טיהור וזיהוי חלבון אנטימיקרוביאלי מהאצה הירוקה Tetraspora Sp. CU2551

Tanaporn Klinsanit; Yothawut Tonawut; Natwikar Laokua; Rawirat Pansomsuay; Wanthanee Khetkorn; Cherdsak Maneeruttanarungroj

doi:10.3791/70066

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיהור וזיהוי חלבון אנטימיקרוביאלי מהאצה הירוקה Tetraspora Sp. CU2551

329 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70066

⸱

17 בפברואר 2026

Tanaporn Klinsanit¹ , Yothawut Tonawut¹ , Natwikar Laokua¹ , Rawirat Pansomsuay¹ , Wanthanee Khetkorn² , Cherdsak Maneeruttanarungroj¹^,³

¹Department of Biology, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang, ²Division of Biology, Faculty of Science and Technology, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, ³Bioenergy Research Unit, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה לחקר חלבונים אנטי-מיקרוביאליים שלמים באמצעות טכניקות רבות, כולל אופטימיזציה של מאגרי חילוץ חלבונים, הפרעת תאי אצות, שבירת חלבונים באמצעות כרומטוגרפיית חילוף יונים, הפרדת חלבונים באמצעות SDS-PAGE, ובדיקות פעילות אנטימיקרוביאלית. החלבון הפעיל אושר וזוהה לאחר מכן באמצעות ניתוח LC-MS/MALDI-TOF.

תקציר

עמידות אנטימיקרוביאלית (AMR) היא איום בריאותי עולמי הולך וגובר, המחייב גילוי של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים. חלבונים ופפטידים שמקורם באצות זכו לתשומת לב הולכת וגוברת בזכות הפוטנציאל הביואקטיבי שלהם; עם זאת, פרוטוקולים סטנדרטיים לחקר פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) באצות ירוקות, במיוחד Tetraspora sp. CU2551, נותרו מוגבלים. פרוטוקול זה מתאר תהליך שלב אחר שלב לבידוד, טיהור ואפיון חלבונים אנטי-מיקרוביאליים שלמים מאצה ירוקה Tetraspora sp. CU2551. ההליך משלב הפקת חלבונים אופטימלית, חלוקה כרומטוגרפית, הפרדה אלקטרופורטית, סקר פעילות אנטימיקרוביאלית וזיהוי חלבונים. תנאי חילוץ חלבונים מותאמים תחילה כדי להפחית השפעות עיכוב רקע שמקורן ברכיבי בופר. כאשר זהות הפפטיד הפעיל אינה ידועה, מבצע מבחן משיכה למטה להערכת קישור חלבונים בין שרפי חילוף יונים שונים ולהנחות את בחירת מטריצת טיהור מתאימה. כרומטוגרפיית חילופי יונים DEAE-Sepharose היא שיטה מתאימה להעשיר חלקי חלבון אנטימיקרוביאליים. כל החלקים מוערכים באופן שיטתי לפעילות אנטימיקרוביאלית ומנותחים על ידי SDS-PAGE. רצועת החלבון המתאימה לפעילות האנטימיקרוביאלית הגבוהה ביותר, יחד עם פרופיל אלקטרופורטי מובחן, מוסרת ומועברת לניתוח LC-MS/MALDI-TOF לזיהוי חלבונים. זרימת העבודה משלמת עוד יותר על ידי ניתוחים ב-in silico לחיזוי תכונות הקשורות לפפטידים אנטימיקרוביאליים באמצעות כלים ביואינפורמטיים זמינים לציבור. פרוטוקול זה מספק מסגרת גמישה לגילוי חלבונים אנטי-מיקרוביאליים וניתן להתאים אותו בקלות למיני אצות אחרים וליישומים ביוטכנולוגיים קשורים.

מבוא

עמידות אנטימיקרוביאלית (AMR) מייצגת אתגר בריאותי עולמי^הולך וגדל 1, ומדגישה את חשיבות האסטרטגיות המתמשכות לזיהוי סוכנים אנטימיקרוביאליים חדשים ממקורות טבעיים. למרות שיש מחקר גובר על התכונות האנטימיקרוביאליות של חלבונים ופפטידים שמקורם באצות ^2,3. רוב המחקרים מתמקדים בגישות מבוססות פפטיד או הידרוליזאט⁴, ושיטות סטנדרטיות לשימור והערכת פעילות חלבוני אצות שלמות נשארות מוגבלות⁵. מאמר זה מתאר שיטה שמטרתה לבודד, לטהר ולהעריך חלבונים שלמים מהאצה הירוקה Tetraspora sp. CU2551 לפעילות אנטימיקרוביאלית.

הפרוטוקול מתאר תהליך שלב אחר שלב הכולל הפקת חלבונים שלמים, פירוק באמצעות כרומטוגרפיית חילוף יונים, הערכת תכונות אנטיבקטריאליות, הפרדת חלבונים מבוססת ג'ל, זיהוי חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסה, וחיזוי פפטידים אנטי-מיקרוביאליים באמצעות טכניקות סילקו. יעילות החומרים האנטיבקטריאליים מוערכת באמצעות בדיקות סטנדרטיות של דיפוזיה אגר ועיכוב גדילה נוזלית על זנים טיפוסיים של גרם-חיובי וגרם-שלילי ^4,6. גישה זו מאפשרת קישור של פעילות אנטימיקרוביאלית מזוהה לשברים מסוימים של חלבונים או רצועות אלקטרופורטיות, במקום להסתמך רק על תערובות פפטידים מעוכלות או רק על תחזיות חישוביות שעשויות להיכשל בזיהוי חלבונים אנטימיקרוביאליים או רצפים דמויי AMP מחוץ להגדרות קנוניות של מסדי נתונים ^7,8.

הקפדה על פרוטוקול זה מאפשרת לקוראים לקבל באופן אמין חלקי חלבון ביואקטיביים המכילים רצפי חלבון אנטימיקרוביאליים פוטנציאליים, המתאימים לאימות עתידי והערכה פונקציונלית. ממצאים מייצגים מצביעים על זיהוי חלקים ביואקטיביים המכילים מועמדים לחלבון ידוע ובלתי ידוע. פרוטוקול זה מספק מסגרת מעשית ורסטילית לזיהוי חומרים אנטי-מיקרוביאליים מחלבונים שלמים המופקים מאצות ומקורות ביולוגיים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים, בעלי חיים או נבדקים עם חולייתיות. כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לבטיחות ביולוגית ואתיקה מחקרית של בית הספר למדעים, מכון הטכנולוגיה של קינג מונגקוט לאדקרבאנג (KMITL), תאילנד. כל הניסויים המיקרוביאליים בוצעו בתנאי מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) בהתאם לארגון הבריאות העולמי ולתקן הלאומי לבטיחות ביולוגית⁹.

יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל מעילי מעבדה, כפפות ומסכות פנים, במהלך כל ההליכים הניסיוניים. לאסוף ולהיפטר מפסולת כימית וכסף בהתאם להנחיות ניהול פסולת מסוכנת מוסדית לפני שליחתן לחברת ניהול פסולת מורשית.

הכינו תמיסות מרוכזות של כימיקלים מסוכנים, כולל נתרן דודציל סולפט, β-מרקפטואנול ותגובות צביעת כסף המכילים פורמלדהיד, בתוך מכסה אדים כימיים. לבצע ניסויים בריכוזי עבודה נמוכים ונפחים קטנים על שולחן המעבדה בהתאם לנהלי בטיחות סטנדרטיים במעבדה.

1. תרבות האצות

הערה: שמרו על תנאים אספטיים לאורך כל גידול האצות.

הכנת תרבות התחלתית
1. הכינו TAP מדיום סטרילי (pH 7.0)¹⁰ וזרקו 150 מ"ל לבקבוקי ארלנמאייר סטריליים בנפח 500 מ"ל.
2. החסן את המדיום בתרבות אינוקולום לילה של 1% (v/v) של Tetraspora sp. CU2551 בטכניקת אספטיקה בארון ביוסייטי Class I.
3. דגרו את התרביות באינקובטור ניעור מצויד באור בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס, 120 סל"ד, ו-45.9 מיקרון/מ^{' 2}/ש' למשך 48 שעות. השתמשו בתרבות הבוגרת כהתחלה לתרבות ההרחבה.
תרבית בקנה מידה גדול וקטיף תאים
1. העבר 25 מ"ל תרבית סטארטר ל-275 מ"ל של מדיום TAP טרי וסטרילי. דגרו את התרביות באותם תנאים במשך 48 שעות.
2. קציר את תאי האצות בצנטריפוגה ב-3,800 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
3. שטפו את כדורי התאים פעם אחת עם מים מזוקקים סטריליים ובצנטריפוגה שוב ב-3,800 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
4. הסר את הסופרנטנט לחלוטין ואחסן את כדורי התא האצות בטמפרטורה של −20°C עד לעיבוד נוסף.

2. ניסוח בופר ליזיס וסקר עיכוב רקע

זהירות: לטפל ב-SDS וב-β-מרקפטואנול עם כפפות גומי או ניטריל. פתח את בקבוק β-מרקפטואנול המרוכז בתוך מכסה אדים כימי.

הכנת בופר ליזיס
1. הכן את בופר הליזה¹¹ המורכב מ-10 מ"מ טריס-HCl (pH 9.0) בתוספת 0.1% w/v SDS ו-38 מ"מ β-מרקפטואנול.
  הערה: שלב קריטי: אופטימיזציה של ריכוזי SDS ו-β-מרקפטואנול כדי למנוע פעילות אנטימיקרוביאלית חיובית שגויה.
2. הכינו סטים פקטוריאליים מלאים של בופר ליזיס על ידי שינוי נתרן דודציל סולפט (SDS) (0, 0.01, 0.05, או 0.1% w/v) ו-β-מרקפטואנול (0, 0.5, 1, או 2 mM), ויצירת 16 נוסחאות.
  הערה: ההרכבים של כל נוסחאות בופר הליזה שנבדקו מסוכמות בטבלה 1. הוסף β-מרקפטואנול מיד לפני השימוש.
סקר רקע אנטימיקרוביאלי
1. השתמש במחור נייר להכנת דיסקים בקוטר 6 מ"מ מנייר מס' 42 Whatman. מרחו 5 מיקרוליטר מכל נוסחת בופר ליזיס על דיסק הנייר ומבצעים בדיקות דיפוזיה לפי הנחיות CLSI⁶. דגרו את לוחות הבדיקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות והערכו את אזורי העיכוב.
  1. ניסוחי בדיקה נגד Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074, ו-Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370.
2. בחרו את הנוסחה שאינה מראה פעילות מעכבת להפקת חלבון לאחר מכן.

3. הפקת חלבון

הערה: שמור על דגימות בטמפרטורה נמוכה במהלך סוניקציה וצנטריפוגה.

הפשרה של כדורי אצות קפואות (מהשלב 1.2.5) ב-37°C והקפאה מחדש ב-−20°C. חזרו על מחזורי הקפאה-הפשרה (-20°C / 37°C) 3 פעמים.
הוסיפו בופר פירוק אופטימלי (10 מ"מ טריס-HCl, pH 9.0, 0.01% SDS, 2 מ"מ β-מרקפטואנול) לנפח סופי של 5 מ"ל והשאירו דגימות על קרח לאורך כל העיבוד המאוחר. לשבש את התאים על ידי סוניקציה של פרוב (25 קילוהרץ, 500 וואט, 40% עוצמה, 1 שנייה הפעלה/כיבוי, 5 דקות).
הוסיפו קוקטייל מעכב פרוטאז לפי הוראות היצרן וערבבו בעדינות.
צנטריפוגות מתלוזות ב-3,800 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואוספות את הסופרנטנט כתמצית חלבון גולמית.
להבהיר את התמציות באמצעות צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אספו ואחסנו את הסופרנטנטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

4. הערכת פעילות אנטימיקרוביאלית

בדיקות דיפוזיה בדיסק
1. תרבית חיידקים פתוגניים (Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074, ו-Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370) על אגר תזונתי בטמפרטורה של 37°C למשך 16-18 שעות.
2. באמצעות לולאת אלומיניום סטרילית, גרדו את המושבות ממשטחי האגר ותשאו מחדש ב-0.9% (עם v) NaCl. כוון את תליית החיידקים לסטנדרט של 0.5 מקפרלנד ומרח באופן שווה על לוחות אגר מולר-הינטון.
3. הנח דיסקי נייר סטריליים על משטחי אגר מחוסנים ומרח 5 מיקרו ליטר של דגימות בדיקה. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות ומדדו אזורי עיכוב באמצעות קליפר ורנייה.
  הערה: שמור על ריווח שווה בין כל הדיסקים.
קביעת MIC ו-MBC
1. הכינו תסלים חיידקיים ב-2 × 10⁶ CFU/מ"ל ב-4x מרק מולר-הינטון.
2. פיפט 50 מיקרוליטר של תלסיסים חיידקיים ו-100 מיקרוליטר מדגימות חלבון מדוללות סדרתית לפלטות של 96 בארות ומכוון את כל הבארות לנפח סופי של 200 מיקרוליטר באמצעות בופר Tris-HCl של 10 מילימטר (pH 7.5).
3. השתמש ב-5 מיקרוליטר סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם) כבקרה חיובית. השתמשו ב-10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ו-0.9% (ללא v) NaCl כאמצעי ביקורת שליליים.
4. דגרו לוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות וקבעו את MIC כרכוז הנמוך ביותר ללא גידול חיידקים נראים לעין.
5. לוחית לוחית מבארות שקופות לאגר מולר-הינטון כדי לקבוע את MBC.
קביעת עקומת גדילה של חיידקים
1. הכינו תסלים חיידקיים ב-1 × 10⁶ CFU/mL במרק מולר-הינטון כפול.
2. דגרו 100 מיקרוליטר של תרבית חיידקים עם 100 מיקרוליטר דגימות חלבון בצלחת עם 96 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות.
3. השתמש ב-5 מיקרוליטר סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם) כבקרה חיובית. השתמש במים מזוקקים סטריליים, 10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), ו-500 מ"מ NaCl ב-10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5) כבקרה.
4. מדדו OD₆₀₀ כל 30 דקות באמצעות קורא מיקרופלט עם רעידות אורביטליות לסירוגין (2 דקות לפני המדידה).
5. חשב עקומות צמיחה וקצבי צמיחה ספציפיים.
  הערה: ריכוזי חלבון גבוהים עלולים להפריע למדידות צפיפות אופטית.

5. מבחן משיכה וטיהור חלבונים

בדיקת משיכה למטה
1. שרף DEAE-Sepharose מאוזן עם בופר Tris-HCl של 10 mM (pH 8.0) או שרף CM-Sepharose עם בופר פוספט 10 mM (pH 7.0).
2. מערבבים 100 מיקרוליטר שרף מאוזן עם 500 מיקרוליטר של תמצית חלבון גולמית, ואז מוסיפים 100 מיקרוליטר מבופר האיזון המתאים (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 ל-DEAE; 10 מ"מ בופר פוספט, pH 7.0 ל-CM). דגור עם היפוך עדין (10 היפוכים).
3. צנטריפוגה לזמן קצר, איסוף הסופרנטנט, והעריך פעילות אנטימיקרוביאלית באמצעות בדיקת דיפוזיה דיסקית.
4. בחר את שרף העבודה (DEAE-Sepharose). לאופטימיזציית pH, יש לאזן שרף עם 10 mM Tris-HCl ב-pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 או 9.0 ולבצע את השלבים 5.1.1-5.1.3.
5. בחר את תנאי ה-pH המראה פעילות אנטימיקרוביאלית לכרומטוגרפיית חילוף יונים.
טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה בחילוף יונים
1. ארוז שרף DEAE-Sepharose בעמודת כרומטוגרפיה זכוכית (נפח מיטה של 16 מ"ל) ומאוזן עם בופר Tris-HCl של 10 מ"מ (pH 7.5) בטמפרטורה של 25 °C למשך נפחי 10 עמודות.
2. טעין 15 מ"ל של תמצית חלבון גולמי (סעיף 3.6) בקצב זרימה של 8 מ"ל לדקה.
3. שטוף את העמודה עם בופר שיווי משקל עד שהספיגה ב-280 ננומטר יורדת מתחת ל-0.05.
4. חלבונים קשורים לאלוט באמצעות גרדיאנט NaCl ליניארי של 0-500 מ"מ ב-10 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5) מעל 500 מ"ל במהירות 8 מ"ל/דקה.
5. אסוף שברים של 5 מ"ל, מנטר את הספיגה ב-280 ו-220 ננומטר, ושמור את השברים על הקרח. אחסן את החלקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לסקר אנטימיקרוביאלי וניתוח חלבונים.

6. SDS-PAGE וצביעת כסף

הערה: הכינו תמיסות צבע כסף בתוך מכסה אדים כימי ולבשו ציוד מגן אישי מתאים. הכינו את כל הפתרונות טריים.

הפרדו חלקי חלבון באמצעות 12% SDS-PAGE¹² והמחישו רצועות על ידי צביעת כסף¹³.
הוצא רצועות חלבון יעד והגיש דגימות לניתוח MS של MALDI-TOF.
זהה חלבונים באמצעות חיפוש במסד נתונים מול NCBInr.

7. חיזוי פפטידים אנטימיקרוביאליים

לשלוף רצפי חלבון מועמדים מניתוח NCBInr.
העריכו פוטנציאל אנטימיקרוביאלי באמצעות כלי חיזוי AMP זמינים לציבור (כגון DBAASP, APD3, AMPScanner, CAMPR4) ומאגרי נתונים.
תוצרי חיזוי תמצית, כולל ציוני הסתברות אנטימיקרוביאלית, סיווג חזוי ותכונות פיזיקוכימיות (מטען נטו, תכולת שאריות הידרופובית, מדד GRAVY [ExPASy ProtParam], ואמפיפתיות).
שילוב תוצאות חישוביות בין פלטפורמות שונות כדי לתת עדיפות לחלבונים אנטי-מיקרוביאליים מועמדים לאימות בהמשך.
הערה: בסיליקו תחזיות תומכות בבחירת מועמדים ואינן מהוות סיווג סופי של פפטידים אנטימיקרוביאליים.

8. בדיקות סטטיסטיות

בצע את כל הניסויים בשלושה מעבדות ביולוגיות. נתחו נתונים באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריהם בדיקת טווח מרובה של דאנקן או ניתוחים פוסט-הוק מתאימים ברמת ביטחון של 95%.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תהליך העבודה המבוסס על חלבון שלם שפותח, ששילב חילוץ חלבון אופטימלי, שבירת חילופי יונים, סקר אנטימיקרוביאלי וזיהוי חלבונים, אפשר בהצלחה גילוי חלקי חלבון ביואקטיביים מ-Tetraspora sp. CU2551. פרוטוקול זה נועד למזער ארטיפקטים רקעיים תוך שמירה על שלמות החלבון הטבעית, ומאפשר לפעילות אנטי-מיקרוביאלית להיות קשורה ישירות לשברים כרומטוגרפיים מוגדרים ולרצועות אלקטרופורטיות.

אופטימיזציה של מאגר הליסיס הייתה קריטית להשגת תוצאות ניתנות לפרשנות. הבופר המקורי הציג פע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי לקבל קריאות אנטימיקרוביאליות אמינות באמצעות פרוטוקול זה, יש לשלוט בכמה שלבים קריטיים בקפידה, במיוחד במהלך חילוץ חלבונים וסקר ביואקטיביות מוקדם. אופטימיזציה של בופר הליזה היא חיונית, שכן עיכוב רקע מרכיבי בופר הוא מקור נפוץ לתוצאות חיוביות שגויות בסריקת חלבונים אנטימיקרוביאליים. הפעילות האנטימיקרוביאלית שנצפתה בנוסחת הבופר^{המקורית 11} מדגישה בעיה זו, בהתחשב בכך ש-SDS עלול לשבש את ממברנות החיידקים על ידי החדרה לשתי שכבות הפוספוליפידים¹⁴, בעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מבית הספר למדעים, מכון הטכנולוגיה של המלך מונגקוט בלדקרבאנג, שניתנו ל-C. Maneeruttanarungroj (RA/TA-2566-M-013) וממכון המלך מונגקוט לטכנולוגיה בלדקרבאנג, שניתנו לי. טונאוט (KREF016329). ניתוח ספקטרומטרי מסה בוצע על ידי יחידת שירות הפרוטאומיקה, הפקולטה לטכנולוגיה רפואית, אוניברסיטת מהידול, תאילנד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד	מעבדות ביו-ראד	1610156	להכנת ג'ל SDS-PAGE קטגוריה: כימי
מנורת אלכוהול / מבער בונזן	מגוון	—	לטכניקת אספטיה קטגוריה: כלי נגינה
AMPScanner	אוניברסיטת ג'ורג' מייסון (ולטרי ואחרים)	—	כלי חיזוי AMP מבוסס למידה עמוקה קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
כלי חיזוי פפטידים אנטימיקרוביאליים (DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4)	מקורות אקדמיים שונים	—	בניתוח AMP סיליקו קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
APD3	מעבדת וואנג, אוניברסיטת נברסקה	—	מאגר נתונים של פפטידים אנטימיקרוביאליים קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
אוטוקלאב	טומי	—	עיקור מדיה וחומרים קטגוריה: כלי
ארון בטיחות ביולוגית Class I/II	מגוון	—	טיפול אספטי קטגוריה: כלי נגינה
BioTool 2.0	ברוקר דלטוניקס	—	כלי להמחשת ספקטרום ופפטידים של טרשת נפוצה קטגוריה: תוכנה
ברדפורד ריאג'נט	מרק	B6916	כימות חלבון קטגוריה: כימי
CAMPR4	המכון ההודי לטכנולוגיה בומביי	—	אוסף פפטידים אנטימיקרוביאליים קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
צנטריפוגה, אפנדורף 5415R מיקרוצנטריפוגה מקוררת	אפנדורף	—	מיקרוצנטריפוגה קטגוריה: כלי
צנטריפוגה, Thermo Scientific Megafuge 8R	תרמו פישר סיינטיפיק	—	צנטריפוגציה בנפח גדול קטגוריה: כלי
עמוד כרומטוגרפיה (זכוכית)	מגוון	—	כרומטוגרפיית חילוף יונים קטגוריה: כלי זכוכית
שרף CM-Sepharose	מרק	CEF100	שרף חילוף קטיוני קטגוריה: כימי (שרף)
מטלית כותנה	מגוון	—	חיסון חיידקים קטגוריה: כלי פלסטיק
קובאט, קוורץ	אנליטיקס הלמה	—	ספקטרופוטומטריית UV קטגוריה: כלי זכוכית
DBAASP	המכון לכימיה ביואורגנית (רוסיה)	—	מאגר פעילות אנטי-מיקרוביאלית ומבני פפטידים קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
שרף DEAE-Sepharose	מרק	DEFF100	שרף חילוף אניונות קטגוריה: כימי (שרף)
בקבוק ארלנמאייר, 100 מ"ל	מגוון	—	גידול אצות קטגוריה: כלי זכוכית
בקבוק ארלנמאייר, 500 מ"ל	מגוון	—	גידול אצות קטגוריה: כלי זכוכית
אשריכיה קולי TISTR 074	טיסטר, תאילנד	—	מיקרואורגניזם בדיקה קטגוריה: חומר ביולוגי
ExPASy ProtParam	המכון השווייצרי לביואינפורמטיקה	—	כלי מקוון לחישוב תכונות פיזיקוכימיות של חלבונים קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
פורמלדהיד	מרק	1.04002	צביעת כסף קטגוריה: כימי
מקפיא (-20 & דרג; C)	מגוון	—	אחסון דגימות קטגוריה: כלי נגינה
מערכת אלקטרופורזה ג'ל (Mini-PROTEAN Tetra)	מעבדות ביו-ראד	—	SDS-PAGE קטגוריה: כלי נגינה
צינור בדיקה מזכוכית (16 & 150 מ"מ)	פיירקס / דוראן	—	טיפול לדוגמה קטגוריה: כלי זכוכית
כפפות, ניטריל	מגוון	—	הגנה אישית קטגוריה: כלי פלסטיק
קוקטייל מעכב פרוטאז Halt (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק	87786	עיכוב פרוטאז קטגוריה: כימי
חממה	מגוון	—	תרבית חיידקים קטגוריה: כלי
רעידת חממה	מגוון	—	תרבות אצות קטגוריה: כלי
לולאת החיסון	כל ספק מעבדה	—	העברה מיקרוביאלית קטגוריה: צרכן
KCl	מרק	P5405	הכנת בופר קטגוריה: כימיקלים
ספקטרומטר מסה MALDI-TOF (רפלקס IV)	ברוקר דלטוניקס	—	זיהוי חלבון קטגוריה: כלי
מסקוט	מדעי המטריקס	—	מנוע חיפוש לזיהוי חלבונים באמצעות MS data קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
מסקוט 2.2	מדעי המטריקס	—	זיהוי חלבונים קטגוריה: תוכנה
גליל מדידה	פיירקס	—	מדידת נפח קטגוריה: כלי זכוכית
צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)	-	—	עיבוד דגימות קטגוריה: כלי פלסטיק
צינור מיקרוצנטריפוגה (2.0 מ"ל)	-	—	עיבוד דגימות קטגוריה: כלי פלסטיק
מיקרופיפטה (100– 1000 ומיקרו; L)	-	—	טיפול נוזלי קטגוריה: כלי נגינה
מיקרופיפטה (1– 10 ומיקרו; L)	-	—	טיפול נוזלי קטגוריה: כלי נגינה
מיקרופיפטה (1– 5 ומיקרו; L)	-	—	טיפול נוזלי קטגוריה: כלי נגינה
מיקרופיפטה (1– 5 מ"ל)	-	—	טיפול נוזלי קטגוריה: כלי נגינה
מיקרופיפטה (20&ndeck; 200 ומיקרו; L)	-	—	טיפול נוזלי קטגוריה: כלי נגינה
קורא מיקרופלט	BioTek	—	מדידת OD600 קטגוריה: מכשיר
Mueller– אגר/מרק הינטון	מגוון	—	בדיקות אנטימיקרוביאליות קטגוריה: בינוני
ספקטרופוטומטר ננודרופ / ביודרופ	מגוון	—	מדידת חלבון קטגוריה: מכשיר
מסד הנתונים של NCBInr	המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי	—	מסד נתונים חלבונים לא מיותר קטגוריה: תוכנה / מסד נתונים
אגר מזין	-	—	תרבית חיידקים קטגוריה: מדיום
דיסק נייר (6 מ"מ)	ווטמן מס' 42	—	בדיקת דיפוזיה בדיסק קטגוריה: כלי פלסטיק
פטרי דיש	מגוון	—	תרבית מיקרוביאלית קטגוריה: כלי פלסטיק
מד pH	מטלר טולדו	—	התאמת pH קטגוריה: כלי נגינה
בופר פוספט (10 מ"מ, pH 7.0)	-	—	בופר כרומטוגרפיה קטגוריה: בופר
Probe Sonicator (VCX500)	סוניקס & Materials Inc.	—	הפרעת תאים 500 וואט, 20 קילוהרץ, עם probe קטגוריה: מכשיר
מקרר (4 מעלות; C)	מגוון	—	אחסון דגימות קטגוריה: כלי נגינה
ניטראט כסף	מעבדות המחקר סיסקו	94118	צביעת כסף קטגוריה: כימי
נתרן כלוריד (NaCl)	מרק	S9888	בופר השטוי קטגוריה: כימי
סודיום דודסיל סולפט (SDS)	מעבדות ביו-ראד	11667289001	ליסיס ו-PAGE קטגוריה: כימי
ספקטרופוטומטר	שימאדזו	—	מדידת ספיגה קטגוריה: מכשיר
צנטריפוגה ספין-דאון	אפנדורף	—	צנטריפוגציה מהירה קטגוריה: כלי נגינה
סטפילוקוקוס אוראוס TISTR 746	טיסטר, תאילנד	—	מיקרואורגניזם בדיקה קטגוריה: חומר ביולוגי
סטרפטומיצין	מרק	S9137-25G	ביקורת חיובית קטגוריה: כימי
טטרספורה sp. CU2551	אוסף התרבות של KMITL	—	זן אצות קטגוריה: חומר ביולוגי
טריס אצטט פוספט (TAP) מדיום	-	—	תרבות אצות קטגוריה: בינוני
טריס-HCl	מרק	—	הכנת בופר קטגוריה: Buffer
קליפר ורנייה	מגוון	—	מדידת אזור קטגוריה: מכשיר
אמבט מים	מגוון	—	בקרת טמפרטורה קטגוריה: כלי
XMASS	ברוקר דלטוניקס	—	תוכנת ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF קטגוריה: תוכנה
α-ציאנו-4-חומצה הידרוקסיצינמית (CHCA)	ברוקר דלטוניקס	—	MALDI matrix קטגוריה: כימי

מקורות

Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
Vasquez-Moscoso, C. A., Merlano, J. A. R., Olivera Gálvez, A., Volcan Almeida, D. Antimicrobial peptides (AMPs) from microalgae as an alternative to conventional antibiotics in aquaculture. Prep Biochem Biotechnol. 55 (1), 26-35 (2025).
Mekhalfi, M., Berteina-Raboin, S. Microalgae, cell factories for antimicrobial peptides: a promising response to antibiotic resistance. Antibiotics. 14 (10), 959(2025).
Singh, L. A., et al. Microalgae-derived antioxidants and antimicrobials: a sustainable approach for natural food preservatives. Front Sustain Food Syst. 9, 1669731(2025).
Wang, X., Ma, S., Kong, F. Microalgae biotechnology: methods and applications. Bioengineering. 11 (10), 965(2024).
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI supplement M100. , 35th ed, Standards Institute Clinical and Laboratory. (2025).
Sun, S. Progress in the identification and design of novel antimicrobial peptides against pathogenic microorganisms. Probiotics Antimicrob Proteins. 17 (2), 918-936 (2025).
Yang, R., et al. Advances in antimicrobial peptides: from mechanistic insights to chemical modifications. Biotechnol Adv. 81, 108570(2025).
Laboratorybiosafety manual. , 4th ed, World Health Organization. (2020).
Bolton, J. Algal culturing techniques. J Exp Mar Biol Ecol. 336, 262-262 (2006).
Tonawut, Y., et al. In silico encrypted peptide from green alga Tetraspora sp. CU2551 showed high antimicrobial activities. Algal Res. 78, 103382(2024).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Oakley, B. R., Kirsch, D. R., Morris, N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 105 (1), 361-363 (1980).
Zhu, Q., et al. Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) on microbial community structure and function in lake-terrestrial ecotones: a simulation experiment. Environ Technol Innov. 34, 103594(2024).
Mattern, K. L., Evans, C. A., Lara, J. C. Selective antibacterial action of 2-mercaptoethanol on propionibacteria in skin cultures. Appl Environ Microbiol. 37 (1), 177-179 (1979).
Click, R. E. Review: 2-mercaptoethanol alteration of in vitro immune functions of species other than murine. J Immunol Methods. 402 (1-2), 1-8 (2014).
Ishak, A., Mazonakis, N., Spernovasilis, N., Akinosoglou, K., Tsioutis, C. Bactericidal versus bacteriostatic antibacterials: clinical significance, differences and synergistic potential in clinical practice. J Antimicrob Chemother. 80 (1), 1-17 (2025).
Vaisbourd, E., et al. Principles of bacteriostatic and bactericidal antibiotics at subinhibitory concentrations. mBio. 16 (11), e0206625(2025).
Marciano, C. L., et al. A comprehensive overview of antimicrobial peptides: broad-spectrum activity, computational approaches, and applications. Antibiotics. 14 (11), 1115(2025).
Lu, Z., et al. Studies on the antibacterial activity of the antimicrobial peptide Mastoparan X against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1552872(2025).
Keeratikunakorn, K., Aunpad, R., Ngamwongsatit, N., Kaeoket, K. The effect of antimicrobial peptide (PA-13) on Escherichia coli carrying antibiotic-resistant genes isolated from boar semen. Antibiotics. 13 (2), 138(2024).
Maneeruttanarungroj, C., Lindblad, P., Incharoensakdi, A. A newly isolated green alga, Tetraspora sp. CU2551, from Thailand with efficient hydrogen production. Int J Hydrogen Energy. 35, 13193-13199 (2010).
Brizuela, C. A., Liu, G., Stokes, J. M., de la Fuente-Nunez, C. AI methods for antimicrobial peptides: progress and challenges. Microb Biotechnol. 18 (1), e70072(2025).
Maccari, G., Di Luca, M., Nifosì, R. In silico design of antimicrobial peptides. Methods Mol Biol. 1268, 195-219 (2015).
Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: classification, design, application and research progress in multiple fields. Front Microbiol. 11, 582779(2020).
Alzain, M., et al. Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential. Infect Drug Resist. 18, 4385-4426 (2025).
Rivero-Pino, F., Millan-Linares, M. C., Montserrat-de-la-Paz, S. Strengths and limitations of in silico tools to assess physicochemical properties, bioactivity, and bioavailability of food-derived peptides. Trends Food Sci Technol. 138, 433-440 (2023).
Curnutte, J. T., Babior, B. M. Biological defense mechanisms: the effect of bacteria and serum on superoxide production by granulocytes. J Clin Invest. 53 (6), 1662-1672 (1974).
Eleftheriadis, T., Pissas, G., Liakopoulos, V., Stefanidis, I. Cytochrome c as a potentially clinically useful marker of mitochondrial and cellular damage. Front Immunol. 7, 279(2016).
Min, L., Jian-xing, X. Detoxifying function of cytochrome c against oxygen toxicity. Mitochondrion. 7 (1), 13-16 (2007).
Mühlhaus, T., et al. Quantitative shotgun proteomics using a uniform N-labeled standard reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol Cell Proteomics. 10 (9), M110.004739(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Tetraspora CU2551 SDS PAGE LC MS