מאמר שיטה

בידוד ותרבות של פראדיפוציטים לבנים וחומים מעוברי עכבר

245 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70101

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory Lille Neuroendocrinology, Lille Neuroscience & Cognition, University of Lille, Inserm, CHU Lille

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים גישה חדשנית, חזקה וניתנת לשחזור לבידוד וטיפוח פרה-אדיפוציטים לבנים וחומים מעוברי עכברים, ואנו קובעים אסטרטגיה עוצמתית במבחנה לניתוח המנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים במחויבות והתמיינות שושלת השומן, ומספקים מסגרת לחקירת השפעת התפתחות רקמת השומן.

תקציר

רקמת השומן ממלאת תפקיד מרכזי בהומאוסטזיס מטבלי, ותכונותיה מעוצבות במהלך ההתפתחות העוברית באמצעות התמיינות של שומניות. לכן, פרה-אדיפוציטים עובריים מהווים מודל רלוונטי לחקר אירועים מוקדמים ביצירת רקמת השומן ובהגדרת שושלת. מאמר זה מתאר פרוטוקול שניתן לשחזור לבידוד והבדלה חוץ-גופית של פרה-אדיפוציטים לבנים וחומים שבודדו מעוברי עכבר ביום העוברי 15.5 (E15.5), שלב התפתחותי שבו מתחילים להיווצר מחסני שומן. השיטה מספקת הנחיות מפורטות למיקרודיסקציה של רקמות, עיכול אנזימטי, תרבית ראשונית ותנאי התמיינות ייחודיים לקו התומכים בחיוניות התאים ובבגרות אדיפוגנית. תוצאות מייצגות כוללות הצטברות טיפות ליפידים וביטוי סמנים הקשור לשושלת, המאשרים התמיינות מוצלחת בתנאי תרבית מוגדרים. באמצעות גישה זו, ניתן לכוון פרה-אדיפוציטים עובריים לגורלות של שומן לבן או חום, מה שמאפשר ניתוחים השוואתיים של תזמון התפתחות, מאפייני שושלת ופרופילי ביטוי גנים. פרוטוקול זה מציע כלי מעשי ורלוונטי מבחינה התפתחותית לחקר היווצרות רקמת שומן ומנגנוני תכנות פרינאטליים בסביבה ניסויית מבוקרת.

מבוא

רקמת השומן ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס של כל הגוף על ידי ויסות אגירת אנרגיה, איתות אנדוקריני ותרמוגנזה אדפטיבית, תוך אינטראקציה נרחבת עם איברים מקומיים ורחוקים 1,2,3. שני סוגים עיקריים של רקמת שומן ניתנים להבחנה: רקמת השומן הלבנה (WAT) ורקמת השומן החומה (BAT), אשר שונות באופן ניכר בקו התאי, התפקוד הפיזיולוגי, התפלגות האנטומית והפעילות המטבולית4.

WAT מהווה את מאגר האנרגיה הראשי של האורגניזם. שומנים לבנים מתמחים מאוד באחסון ליפידים ומאופיין בנוכחות טיפה ליפידית גדולה אחת (LD) שתופסת את רוב המרחב הציטופלזמי5. לעומת זאת, BAT מתמחה בתרמוגנזה שאינה רועדת. שדיפוציטים חומים מכילים מספר דמויות קטנות ומציגים צפיפות מיטוכונדרית גבוהה 3,6. היכולת התרמוגנית של BAT נשענת על חלבון הפרדה 1 (UCP1), חלבון ממברנה מיטוכונדריאלית פנימית שמקל על דליפת פרוטונים דרך הממברנה7. על ידי ניתוק הצרחון החמצוני מסינתזת ATP, UCP1 מפזר את גרדיאנט הפרוטונים כחום, ובכך תורם לשמירה על טמפרטורת הגוף8. בהתחשב בתפקידיהם המגוונים, WAT ו-BAT עוררו עניין רב לא רק כרגולטורים מרכזיים ומטרות טיפוליות פוטנציאליות במחלות מטבוליות, אלא גם בביולוגיה התפתחותית ואבולוציונית, אימונולוגיה והזדקנות, בשלהאינטראקציות המערכתיות המורכבות והרחבות שלהם. ראיות מצטברות מצביעות גם על כך שתכנות מטבולי עוברי קשור קשר הדוק להתפתחות רקמת השומן, שכן הפרעות בסביבה התוך-רחמית עלולות להשפיע על מספר, תפוצה ותפקוד השומן, ובכך לגרום לאנשים להיות מועדים להשמנה ולמחלות מטבוליות בהמשך חייהם11.

כדי לחקור את ביולוגיית רקמת השומן, זמינות של שומנים בוגרים היא חיונית. מערכות תרביות במבחנה מספקות סביבה מבוקרת המאפשרת הערכת גורמים ספציפיים המשפיעים על הדיפוגנזה ותפקוד השומרים. הוקמו מספר פרוטוקולים לבידוד והבחנה של שומניות מעכברים בוגרים או גורים יילודים 12,13,14,15. עם זאת, אבות השומנים הללו עשויים להיות שונים מאוכלוסיות התאים המקוריות שנוצרות רקמות שומן במהלך ההתפתחות. בעכברים, מחסני BAT הם הראשונים שמתפתחים במהלך העובר, ומספקים לתינוקות יכולת תרמוגנית שאינה רועדת, שהיא קריטית להסתגלות לקור לאחר הלידה. מאגרים של שומרי שומרי חומים ניתנים לזיהוי באזור הבין-סקיפולרי כבר ביום העוברי 14.5 (E14.5)16. LDs מתחילים להיווצר ב-E15.5, והביטוי של UCP1 מתחיל סביב E16.5. בעובר העכבר, פרה-אדיפוציטים של WAT המפשעה (iWAT) כבר קיימים בשלב16 זה.

הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בפרה-אדיפוציטים המבודדים ב-E15.5. שלב זה תואם לתקופה העוברית שבה תאי אב מתחילים התמיינות ב-vivo16, ובכך מייצגים את האבות הראשיים שיוצרים WAT ו-BAT. לעומת זאת, אבות אדיפוגניים שבודדו בשלב בוגר או יילוד עשויים כבר להיות מושפעים מגורמים סביבתיים וסביר להניח שיפגינו גמישות מוגבלת יותר. לכן, שימוש באבות עובריים ב-E15.5 משפר את היכולת לשחזר בנאמנות את תוכנית האדיפוגנית ב-invivo , שכן תאים אלו שומרים על פלסטיות התפתחותית גבוהה ונוטים יותר לעקוב אחרי מסלולי התמיינות פיזיולוגיים. גישה זו מעניינת במיוחד בשאלות ביולוגיה התפתחותית, במיוחד לחקירת השפעות הגורמים הסביבתיים על התמיינות פרה-אדיפוציטים בתקופה הפרינטלית, ומספקת מודל חשוב לחקר האופן שבו חשיפות בגיל צעיר עשויות לעצב את התפתחות רקמת השומן ואת התוצאות המטבוליות ארוכות הטווח. עם זאת, על המשתמשים להיזהר לגבי ספציפיות שלב זה: השיטה מותאמת לעוברים E15.5, וסטיות בגיל העוברי או בדיוק הניתוח עשויות להשפיע על תפוקת התאים או חיוניותם. בנוסף, טכניקת המיקרודיסקציה דורשת תרגול כדי להימנע מזיהום ברקמות שאינן שומן, במיוחד לאור גודלם הקטן של מחסני עוברים. פרוטוקול זה מסכם את כל השלבים והנהלים לבידוד, תרבות, הגברה והבחנה של פרה-אדיפוציטים עובריים לשומנים חומים ולבנים בוגרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות המקומיות ובהתאם להנחיות שהוגדרו בדירקטיבת מועצת האיחוד האירופי מ-22 בספטמבר 2010 (2010/63/EU) (APAFIS#2617-2015110517317420).

כל הפסולת הביולוגית והתמיסות האנזימטיות חייבות להיות מטופלות ומושמכות בהתאם להנחיות ותקנות בטיחות ביולוגית מוסדיות לחומרים מסוכנים ביולוגית. במיוחד:
- פסולת ביולוגית: לאסוף במיכלים מאושרים לביו-סיכון ולהיפטר באמצעות אוטוקלבינג או לפי הוראות משרד הבטיחות הביולוגית של המוסד.
- תמיסות אנזימטיות: מבטלות פעילות אנזימטית שאריתית על ידי הוספת 10% אקונומיקה למשך 30 דקות והשלכתה כפסולת כימית לפי התקנות המקומיות.
- מוצרי צריכה מזוהמים (קצות פיפטה, צינורות וכו'): מונחים בשקיות ביוסכנה ואוטוקלאב לפני ההשלכה.
- תגובות קיבוע: סילוק כפסולת כימית מסוכנת במיכלים ייעודיים.

תמיד תלבשו ציוד מגן מתאים בעת טיפול בפסולת.

1. קצירת עוברים של עכברים

  1. הורד את העכברים ההרות (C57Bl/6J) בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית.
  2. חיטא את אזור הבטן של עכברים בהריון עם 70% אתנול ובצע חתך בקו האמצע כדי לחשוף את הרחם.
  3. חתכו את חלל הבטן כדי להסיר את שקי החלמון המכילים את העוברים ב-E15.5 והניחו אותם בקופסת אגרוז המכילה 1x PBS קרה (4 מעלות צלזיוס).
  4. הסר את הממברנה החיצונית של כל שק חלמון והשליה, וחתוך את חבל הטבור של העוברים.
  5. הניחו את העוברים בקופסת אגרוז חדשה המכילה 1x PBS קר.
    הערה: למרות שמבני מערכת העצבים המרכזית העומדים בבסיס תפיסת הכאב המודעת אינם מפותחים במלואם בשלב ההריון הזה, קולטני כאבים פריפריים מתחילים להיווצר בין E13 ל-E15. בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים, כדי למזער תגובות נוציספטיביות פוטנציאליות, אנו ממליצים עם זאת להמית עוברים באמצעות כריתת ראש לפני כל מניפולציה ניסויית.

2. כריתה של רקמות שומן עובריות (איור 1)

  1. פירוק BAT בין-סקפולרי (איור 1A)
    1. חתכו מלבן מתוך צלחת אגרוז 5% והניחו את העובר בתוכו כדי לשתק אותו. מלא את הצלחת ב-1x PBS קר. הניחו את קופסת האגרוז עם העובר תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.
    2. הסר את העור מאחורי העובר.
    3. נתח את ה-BAT הבין-סקיפולרי באמצעות מלקחיים דקים ומספריים.
    4. הפרדו בזהירות את ה-BAT מהרקמה הסובבת (רקמת חיבור ושריר) באמצעות מיקרוסיסורים כדי לקבל דגימת BAT בגודל של כ-4–6 מ"מ על 2–3 מ"מ.
    5. הניחו את ה-BAT בצינור של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל גלוטמין קר (4 מעלות צלזיוס) של Dulbecco Modified Eagle Medium Medium F-12 (DMEM/F-12) עם 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
  2. ניתוח של iWAT (איור 1B)
    1. מניחים את העובר על צידו (בצד אחד ואז בצד השני) על צלחת האגרוז.
    2. נתח את ה-iWAT באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים.
    3. הפרדו בזהירות את ה-iWAT מהרקמה הסובבת (רקמת חיבור ועור) עד שיש שני מחסנים בגודל של כ-2–4 מ"מ x 0.5–0.8 מ"מ.
    4. הנח את שתי דגימות ה-WAT בצינור של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל גלוטמין קר DMEM/F-12 עם 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
      הערה: כל הניתוחים חייבים להתבצע תחת מיקרוסקופ בינוקולרי בסביבה הסטרילית ביותר האפשרית, באמצעות כלים שחוטאו מראש.

3. עיכול רקמות שומן

  1. הסר את ה-DMEM/F12 עם פיפטה והוסיף לצינורות 200 מיקרולטר של DMEM/F12 גלוטמין עם 100 U/mL P/S, 0.2% אלבומין סרום בקר (BSA), 0.5 U קולגנאז D, ו-0.5 U דיספאז II.
  2. חתוך את הרקמות עם מיקרוסיסורים בצינורות כדי לצמצם את חלקי הרקמה כמה שיותר ולעזור בתהליך העיכול על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
    הערה: דגימות מעוכלות לחלוטין צריכות להופיע כמעונן מעונן ללא גושים נראים לעין.
  3. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס (באמבט מים) למשך 15 דקות.
  4. עצור את התגובה על ידי הוספת 600 מיקרוליטר גלוטמין קר DMEM/F-12 עם 100 U/mL P/S, 20% סרום בקר עוברי (FBS). תחזיר תלייה אחידה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.

4. תרבית תאים ראשונית

הערה: מהשלב הזה ואילך, כל ההליכים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים קפדניים בארון בטיחות ביולוגית (BSC) כדי למנוע זיהום. לבש כפפות סטריליות, חלוק מעבדה ומשקפי מגן כדי לשמור על הסטריליות ולהגן מפני סכנות פוטנציאליות. השתמש בכלי פלסטיק חד-פעמיים סטריליים, בטכניקת אספטיה, וודא שכל התגובות והמדיה סטריליים. הימנעו ממגע עם משטחים לא סטריליים כדי למנוע זיהום.

  1. לוחות את התאים על מחסניות באר ודגרו אותם בתנאים סטנדרטיים (37°C, 5%CO2) למשך שעה; ללוחות עם 8 בארות, שים 200 מיקרוליטר לבאר. לאחר הדגירה, ודאו שהתאים נדבקו על ידי הזזת הפלטה בעדינות תוך התבוננות תחת מיקרוסקופ.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאגד דגימות BAT או WAT שונות לצינור אחד כדי לקבל תרביות הומוגניות בבארות השונות (למשל, לבדוק את השפעת הטיפול על תרביות דומות).
  2. החלף את המדיום בגלוטמין DMEM/F-12 מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) עם 100 U/mL P/S, 10% FBS, ודגר את התאים ללילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
    הערה: על ידי החלפת המדיום, תאים מתים/לא מחוברים ושברי רקמה שלא יכלו לפרק מוסרים, ונשארים רק התאים המחוברים.
  3. טיפול התמיינות (72 שעות)
    1. לצורך התמיינות שומן חום, החליפו את המדיום באמצעות גלוטמין dmem/f-12 מחומם מראש (37°C) עם 100 U/mL P/S, 10% FBS, 125 ננומטר אינדומתסין, 0.5 mM 3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין (IBMX), 1 ננומטר טריודותירונין (T3), 1 מיקרומום רוזיגליטזון, 1 מיקרומום דקסמתזון ו-850 ננומטר אינסולין, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 72 שעות.
    2. לצורך התמיינות של שומן לבן, החליפו את המדיום באמצעות DMEM/F-12 גלוטמין מחומם מראש עם 100 U/mL P/S, 10% FBS, 0.5 מ"מ IBMX, 1 מיקרומום דקסמתזון, ו-850 ננומטר אינסולין, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 72 שעות.
  4. טיפול תחזוקה (כל 48 שעות)
    1. החלף את המדיום באמצעות גלוטמין DMEM/F-12 מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) עם 100 U/mL P/S, 10% FBS, 1 ננומטר T3, 1 מיקרומום רוזיגליטזון ו-850 ננומטר אינסולין. לחדש את המדיום כל 48 שעות.
      הערה: כל הריכוזים הרשומים מתייחסים לריכוזי העבודה הסופיים של המגבים. כוונן את נפחי המדיות הסופיות של מדיית ההפרשה והתחזוקה לפי מספר הבארות שיש לטפל, תוך שימוש ב-200 מיקרוליטר לכל באר כנפח סטנדרטי ללוחות 8 בארות.

5. קיבוע וצביעת חיסון (איור 2א)

  1. שאופי את המדיה ושוטפים את התאים עם PBS קר של 1x.
  2. תקן את התאים 10 דקות עם פורמלדהיד קר 4% ב-1x PBS.
  3. שטוף את התאים עם 1x PBS למשך 3 על 5 דקות.
  4. חדיר את התאים עם 0.1% טריטון ב-1x PBS למשך 10 דקות.
  5. שטוף את התאים עם 1x PBS למשך 3 על 5 דקות.
  6. חסום אתרים לא ספציפיים עם 5% סרום חמור רגיל (NDS) ב-1x PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: בחירת המין לסרום החוסם תלויה במין שבו מיוצרים הנוגדנים המשניים.
  7. דגרו נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-5% NDS ב-1x PBS במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: אל תוסיפו נוגדנים ראשוניים לאחת הבארות — זה ישמש כבקרה שלילית.
  8. שטוף את התאים עם 1x PBS למשך 2 x 5 דקות.
  9. שטוף את התאים עם 5% NDS ב-1x PBS למשך 5 דקות.
  10. דגרו עם הנוגדנים המשניים, DAPI, ו-Bodipy למשך שעה אחת ב-RT, מכוסים כדי להגן מפני אור.
  11. שטוף את הבארות עם 1x PBS למשך 3 על 5 דקות.
  12. שמור על התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך עד לקבלת התמונות.

6. שימור קריוקונסרבטיבי של פרה-אדיפוציטים

הערה: ניתן לעצור את התרבית ולהקפיא את התאים לפני או אחרי תהליך ההתמיינות, כדי לאחסן אותם ולהשתמש בהם מחדש לתרביות תאים נוספות.

  1. הכינו מדיום הקפאה: 50% FBS, 40% DMEM/F-12 גלוטמין עם 100 U/mL P/S, 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    אזהרה: DMSO הוא חומר כימיקל מסוכן. הוא מגרה בעור ובעיניים, יכול להקל על ספיגת חומרים רעילים אחרים דרך העור, ועלול לגרום לנזק אם נשאף או נבלע. תמיד טפל ב-DMSO בתוך ה-BSC כדי למזער חשיפה וזיהום. לבש ציוד מגן אישי מתאים (כפפות סטריליות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות למניעת מגע). הימנע ממגע עור. במקרה של מגע, שטוף מיד עם הרבה מים. אחסן את ה-DMSO במיכל אטום היטב בתוך ה-BSC כאשר אינו בשימוש, וודא סילוק נכון בהתאם לפרוטוקולי בטיחות במעבדה.
  2. שטוף את התאים עם PBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) 1x.
  3. הוסיפו טריפסין מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) 0.05% לניתוק התאים כימית ודגרו 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2. בדוק ויזואלית היפרדות תאים תחת מיקרוסקופ.
  4. עצור את התגובה על ידי הוספת פי 3 נפח של גלוטמין DMEM/F-12 מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) עם 100 U/mL P/S, 10% FBS. השעתי מחדש באופן שווה.
  5. צנטריפוגה 7 דקות ב-RT, 300 × גרם וזרוק את הסופרנטנט.
  6. להחזיר את התאים ל-10 מ"ל של מדיום קפוא. צנטריפוגה 7 דקות ב-RT, 300 × גרם והשלכת הסופרנאנט, ומשאירה בערך 3 מ"ל.
    הערה: מדוד את הנפח המדויק כדי לחשב את מספר התאים הכולל לאחר הספירה.
  7. מדלל נפח קטן 1:2 עם Trypan Blue וספר תאים חיים באמצעות תא נויבאואר.
  8. כוונן את הנפח עם מדיום הקפאה כדי להגיע ל-5 × 104 – 1 ×10 5 תאים לבקבוקון (נפח סופי: 1 מ"ל לבקבוקון).
  9. העבר את הבקבוקים למיכל קפוא (קצב קירור: -1 מעלות צלזיוס לדקה) ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס בלילה.
  10. העבר לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
    הערה: פרוטוקול זה מאפשר עמידות גבוהה מ-90% לאחר הפשרה.
  11. הפשרת התאים בעת הצורך על ידי הפשרת הבקבוקון במהירות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  12. העבר את תכולת הבקבוקון ל-4 מ"ל של גלוטמין DMEM/F-12 מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) עם 100 U/mL P/S, 10% FBS. תלייה מחדש באופן אחיד על ידי פיפסט עדין למעלה ולמטה 10 פעמים. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2.
  13. החלף את המדיום ב-DMEM/F-12 גלוטמין טרי עם 100 U/mL P/S, 10% FBS וחדש כל 48 שעות.
    הערה: חשוב לבצע שינוי במדיה כדי להסיר שאריות DMSO, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בחיוניות, התמיינות ותפקוד התאים. יש להבטיח החלפה מלאה של המדיום כדי למנוע השפעות ציטוטוקסיות.
  14. המשך בניסויים או תאי מעבר כאשר הם מגיעים ל-80% מהמפלוקס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שמודגם באיור 1, מחסני BAT ו-iWAT שלמים יכולים להיות מבודדים ביעילות מעוברים ב-E15.5. בעוד ש-BAT ניתן לזיהוי בקלות בעוברים E15.5, זיהוי iWAT עשוי לדרוש הכשרה. בשני המקרים, חיוני לבצע מיקרודיסקציה של כל הרקמה הסובבת לאחר ניתוח גס כדי למנוע גידול סוגי תאים אחרים.

שלבי העיכול והתרבית הראשונים של פרה-אדיפוציטים לבנים וחומים זהים (איור 2A,B), בעוד שלבי ההתמיינות הבאים משתנים כדי לכוון א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תרבות הפרה-אדיפוציטים תוארה בהרחבה בהקשרים ניסיוניים שונים. עם זאת, הפרוטוקולים הקיימים מסתמכים בעיקר על רקמות בוגרות או פיברובלסטים עובריים, ואין כיום שיטות סטנדרטיות לבידוד וטיפוח פרה-אדיפוציטים עובריים ישירות מרקמות שומן מתפתחות. חקר תאים אלו חשוב במיוחד, שכן הם מייצגים את אוכלוסיות הפרה-אדיפוציטים האותנטיים השוכנות במיקרו-סביבה העוברית הטבעית שלהם. ניתוחים כאלה קריטיים להבנת היווצרות שומנים לבנים וחומים במהלך העובר, כולל רמזי ההתמיינות והגורמים המולקולריים השולטים בכל שלב בהתפתחות. E...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

אנו מודים לכריסטיאן דוהם על עצתו. אנו מכירים בתמיכה מהמכון הלאומי הצרפתי למחקר בריאות ורפואי (INSERM). M.C-M נתמכה על ידי ANR-23-CE13-0044. תואר שני נתמך על ידי המכון האירופי לגנומיקה לסוכרת (EGID, ANR-10-LABX-0046), המרכז הלאומי לרפואה מדויקת בסוכרת (PreciDIAB, ANR-18-IBHU-0001), והמועצה האזורית של אוט-דה-פראנס (22005973). איור 2 נוצר ב-BioRender. מאיוף-לושאר, א. (2026) https://BioRender.com/3pbzif1. SB נתמכה על ידי מענק ANR-24-CHBS-0002.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3,5,3'-טריאודותירוניןסיגמא709719T3
3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין סיגמאI7018IBMX
אגרוזסיגמאA0169
אלכוהולVWR1.59010.0500
נוגדן אנטי-UCP1אבקאםAB10983
מיקרוסקופ בינוקולרילייקה  MZ9.5
ארון בטיחות ביולוגיתתרמו-סיינטיפיק51022482ארון בטיחות BSC, HeraSafe KS Class II
בודיפיInvitrogenD3922עירור/פליטה 493/504 ננומטר
אלבומין סרום בקריורומדקס04-100-812-CBSA
צנטריפוגהאפנדורף5430 R
מהדקיםFST (גרמניה אל-חלד)
קולגנאז Dסיגמא11088882001
קריוטיוביםסארסטדט72.379
לוחות גידול (8-בארות)Ibidi 80826
לוחות גידול (12 בארות)קורנינג קוסטארCLS3513פלטת פוליסטירן, תחתית שטוחה, סטרילית
דקסמתזוןסיגמאD2915
Dispase IIסיגמא4942078001
DMEM/F12גיבקו31331גלוטמין נוסף
DMSOסיגמאD2438
נוגדן נגד ארנב לחמורInvitrogenA32795אלקסה פלואו פלוס 647
אפנדורף 1.5 מ"לאפנדורף15625367
FBSגיבקוA5256701
פורמלדהיד 37%תרמו-סיינטיפיק119690010
מיכל הקפאהתרמו-סיינטיפיק  5100-0001
Hoechst InvitrogenH3570
חממהתרמו-סיינטיפיק50116048חממת ה-CO2 של Heracell 150i
אינדומתציןסיגמאI7378
אינסוליןסיגמאI9278
  מיקרוסקופ הפוך המצויד ב-10& פעמים; תאורת אובייקטיבית והלוגןקרל צייס אקסיו ורט A1
עכברים C57BL/6Jנהר צ'ארלס
מיקרוסיסורסFST (גרמניה אל-חלד)
NDSסיגמאD9663
לשכת נויבאוארתרמו-סיינטיפיק10195580
PBS 10xגיבקו14200
PBS 1xגיבקו14190
פניצילין/סטרפטומיציןגיבקו15140-122
צלחות פטריסארסטדט83.3902
לוחות qPCRתרמו-סיינטיפיקAB-0600
גלאי qPCR עבור Fabp4תרמו-סיינטיפיק4331182בדיקות טאקמן, Mm00445878_m1
גלאי qPCR עבור Ppargתרמו-סיינטיפיק4331182TaqMan בודק, Mm00440940_m1
גלאי qPCR עבור Ucp-1תרמו-סיינטיפיק4331182TaqMan בודק, Mm01244861_m1
ערכת תמלול הפוך  תרמו-סיינטיפיק4368813ערכת cDNA בעלת קיבולת גבוהה
ערכת חילוץ RNAאומגה ביו-טקR6934-02ערכת RNA כוללת של E.Z.N.A. II
רוזיגליטאזוןסיגמאR2408
טריטון X-100תרמו-סיינטיפיקA16046
טרייפן בלוסיגמאT8154
טריפסין-אדטהגיבקו25300054
אמבט מיםגרנטSAP12 קיבולת של 12 ליטר

מקורות

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444 (7121), 847-853 (2006).
  2. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (6), 2548-2556 (2004).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Bouchekioua, A., Pourquié, O., Mayeuf-Louchart, A. In vitro differentiation of beige/brown adipocytes for the treatment of metabolic diseases. Adipose Tissue Homeostasis in Health and Disease. IntechOpen. , (2024).
  5. Fischer-Posovszky, P., Newell, F. S., Wabitsch, M., Tornqvist, H. E. Human SGBS cells - a unique tool for studies of human fat cell biology. Obes Facts. 1 (4), 184-189 (2008).
  6. Mayeuf-Louchart, A., Duez, H. From glycogen to lipid droplet: an intimate connection in the brown adipocyte. Med Sci (Paris). 36 (6-7), 577-579 (2020).
  7. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  8. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  9. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (4), 242-258 (2019).
  10. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  11. Merkestein, M., et al. Programming of adipose tissue function: an evolutionary perspective. Mamm Genome. 25 (9-10), 413-423 (2014).
  12. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. J Vis Exp. (162), e61610(2020).
  13. Curtin, M. C., Jackson, A. E., Hilgendorf, K. I. Isolation and culturing of primary murine adipocytes from lean and obese mice. J Vis Exp. (215), e67846(2025).
  14. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio Protoc. 11 (24), e4265(2021).
  15. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. J Vis Exp. (167), e62005(2021).
  16. Mayeuf-Louchart, A., et al. Glycogen dynamics drives lipid droplet biogenesis during brown adipocyte differentiation. Cell Rep. 29 (6), 1410-1418.e6 (2019).
  17. Herbers, E., et al. Preventing white adipocyte browning during differentiation in vitro: the effect of differentiation protocols on metabolic and mitochondrial phenotypes. Stem Cells Int. 2022, 3308194(2022).
  18. Yau, W. W., et al. Thyroid hormone (T3) stimulates brown adipose tissue activation via mitochondrial biogenesis and MTOR-mediated mitophagy. Autophagy. 15 (1), 131-150 (2019).
  19. Zekri, Y., et al. Brown adipocytes local response to thyroid hormone is required for adaptive thermogenesis in adult male mice. eLife. 11, e81996(2022).
  20. Smolińska, K., et al. Targeting fatty acid-binding protein 4: a therapeutic intersection of obesity and cancer via lipid metabolism. Prog Lipid Res. 100, 101353(2025).
  21. Cero, C., et al. Standardized in vitro models of human adipose tissue reveal metabolic flexibility in brown adipocyte thermogenesis. Endocrinology. 164 (12), bqad161(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים