שנחשפו לקרקע ב-0, 50 ו-250 מ"ג P ^kg-1 . LOQ הוא גבול הכימות

טבלה משלימה 1: פרמטרי שטיפת NaOH (1 מ"ל, 0.5 מול ^L-1) (יעילות וגורם תיקון) וקיבולת ההידרוג'ל ZrOH לשבעה קרבוקסילטים. הנתונים הם ממוצעים ± סטיות תקן של הממוצע (n = 4 ליעילות וקיבולת של קרבוקסילטים בודדים ו-n = 40 לתערובת קרבוקסילטים). אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 1: ייצוג סכמטי של תיבת הקריזובוקס המומלצת להקלה על ההשקיה. תיבת הריזובוקס מורכבת ממסגרת ריזובוקס המצוידת בחורי השקיה במרווחים שווים בתחתית ובגב, כדי לאפשר חלוקת מים שווה במהלך ההשקיה, ולוחית קדמית שקופה וניתנת להסרה למעקב אחר צמיחת שורשים במהלך הניסוי. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: תהליך הרכבת ריזובוקס ומילוי הקרקע. (א) כסו את החורים בגב מסגרת הרייזובוקס בסרט דבק. (ב) לחבר (ממברנת גרעין), ואז נייר כסף מפלסטיק לצד הקדמי או הפתוח של מסגרת הריזובוקס (ודא שהיא הדוקה ושטוחה מספיק). (ג) הנח את הפלטה הקדמית והדק את הרייזובוקס. (ד) מלא את הקרייזובוקס תוך הטיה קדימה כך שהחלקיקים הדקים יפלו על המשטח הנשלף ולקבל משטח חלק, כפי שמופיע בתמונה. (ה) לחלופין, למלא את מסגרת ה-Rhizobox המכוסה (A) מהצד הפתוח, ליישר אותה עם הפלטה הנשלפת, ואז לכסות אותה בממברנת נוקלאופור, נייר כסף מפלסטיק ולוחית הקדמית. (ו) ההתקנה הסופית של ה-Rhizobox, הושקה ושתילה. הליך מילוי חלופי מוצגת ב-Wagner ואחרים (2020). אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: הקובץ כולל פרטים על סקריפט R ששימש ליצירת מפת חום. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

Discussion

שיטת הדגימה הקרבוקסיליאטית המתוארת כאן עושה שימוש בהידרוג'לים של ZrOH, שלגביהם הכנה וטיפול נכונים של הג'ל הם קריטיים. לטיפול בהידרוג'לים של ZrOH, אנו ממליצים לשמור עליהם לחים עם כמה טיפות מים מעבדתיים. במהלך ההכנה, חשוב ליצוק את הג'ל מיד לאחר הכנת תערובת הג'ל (שלב 1.1.3) ולוודא שלא נוצרות בועות בין לוחות הזכוכית. בועות הממוקמות במרכז ההידרוג'ל של ZrOH הן קריטיות במיוחד, שכן הן עלולות להפריע לדגימה. לעומת זאת, ניתן להסיר בועות בקצוות על ידי חיתוך הג'ל לפני היישום. בנוסף, קרבוקסילטים משורש נקשרים ל-ZrOH השוקע בהידרוג'לים, מה שמקשה על התפלגות אחידה של Zr במהלך המשקעים. התפלגות Zr לא אחידה בתוך הג'ל עלולה להוביל לדיפוזיה רוחבית של קרבוקסילטים, מה שמעוות את התפלגות המרחבית שלהם ופוגע באמינות המיקום הדו-ממדי²⁶. התפלגות אחידה של Zr יכולה להתבצע על ידי הטבלת ג'לי הפוליאקרילאמיד בתמיסת ZrOCl₂·_8H2O למשך יותר מ-2 שעות בבקבוק רחב יותר ועל ידי הנחת פחות ג'לים¹² (שלב 1.2.3). יתרה מזאת, ניתן לאמת את התפלגות ה-Zr באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM, S-3400N II, היטאצ'י, יפן) כפי שהומלץ על ידי גואן ואח' ¹⁴, שפיתחו את ההידרוג'לים של ZrOH. עם זאת, SEM אינו ישים כהליך סטנדרטי לדגימות ענקיות.

שלב קריטי נוסף נוגע למילוי ריזובוקס, יישום ממברנת הנוקלפור והשקיה לפני מריחת הג'ל לדגימת קרבוקסילאט. יש להקפיד במיוחד במילוי וטיפול בקרקעות חוליות או כבדות כדי להבטיח משטח חלק ואחיד, דבר חיוני למגע נכון עם הג'ל, תוך שמירה על תנאי ניקוז טובים. משטח חלק חיוני גם לחיבור נכון של ממברנת הגרעין. חשוב ליצור מגע טוב בין השורש להידרוג'ל ZrOH על ידי הבטחת הדבקת ממברנת הנוקלפור נכון לפני הקרקע עם מינימום בועות אוויר. לפני מריחת ג'ל ZrOH, חשוב גם לרוויה את הקרקע כראוי כדי ש-ZrOH יוכל להיות מחובר היטב, שטוח ולשמור על שלמותו במהלך הדגימה. בעת חיתוך הג'ל למיפוי קרבוקסיליאט דו-ממדי, השגת חיתוכים מדויקים במילימטר יכולה להיות מאתגרת; לכן, אנו ממליצים לא לרדת מתחת לרזולוציה של 2x2 מ"מ. בנוסף, מאחר שהג'לים מתכווצים לאחר הייבוש, חיוני לשמור עליהם לחים לאחר הדגימה כדי לשמור על שלמותם (שלב 3.12). השיטה הנוכחית הותאמה מ-Tiziani ואח' ¹² שהמליצו להשתמש ב-NaN₃ כמעכב מיקרואורגני למניעת פירוק קרבוקסילטים. בפרוטוקול זה, איננו משתמשים במעכבי מיקרוביאלים, המשמשים בדרך כלל לדגימת הפרשות שורש (NaN₃ או מיקרופור, חומר מבוסס AgCl₃)²³, בשל הפרעותיהם לשיטות האנליטיות וההשפעות האפשריות על מערכת IC-MS.

עד כה, השיטה אושרה אך ורק עבור שבעה קרבוקסילטים (אקוניטט, ציטראט, פומראט, לקטט, מלט, אוקסלט, סוקסינט), בעוד שהאקסודום השורש מורכב מתערובת מורכבת של תרכובות (למשל, פנוליקה, חומצות אמינו, פחמימות וקרבוקסילטים). תרכובות חשובות אלו אינן נלקחות בחשבון בשיטה, וגם ההידרוג'לים ZrOH לא אופיינו לדגימה שלהם. נוכחות אוקסיאניונים אחרים בקרקע (כגון פוספט, ניטראט) עשויה להשפיע על ספיגת קרבוקסילאט, קיבולת ושחרור, וכן על כימות קרבוקסילאט ב-IC או HPLC. בנוסף, דגימה של מערכות שורשים שלמות גדולות מאוד מצמחים גדולים יותר (כגון עצים או שיחים) יכולה להיות מאתגרת מאוד בשל הקושי בייצור הידרוג'לים גדולים מאוד מסוג ZrOH (>30 ס"מ). עם זאת, זו בעיה בכל טכניקות הדגימה הנוכחיות^{להפרשה 8}. מגבלה נוספת היא השימוש בריזובוקסים. למרות שגדילת הצמחים בקריזובוקס ריאליסטית הרבה יותר מאשר במערכות הידרופוניות⁸, מדובר בהגדרה מלאכותית, עם מרחב תלת-ממדי מוגבל להתפתחות שורשים³³. יתרה מזאת, הדגימה מתבצעת על משטח דו-ממדי, מה שיכול תיאורטית לגרום לאובדן קרבוקסילטים המופרשים לכיוונים אחרים שאינם במגע עם הג'לים. עם זאת, מגבלה זו יכולה להיות מתוקלה באמצעות דיפוזיה, יכולת קשירה גבוהה יותר של הידרוג'לים ZrOH עבור הקרבוקסילטים, ותכולת המים הגבוהה בקרקע הריזוספירה במהלך היישום. עם זאת, יש צורך באימות נוסף כדי לקבוע היבטים אלו.

שיטת ההידרוג'ל של ZrOH לדגימת קרבוקסילטים משוחררים מהשורשים מציעה מספר יתרונות על פני השיטות הנפוצות (כלומר, גישות היברידיות הידרופוניות קרקע והידרופוניות). גישה חדשנית זו מאפשרת דגימה בשטח של קרבוקסילטים ממערכות שורשים שגדלו בקרקע לא מופרעות, דגימה עם פתרון זמן (סנטנר, מיהלבכר ואחרים, נתונים שלא פורסמו), ומיפוי דו-ממדי בקנה מידה מילימטר. בנוסף, ניתן להשתמש בהידרוגלים של ZrOH על שורשים לפחות 24 שעות^ו-12. כמו כן, דגימה חוזרת של אותו מקטע שורש לאורך תקופות ארוכות יותר. שיטה זו מפותחת ומאופיינת הרבה יותר משיטות דומות, כמו יישום ניירות סינון⁸. דגימה לתקופה ארוכה אפשרית עם הידרוגלים של ZrOH בשל קיבולת ג'ל גבוהה לקרבוקסילטים, לדוגמה הנמוכה ביותר של 0.44 מיקרומול ס"^מ-2 ± 0.04 מיקרומול ס"מ^² ג'ל למלאט, עד הגבוה ביותר של 1.66 מיקרומול-ס"^מ-2 ± 0.10 מיקרומול ס"מ⁻² לסוקסינאט ב-pH 4.00, עם סך של 3.29 מיקרומול-ס"^מ-2 ±-0.40 מיקרומול ס"מ^² כאשר הקרבוקסילטים מעורבבים ( ראו טבלה משלימה 1). השמטת שלב שטיפת השורשים (שבדרך כלל לוקח 20–30 דקות לכל צמח) בשיטת הקרקע-הידרופוניקה מפחיתה משמעותית את הנזק למערכת השורשים ואת ההטיה הנלווה, ומביאה לנתונים ריאליים ומייצגים יותר.

ראוי לציין כי ההידרוג'לים הטעונים ב-ZrOH אינם דורשים תנאי אחסון מיוחדים, אלא רק קירור, ומצאנו עד כה ביישומים שלנו לא צורך בריכוז מוקדם לאחר השחרור. הידרוג'לים של ZrOH גם נקשרים לאניונים אחרים, שמוחלפים בתנאים דומים וניתנים לניתוח על ידי IC^14,34. דבר זה מאפשר קישור פליטת קרבוקסילטים להתפלגות המרחבית של חומרי הזנה בריזוספירה²⁹.

לסיכום, הגישה החדשנית הזו של דגימת קרבוקסילטים משורש היא צעד יסודי במחקר הריזוספירה. מכיוון שקרבוקסילטים ממלאים תפקיד מרכזי בגיוס ורכישת חומרי הזנה של צמחים (למשל, P, Fe)^35,36, וכן בגיוס מיקרואורגניזמים מועילים, שיטה זו יכולה לשמש לסינון זנים לתכונות שורש וטיפוח צמחים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אתנול	סיגמא-אלדריץ'		70%
חומצה אוקסלית	סיגמא-אלדריץ'	194131-250G	98%
חומצה טרנס-אקוניטית	סיגמא-אלדריץ'	122750-25G	98%
אוקטהידרט זירקוניום דיכלוריד אוקסיד (ZrOCl2 & 8H2O, 98%)	תרמו-סיינטיפיק	A12342.22	98%
חומצה ציטרית	סיגמא-אלדריץ'	C83155-500G	99%
נתרן ניטראט	VWR כימיקלים	מספר מגרש: 19H224150	100%
חומצה חנקתית (HNO3)	סיגמא-אלדריץ'	CAS-No: 7697-37-2	>65% לניתוח EMSURE & REG; ריג. דוקטורט אירו, ISO
חומצה פומארית	סיגמא-אלדריץ'	240745-100G	>99%
נתרן הידרוקסיד	סיגמא-אלדריץ'	S8045-500G	≥ 98%
פרסופט אמוניום (APS_(NH4)2S2O8)	תרמו-סיינטיפיק	201531000	≥ 98.0%, טהור במיוחד, לאלקטרופורזה
חומצה סוקסינית	סיגמא-אלדריץ'	S3674-100G	≥ 99%
בופר 2-(N-מורפולינו)-אתאנסולפוניק חומצה (MES)	סיגמא-אלדריץ'	M8250-250G	≥ 99.5%
כלוריד נתרן	סיגמא-אלדריץ'	71376-1KG	≥ 99.5%
קישור צולב	DGT Research Ltd (לנקסטר, בריטניה)	לא	2%, נגזרת אגרוז
שייקר פלוח או אופקי			Any
כרומטוגרפיית יונים או IC-MS	תרמו פישר סיינטיפיק	לא	כל כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או אולטרה-ביצועים (HPLC או UHPLC) יכולה לשמש בשילוב עם גלאים שונים, כולל גלאים מתקדמים של MS (למשל, זמן טיסה או Orbitrap) או גלאים ספקטרופוטומטריים
מד pH			ניתן להשתמש בכל אלקטרודה pH מעבדתית
תנור	קלסר	לא	אפשר להשתמש בכל תנור קטן ששומר על טמפרטורה מסוימת, עדיף תנור קטן יותר.
ניילון filters_13 מ"מ 0.45 ומיקרו; M	טכנולוגיית סינון GVS	מספר מגרש: 7135431	ניתן גם להשתמש במסנני ניילון גדולים יותר, אך מעדיפים קטנים יותר כי נפח הנוזל קטן.
סולפט סידן דיהידראט	סיגמא-אלדריץ'	C3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4	ניתן גם להשתמש ב-CaSO4.
תמיסת אקרילאמיד, 40%	G-Biosciences	786-508	אל תשתמש בתמיסת אקרילמיד שמעורבבת עם  ביס-אקרילאמיד. תרכובת רעילה שצריך לטפל בה בזהירות באד.
ריזובוקס	https://www.rhizosphere.com/	לא	הקישוטים שלנו מיוצרים בהתאמה אישית על פי עיצוב Rhizosphere.com
ערכת בקבוקון פוליפרופילן, 1.5 מ"ל	תרמו-סיינטיפיק	79812	בקבוקי IC מפלסטיק מועדפים כי אפשר להקפיא אותם מבלי להישבר. 330 ומיקרו; ניתן גם להשתמש ב-L אך יש להיזהר שלא תהיה בועת אוויר
חומצה ציס-אקוניטית	תרמו-סיינטיפיק	A16010.06	טכנולוגיה. 85%
N,N',N',N'- טטרמתילתילנדיאמין (טממדי)	סיגמא-אלדריץ'	מגרש מס' BCBN1173V	תרכובת רעילה שצריך לטפל בה בזהירות
בקבוקי PP בנפח 250 מ"ל	סארסטדט	מגרש מס' 2406082
נייר אלומיניום	סופרמרקט מקומי	לא
Beakers_1 L/ 2 L
מהדקים	מחסן מקומי	לא
לוח זכוכית (6.1 x 17 x 0.4 ס"מ)	מחסן מקומי	לא
L-(-)-חומצה מלית	סיגמא-אלדריץ'	M6413-25G
תקן לקטט ל-IC	סיגמא-אלדריץ'	07096-100ML
ספסל זרימה למינרי
חומצה L-לקטית אנהידרית	תרמו-סיינטיפיק	L13242.14
Nuclepore Track-etch Membrane_0.2 ומיקרו; m	ציטיבה	מגרש מס' A29983896
נייר כסף/שקיות פלסטיק	מחסן מקומי	לא
פינצטה מפלסטיק	סמדני	602
לוח פלקסיגלס	מחסן מקומי	לא
בקבוקי PP 30 מ"ל	ספא אפטקה	מגרש מס': 250552
PTFE spacer_0.25/0.4 מ"מ	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
להבי גילוח	מחסן מקומי	לא
שליט	חנות ספרים מקומית	לא
נתרן היפוכלוריט (NaClO)	CARLO ERBA ריאג'נטים	CAS-No: 7681-52-9
Syringes_1 מ"ל	הנקה סאס וולף (הנקה-ג'ט)	מספר מגרש: 22A17C8
סרט חשמלי ויניל	מחסן מקומי	לא