דימות ברזולוציה גבוהה וניהול משותף: פרוטוקול למיקרוסקופיה קונפוקלית עם זיהוי מולטיפלקס

Summary

פרוטוקול זה מפרט את יישומי ההדמיה המתקדמים ואת ניהול המשאבים המשותפים של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורקת לייזר, המשולבת עם גלאי מערך מרובה לעיבוד ברזולוציה גבוהה להדמיה תאית ותת-תאית ברזולוציה גבוהה. תהליך העבודה מאפשר הדמיה מולטימודלית מקונפוקלי לרזולוציה סופר (~120 ננומטר) בתוך פלטפורמה אחת, מה שמקל על הדמיה בקנה מידה ננומטר.

Abstract

מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה (SRM) מתגברת על מגבלת הדיפרקציה של מיקרוסקופיית אור קונבנציונלית, ומאפשרת הדמיה ננומטרית של מבנים תת-תאיים. עם זאת, האימוץ הנרחב של טכניקות כמו מיקרוסקופיית דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופ לוקאליזציה פוטואקטיבציונית (PALM) / מיקרוסקופיה לשחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ומיקרוסקופיה של תאורה מובנית (SIM) עלול להיפגע מגורמים כמו פוטוטוקסיות גבוהה, הכנת דגימות מיוחדת או פעולה מורכבת. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף המשתמש בפלטפורמת קונפוקלית לסריקת לייזר המשולבת עם גלאי סופר-רזולוציה מולטיפלקס. מערכת זו, בשילוב עם עיבוד חישובי, מאפשרת מעבר פשוט בין הדמיה קונפוקלית לסופר-רזולוציה בתוך אותו תהליך עבודה. הפרוטוקול מספק גישה ידידותית למשתמש להדמיה מהירה, ברזולוציה גבוהה ובעלת פוטוטוקסיות נמוכה. השיטה המפורטת כוללת יכולות הדמיה רב-מודלית, כולל פלואורסצנציה רב-צבעונית, קונטרסט הפרעות דיפרנציאליות (DIC), שחזור Z-stack תלת-ממדי, הדמיית תאים חיים ב-time-lapse, ריצוף בשטח גדול, ומצבי רזולוציה-על שונים המוצעים על ידי גלאי המערך המולטי-פלקס. השוואות שיטתיות מראות כי מצבי הרזולוציה העל-מגיבה לרזולוציה רוחבית של כ-120 ננומטר, מה שמייצג שיפור כפול על גבול הדיפרקציה של מיקרוסקופיה רחבת שדה קונבנציונלי ושיפור משמעותי הן ברזולוציה והן ביחס אות לרעש (פי 4-8) בהשוואה לפעולה קונפוקלית סטנדרטית על אותה פלטפורמה. הדיון גם עוסק בנקודות מרכזיות במודל ניהול משאבים משותף החיוני לתמיכה בתפקוד בר-קיימא של טכנולוגיה זו. מדריך משולב זה משמש משאב חשוב הן לחוקרים חדשים והן למנוסים ולמנהלי מתקנים השואפים לאמץ ולמקסם את הפוטנציאל של צורת דימות מתקדמת נגישה זו במחקר מדעי החיים.

Introduction

הדמיה של מבנים תת-תאיים דינמיים היא יסודית לקידום מחקר מדעי החיים. עם זאת, הרזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית מסורתית מוגבלת על ידי דיפרקציה לכ-200 ננומטר לרוחב, מה שמגביל את יכולתו לפענח תהליכים תת-תאיים דינמיים. כדי להתגבר על מחסום זה, פותחו טכניקות שונות לסופר-רזולוציה. עם זאת, טכניקות כמו מיקרוסקופיית STED, PALM/STORM ו-SIM לעיתים מציבות מחסומים לאימוץ נרחב בסביבות רב-משתמשיות, כולל פוטוטוקסיות גבוהה, צורך בפלואורופורים מיוחדים או הכנת דגימות, הליכי יישור מורכבים או עיבוד חישובי אינטנסיבי ^1,2,3.

בהקשר זה, מערכות מיקרוסקופ קונפוקלי המצוידות בגלאי מערך מרובה מערך מציעות אלטרנטיבה משכנעת על ידי אפשרות הדמיה ברזולוציה על-גבוהה באמצעות זיהוי רב-פיקסלים והקצאה מחדש חישובית, מה שמוריד משמעותית את הסף הטכני⁴. גישה זו מנצלת מערך גלאי גאליום ארסניד פוספיד (GaAsP) בן 32 אלמנטים כדי לאסוף יותר פוטונים מכל נקודת סריקה. אלגוריתמים אינטליגנטיים של דה-קונבולוציה מאוחרים לאחר מכן מחלקים מחדש את המידע הזה, ובכך מפחיתים למעשה את נפח הגילוי. תהליך זה משיג רזולוציות מרחביות של כ-120 ננומטר לרוחב ו-350 ננומטר צירית, מה שמייצג שיפור פי 2 על גבול הדיפרקציה של מיקרוסקופ שדה רחב ומניב עלייה פי 4-8 ביחס האות לרעש לעומת מצב קונפוקלי סטנדרטי באותו מכשיר ^4,5,6. השילוב הייחודי הזה של רזולוציה משופרת, איכות אות מעולה ותאימות לתוויות ופרוטוקולים פלואורסצנטיים נפוצים מהווה את היתרון העיקרי שלה ליישומים רחבים.

כתוצאה מכך, סוג זה של מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה נגישה מצא יישום נרחב במחקר מדעי החיים, ומאפשר מחקרים מפורטים של מורפולוגיית אברונים, דינמיקת שלדי התא, אינטראקציות בין וירוס למארח, וקולוקליזציה מולקולרית בתאים קבועים וחיים^כאחד. העדינות היחסית שלה הופכת אותה למתאימה במיוחד לתצפיות טיימלפס ממושכות של דגימות חיות.

שילוב מערכות מתקדמות כאלה במתקנים מרכזיים הוא קריטי לדמוקרטיזציה של הגישה, אך תפעולן בת-קיימא ויעיל מציב אתגרים ברורים. במוסדות מרכזיים מרכזיים, כמו בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג, ביצועים מיטביים והשפעה תלויים באופן קריטי בשלושה עמודי תווך: (1) פרוטוקולי הדמיה סטנדרטיים וניתנים לשחזור, (2) תחזוקה שגרתית קפדנית, ו-(3) מסגרת ניהול יעילה לגישה משותפת. בעוד שקיימים משאבים יקרי ערך להיבטים מסוימים, כגון שיטות הדמיה עבור מערכות⁹קודמות או עקרונות ניהול מתקנים כלליים^10,11, מדריך מקיף המשלב פרוטוקולים מפורטים וניתנים לשחזור עבור פלטפורמות גלאי מערך מרובות מודרניות עם מודל ניהול משאבים משותפים מוכח כיום חסר. מאמר הפרוטוקול הזה שואף לגשר על הפער הזה.

המטרה הכוללת היא לספק מדריך מקיף שלב אחר שלב ליישום ושימוש יעיל במערכת קונפוקלית עם גלאי מערך מרובה לצורך דימות ברזולוציה על-ברזולוציה בתוך סביבה של משאבים משותפים. הוא מיועד לשני קהלים עיקריים: חוקרים הזקוקים לרזולוציה מעבר לגבולות קונפוקליים קונבנציונליים (~250-300 ננומטר) אך עבורם תאימות תאים חיים, קלות השימוש וקצב התפוקה הם גם קריטיים; ומנהלי מתקנים שמקימים או אופטימיזציה של שירות כזה. כאן אנו מפרטים באופן שיטתי את תצורת המערכת, פרוטוקולי הדמיה רב-מודליים (הכוללים מצבי רב-צבעוני, תלת-ממד, תאים חיים, ריצוף ורזולוציה על-טבעית), ומודל ניהול משותף מוכח. מדריך משולב זה משמש כמשאב למקסום הפוטנציאל והנגישות של שיטת ההדמיה החזקה הזו.

Protocol

כל הניסויים שכללו דגימות ביולוגיות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של מתקני הליבה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ג'יאנג ואושרו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (תעודת אישור מס' BSL20235710079).

הערה: כל ההליכים הכוללים תרביות תאים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית מסוג Class II אלא אם צוין אחרת. פרוטוקול זה מניח שמערכת המיקרוסקופ מותקנת, וכוחות הלייזר מכוילים. מפרטים מפורטים וספקים מומלצים לחומרים מרכזיים, צרכנים וציוד (למשל, צלחות הדמיה, זכוכית כיסוי, מדיום הרכבה) מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימה

הערה: הדמיה סופר-רזולוציה מוצלחת מתחילה בהכנה מיטבית לדגימה. שימוש בכלי הדמיה איכותיים בעובי 1.5 (0.17 מ"מ) מבוסס זכוכית הוא חיוני כדי להתאים את צווארון התיקון של מטרות טבילה בשמן עם NA גבוה ולמנוע סטייה כדורית. כל שלבי הצנטריפוגה צריכים להתבצע ב-300 × גרם למשך 5 דקות אלא אם צוין זאת.

1. הכנת דגימות תאים קבועות להדמיה סופר-רזולוציה רב-צבעונית (למשל, תאי COS7)
   הערה: פרוטוקול זה מתאר צביעת חיסון למיקרוטובולים (Alexa Fluor 568) ולמיטוכונדריה (Alexa Fluor 488), עם צביעת נגד גרעינית 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), כפי שמוצג באיור 1.
   1. תרבית תאי COS7 במדיום Eagle (DMEM) המותאם של Dulbecco, עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לחות עם 5%_CO2 .
   2. תאי לוח על צלחות הדמיה 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בצפיפות של 1.0 × 10⁵ תאים לצלחת. אפשר לתאים להידבק ולגדול עד 60-70% מפגש (בדרך כלל 24 שעות).
   3. שאופי את מדיום התרבית ושוטף תאים בעדינות עם מלח מחומם מראש (37°C) עם מלוחה מפופר פוספט (PBS). תקבע את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   4. שאפו את תמיסת ה-PFA (התייחסו לפסולת מסוכנת). שטפו את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS, תוך דגירה של 5 דקות בכל שטיפה עם נדנוד עדין.
   5. חדירת חסימה וחסימה: דגרו את התאים עם 1 מ"ל של בופר חסימה/חסימה (0.1% v/v) טריטון X-100, 1% (עם חוץ) אלבומין סרום בקר (BSA) ב-PBS) למשך 30 דקות ב-RT.
   6. דגירה ראשונית של נוגדנים: דגירה של תאים עם תערובת של נוגדנים ראשוניים נגד α-tubulin (מונוקלונלי עכבר) ו-TOMM20 (פוליקלונל ארנב) במאגר דילול נוגדנים (1% BSA ב-PBS) בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה (או 1-2 שעות ב-RT). השתמש ב-300 מיקרוליטר לכל צלחת כדי לכסות את פני הזכוכית.
   7. שטיפה: שאפו בזהירות את תמיסת הנוגדנים הראשית. שטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS המכיל 0.05% Tween-20 (PBST), 5 דקות בכל שטיפה.
   8. צביעת נוגדנים משניים וגרעין: הכינו תערובת של נוגדנים משניים פלואורסצנטיים ו-DAPI בבופר דילול נוגדנים (1% BSA/PBS), מוגן מאור.
      1. השתמש ב-IgG אנטי-עכבר לחמור המקושר ל-Alexa Fluor 568 (1:500) ו-IgG נגד ארנב לחמור המקושר לאלקסה פלור 488 (1:500).
      2. כלול DAPI בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל לצביעה גרעינית. מרחו 300 מיקרוליטר מהתערובת הזו על התאים ודגרו במשך שעה אחת ב-RT בחושך.
   9. שטיפה סופית: שאפו את תמיסת הצביעה ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS, 5 דקות לכל שטיפה.
   10. מרח מדיום הרכבה: שאפו בזהירות את ה-PBS מהצלחת, והשאירו את הדגימה מעט לחה. מיד הניחו טיפה קטנה (~20 מיקרוליטר) של מדיום הרכבה נגד דהייה מוקשח (למשל, ProLong Gold) ישירות על אזור תחתית הזכוכית.
   11. כיסוי וקיבוץ: הורד בעדינות כיסוי #1.5 מדויקת על הטיפה, כדי להימנע מבועות. אפשר למתקן להתקשות בלילה ב-RT בחושך, או ל-2-4 שעות בטמפרטורה של 37°C אם צריך ייבוש מהיר יותר.
2. הכנת דגימת תאים חיים להדמיית טיים-לאפס (למשל, תאי Hep3B המבטאים תג חלבון פלואורסצנטי).
   הערה: פרוטוקול זה מתאר הדמיה של תאי Hep3B המבטאים באופן יציב חלבון פלואורסצנטי (למשל, EGFP) המיועד למיטוכונדריה.
   1. תרבית תאי Hep3B במדיה חיונית מינימלית (MEM) בתוספת 10% FBS. תאי לוחות על צלחות הדמיה עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ (1.5 זכוכית כיסוי) בצפיפות של 0.8 × 10⁵תאים לצלחת. אפשר לתאים לגדול לכ-70-80% מפגש לבריאות אופטימלית וצפיפות הדמיה (בדרך כלל 18-24 שעות).
   2. הכנה להדמיה: ביום ההדמיה, החליפו בעדינות את מדיום התרבית הסטנדרטי ב-2 מ"ל של מדיום דימות מאוזן מראש (37°C, 5%_CO2 למשך לפחות 30 דקות), ללא פנול אדום, בעל פלואורסצנציה נמוכה, בתוספת 10% FBS ואם יש צורך, בופר HEPES של 25 מ"מ לייצוב pH מחוץ לאינקובטור_CO2 . זה ממזער את הפלואורסצנציה ברקע ושומר על pH פיזיולוגי במהלך ההדמיה.
      הערה: אפשר למנה להסתגל לשלב המיקרוסקופ המחמם מראש בתוך תא הסביבה לפחות 30-45 דקות לפני תחילת רכישת הזמן-לאפס כדי להבטיח טמפרטורה, מיקוד וייצוב בריאות התאים.

2. הפעלת מערכת מיקרוסקופ, אתחול ויישור בסיסי

1. חשמל על יחידת המיקרוסקופ הראשית, מודול שיגור הלייזר (המכיל לייזרים מוצקים ב-405, 488, 561 ו-640 ננומטר), מקור האור של ה-LED, ומחשב הבקרה.
   1. תן ללייזרים להתחמם ולהתייצב לפחות 15-20 דקות. זה קריטי להספק לייזר יציב, במיוחד בניסויים כמותיים או טיים-לאפס.
2. השיק את תוכנת ההפעלה של מיקרוסקופ.
3. מהממשק הראשי, בחר 'Microscope' > 'Initialize' או עקב אחרי אשף ההפעלה של התוכנה.
4. בתוכנה, עברו ללוח 'רכישה'. מתפריט הנפתח של עדשת האובייקטיביות, בחר 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 שמן ' או את האובייקטיב המתאים לניסוי שלך.
5. מרחו טיפה של שמן טבילה (מקדם שבירה = 1.518) ישירות על העדשה הקדמית של האובייקטיבי. הימנעו מהכנסת בועות.
6. בהדמיה של תאים חיים, יש להפעיל את תא הסביבה ואת מערכת ייצוב המיקוד הפעיל (למשל, 'Definite Focus' >) לפחות 45-60 דקות לפני ההדמיה. הגדר את הטמפרטורה ל-37°C,_CO2 ל-5%, והלחות ל->60%. תן למערכת להתייצב. בדוק את היציבות באמצעות חיישני התא.
7. המערכת מוכנה כעת לטעינת דגימות והגדרת פרמטרי הדמיה.

3. הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעונית

1. הנח את הדגימה המוכנה על שלב המיקרוסקופ. הרימו בזהירות את הבמה עד שזכוכית הכיסוי נוגעת בשמן הטבילה.
2. בתוכנת הרכישה, נווט בלשונית 'רכישה' ובחר ליצור ניסוי חדש.
3. הוסף מספר מסלולי הדמיה (ערוצים) התואמים לפלואורופורים שבהם משתמשים. לדוגמה באיור 1, הגדר:
   1. מסלול 1 (DAPI): עירור 405 ננומטר, גילוי 410-480 ננומטר.
   2. מסילה 2 (Alexa Fluor 488): עירור 488 מייל ימי, גילוי 495-550 מייל ימי.
   3. מסלול 3 (Alexa Fluor 568): עירור 561 ננומטר, גילוי 570-620 ננומטר.
4. לכל מסילה, כוון את קוטר הפיני קונפוקלי ל-1 יחידת אווריות (1 AU).
5. אופטימיזציה של עוצמת הלייזר ורווח הגלאי עבור כל ערוץ באמצעות תהליך איטרטיבי הבא:
   1. בחר את הערוץ הראשון (למשל, DAPI). עבור למצב סריקה 'חיה'.
   2. הגדר את עוצמת הלייזר ההתחלתית לערך נמוך (למשל, 0.1-0.5%). הגדר את רווח הגלאי לרמה בינונית בטווח הליניארי שלו (למשל, 700 וולט עבור PMT GaAsP).
   3. הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר עד שמבני המטרה נראים בבירור מעל הרקע בתמונה החיה.
   4. פתח את תצוגת ההיסטוגרמה . ודא שאין רוויה בפיקסלים (ההיסטוגרמה לא נערמה בקצה הימני). הפחיתו את עוצמת הלייזר במידת הצורך.
   5. כוון את הגיין של הגלאי כדי להשיג תמונה בהירה ובעלת רעש נמוך. הימנעו מהתקדמות מעל 850 וולט כדי למנוע רעש מופרז.
   6. חזור על שלבים 3.5.1-3.5.5 לכל ערוצי הפלואורסצנציה שנותרו.
      הערה: איזון בין עוצמת הלייזר, הרווח וזמן השהייה בפיקסלים כדי למקסם את יחס האות לרעש תוך מזעור נזק לאור. עבור תאים חיים, תתן עדיפות להספק נמוך וזמני שהייה קצרים יותר.
6. הגדר את פורמט התמונה (מספר הפיקסלים) ואת זמן השהייה של הפיקסלים.
   1. הגדר את גודל הפיקסל כך שיעמוד בקריטריון נייקוויסט: גודל פיקסל ≤(רזולוציה / 2.3). להדמיה קונפוקלית סטנדרטית (רזולוציה רוחבית ~250 ננומטר), הגדר את גודל הפיקסל ≤108 ננומטר.
   2. השתמש בכפתור הדגימה 'Nyquist ' של התוכנה כדי לחשב זאת אוטומטית אם זה זמין.
   3. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים. השתמש בזמן שהייה ארוך יותר (למשל, 1.0-2.0 מיקרושניות) ליחס אות לרעש גבוה יותר, או בזמן שהייה קצר יותר (למשל, 0.5-1.0 מיקרושניות) להדמיה מהירה יותר.
7. ודא שמצב 'סריקה רציפה' נבחר בין המסלולים כדי למזער דיבור חופף.
8. לחץ על 'התחל' כדי לקבל תמונה אחת. שמור את התמונה עם מטא-דאטה רלוונטי.

4. הדמיית קונטרסט בהפרעות שונות (DIC)

1. בלשונית 'רכישה' של תוכנת הרכישה, בחר 'הוסף ערוץ חדש ' והגדר אותו לזיהוי אור משודר.
2. בחר את גלאי האור המשודר המתאים (לעיתים נקרא T-PMT (צינור פוטומולטיפלייר אור מועבר) או ESID (גלאי ממשק מערכת חיצוני) בתוכנה).
3. פריזמת DIC ותצורת הקיטוב:
   1. מלוח הבקרה החומרתי או ממשק התוכנה, בחר את פריזמת ה-DIC התואמת למטרה שלך (למשל, 'DIC III' עבור מטרה של 63x).
   2. הכנס את הפריזמה הנבחרת לנתיב האור.
4. כוון את הפולרייזר ואת מחוון ה-DIC לניגודיות אופטימלית:
   1. סובב את האנלייזר (המקטב) עד שהרקע בתמונה 'חיה' נראה כהה או עמום מאוד.
   2. בעת צפייה בתמונה החיה, כוון לאט את מיקום מחוון ה-DIC במרווחים קטנים.
   3. אופטימיזציה עד שתכונות תאיות (למשל, ממברנות, גרעינים) יופיעו עם תבליט פסאודו-תלת-ממדי מובחן על רקע אפור ניטרלי.
5. הגדר את אורך הגל של DIC לערך בטווח הנראה (למשל, 488 ננומטר או 546 ננומטר).
6. כוונו את עוצמת השידור (הספק לייזר או מנורה) ואת רווח הגלאי של ערוץ האור המשודר כדי להשיג תמונה ברורה ללא רוויה.
7. רכוש את תמונת ה-DIC.

5. רכישת מחסנית Z לשחזור תלת-ממדי

הערה: לפני הגדרת מחסנית ה-Z, הגדר את כל פרמטרי ההדמיה (עוצמת לייזר, רווח, חור סיכה, גודל פיקסל) על מישור מוקד אחד ואופטימלי כפי שמתואר בסעיף 3. זה מבטיח הגדרות עקביות בכל חלקי האופטיקה.

1. בלשונית 'רכישה', בחר במצב 'Z-stack'.
2. הגדר את נפח העניין:
   1. באמצעות סריקה חיה ומהירה, תתמקד במבנה העליון שמעניין אותו.
   2. לחץ על 'Set First' (או 'Top').
   3. תתמקד בזהירות במבנה התחתון ביותר שמעניין אותו.
   4. לחץ על 'Set Last' (או 'Bottom'). התוכנה תציג את העומק הכולל.
3. הגדר את גודל שלב ה-Z כך שיקיים את קריטריון הדגימה של נייקוויסט בכיוון הצירי. (בדרך כלל d_r/2.3, כאשר d_r היא הרזולוציה הצירית). למטרת שמן 63x/1.4 NA, השתמש ב-0.3-0.4 מיקרון.
4. חלופה נוספת היא להשתמש בכפתור 'Optimal' או 'Nyquist' של התוכנה כדי לחשב אוטומטית את גודל הצעד.
5. הגדר פרמטרי הדמיה (עוצמת לייזר, רווח, חור סיכה = 1 AU) לכל ערוץ כפי שמתואר בסעיף 3. לאותות חלשים, שקול להגדיל מעט את עוצמת הלייזר או הרווח לעומת תמונה דו-ממדית אחת.
6. התחל ברכישה כדי לאסוף את כל ערימת התמונות.
   הערה: זמן רכישה כולל = (זמן פריים מפרוסה אחת) × (מספר פרוסות)
   תכנן בהתאם, במיוחד לדגימות חיות.
7. שחזור וויזואליזציה תלת-ממדית:
   1. השתמש במודול 'Processing' של התוכנה (למשל, פונקציית הקרנה תלת-ממדית) או פתח את ערימת התמונה בתוכנה ייעודית כמו ImageJ/Fiji.
   2. יצר הקרנות עוצמה מרבית (MIP) כדי לצפות בכל אותות המיקוד בתמונה דו-ממדית אחת.
   3. לייצוג תלת-ממדי אמיתי, יישם רינדור נפח. כוון את הבהירות, האטימות והתאורה לפי הצורך.
   4. יצירת תצוגות אורתוגונליות (חתכי XZ ו-YZ) כדי לבדוק את היקף הציר והרישום.

6. הדמיית טיים-לאפס לתאים חיים

1. הכינו תאים חיים כפי שמתואר בסעיף 1.2. ולהתקין את הצלחת על שלב המיקרוסקופ המחומם מראש בתוך תא הסביבה.
2. אפשר לדגימה להסתגל לפחות 45-60 דקות כפי שמתואר בסעיף 2.6 כדי להבטיח ייצוב.
3. לנווט לשדה ראייה עם תאים בריאים ומרווחים היטב ולקבל תמונת מצב איכותית אחת באמצעות פרמטרים מותאמים לפי סעיף 3.5.
4. הפעל את מערכת ייצוב המיקוד הפעיל (למשל, מיקוד ברור או דומה). זה לא נתון למשא ומתן בניסויים ארוכי טווח כדי לפצות על נדידת תרמית.
5. בלשונית 'רכישה', בחר במצב 'סדרת זמן'.
6. בחר את מצב ההדמיה המתאים בהתבסס על האיזון הנדרש בין מהירות, רזולוציה ופוטוטוקסיות:
   1. לרזולוציה מרחבית מקסימלית בתהליכים פחות דינמיים, בחרו במצב 'SR' (סופר-רזולוציה).
   2. לאיזון המתאים לדינמיקת אברונים רבים, בחרו ב-'SR 2 Y ' או 'SR 4 Y ' (מצבי סופררזולוציה מואצת).
   3. להדמיה במהירות גבוהה מאוד ללא רזולוציית על, בחר במצב 'Confocal' או 'Co 2 Y'.
7. הגדר את ציר הזמן של הניסוי: קבע את משך הניסוי הכולל ואת מרווח הזמן (Δt) בין פריימים עוקבים. (למשל, 5-30 שניות לתנועתיות מיטוכונדריאלית)
8. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה למזעור נזק פוטוגרפי:
   1. תתחיל עם עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר שמספקת אות שניתן לזיהוי.
   2. כוונן את הרווח של הגלאי בטווח הליניארי שלו (600-850 וולט) כדי להשיג רמת אות מתאימה, תוך העדפת הגבר על פני הגדלת עוצמת הלייזר.
   3. השתמש במהירות הסריקה המהירה ביותר (זמן השהייה הפיקסלי הקצר ביותר) התואמת לדרישות איכות התמונה.
9. התחילו את רכישת הטיימלפס. עקבו אחרי הפריימים הראשונים ליציבות פוקוס ובריאות התאים.

7. הדמיית אריחים בשטח גדול

1. בלשונית 'רכישה', בחר במצב 'סריקת אריחים'.
2. הגדר את אזור האריחים באמצעות אחת משתי שיטות:
   1. מבוסס פריסה: ציין את מספר האריחים בכיווני X ו-Y (למשל, 3 x 3).
   2. מבוסס ROI: ציור ידנית מלבן מעל התמונה 'Live' כדי להגדיר את אזור העניין. התוכנה מחשבת אוטומטית את מספר האריחים הנדרשים.
3. הגדר את החפיפה בין האריחים הסמוכים ל-10-15%.
   הערה: חפיפה זו מספקת מידע מספק לאלגוריתם התפירה של התוכנה ליצירת תמונה מורכבת חלקה.
4. הגדר פרמטרי הדמיה (עוצמת לייזר, רווח, רזולוציה) עבור אריח יחיד כפי שהגדרת לתמונה סטטית.
   הערה: לאזורים מרוצפים גדולים מאוד, כדאי להשתמש במצב סריקה מהיר יותר (למשל, 'Co 2 Y') כדי לשמור על זמן רכישה כולל פרקטי ולמזער הלבנת פוטו.
5. התחל ברכישת הריצופים. התוכנה תרכוש ותתפור אוטומטית את האריחים.
6. לאחר הרכישה, יש לבדוק בקפידה את התמונה התפורה, במיוחד בגבולות האריחים, לאיתור פריטים כלשהם. השתמש בכלי ההתאמה הידניים של התוכנה במידת הצורך.

8. הדמיה ברזולוציה על-גבוהה באמצעות גלאי מערך מרובה

1. בלשונית 'רכישה', עבור לבחירת המצבים, לחץ על 'הגדרה חכמה' ובחר במצב 'Airyscan'. לאחר מכן בחר 'סופררזולוציה' כמצב הפעלה לגלאי המערך המולטי-פלקס.
2. בחר את מצב הרכישה הספציפי בהתבסס על סדרי העדיפויות הניסיוניים:
   1. מצב 'SR': לרזולוציה מרחבית הגבוהה ביותר האפשרית (~120 ננומטר רוחבי). שימוש לדגימות קבועות.
   2. מצב 'SR 2 Y': מספק איזון בין רזולוציה למהירות.
   3. מצב 'SR 4 Y': מצב רזולוציית העל המהיר ביותר (עד קצב קו ~25 fps, תיאורטית), מותאם להדמיה של תאים חיים כדי למזער את מינון האור.
   4. מצב 'Co 2 Y': מציע מהירות הדמיה קונפוקלית עם יחס אות לרעש משופר, כאשר אין צורך ברזולוציה על.
      הערה: ערכי הרזולוציה (למשל, 120 ננומטר) הם מפרטי מערכת בתנאים אידיאליים¹². הרזולוציה בפועל תלויה בהכנת דגימה, יחס אות לרעש ועיבוד נכון.
3. הגדר את פרמטרי ההדמיה (עוצמת לייזר, רווח גלאי).
   1. בהדמיית תאים חיים, התחל בעוצמת לייזר נמוכה יותר מאשר במצב קונפוקלי כדי להפחית נזק פוטוגרפי.
   2. לדגימות עמומות וקבועות, ייתכן שיהיה צורך בעוצמת לייזר גבוהה יותר ו/או רווח כדי להשיג יחס אות-רעש מספיק.
   3. מצא את עוצמת הלייזר המינימלית שמניבה תמונה נקייה ובעלת ניגודיות גבוהה במצב 'Live'.
4. הגדר את גודל הפיקסלים וזמן השהייה (dhang).
   1. כדי ללכוד את הרזולוציה המשופרת, הגדר את גודל הפיקסל כדי לעמוד בקריטריון נייקוויסט: גודל פיקסל ≤(רזולוציה רצויה / 2.3). למצב SR (יעד 120 ננומטר), הגדר גודל פיקסל ≤~52 ננומטר.
   2. השתמש בכפתור 'אופטימלי' או 'Nyquist' של התוכנה כדי לחשב זאת אוטומטית אם זמין.
5. רכוש את התמונה. הנתונים הגולמיים מכילים אותות מרובבים ועדיין לא סופר-סולו.
6. עבד את הנתונים שנרכשו כדי להגיע לרזולוציה על:
   1. נווט למודול העיבוד של התוכנה.
   2. בחר את מערך הנתונים ובחר את פונקציית 'עיבוד רזולוציית על'.
   3. תתחיל עם הגדרות 'אוטומטי'. לנתוני lowSNR, כווננו ידנית את 'Strength' ו-'Noise Filter' כדי לשפר את החדות מבלי לגרום לארטיפקטים.
   4. (אופציונלי) לאיכות גבוהה ביותר, במיוחד בערימות תלת-ממדיות, יש להחיל שלב נוסף של דה-קונבולוציה (jDCV).
   5. בצע עיבוד. השווה בין תצוגות מעובדות ולא מעובדות כדי לוודא שיפור בפרטים אמיתיים.
7. (אופציונלי) לצורך השוואה כמותית של יחס אות-רעש (SNR) בין מצבים:
   1. לצלם תמונות של אותה דגימה במצבים שונים.
   2. בתוכנות ניתוח, מגדירים אזור עניין (ROI) על מבנה אחיד ומודדים את עוצמת האות הממוצעת.
   3. הגדר תשואה על רקע ומדד את סטיית התקן של עוצמת הרקע.
   4. חשב SNR = (אות ממוצע) / (סטיית תקן של הרקע).
8. (אופציונלי) למדידת רזולוציה אמפירית באמצעות חרוזי פלואורסצנטיות:
   1. הכינו דגימה של חרוזי פלואורסצנטי של 100 ננומטר.
   2. רכוש Zstack של חרוז מבודד במצב SR עם דגימת Nyquist.
   3. עבד את הסטאק עם סופר-רזולוציה ו(אופציונלי) jDCV.
   4. השתמש בכלי 'PSF Measurement' של התוכנה כדי להתאים גאוסיאן תלת-ממדי ולתעד את הרוחב המלא בערכי חצי מקסימום (FWHM).

Results

הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעונית
הדמיית פלואורסצנציה רב-צבעונית של תאי COS7 קבועים בוצעה כפי שמתואר בסעיף 3. נוגדנים נגד α-טובולין (מיקרוטובולים) ו-TOMM20 (מיטוכונדריה) שימשו יחד עם צביעת נגד גרעינית DAPI. כפי שמוצג באיור 1, גרעינים (כחול), מיטוכונדריה (ירוק, אלקסה פלואר 488) ומיקרוטובולים (אדום, אלקסה פלואר 568) סומנו בבירור עם ספציפיות גבוהה ועם דיבור ספקטרלי מינימלי, מה שאישר את יעילות הסריקה הסדרתית והגדרות הגילוי האופטימליות.

Discussion

הפרוטוקול המשולב המוצג כאן מספק מפת דרכים מקיפה ליישום יכולות הדימות המתקדמות של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי מודרנית המצוידת בגלאי סופר-רזולוציה של מערך מרובה מערך, במסגרת משאבים משותפים בת-קיימא. סעיף זה מסכם את ההיבטים הקריטיים של השיטה, היישום המעשי ומיקומה בתחום הביו-אימות. ביצוע מוצלח של פרוטוקול זה תלוי במספר שלבים מכריעים. ראשית, הכנת דגימות קפדנית היא יסוד; השימוש בתת-קרקעים תואמי רזולוציה גבוהה (למשל, זכוכית כיסוי #1.5) ופרוטוקולי צביעת חיסון אופטימליים הוא חיוני להשגת שלמות האות ו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תאי COS7	ATCC (או דומה)	CRL-1651	קו תאי פיברובלסטים של כליית קוף ירוק אפריקאי. משמש להכנת דגימות תא קבוע להדמיה סופר-רזולוציה רב-צבעונית
IgG נגד עכבר של חמור, אלקסה פלור 568 קונוגט	Invitrogen (או דומה)	A10037	נוגדן משני לצביעת מיקרוטובולים. בשימוש בדילול של 1:500
דולבקו' מדיום נשר מותאם (DMEM), רמות סוכר גבוהות	Gibco (או דומה לו)	11965092	מדיום תרבית סטנדרטי לתאי COS7, בתוספת 10% FBS.
סרום בקר עוברי (FBS), מנוטרל בחום	Gibco (או דומה לו)	10082147	תוסף סרום בשימוש ב-10% (v/v) בכל מדיום תרבית התאים.
צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית (35 מ"מ, &מיקרו-צלחת, #1.5 פולימר כיסוי, 0.17 מ"מ עובי)	איבידי (או דומה)	81156	מצע לציפוי תאים והדמיה. קריטי לתאימות עם מטרות טבילה בשמן ברמות NA גבוהות.
עיבוד תמונה & תוכנת ניתוח (מודולי ZEN)	קרל צייס AG	ZEN 3.5 (כחול)	משמש לשחזור תלת-ממדי, עיבוד רזולוציה על-גבוהה (למשל, עיבוד Airysscan), מדידת PSF וניתוח SNR.
ImageJ / פיג'י	קוד פתוח	לא זמין	משמש לשחזור תלת-ממדי נוסף, יצירת תצוגות אורתוגונליות וניתוח תמונה כללי.
שמן טבילה (מדד שבירה = 1.518)	קרל צייס (או דומה)	444960-0000-000	לשימוש עם מטרות טבילה בשמן (למשל, 63x/1.4 NA).
מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר עם גלאי מערך מולטיפלקס (למשל, ZEISS LSM 900 עם Airyscan 2)	קרל צייס AG	LSM 900 (אייריסקן 2)	פלטפורמת ההדמיה הראשית שימשה לכל מצבי הקונפוקלי והסופר-רזולוציה המתוארים בפרוטוקול.
מדיום חיוני מינימלי (MEM) עם ארל' מלחים	Gibco (או דומה לו)	11095080	מדיום תרבית סטנדרטי לתאי Hep3B, בתוספת 10% FBS.
נוגדן מונוקלונלי אנטי-ואלפא;-טובולין לעכבר (שיבוט DM1A)	סיגמא-אלדריץ' (או דומה)	T6199	נוגדן ראשי לתיוג מיקרוטובולים. בשימוש בדילול של 1:500
פאראפורמלדהיד (PFA), 4% ב-PBS	ג'יפן  (או דומה)	TBS5083	קיבוע לתאים. השתמש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. טפלו בזהירות המתאימה.
מדיום הדמיה ללא פנולים אדומים	Gibco (או דומה לו)	21063029	מדיום עם אוטופלואורסצנציה נמוכה המשמש להדמיית תאים חיים. מאוזנת מראש עם 5% CO2 ב-37> C לפני השימוש.
סליין בופר-פוספט (PBS), 1X, pH 7.4	CellWorld (או דומה)	C0162-311	משמש כבופר שטיפה ודילול לאורך כל הפרוטוקול.
מגדל אנטי-פייד זהב של ProLong	Invitrogen (או דומה)	P36930	מדיום התקנה מוקשה לשימור פלואורסצנציה בדגימות קבועות.
טריטון X-100	סיגמא-אלדריץ' (או דומה)	T8787	נעשה שימוש ב-0.1% (v/v) לחדירות תאים
טווין-20	סיגמא-אלדריץ' (או דומה)	P9416	שימש ב-0.05% (v/v) ב-PBS (PBST) לשלבי שטיפה לאחר דגירות נוגדנים.
אלבומין סרום בקר (BSA), Fraction V	סיגמא-אלדריץ' (או דומה)	A7906	בשימוש ב-1% (ללא צבע) ב-PBS לחסימה וכרכיב בבופר דילול נוגדנים.
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול)	סיגמא-אלדריץ' (או דומה)	D9542	נגד-כתם גרעיני. בשימוש בריכוז סופי של 1 ומיקרו; g/mL.
חמור נגד ארנב IgG, אלקסה פלואר 488 קונוגט	Invitrogen (או דומה)	A21206	נוגדן משני לצביעת מיטוכונדריה. בשימוש בדילול של 1:500
מיקרוספירות פלואורסצנטיות (חרוזים), קוטר 100 ננומטר	Invitrogen (למשל, TetraSpeck™) או דומה לכך	T7279	משמש למדידה אמפירית של המערכת' פונקציית פיזור נקודות (PSF) ורזולוציה.
תאי Hep3B המבטאים באופן יציב מיטוכונדריה EGFP	IMMOCELL	IM-H367	קו תאי הפטומה האנושית מהונדס לבטא באופן יציב EGFP המיועד למטריצת המיטוכונדריה. משמש להדמיית טיים-לאפס של תאים חיים.
תמיסת בופר HEPES, 1 M	Gibco (או דומה לו)	15630080	משמש בריכוז סופי של 25 מ"מ מולר במדיום הדמיה לייצוב pH במהלך הדמיה חיה מחוץ לאינקובטור CO2.
זכוכית כיסוי מדויקת (#1.5, עובי 0.17 מ"מ)	מריאנפלד (או דומה)	107052	משמש להרכבת דגימות קבועות.
תוכנת הפעלת מיקרוסקופ (למשל, מהדורת ZEN כחולה)	קרל צייס AG	ZEN 3.5 (כחול)	משמש לשליטה במערכת, רכישת תמונה ועיבוד בסיסי.
עדשת אובייקטיבית: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC	קרל צייס AG	421462-9900-000	המטרה העיקרית המשמשת להדמיה ברזולוציה גבוהה.
נוגדן פוליקלונלי אנטי-TOMM20 של ארנב	אבקאם (או דומה)	ab186735	נוגדן ראשי לתיוג מיטוכונדריה. בשימוש ב-1:1000 דילול