יישום מתקדם של אלקטרופורזה קפילרית בזיהוי חלבון מונוקלונלי ברזולוציה גבוהה בסרום

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לניתוח חלבוני סרום ברזולוציה גבוהה באמצעות אלקטרופורזה קפילרית. תחת שדה חשמלי במתח גבוה, חלבוני הסרום נודדים דרך קפילריה בהתבסס על מטען וניידות אלקטרופורטית. האלקטרופרוגרמה המתקבלת מאפשרת זיהוי, מיקום וכימות של פסגות חלבון מונוקלונליות.

תקציר

אימונוגלובולין מונוקלונלי, הידוע גם כחלבון M או פאראפרוטאין, מיוצר על ידי התרבות קלונית של תאי פלזמה או לימפוציטים B ומשמש כסמן ביולוגי מרכזי לגמופתיות מונוקלונליות. זיהוי וכימות מדויק של חלבון M בסרום חיוניים לאבחון מוקדם של מחלה, סיווג קליני ומעקב טיפולי. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת באלקטרופורזה נימית (CE) להפרדה ברזולוציה גבוהה של חלבוני סרום. חלבונים מופרדים בבופר אלקליני תחת אלקטרופורזה במתח גבוה ומזוהים על ידי ספיגת אולטרה סגול, מה שמייצר אלקטרופרוגרמות המאפשרות ויזואליות וכימות ברורות של פסגות חלבון מונוקלונליות חריגות. בהשוואה לשיטות המסורתיות, CE מספק רזולוציה משופרת של אזור הבטא ומאפשר ניתוח אוטומטי ומהיר עם דרישות טיפול מינימליות בדגימות. חמישה אלקטרופרוגרמות מייצגות הראו נדידת חלבוני M באזורים β1, β2 ו-γ, עם רמות חלבון M של 0, 44.1% (45.8 גרם לליטר), 10.5% (8.6 גרם לליטר), 35.5% (28.4 גרם לליטר), ושיאים כפולים של 41.3% (46.0 גרם לליטר) ו-12.4% (13.8 גרם לליטר). במחקר רטרוספקטיבי שכלל 700 דגימות סרום קליניות, CE השיג שיעור גילוי חיובי של 51.86%, לעומת 52.86% לאלקטרופורזה אימונופיקסיבית (IFE). באמצעות IFE כשיטת ייחוס, CE הראתה רגישות של 92.70% וסגוליות של 93.94%. ממצאים אלו אישרו את CE כגישה מהירה ואוטומטית לסינון וכימות חלבון M בדם במעבדות קליניות שגרתיות.

מבוא

הפרעות הקשורות לחלבון M מאופיינות בנוכחות אימונוגלובולין מונוקלונלי (חלבון M) בסרום ו/או בשתן. חלבונים אלו מופרשים בדרך כלל על ידי תאי פלזמה קלונליים או לימפוציטים מסוג B, והם קשורים בעיקר לדיסקרזיה של תאי פלזמה ממאירים או לגמופתיות מונוקלונליות שפירות^. הספקטרום הקליני של מצבים אלו כולל גמופתיה מונוקלונלית בעלת משמעות לא מוגדרת (MGUS), פלזמציטומה בודדת (SPC), מיאלומה נפוצה בוערת (SMM), מיאלומה נפוצה (MM), לוקמיה פלזמה (PCL), מקרוגלובולינמיה של וולדנסטרום (WM), אמילואידוזיס שרשרת אור מערכתית (AL), לימפומה לא-הודג'קין של תאי B (B-NHL) והפרעות לימפופופרוליפרטיביות נוספות של תאי B (LPD)³. מחקר רטרוספקטיבי שנערך בספרד דיווח כי מבין המחלות הללו, MGUS הוא השכיח ביותר, עם 54.1% מהמקרים, אחריו MM (31.3%) וגמופתיות ממאירות אחרות (14.6^%)4. חשוב גם לציין שחלבון M עשוי להיות מיוצר בתגובה למצבים מסוימים שאינם ניאופלסטיים, כגון תסמונת נפרוטית⁵.

בדיקות חלבון M ממלאות תפקיד קריטי באבחון ובמעקב אחר הפרעות הקשורות לחלבון M⁶. עם זאת, אבחון מוקדם נותר אתגר קליני, שכן מטופלים עם MM לעיתים קרובות חסרי תסמינים בשלבים הראשונים, מה שמוביל לאבחון מאוחר בשלב מתקדם יחסית של המחלה. כ-1% מהאנשים עם MGUS מתקדמים למצב ממאיר מדי שנה – בדרך כלל ל-MM, WM או SPC⁷. למרות שכמעט כל מקרי MM נחשבים כמתפתחים מ-MGUS, פחות מ-10% מחוללי MM מתועדים באבחון MGUS קודם. כתוצאה מכך, זיהוי מהיר של חלבון M בסרום ו/או בשתן יכול לספק רמזים חשובים לאבחון מוקדם של הפרעות אלו, דבר קריטי לשיפור הישרדות המטופלים והפרוגנוזה. מחקרים מראים כי מטופלים עם MGUS שזוהו באמצעות סקר פעיל חווים פחות סיבוכים מאשר אלו שאובחנו במקרה⁸. במהלך ניטור טיפולי, מידע על האיזוטיפ ודפוס הנדידה האלקטרופורטית של חלבון M חיוני להבחנה בין הישנות של החלבון המונוקלונלי המקורי לבין הופעת רצועות אוליגוקלונליות או חלבון M תגובתי^{משני 9}. הופעתו של חלבון M חדש, שנצפה לעיתים לאחר השתלת תאי גזע אוטולוגיים, נחשבת בדרך כלל לאינדיקטור פרוגנוסטי חיובי עבור^{רוב המטופלים}. בהתאם לתצפית זו, נתוני הישרדות השוואתיים מצביעים על כך שמטופלים שמפתחים חלבון M משני מציגים הישרדות חציונית כוללת של 115.3 חודשים, לעומת 31.0 חודשים בקרב אלו שאינם¹¹.

אלקטרופורזה של חלבונים היא טכניקה אנליטית מתוחכמת מאוד. קיימות מגוון שיטות לזיהוי חלבון M בסרום, כולל אלקטרופורזה של חלבון סרום (SPE), IFE, אימונוטיפינג אלקטרופורזה קפילרית (IT), בדיקת שרשרת קלה חופשית (FLC), זיהוי שרשראות כבדות וקלות (HLC) וספקטרומטריית מסה (MS). כל גישה מציעה יתרונות ייחודיים תוך התמודדות עם מגבלות מובנות. ניתן לחלק את SPE עוד לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (AGE) ו-CE. AGE, המשתמשת במדיום מבוסס אגרוז, היא שיטה פשוטה וחסכונית המתאימה להפרדה וניתוח מהירים. עם זאת, הוא מוגבל על ידי רגישות יחסית נמוכה, עם מגבלת גילוי טיפוסית של 0.3-0.5 גרם^{לליטר 12}, מה שעלול לגרום לכישלון בזיהוי חלבוני M בנפח קטן או בריכוז נמוך. יתרה מזאת, הטכניקה רגישה לכיפוף רצועות ועיוות, מה שפוגע ביכולת השחזור.

IFE מוכר באופן נרחב כסטנדרט הזהב לטיפוס חלבוני M. לאחר האלקטרופורזה הראשונית, נוגדנים ספציפיים (אנטי-IgG, אנטי-IgA, אנטי-IgM, κ, λ) מוחלים ליצירת רצועות אימונופרסיפיטציט, המאפשרים זיהוי סוג אימונוגלובולין ותת-סוג שרשרת קלה. IFE יכול לזהות חלבון M בריכוזים נמוכים של 0.05-0.15 גרם לליטר, ומספק רגישות גבוהה פי 10 מזו של SPE. למרות יתרון זה, נדרש טיפול מוקדם מיוחד עבור דגימות מסוימות, כגון אלו המכילות פולימרי חלבון M, כדי להבטיח ניתוק עם β-מרקפטואנול. טיפול לא מספק עלול להוביל לתוצאות מטעות. בנוסף, מטופלים שעוברים טיפולים משולבים חדשים (למשל, משטרים המכילים דראטומומאב, בורטסומיבי, דקסמתזון ותלידומיד/לנלידומיד) עשויים להניב ממצאים חיוביים שגויים של IFE¹³. מגבלה מרכזית של IFE היא שהוא מספק תוצאות איכותיות בלבד, שכן הוא אינו יכול לכמת את רמות חלבון M ולכן אינו מתאים למעקב אחר יעילות טיפולית¹⁴. בקרב מטופלים מטופלים, תוצאות IFE עשויות להישאר חיוביות גם כאשר ריכוז חלבון M יורד במהלך טיפול מוצלח.

לעומת זאת, IT משתמש במאגרי נימים כאמצעי הפרדה, ומציע רזולוציה גבוהה יותר מאשר IFE קונבנציונלי. למרות זאת, התהליך דורש שלבים מורכבים לטיפול מקדים בדגימות, כגון ערבוב אנטי-סרום, שמאריך את תהליך הזיהוי הכולל. FLCs, שהם שרשראות קלות של אימונוגלובולין (κ ו-λ) שאינן קשורות לשרשראות כבדות, נמדדות ישירות בסרום באמצעות נוגדנים המכוונים לאפיטופים של "אזור נסתר" שלהם, ומספקים רגישות גבוהה לזיהוי הפרעות הקשורות לשרשראות קלות עם מגבלת גילוי נמוכה עד 10–30 מ"ג/ליטר. ב-MM, רמות גבוהות של FLC בסרום קשורות לעומס הגידול ומאפשרות הערכה מוקדמת יותר של תגובת הטיפול, בשל מחצית החיים הקצרה יותר שלהם בהשוואה לאימונוגלובולינים^{שלמים 15}. עם זאת, יש לשלב את יישומה הקליני עם שיטות אבחון אחרות, כגון אלקטרופורזה, כדי לשלול מצבים נוספים ולהבטיח הערכה מקיפה. לדוגמה, פגיעה בתפקוד הכליות עלולה להוביל לרמות שרשרת קלות גבוהות באופן שגוי. בדיקות HLC מייצגות גישה כמותית נוספת המשתמשת בנוגדנים המכוונים לאפיטופים הן בשרשראות הקבועות והן בשרשראות הקלות של האימונוגלובולין. עיצוב זה מאפשר כימות נפרד של זוגות אימונוגלובולינים ספציפיים לאיזוטיפ (למשל, IgGκ ו-IgGλ), ויחס ה-HLC הנגזר משמש כאינדיקטור רגיש לקלונליות. עם זאת, התוצאות עשויות להיות מושפעות מרמות אימונוגלובולין פוליקלונליות רקע, והשיטה עשויה להיות פחות אמינה בניתוח וריאנטים מורכבים של חלבוני M. טרשת נפוצה מציעה רגישות יוצאת דופן ומאפשרת אפיון פרוטאומי מעמיק של חלבוני M. עם זאת, יישומו מוגבל בשל עלויות ציוד גבוהות, נהלים אנליטיים ממושכים ומומחיות מיוחדת הנדרשת לפרשנות נתונים.

CE היא טכניקת הפרדה אנליטית עוצמתית המשתמשת בנימי סיליקה אלסטיים כערוצי הפרדה ובשדה חשמלי ישר במתח גבוה ככוח מניע. הוא מספק הפרדה ברזולוציה גבוהה על ידי ניצול הבדלים בניידות האלקטרופורטית ו/או בהתנהגות החלוקה של אנליטי המטרה. מאז תחילתה, הטכנולוגיה התקדמה מתצורות נימי יחיד למערכי קפילרי בעלי הספק גבוה ומכשירים מיקרופלואידיים מוקטנים. היישומים שלה כיום משתרעים על תחומים מגוונים, כולל ניתוח פרמצבטי, אבחון ביו-רפואי וקליני, בדיקות בטיחות מזון^ואפיון ביותרפי. CE מוכר יותר ויותר ככלי חיוני לסינון וניתוח כמותי של חלבוני M. הוא קובע את אחוז חלבון M ביחס לסך החלבון, שניתן להכפיל אותו בריכוז החלבון הכולל כדי לחשב את רמות החלבון המוחלטות של M. במיוחד, דרישת הדגימה המינימלית שלו הופכת אותה למתאימה במיוחד לניתוח דגימות יקרות או מוגבלות בנפח.

ה-CE מציע שלושה יתרונות טכניים מרכזיים. ראשית, הרגישות האנליטית הגבוהה שלו (0.1–0.5 גרם לליטר) מאפשרת זיהוי יעיל של חלבוני M בריכוז נמוך, ובכך מפחיתה את הסיכון לאבחון שגוי במצבים כמו MGUS ומחלות שרשרת קלה. שנית, תהליך העבודה האוטומטי לחלוטין מבטל את שגיאות הפרשנות הסובייקטיביות הטבועות בשיטות צביעה מסורתיות מבוססות ג'ל. לבסוף, זמן הבדיקה מתקצר משמעותית ל-15–20 דקות, קצר משמעותית מהנדרש 60–90 דקות לאלקטרופורזה קונבנציונלית. כשיטה אנליטית מרכזית בין אלקטרופורזה אזורית לכרומטוגרפיה נוזלית, CE מבצעת הפרדה אלקטרופורטית בתמיסה חופשית. בשדה חשמלי מיושם, מולקולות החלבון מופרדות בעיקר על ידי זרימה אלקטרואוסמוטית בתוך בופר אלקליני ב-pH מסוים. לאחר דילול עם בופר ייעודי, הדגימות מוזרקות באנודה הקפילרית במתח גבוה כדי להתחיל הפרדה מהירה ויעילה של חלבונים, ואז מזוהות בקתודה ב-200 ננומטר. לאחר כל מחזור אנליטי, הנימים עוברים ניקוי אוטומטי ומילוי בופר כדי לעבד דגימות נוספות. הפרדת החלבונים מתרחשת בסדר הבא: גמא-גלובולין, בטא-2-גלובולין, בטא-1-גלובולין, אלפא-2-גלובולין, אלפא-1-גלובולין ואלבומין, ומאפשר זיהוי חריגות בחלק או יותר מחלבון הסרום. ראוי לציין כי CE מספק רזולוציה משופרת באזור הבטא, ומפריד אותו באופן ברור לרכיבי גלובולין בטא-1 ובטא-2, ובכך מספק מידע קליני מפורט יותר¹⁸. בהשראת שילוב בינה מלאכותית והתקדמות מתמשכת בזיהוי רב-פרמטרים, CE עומדת להתפתח לשיטת סקר ראשונה לזיהוי חלבוני M. לכן, פרוטוקול זה מתאר את השימוש באלקטרופורזה נימית לזיהוי מהיר, מיקום וניתוח כמותי של חלבוני מונוקלונל בסרום בדגימות קליניות.

פרוטוקול

פרוטוקול המחקר נבדק ואושר על ידי ועדת סקירת האתיקה של בית החולים העממי המחוזי של גואנגדונג (מספר אישור: KY2025-176-01). כל המשתתפים נתנו הסכמה מדעת בכתב לפני איסוף הדגימות.

1. הכנת חומרים

הערה: ערכת הריאגנט צריכה להיאחסן בטמפרטורה של 2–30 מעלות צלזיוס וחיי מדף של עד 3 שנים.

1. אחסן את הבופר בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס ואפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר הפתיחה, הפתרון נשאר יציב עד 3 חודשים. השתמש בתמיסה זו כבופר ריצה להפרדת חלבוני סרום באלקטרופורזה קפילרית.
   הערה: הבופר הרץ מוכן לשימוש עם pH של 9.9 ± 0.5. ערכת התגובה מכילה שלושה בקבוקי בופר אלקליני בנפח 700 מ"ל המשמשים כבופר ריצה להפרדת חלבוני הסרום.
2. דילל 75 מ"ל של תמיסת שטיפה מרוכזת ל-750 מ"ל עם מים דה-יוניים לפני השימוש. שמור את תמיסת השטיפה המדוללת בטמפרטורת החדר. לאחר הפתיחה, הפתרון נשאר יציב עד 3 חודשים. השתמש בתמיסה זו לניקוי צינורות נימים לאחר אלקטרופורזה.
   הערה: תמיסת השטיפה מכילה נתרן הידרוקסיד ומשמשת לניקוי נימים.
   אזהרה: תמיסת השטיפה מכילה הידרוקסיד נתרן, חומר קורוזיבי שעלול לגרום לכוויות חמורות. במקרה של קשר עין, שטוף מיד בהרבה מים ופנה לטיפול רפואי. אם עור או בגדים מזוהמים, הסירו את הבגדים המזוהמים מיד. תמיד לבשו בגדים מגנים מתאימים והשתמשו בהגנת עיניים ופנים.
3. אחסן את כוסות הריאגנט באריזה המקורית האטומה בטמפרטורה של 2–30 מעלות צלזיוס במקום נקי ויבש. השתמש בכוסות התגובה לדילול דגימות במכשירים אוטומטיים לחלוטין.
4. שמרו את המסנן האטום במקום יבש בטמפרטורת החדר (15–30 מעלות צלזיוס). השתמש במסננים חד-פעמיים כדי לסנן תמיסות בופר ומים דה-יוניים.
5. אחסן את תמיסת הניקוי הקפילרי (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס והימנעו ממשקעים.
   הערה: כל בקבוק של תמיסת ניקוי נימי (25 מ"ל לבקבוק) מכיל אנזימים פרוטאוליטיים, סורפקטנטים ותוספים נוספים. תוספים אינם מסוכנים בריכוז היישום והם הכרחיים לביצועים מיטביים. התמיסה מונעת חסימת נימים ושומרת על ביצועים מיטביים.
6. השתמשו במים מסוננים דה-יוניים עם גודל נקבובית ≤ 0.45 מיקרון, מוליכות מתחת ל-3 מיקרו-סמינמטר והתנגדות העולה על 0.33 MΩ·cm. החליפו את המים מדי יום כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. השתמש במים אלו לניקוי צינורות הנימים של אנלייזר האלקטרופורזה.
7. הכינו תמיסת נתרן היפוכלוריט המכילה 2–3% כלור זמין. השתמש בתמיסה זו לניקוי דגימות להסרת חלבונים נספגים. אחסן את התמיסה הכלורית העובדת בטמפרטורת החדר במיכל סגור. הפתרון נשאר יציב עד 3 חודשים. אין לאחסן בקרבת אור שמש, חום, מקורות הצתה, חומצות או אמוניה.

2. איסוף דגימות

1. יש לוודא שהמטופלים צמים לפחות 8–12 שעות לפני איסוף הדם.
2. בקשו מהמטופלים לנוח בישיבה או בשכיבה למשך 10–15 דקות כדי לייצב את ההמודינמיקה.
3. הכינו את הציוד הבא: מחטים דם ורידיות חד פעמיות, צינורות איסוף דם בוואקום (צינורות סרום), חוסמים, מטליות כותנה סטריליות, חומר חיטוי 75% אלכוהול או יודופור, תחבושת דבק רפואי, ומיכל פסולת ביולוגית.
   הערה: הווריד הקוביטלי האמצעי בפתח המרפק הוא אתר הדקירה המועדף.
4. יש להניח חוסם דם בגובה 3–5 ס"מ מעל אתר הדקירה כדי למלא את הווריד מספיק.
5. חטא את העור ב-75% אלכוהול או יודופור בתבנית ספירלית צנטריפוגלית מהמרכז החוצה, מכסה שטח בקוטר ≥5 ס"מ, ואפשר לחומר הניקוי להתייבש באוויר באופן טבעי מבלי לגעת שוב באזור.
6. החזק את המחט עם הזווית כלפי מעלה בזווית של 15–30° לעור ודוקב את העור ודופן הווריד בצורה חלקה.
7. לאחר צפייה בחזרת הדם, אבטח את המחט וחבר את שפופרת הוואקום. תנו לדם למלא את הצינור באופן פסיבי תחת לחץ שלילי, ללא דחיסה ידנית, כדי למנוע המוליזה.
8. לאחר האיסוף, שחררו תחילה את החוסם עורק, משכו את המחט בעדינות, ומיד לחצו על אתר הדקירה עם מטוש כותנה סטרילי למשך 3–5 דקות כדי להבטיח המיסטזיס.
9. מניחים את הדגימה שנאספה זקופה בטמפרטורת החדר ותנו לדם להיקרש באופן טבעי.

3. הערכת איכות המדגם

1. דגימות סרום צנטריפוגה בעוצמה של 2,095 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. דגימות סרום הנבדקים עברו הערכת איכות ויזואלית קפדנית תחת אור טבעי מספק על רקע לבן פשוט.
3. הערך המוליזה על ידי בדיקת הצבע והבהירות של הסופרנאנט. דגימות דרגה אינן המוליזות אם הסופרנטנט נראה צלול וצהוב, בעוד שכל שינוי צבע ורוד או אדום מעיד על המוליזה קלה עד חמורה.
   הערה: המוליזה עשויה ליצור אזור כפול אלפא-2. חלק בטא-2 עשוי לרדת בדגימות סרום ישנות או מאוחסנות בצורה לא נכונה.
4. בדקו התאבכות פיברינוגן על ידי בדיקת חוטי פיברין נראים לעין, קרישי דם או רשתות ג'לטיניות בתוך הסופרנאנט, וכן הפרדה לא שלמה, עכירות או אותות אנליטיים לא עקביים.
   הערה: פיברינוגן נודד במצב בטא-2 (כתף על בטא-2 או מונח על גבי אזור בטא-2, עם אפשרות להגדלה של חלק זה). בחלק מהדגימות (פלזמה, סרום שלא עבר דפיברינציה מלאה, או מטופלים בטיפול נוגדי קרישה), פיברינוגן עלול להפריע לניתוח ולהוביל לפרשנות לא מדויקת, כמו חשד לרצועה מונוקלונלית או עלייה בחלק של בטא-2.
5. יש להוציא דגימות המראות המוליזה, הפרעות פיברינוגן או חריגות טרום-אנליטיות אחרות לאחר שזוהו בניתוח.
6. איסוף דגימת דם חדשה בהתאם לפרוטוקולי פלבוטומיה ועיבוד סטנדרטיים, תוך הבטחת זמן קרישה מתאים ופרמטרים סטנדרטיים של צנטריפוגה. השתמשו רק בדגימות בעלות מראה מספק—שקופות, ללא המוליזה, פיברין, לימפיה או זיהום לבדיקות הבאות.
7. בדקו את דגימות הסרום המופרדות בהקדם האפשרי בטמפרטורת החדר. אם אין בדיקה מיידית, יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס עד 10 ימים ובטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד 30 יום. אין להקפיא ולהפשיר דגימות שוב ושוב.
   הערה: הימנעו מדגימות פלזמה. בעת ניתוח דגימות פלזמה מיושנות (שאינו מומלץ), רכיבים גמישים כמו משלים C3 מתפרקים עם הזמן, ולכן אזור בטא-2 בעצם מתאים לפיברינוגן.
8. לפני הבדיקה, החזירו את הדגימות לטמפרטורת החדר וערבבו אותן היטב. ודא שהדגימות הקפואות הפושרות לחלוטין לפני השימוש.
   הערה: השתמש בדגימות חלבון סרום לא מדולל. חלק מהסרומים המאוחסנים עלולים להפוך לצמיגים או עכורים, במיוחד כאלה המכילים קריוגלובולינים או קריוג'ל. השתמש בדגימות המכילות פוליאימונוגלובולינים ישירות ללא טיפול מוקדם נוסף.

4. נהלים מבצעיים

1. חשמל על אנלייזר האלקטרופורזה הקפילרי האוטומטי (ראו טבלת חומרים) ועל מערכת המחשב המחוברת. חכה עד שהכלי יוכל לאתחול במלואו.
   הערה: אורך הנימים והקוטר הפנימי הם 17.5 ס"מ ו-25 מיקרון, בהתאמה. מתח ההפרדה נע בין 8,000–10,000 וולט. נעשה שימוש בהזרקה אלקטרוקינטית, וטמפרטורת ההפרדה נשמרת על כ-25 מעלות צלזיוס. משך הריצה הכולל הוא כ-10 דקות לכל דגימה.
2. השיק את תוכנת PHORESIS (ראו טבלת חומרים) המותקנת במחשב לעיבוד נתונים.
3. מממשק התוכנה, בחר את תוכנית PROTEIN (E) 6 ואז הכנס את בקבוק הבופר הרץ למכשיר.
   הערה: תוכנית זו היא פרוטוקול פריסט מכויל במפעל שתוכנן במיוחד לשבירת חלבוני סרום. כל הפרמטרים מוגדרים מראש בתוכנת PHORESIS של הכלי ללא צורך בשינוי ידני.
4. במידת הצורך, הניחו את בקבוק התגובה המכיל תמיסת ניקוי מסיסה, בתוך הכלי.
5. התקן תגובה חדשה על פלטפורמת הטעינה האוטומטית של מנתח האלקטרופורזה הקפילרי.
6. התקן תיבת פסולת חדשה במיקום הסטנדרטי של מנתח האלקטרופורזה הקפילרי עבור כוסות התגובה המשומשות.
7. טעין את מדפי הדגימה לאנלייזר דרך הפתח בצד ימין (קיבולת מרבית: 15 מדפים).
   הערה: כל מדף יכול להכיל עד 8 צינורות דגימה. הברקוד על כל מבחנה חייב להיות נראה דרך פתח המדף.
8. השתמש במדף דגימות מספר 0 לסרום הבקרה. השתמש בבקרת איכות של צד שלישי המבוססת על ממוצע מצטבר ומקדם שונות שחושבים מ-20 נקודות נתונים של בדיקה.
9. הסר את מתקן הדגימה המוגמר ממגש הפריקה בצד שמאל. הסר והשליך את קופסת הפסולת המכילה את כוסות התגובה המשומשות במידת הצורך.
   זהירות: יש לטפל בכוסות המגיב המשומשות בזהירות, שכן הן עלולות להכיל דגימות ביולוגיות.
10. הניחו את תמיסת הניקוי הקפילרי במיקום S2 בתא התגובה המשני. לחץ על תחזוקה וניקוי במסך המכשיר, ואז בחר התחל Capiclean.
11. הנח תמיסת נתרן היפוכלוריט של 2-3% בתא התגובה המשני (מיקום T1). לחץ על תחזוקה וניקוי במסך המכשיר, ובחר ב'התחל דה-קונטמינציה'.
    הערה: כל תהליך ניקוי הנימים נמשך אוטומטית למשך 45 דקות.
12. התחל את רצף הניקוי לפחות פעם בשבוע.

5. ניתוח תוצאות

1. לאחר סיום כל ריצת ניתוח, שלחו נתונים גולמיים מהכלי לתוכנה לעיבוד. התוכנה מייצרת אלקטרופרוגרמה המוצגת על מסך המחשב.
2. נתח את האלקטרופרוגרמה וכמת עוצמות הספיגה היחסית של כל רצועת חלבון באורך גל של 200 ננומטר באמצעות התוכנה.
   הערה: בהתבסס על ריכוזי החלבון הכוללים שנמדדו על ידי האנלייזר הביוכימי האוטומטי במלואו, התוכנה מחשבת את הריכוז של כל רצועת חלבון.
3. השתמשו באלקטרופרוגרמות שנוצרו להערכה ויזואלית ולזיהוי רצועות חריגות.
   הערה: כברירת מחדל, המערכת מציגה אלקטרופרוגרמות במצב ציור מחדש.
4. השתמש במצב סטנדרטי להצגת אלקטרופרוגרמות ראשוניות שמקורן בנתונים גולמיים במידת הצורך.
   הערה: טווחי ההתייחסות של האנלייזר האלקטרופורטי הקפילרי נקבעו באמצעות ניתוח סטטיסטי של 246 משתתפים בוגרים בריאים (גברים ונשים) עם רמות טריגליצריד תקינות (טבלה 1). מומלץ שכל מעבדה תקבע תקנים משלה.

6. כיבוי מכשירים

1. בסיום כל רצף ניתוח, יש להתחיל את תהליך הכיבוי של מנתח האלקטרופורזה הקפילרי כדי לאחסן את הנימים בתנאים אידיאליים.
   1. כדי להתחיל את תהליך הכיבוי, בחר "כיבוי" מהתפריט הראשי או השתמש במדף הכיבוי שמצורף לאנלייזר.
   2. לחץ על "כיבוי" בתפריט הראשי. בחלון המוצג על המסך, לחץ כדי להתחיל את ההליך. תהליך ההשבתה יתחיל אוטומטית עם סיום תוכנית הניתוח המתמשכת.
   3. מדף הכיבוי מסומן "EXTINCTION/SHUTDOWN CAPILLARYS 3 & MC". הכנס את המדף הזה לסוף תור מדף הדגימה, והכלי יתחיל אוטומטית את תהליך הכיבוי.
      הערה: כאשר תהליך הכיבוי מסתיים, המכשיר כבוי והמסך יכבה.
2. השתמש במתג ההפעלה הפיזי בגב המכשיר כדי לנתק את האנלייזר מהחשמל הרשתית.
3. הסר את כל בקבוקי התגובה משני תאי התגובה ואחסן אותם בתנאי אחסון מומלצים. תקלות נפוצות, סיבות אפשריות ופתרונות של אנלייזר האלקטרופורזה האוטומטי לחלוטין מוצגים בטבלה משלימה 1.

7. פרמטרי ביצועים

1. כדי לקבוע את הרגישות האנליטית של הליך האלקטרופורזה הקפילרית, יש להכין ולנתח דילול סדרתי של דגימת סרום המכילה חלבון חריג באזור הגמא בעוצמה של 1.198 גרם/ד"ל. הדילול הגבוה ביותר עם חריגה ניכרת מתאימה לריכוז של 19 מ"ג/ד"ל של החלבון החריג.
   הערה: בהתאם למיקום החלבון הלא תקין ולרקע הפוליקלונלי באזור הגמא, מגבלת הגילוי עשויה להשתנות.
2. הערכת דיוק – קורלציה פנימית
   1. כדי להבטיח שלמות דגימה, יש לעבד את כל דגימות הסרום (כולל 18 דגימות רגילות ו-100 דגימות פתולוגיות) באופן זהה ולטפל בהן לפי אותן הנחיות.
   2. מדדו את רמות כל חלק חלבוני הן באמצעות הפרדות אלקטרופורטיות שהתקבלו באמצעות הליך האלקטרופורטי הקפילרי על האנלייזר והן באמצעות טכניקת אלקטרופורזה קפילרית מסחרית נוספת לניתוח חלבונים.
   3. נתח את הערכים הנמדדים משני ההליכים באמצעות הליך סטטיסטי של רגרסיה ליניארית. התוצאות שהושגו הראו מתאם מושלם בין שתי התהליכים.

תוצאות

מיקומי הנדידה, מאפייני השיא והאחוזים היחסיים של כל רצועת חלבונים נותחו כמותית על ידי זיהוי ספיגת חלבון הסרום. לאחר מכן בוצעה פרשנות קלינית בהתבסס על נוכחות ודפוס של פסים חריגים שנצפו באלקטרופרוגרמה. אלקטרופרוגרפיה קפילרית מייצגת המציגה את דפוס הנדידה התקין של חלקי חלבוני הסרום מוצגת באיור 1. שינויים בזמני הנדידה השיא מיוחסים בעיקר להבדלים פיזיולוגיים בין מטופלים המשפיעים על תכונות מטריצת הדם. בפרט, הבדלים בעוצמת היונים של מטריצת הדם, נוכחות רכיבים מפריעים, ושינויים חלבונים לאחר תרגום תורמים ...

דיון

SPE היא טכניקת אבחון בסיסית במעבדות קליניות, המפרידה בין חלבוני הסרום על פי הבדלים בנקודות האיזואלקטריות שלהם, במשקלים המולקולריים ובקונפורמציות¹⁹. מחקר זה מתאר באופן שיטתי פרוטוקול לזיהוי וכימות מהיר של חלבון M בסרום באמצעות CE. הפרוטוקול מדגיש את הביצועים האנליטיים המצוינים של השיטה, כאשר יתרונותיה המרכזיים הם רגישות גבוהה, קצב תפוקה גבוה ואוטומציה מלאה²⁰. בשל אופיו המונוקלונלי, חלבון M מציג בדרך כלל דפוס נדידה מובחן ומקומי, שמוביל לשיא ח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בופר חלבון CAPI 3 (E) 6	סביה	2503	בופר ריצה המשמש להפרדת חלבוני סרום באלקטרופורזה נימית (המכונה בופר רץ בכתב היד).
תמיסת שטיפת דה-לבג'	סביה	2062	תמיסת שטיפה מדוללת המשמשת לניקוי צינורות נימים לאחר אלקטרופורזה.
כוסות מגיב	סביה	2582	לדילול דגימות על כלים אוטומטיים לחלוטין.
נימי סינון	סביה		מסנן חד-פעמי המשמש לסינון תמיסות בופר ומים דה-יוניים במהלך ניקוי קפילרי.
קפיקלין	סביה	2060	לניקוי צינורות קפילריים של כלי CAPILLARYS 3 OCTA (המכונים בתמיסת ניקוי הנימים בכתב היד)
תמיסת נתרן היפוכלוריט	מפעל החומרים הכימיים של גואנגג'ואו	1703079	לניקוי גלאי דגם.
מים דה-יוניים	ווטסונס	/	משמש לשטיפת נימים במנתח אלקטרופורזה קפילרי אוטומטי.
בקרת איכות של רנדוקס	רנדוקס	HN1530	לבקרת איכות.
אנלייזר אלקטרופורזה קפילרי אוטומטי לחלוטין	סביה	קפילריס 3 אוקטה	מכשיר המשמש לניתוח חלבון סרום ברזולוציה גבוהה ובתפוקה גבוהה.
תוכנת PHORESIS 9.30	סביה	/	תוכנה המשמשת לרכישה וניתוח אוטומטי של דפוסי אלקטרופורזה.