מאמר שיטה

In-Vitro הערכת השפעות ההגברה של מולקולות שמקורן בצמחים על ביוצידים קונבנציונליים

DOI:

10.3791/70172

⸱

8 במאי 2026

 ,  ,  , 
1LEPABE, ALiCE, Faculty of Engineering, University of Porto, 2DEQB-Department of Chemical and Biological Engineering, Faculty of Engineering, University of Porto, 3LAQV/REQUIMTE, BioSIM, Department of Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Porto, 4Department of Chemical Engineering, Faculty of Science and Technology, University of Coimbra

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק מסגרת שיטתית להערכת האופן שבו פיטוכימיקלים יכולים לשפר את ההשפעות החיידקיות של ביוצידים מסורתיים באמצעות מודלים של פעילות חיידקית ובדיקות אינטראקציה קומבינטוריות, שמטרתן לזהות תערובות סינרגטיות המשפרות את השליטה במיקרואורגניזמים ומפחיתות את השימוש הכולל בביוצידים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח גישות חדשניות ויעילות לשיפור הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ביוצידים קונבנציונליים הוא אסטרטגיה מבטיחה לשיפור השליטה במיקרואורגניזמים למטרות חיטוי רפואי. בהקשר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להערכת ההשפעות המעצימות של פיטוכימיקלים שמקורם בצמחים על ביוצידים סינתטיים. מוצרים אלו מבוססי צמחים הם מועמדים אטרקטיביים כאביזרי ביוציד בשל המגוון המבני שלהם, הפעילות הביולוגית ולעיתים קרובות רעילות נמוכה יותר. תהליך העבודה המתואר כאן מאפשר קביעת ריכוזי חיידקים מינימליים (MBCs) ויצירה שיטתית של עקומות מינון-תגובה וזמן-תגובה לכל מוצר שנבדק בנפרד (ביוצידים ופיטוכימיקלים) וכן לשילובים הכפולים או המשולשים. הנתונים שהתקבלו מאפשרים מידול מתמטי מתקדם, כולל קביעת מדד הריכוז החלקי של חיידקים (FBCI) והערכת האינטראקציות בין המוצרים שנבדקו בנוגע להשפעות סינרגטיות, תוספתיות או אנטגוניסטיות באמצעות התוכנה Combenefit. במובן זה, ניתן לזהות מוצרים טבעיים מבטיחים כמגבירים ביוצידים, למקסם את היעילות האנטי-מיקרוביאלית, ולעצב אסטרטגיות חיטוי ברות קיימא ובטוחות יותר שעשויות להפחית את הריכוזים הנדרשים של ביוצידים סינתטיים. דבר זה משפר את השליטה במיקרואורגניזמים ומפחית סיכונים סביבתיים ובריאותיים ציבוריים הקשורים לשימוש מופרז בביוציידים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים הקשורים לבריאות (HAIs) הם בין האתגרים הבריאותיים הציבוריים הקריטיים והמדאיגיםביותר בעולם. באופן מדאיג, הם קשורים באופן חזק להתפשטות מיקרואורגניזמים עמידים לתרופות מרובות (MDR) ולהתמדה של עומס ביולוגי חיידקי על פני בתי חולים, לעיתים קרובות בשל שיטות חיטוי לא מתאימות או לא יעילות 2,3. יתרה מזאת, הזיהום ההדדי בין מטופלים, צוותי הבריאות וציוד רפואי מחריף עוד יותר את הבעיההזו 4,5. באירופה, למשל, הוערך כי כמעט 80,000 מטופלים מאושפזים סובלים לפחות מ-HAI אחד בכל יום נתון, מה שמהווה כ-16 מיליון ימי אשפוז נוספים בכל שנה2. מגפת הקורונה סיבכה עוד יותר את הבעיה, ותרמה לעלייה בזיהומים חיידקיים ב-MDR בעקבות השימוש הגבוה בסוכנים/חומרי חיטוי אנטימיקרוביאליים ועלייה באשפוזים 6,7. עליית חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, כולל אשריכיה קולי המייצרת β-לקטמאז בספקטרום מורחב (ESBL) וסטפילוקוקוס אוראוס עמיד למתיצילין (MRSA), הובילה לעומס בריאותי וכלכלי הולך וגדל ברחבי העולם. למעשה, זנים אלו מדגישים את הדחיפות בפיתוח פתרונות חדשניים למניעה ושליטה בזיהומים 1,8,9.

בהתחשב בכך, ביוצידים הפכו לכלים חיוניים לשליטה בהתפשטות חיידקים וזיהומים עמידים, והוחלו בהרחבה לחיטוי משטחי בתי חולים, עיקור ציוד, טיפול במערכות מים ומניעת זיהוםשל מכשירים רפואיים. בניגוד לאנטיביוטיקה, הפועלת על מטרות מיקרוביאליותספציפיות 12, ביוצידים משבשים מספר מבנים תאיים בו-זמנית, כולל ממברנות, אנזימים, RNA ריבוזומי ונתיבי מטבול 13,14,15. פעולה רחבת טווח זו נחשבה בתחילה כמפחית את הסיכון להתנגדות. עם זאת, ראיות מראות שמיקרואורגניזמים יכולים להסתגל לחשיפה לביוציידים, מה שמוביל לסבילות, התמדה ואפילו עמידות צולבת לאנטיביוטיקה10,16. לדוגמה, חשיפה של Pseudomonas aeruginosa לבנזלקוניום כלוריד שנבחר עבור וריאנטים עמידים לציפרופלוקצין ולנובובוצין באמצעות ביטוי יתר של משאבות פליטה17. באופן דומה, הוכח כי טריקלוזן מפעיל משאבות פליטה ב-Stenotrophomonas maltophilia, בעוד שחשיפה לכלורקסידין נקשרה לעלייה בעמידות לאנטיביוטיקה ב-S. aureus18.

יתרה מזאת, תרכובות אמוניום רבעיות (QACs), כלורקסידין, דיאמידינים, אקרדינים וטריקלוזן הוגדרו כגורמים אפשריים לבחירה והתמשכות של עמידות חיידקית למספר אנטיביוטיקות19,20. גנים עמידות כמו qacA/B ו-smr ידועים כמעניקים סבילות ל-QACs, וכישלונות קליניים כמו בקטרמיה הקשורה לקטטרים המאוחסנים בתמיסות QAC מזוהמות וזיהום מיקרוביאלי פנימי של יודופורים דווחו גםהם ב-16,17,21. ממצאים אלו מדגישים את הצורך הדחוף בשימוש אופטימלי בביוצידים, הנתמך במחקרים מכניים ואסטרטגיות חיטוי רציונליות.

ביופילמים, שהם קהילות חיידקיות בעלות צפיפות תאים גבוהה ומבנית היטב, הטבועות במטריצה חוץ-תאית של פוליסכרידים, חלבונים וחומצות גרעין, מהוות מכשול נוסף ומשמעותי לשליטה בזיהומים22,23. הם מפגינים סבילות מרשימה לאנטיביוטיקה ולביוצידים, התורמים להתמשכות הזיהומים אצל מטופלים. יתרה מזאת, ביופילמים מקושרים לעיתים קרובות לזיהום מתמשך של מכשירים רפואיים, כלי ניתוח ומשטחי בתי חולים24. למרות חשיבותם הקלינית, הביופילמים הוכרו כתורמים מרכזיים לזיהומים כרוניים ולעמידות לאנטימיקרוביאלים רק בעשורים האחרונים. החוסן שלהם כה רב שגם חומרי חיטוי אגרסיביים לעיתים קרובות אינם מצליחים להשמידם, ומשאירים מאחור תאים מתמידים המסוגלים לזרוע מחדש את הזיהום 20,25,26. לכן, מציאת אסטרטגיות אנטיביופילם יעילות היא קריטית לשליטה ב-HAIs ולהפחתת העומס הבריאותי והכלכלי של פתוגנים MDR27,28.

כפתרון מבטיח, פיטוכימיקלים, שהם מטבוליטים משניים המיוצרים ומופקים מהצמחים, מהווים משאב כמעט בלתי מנוצללסוכנים אנטי-מיקרוביאליים ואנטיביופילמים חדשים. עם זאת, לא נעשה שימוש בפיטוכימיה כאנטיביוטיקה, בשל פעילותו האנטימיקרוביאלית המתונה בהשוואה לאנטיביוטיקה קונבנציונלית. פיטוכימיקלים מסווגים באופן שגרתי כאנטימיקרוביאליים בהתבסס על בדיקות רגישות שמייצרות ריכוז מעכב מינימלי (MIC) בטווח של 100 עד 1000 מיקרוגרם/מ"ל, ערכים גבוהים בהרבה מאלו של אנטיביוטיקות קונבנציונליות30,31. חשוב לציין כי פיטוכימיקלים כבר הראו פעילות אנטיביופילם כאשר משתמשים בהם לבד או כמחזקים של ביוצידים קונבנציונליים. לדוגמה, קוורצטין עשוי לעכב את ייצור האלגינט, מה שמוביל לירידה בהידבקות במהלך התפתחות הביופילם 32,33,34. אמודין עיכב את התפתחות הביופילמים על ידי P. aeruginosa, E. coli ו-S. aureus באמצעות הפחתת הביטוי של גנים מרכזיים המעורבים ביצירת ביופילם35. שילוב פיטוכימיקלים עם ביוצידים בשימוש קונבנציונלי אך הולכים ופחות יעילים, כסוכנים לשינוי עמידות, מייצג אסטרטגיה מבטיחה לשיפור היעילות האנטימיקרוביאלית36. אינטראקציות סינרגטיות כאלה עלולות להפריע למנגנוני עמידות מיקרוביאלית, ולהפחית את הריכוזים המינימליים היעילים של ביוצידים הנדרשים להשגת חיטוי מספק37. גישה זו ממקסמת את ביצועי הביוציידלים, מפחיתה לחץ סלקטיבי להתפתחות עמידות, ומפחיתה את ההשפעות האקולוגיות והטוקסיקוליות הקשורות ליישום מופרז של ביוצידים15,20. פיטוכימיקלים מגוונים מבחינה מבנית 38,39,40, זמינים באופן נרחב 38,39,41, זולים 38,39,42, ולעיתים פחות רעילים לבני אדם ולסביבה מאשר ביוצידים סינתטיים38,39. מדובר במוצרים טבעיים שלרוב מופקים ממקורות צמחים מתחדשים, ובמקרים מסוימים דווח כי הם מציגים עמידות סביבתית נמוכה יותר ופרופיל רעילות מופחת בהשוואה לביוצידים סינתטייםמסוימים 43,44,45. בעוד שפרופילי העלות, הזמינות והרעילות משתנים בהתאם לתרכובת ולתהליך ההפצה, מספר פיטוכימיקלים הראו תכונות בטיחות וסביבתיות חיוביות בהשוואה לביוצידים קונבנציונליים מסוימים46,47.

פרוטוקול זה נועד להעריך את הפוטנציאל של פיטוכימיקלים, בנפרד ובשילוב עם ביוצידים קונבנציונליים, לחיטוי רפואי. בקצרה, הפרוטוקול מעריך אינטראקציות בין ביוציד לפיטוכימיה בטווחי ריכוז רחבים. ביוצידים נבדקו תחילה ב-0.1–500 מ"ג/ליטר ופיטוכימיקלים ב-50–10,000 מ"ג לליטר כדי לקבוע את ריכוזי החיידקים המינימליים (MBCs) (טבלה 1). לשילובים כפולים, נבחרו ריכוזים תת-חיידקיים כדלקמן: בנזלקוניום כלוריד (BAC) ברמות 0.1, 0.5 ו-0.75 מ"ג/ליטר; חומצה פראצטית (PAA) ברמות 0.1, 0.3 ו-0.5 מ"ג/ליטר; חומצה סליצילית (SAL) ברמות 50, 100 ו-250 מ"ג/ליטר; ואוגנול (EUG) ברמות 100, 250 ו-750 מ"ג/ליטר (טבלה 1). שילובים משולשים בוצעו באמצעות BAC (0.75 מ"ג/ליטר) או PAA (0.5 מ"ג/ליטר) בשילוב עם SAL (100 או 250 מ"ג/ליטר) ו-EUG (250 או 750 מ"ג/ליטר) (טבלה 1). בדיקות תגובה בזמן בוצעו במשך 1–90 דקות, ואחריהן הערכת צמיחה מחדש של חיידקים במשך 24 שעות. אינטראקציות אנטימיקרוביאליות מכומתות באמצעות מדד ריכוז חיידקי חלקי (FBCI) ומנותחות באמצעות תוכנת Combenefit, בעוד שקינטיקת חיטוי מדומה באמצעות מודלים של צ'יק-ווטסון ווייבול לאפיון תלות בריכוז ודינמיקת השבתה.

החידוש טמון בתכנון רציונלי של אינטראקציות יציבות בין פיטוכימיקלים וביוצידים, תוך אופטימיזציה של פעילות החיטוי תוך מזעור רעילות והשפעה סביבתית עקב ירידה בשימוש בביוצידים קונבנציונליים. גישות מתמטיות כמו חישוב ה-FBCI והערכת סינרגיה שימשו גם הן לכימות אינטראקציות בין פיטוכימיקלים לביוצידים בבקרה מיקרואורגנית. בעוד ש-FBCI מציע פרשנות קטגורית לאינטראקציה (סינרגיה, אנטגוניזם או אדישות) בשילובי ריכוז ספציפיים, Combenefit מאפשרת הערכה מקיפה יותר, מבוססת תגובה על פני שטח, של דפוסי אינטראקציה בטווח ריכוז רחב יותר. זה מאפשר ויזואליזציה וכימות של השפעות אינטראקציה תלויות בריכוז שאינן נתפסות על ידי אינדקסים חד-נקודתיים48,49. יתרה מזאת, קינטיקת חיטוי מדומה באמצעות מודלים של צ'יק-ווטסון (לתגובת מינון) ווויבול (לתגובה בזמן)50. מודלים אלו מספקים מודלים קינטיים של השבתת מיקרואורגניזמים, ומציעים פרמטרים כמותיים המתארים שיעורי חיטוי והתנהגות עקומת הישרדות50. הם מסייעים לאפיין האם ההריגה פועלת לפי דינמיקה לוגיתרמית או לא-ליניארית, ומאפשרים פרשנות מכנית יותר של השפעות הטיפול, החורגת מעבר לתיאור של FBCI51,52.

פרוטוקול זה מבטיח זיהוי שיטתי של שילובים פוטוכימיים-ביוצידים מבטיחים ופיתוח אסטרטגיה יעילה וברת קיימא לחיטוי רפואי. בניגוד למבחני MIC או לוח שחמט קלאסיים שמספקות מדידות קצה סטטיות, פרוטוקול זה משלב מידול דינמי של בקטריצידים וניתוחי אינטראקציה כדי ללכוד את עוצמת וקינטיקה של ההעצמה. בעוד שבדיקות לוח שחמט קלאסיות מספקות מידע חשוב על אינטראקציות מעכבות המבוססות על נקודות קצה של MIC, הן מוגבלות למדידות צמיחה ומדדי אינטראקציה בודדים. הפרוטוקול המתואר כאן מתקדם מעבר למסגרת זו על ידי כימות פעילות קוטל חיידקים במקום עיכוב גדילה, הערכת צמיחה מחודשת לאחר טיפול להערכת השפעות אנטימיקרוביאליות מתמשכות, הערכת שילובים כפולים ומשולשים של ביוצייד-פיטוכימיקלים, מודל קינטיקה של חיטוי באמצעות גישות צ'יק-ווטסון וויבול, ויישום ניתוח ריכוז-תגובה של משטח באמצעות Combenefit. אסטרטגיה רב-ממדית זו מאפשרת הערכה חזקה וחזאית יותר של החזקת ביוצייד-פיטוכימית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: המתודולוגיה שהוצעה הותאמה מהתקן האירופי EN 127653.

1. הכנה לתרבות

  1. שמר על זני החיידקים שנבדקו, Escherichia coli CECT 434 ו-Staphylococcus aureus CECT 976, על ידי אחסונם בקירור עם גליצרול 30% (v/v) בטמפרטורה של -80°C.
  2. לצורך שיקום, מגדלים חיידקים בלוחות אגר לספירה (PCA) ומאפשרים להם לגדול, למשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, על ידי דגירה של הצלחות.
  3. הכינו תרביות לילה של הזנים הנבדקים על ידי חיסון מושבה חיידקית אחת מצלחת מפוספסת בציר סויה טריפטי (TSB) כדי להגיע לשלב הגדילה האקספוננציאלי (לפי עקומת הכיול שמתקבלת מהשלבים הבאים), ודגירה על אינקובטור רועד במהירות של 100 סל"ד ו-25 מעלות צלזיוס.
  4. באמצעות ספקטרופוטומטר, יש לקבל עקומת כיול של יחידות יצירת המושבה (CFU)/mL כפונקציה של צפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) עבור כל זן חיידקי בתנאי הגידול שהוזכרו קודם.
    1. לגדל תרבית חיידקים בלילה ב-TSB בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם ערבוב (100 סל"ד).
    2. הכינו דילול סדרתי של 10 פעמים של התרבית בתמיסת מלח סטרילית (0.85% w/v NaCl).
    3. מדודאת ה-OD 600 של כל דילול באמצעות ספקטרופוטומטר.
    4. דילול מתאים לצלחת על PCA. דגירה של צלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    5. בחרו לוחות המציגים בין 10 ל-100 מושבות וקבעו את ערכי ה-CFU/mL המתאימים.
    6. השרטט ערכי CFU/mL מול קריאות OD600 המתאימות בטווח הליניארי (0.04–0.8).
    7. בצע לפחות שתי בדיקות עצמאיות עם לפחות שני שכפולים. בצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לקבל את משוואת הכיול.
    8. השתמשו במשוואה המתקבלת כדי להעריך ריכוזי חיידקים בניסויים הבאים.
  5. צנטריפוגה את האינוקולה בעוצמה של 3772 x גרם למשך 10 דקות, ושוטפים פעם אחת עם מלח בופר פוספט (PBS) (8 גרם/ליטר NaCl, 0.2 גרם לליטר KCl, 1.44 גרם לליטר של Na2HPO4, ו-0.24 גרם לליטר של KH2PO4).
  6. באמצעות ספקטרופוטומטר, כוונן אתה-OD 600 של האינוקולה ב-PBS ל-1 x 108 יחידות יצירת מושבות (CFU)/מ"ל.

2. הכנת תמיסות מולקולות ובקרות

  1. שקלו את הבחירה, הלימוד וההכנה של מולקולות שנבדקו כך: השתמשו בשני ביוצידים – BAC ו-PAA (15% (w/v) – ובשני פיטוכימיקלים – SAL ו-EUG 99%.
    הערה: BAC נבחר במחקר זה משום שמדובר ב-QAC בשימוש נרחב, יעיל נגד חיידקים באמצעות הפרעה לממברנה54,55. חומצה פראצטית היא חומר חיטוי מחמצן רחב טווח המשמש יותר ויותר לעיקור כלי עבודה רפואיים56,57. חומצה סליצילית היא תרכובת פנולית מעניינת משום שהיא מציגה פעילות אנטיבקטריאלית ואנטיביופילם ומשפיעה על אלימות חיידקית ומנגנוני עמידות לאנטיביוטיקה, מה שמרמז על תפקידים פוטנציאליים בחיטוי ובשליטה במיקרוביה. יוגנול הוא תרכובת טרפנואידית/ארומטית פנולית טבעית עם תכונות אנטימיקרוביאליות מוכרות, שיכולה לשמש כחלופה בטוחה וידידותית לסביבה לחיטוי סינתטי60,61.
  2. הכינו את BAC ו-PAA טריים במים אולטרה-טהורים.
  3. EUG ו-SAL מומסים בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), מה שמבטיח שהתאים לא ייחשפו לריכוז גבוה מ-5% של DMSO.
  4. הכינו את הריכוזים שנבדקו של BAC, PAA, EUG ו-SAL, לפי טבלה 1.
  5. הכינו את הריכוזים שנבדקו בצינורות צנטריפוגות בנפח 15 מ"ל על ידי התאמת נפחי התמיסה המקורית וההשעיה התאית לקבלת ריכוז המולקולה הסופי הרצוי וצפיפות התא.
  6. לכל הבדיקות הבאות, כלול שתי ביקורות שליליות: (i) חיידקים ללא טיפול ו-(ii) חיידקים שנחשפו ל-5% DMSO (שכן זהו הריכוז המרבי של DMSO שהתאים נחשפים אליו לאורך כל הבדיקות).

3. חשיפה חיידקית לביוצייד או פיטוכימי

  1. הוסיפו 1 מ״ל של תאי השעיה ל-1 מ״ל מים אולטרה־טהורים והמתינו 2 דקות.
  2. לאחר מכן, הוסיפו 8 מ"ל ביוצייד או תמיסה פיטוכימית (במים אולטרה-טהורים או 5% DMSO) ודגרו על אינקובטור ניעור במהירות של 100 סל"ד ו-25 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות.
  3. מערבבים את התרכובות עם התאים על ידי מערבולת.

4. ניטרול, דילול סדרתי וציפוי

  1. בצע ניטרול כל ביוציד או פיטוכימי בכל ריכוז שנבדק באמצעות שיטת ניטרול הדילול והנטרל האוניברסלי: 30 גרם לליטר פוליסורבט 80, 30 גרם לליטר סאפונין, 1 גרם לליטר L-היסטידין, 3 גרם לליטר לציטין, ו-5 גרם לליטר תיוסולפט נתרן בבופר פוספט 0.0025 M.
  2. הוסיפו 1 מ"ל מהדגימה המנוטרלת ל-8 מ"ל של ניטרל אוניברסלי ו-1 מ"ל מים אולטרה-טהורים53.
  3. בצע דילול סדרתי פי עשרה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של דילול ספציפי ל-900 מיקרוליטר של תמיסת מלח סטרילית כדי לבצע את הדילול הבא (חזור על זה מהדילול 10-1 ל-10-7), וקבע את התאים ששרדו בדגימות מנוטרלות על ידי ציפוי של 10 מיקרוליטר מכל דילול על PCA, לפי שיטת פלטה62.
  4. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ללא ערבוב במשך 24 שעות לספירת תאים.
  5. ה-CFU נספרו ויזואלית עבור לוחות המכילים יותר מ-10 ופחות מ-100 מושבות, והריכוז שבו מתרחשת הפחתה מלאה ביכולת הגידול נרשם כ-MBC. לפי משוואה (1), חשב את ה-CFU/mL, כאשר n הוא מספר ה-CFU שנספר, SV הוא נפח הדגימה המצופה (0.01 מ"ל), ו-Dil הוא הדילול שבו נספרו ה-CFU.
    CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
  6. העריך את ההפחתה הלוגריתמית, הפחתת לוגריתם, לפי משוואה (2), כאשר X0 ו-X הם ה-CFU/mL עבור החיידקים הלא מטופלים (בקרה) והחיידקים המטופלים, בהתאמה.
    הפחתת לוגריתם = log (X0) - log (X) = log (X0/X) (2)

5. הערכת שילובים כפולים ומשולשים

  1. יישמו את המתודולוגיה שתוארה לעיל כדי להעריך את פעילות כל השילובים הכפולים והמשולשים האפשריים של ביוציד אחד ופיטוכימי אחד (לשילובים כפולים) או שני פיטוכימיקלים (לשילובים משולשים) כדי לחפש השפעות אפשריות של העצמה/סינרגיה.
  2. שקול את בחירת הריכוזים הבאה: עבור השילובים הכפולים, הריכוזים שנבדקו ל-BAC היו 0.1, 0.5 ו-0.75 מ"ג/ליטר; עבור PAA היו 0.1, 0.3 ו-0.5 מ"ג/ליטר; ל-SAL היו 50, 100 ו-250 מ"ג/ליטר; ול-EUG היו 100, 250 ו-750 מ"ג/ליטר (טבלה 1). לגבי השילוב המשולש, הריכוז שנבדק ל-BAC היה 0.75 מ"ג/ליטר; ל-PAA היה 0.5 מ"ג/ליטר; ל-SAL היו 100 ו-250 מ"ג/ליטר; ול-EUG היו 250 ו-750 מ"ג/ליטר (טבלה 1).
  3. בחר את הריכוזים, ובחר את אלו שנבדקו במבחן המינון-תגובה של מולקולות בודדות שגרמו להשפעות שאינן חיידקיות.

6. הערכת צמיחה מחדש של חיידקים

  1. כדי להעריך את יכולת הצמיחה מחדש של חיידקים, אפשר לתאי המיקרוביאלים לגדול בתווך נוזלי למשך יותר מ-24 שעות, בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד, לאחר הטיפול והנטרול.
  2. לבצע דילול סדרתי פי עשרה, ציפוי, דגירה של לוחות ה-PCA וכימות של ה-CFU/mL באותן טכניקות ותנאים.

7. פירוש תוצאות קומבינטוריות – מדד ריכוז בקטריצידלי חלקי (FBCI)

  1. פרש את התוצאות מניתוח קומבינטורי כך:
    1. לשילובים כפולים, FBCI = FBC(A) + FBC(B), כאשר הריכוז החיידקי השברירי של A, FBC(A), הוא היחס בין ה-MBC של A בשילוב כפול לבין ה-MBC של A בלבד (שילוב MBCA/MBCA בלבד), ו-FBC(B) הוא היחס בין ה-MBC של B בשילוב כפול לבין ה-MBC של B בלבד (שילוב MBC B/MBCB בלבד) (משוואה 3).
    2. עבור שילובים משולשים, FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), כאשר FBC(A) הוא היחס בין ה-MBC של A בשילוב משולש לבין ה-MBC של A בלבד (שילוב MBCA/MBCA בלבד), FBC(B) הוא היחס בין ה-MBC של B בשילוב משולש ל-MBC של B בלבד (שילוב MBC B/MBCB בלבד), ו-FBC(C) הוא היחס בין ה-MBC של C בשילוב משולש לבין ה-MBC של C בלבד (שילוב MBCC/MBCC בלבד) (משוואה 4).
    3. בהחלת הסיווג שהציעו פרננדס ואח' 50, FBCI ≤ 0.5 מתאים לסינרגיה, 0.5 < FBCI ≤ 1 מציין הוספתיות, 1 < FBCI ≤ 4 מסווג כאדישות, ו-FBCI > 4.00 נחשב לאנטגוניזם.
      FBC(A) + FBC(B) = (שילוב כפול של MBC/MBCA בלבד) + (MBCB שילוב כפול/MBCB בלבד) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (שילוב משולש MBCA/MBCA בלבד) + (שילוב משולש MBCB/MBCB בלבד) + (שילוב משולש MBCC/MBCC בלבד) (4)

8. הליך לבחינת תגובת זמן

  1. הכן את התרביות הליליות של E. coli CECT 434 ו-S. aureus CECT 976 בהתאם לתנאי הגדילה שתוארו קודם (סעיף 1).
  2. הוסיפו 1 מ״ל של תאי השעיה ל-1 מ״ל מים אולטרה־טהורים והמתינו 2 דקות. בשלב זה, יש להוסיף 8 מ"ל תמיסה ביוצידלית/פיטוכימית (במים אולטרה-טהורים או 5% DMSO) כדי להגיע לריכוזים הרצויים לכל מולקולה: 1/4 x MBC ו-MBC, ועבור ההשעיה החיידקית (על ידי התאמת ה-OD), ב-100 סל"ד ו-25 מעלות צלזיוס. ערבב את המולקולות עם התאים על ידי מערבול.
  3. הערך את זמני החשיפה הבאים: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 ו-90 דקות.
  4. כפי שמתואר בסעיף 4, העריכו את הפעילות האנטימיקרוביאלית על ידי חישוב הפחתת הלוגריתם (CFU/mL) כלוגריתם (X/X0).
  5. בצע את הביוצייד או הנטרול הפיטוכימי עבור כל זוג ריכוז/זמן שנבדק באמצעות שיטת דילול-ניטרול והנטרול האוניברסלי, הדילול הסדרתי והציפוי, כפי שמתואר קודם בסעיף 4.

9. ניתוח נתונים קומבינטוריים באמצעות התוכנה Combenefit

  1. פתח את קובץ 'REPLICATE_TEMPLATE.xls' שסופק, ב-https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/, כדי להבטיח את המבנה והעיצוב הנכונים.
  2. ארגן את הנתונים שלך למטריצה, לפי הטבלה המשליפה 1, כאשר:
    1. הגדילו את ריכוזי המוצר A מלמעלה למטה (מהשורות הקצרות ביותר להכי גבוהות). כלול לפחות שלושה ריכוזים שונים עבור מוצר A.
    2. הגדל את ריכוזי המוצר B משמאל לימין (מהעמודה הנמוכה לגבוהה ביותר): כלול לפחות שלושה ריכוזים שונים עבור מוצר B.
    3. ייצג את השורה העליונה (0 מ"ג/ליטר מוצר A) מוצר סוכן יחיד B.
    4. ייצג את העמודה הראשונה (0 מ"ג/ליטר מוצר B) מוצר סוכן יחיד A.
    5. ייצג את התא (0,0) כמו הבקרה שלא טופלה.
    6. נרמל, עבור כל מקרה, את הערכים שנעשה בהם שימוש באמצעות משוואה (5), כאשר treat_0h הוא הלוגריתם (CFU/mL) לטיפול מסוים, מיד לאחר החשיפה (0h); treat_24h הוא היומן (CFU/mL) לטיפול מסוים, 24 שעות לאחר החשיפה (צמיחה מחודשת); control_0h הוא הלוגריתם (CFU/mL) עבור הבקרה המתאימה (רק תאים או תאים שנחשפו ל-5% DMSO), מיד לאחר החשיפה (0 שעות); ו-control_24h הוא הלוגריתם (CFU/mL) עבור הביקורת המתאימה (רק תאים או תאים שנחשפו ל-5% DMSO), 24 שעות לאחר החשיפה (צמיחה מחדש).
    7. בצע, בכל המקרים, ספירת CFU לאחר דגירה של 24 שעות של דגימות מצופות על PCA.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      הערה: כלול בקרות/מצבים לא מטופלים שמגדירים כדאיות של 100% ובקרה חיובית שמגדירה עיכוב מקסימלי (אופציונלי); השתמשו בערכים מספריים בלבד, ללא נוסחאות; השתמש באותו מספר שורות ועמודות בין השכפולים; השתמש ב-'.' עבור עשרוניות.
  3. שמור קובץ כ-.xls או .xlsx.
  4. צור קובץ אקסל לכל שכפול, כפי שתואר קודם וכמו בטבלה משלימה 1, והוסף את כל הקבצים באותה תיקייה.
  5. פתח את התוכנה Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, קיימברידג', גרסה 2.021, זמינה ב-https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
  6. העלה את התיקייה הזו ל-Combenefit.
    1. פתח את תוכנת Combenefit
    2. לחץ על Select Project Folder ובחר את התיקייה הנכונה.
    3. בחירת מודל ההתייחסות: תוספת לווה, שמניחה את המנגנון המדויק של שני המכפלים; עצמאות אושר שמניחה פעולה עצמאית, או HAS, שהוא מודל שמרני (משווה את השילוב לסוכן היחיד הטוב ביותר). הנוהג הטוב ביותר הוא להריץ לפחות שני דגמים ולבחור את הטוב ביותר.
    4. במקרה זה, נבחר מודל בליס, בהתחשב באופן הפעולה של המולקולות שנבדקו.
    5. בחר את הפלטים הגרפיים הרצויים, בידיעה שעליך לבחור לפחות עוד אחד עבור התפלגות הסינרגיה.
    6. ניתוח Press Run (איור משלים 1). טיפ: בחלון 'בחר שמור במהלך ניתוח', בחר הכל כדי לשמור את כל הפלטים הגרפיים בתיקייה המקורית.

10. יישום מודלים של צ'יק-ווטסון וויבול על נתוני מינון ותגובה בזמן

  1. הכינו את הנתונים שלכם על ידי עיצוב מערך הנתונים באקסל או CSV לפני הייבוא: לתגובה למינון, עמודה A מתאימה למינון (ריכוז, mg/L) ועמודה B מתאימה ללוגר (X/X₀); עבור נתוני תגובת הזמן, עמודה A מתאימה לזמן (דקות) ועמודה B מתאימה ללוגריתם (X/X₀).
  2. שמור את הקובץ שלך ב-'.csv' או העתק-הדבק ישירות ל-Prism.
  3. Open GraphPad Prism (גרסה בשימוש: 9.0 ל-Windows 11; לה חויה, קליפורניה, ארה"ב).
  4. בטבלה ובגרף חדשים, בחרו XY, ובטבלת הנתונים בחרו בהזנה או ייבוא נתונים לטבלה חדשה (איור משלים 2).
  5. באפשרויות, עבור X, בחר מספר, עבור Y בחר הזן ערכים כפולים בעמודות משנה זו לצד זו, ולחץ על יצירה (איור משלים 2).
  6. הזן נתוני מינון/זמן ב-X ורשום נתוני הישרדות ב-Y.
  7. עבור לניתוח, רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה), בחר את מערכי הנתונים שברצונך לנתח, ולחץ על OK (איור משלים 2).
  8. בחר חדש ואז צור משוואה חדשה.
  9. במשוואה, עבור סוג משוואה, בחרו משוואה מפורשת: Y = פונקציה של X ופרמטרים; לגבי השם, כתוב Chick-Watson Model/Weibull; ובהגדרה כתוב Y = -a*x^(n)*30 מודל צ'יק-ווטסון (איור משלים 3) ו-Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b) עבור מודל וייבול (איור משלים 4).
    הערה: מודל צ'יק-ווטסון מבוטא על ידי משוואה 6, כאשר X0 ו-X הם CFU/mL עבור החיידקים הלא מטופלים (הבקרה) והחיידקים המטופלים, C הוא הריכוז (המינון), kdis הוא מקדם שיעור ההשבתה, C הוא הריכוז (המנה), n הוא מעריך הריכוז, ו-t הוא זמן החשיפה (במקרה זה, 30 דקות) 50. מודל צ'יק-ווטסון יושם לצפייה בתגובה במינון ולאפיון הקשר בין ריכוז חומרי החיטוי להפחתת מיקרואורגניזמים.
    log (X/X₀) = -kdis · Cⁿ · t (6)
    הערה: מודל וייבול מבוטא על ידי משוואה 7, כאשר X0 ו-X הם ה-CFU/mL עבור החיידקים הלא מטופלים (בקרה) והחיידקים המטופלים, t הוא הזמן, α הוא פרמטר הסקאלה (זמן אופייני), ו-β הוא פרמטר הצורה50. מודל וייבול יושם כדי לצפות בתגובת הזמן ולאפיין את צורת עקומות ההישרדות. פרמטר הקנה מידה מייצג את זמן ההשבתה האופייני, בעוד שפרמטר הצורה מתאר סטיות מהתנהגות לוגית-ליניארית (β = 1 לוגרית-ליניארית; β < זנב אחד; β > כתף אחת).
    log (X/X0) = -1/2.303 (t/α)^β (7)
  10. בתפקידים לערכים התחלתיים, בחרו ב-0 כערך ההתחלתי לכל פרמטר ו-(ערך התחלתי, להתאים) ככלל (איור משלים 5).
  11. תשמור על שאר ההגדרות כברירת מחדל ותלחץ אוקיי.
  12. הרץ את ההתאמה ובדוק את הפרמטרים שהוערכו.

11. שכפול ביולוגי

  1. בצע, עבור כל הבדיקות, לפחות שני ניסויים עצמאיים עם לפחות שני שכפולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה העריך את הפעילות החיידקית של כל ארבע התרכובות שנבדקו — BAC, PAA, SAL ו-EUG — מול E. coli CECT 434 ו-S. aureus CECT 976. כפי שמוצג באיור 1 ובאיור 2, BAC, PAA, SAL ו-EUG הראו השפעה נראית תלויה בריכוז על הגידול. טבלה 2 מציגה את ערכי ה-MBC עבור המולקולות שנבדקו לאחר החשיפה ו-24 שעות לאחר החשיפה (הערכת יכולת צמיחה מחדש). לגבי BAC, לא נצפו CFUs (≈ ירידה של 6 log CFU/mL) ב-3 מ"ג/L עבור E. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג במחקר זה מספק מסגרת משולבת להערכת הפעילות החיידקית של שני ביוצידים נפוצים – BAC ו-PAA – ושני פיטוכימיקלים מבטיחים – EUG ו-SAL – בנפרד ובשילוב (שילובים כפולים ומשולשים), נגד E. coli ו-S. aureus. מספר שלבים בפרוטוקול זה קריטיים במיוחד להבטחת שכפול ופרשנות מדויקת של אינטראקציות אנטימיקרוביאליות. אלה כוללים סטנדרטיזציה של החיסון החיידקי, הכנה וטיפול מדויקים בתמיסות ביוצידים ופיטוכימיות, בקרה קפדנית על זמן החשיפה והטמפרטורה, וספירת CFU מדויקת למידול קינטי במורד הזרם וניתוח סינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים בכתיבת מאמר זה ואין להם מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי: פרויקט InnovAntiBiofilm (מקור 101157363) במימון הנציבות האירופית (Horizon-Widera 2023- Acess-02/Horizon-CSA); פרויקטים MultAntiBiofilm (הפניה COMPETE2030-FEDER00852000; Nº 17121) ו-HCAI_Disinfect (COMPETE2030-FEDER-00752300; Nº 16360) במימון גורמי תחרותיות בתכנית התפעולית-COMPETE, וכספים לאומיים על ידי הקרן למדע וטכנולוגיה (FCT); LEPABE, UID/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/00511/2025) ו-UID/PRR/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/PRR/00511/2025) ו-ALiCE, LA/P/0045/2020 (https://doi.org/10.54499/LA/P/0045/2020), ממומנים על ידי קרנות לאומיות דרך FCT/MCTES (PIDDAC; ליסבון, פורטוגל). מלגת הדוקטורט של מריאנה סוזה (2023.00337.BD; https://doi.org/10.54499/2023.00337.BD) ניתנת על ידי ה-FCT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בנזלקוניום כלוריד מרק, ספרד8.14363.0100ביוצייד
מגה סטאר 600R עם צנטריפוגהVWR, ארה"בVWR מגה סטאר 600R-
Combenefit - גרסה 2.021מחקר סרטן בריטניה מכון קיימברידג', קיימברידג', בריטניה-תוכנה להערכת סינרגיה
קובטותVWR, גרמניהVWRI634-0678קובטות 1.5 מ"ל לכיוון צפיפות אופטית
מים מנוקלים--להכנת מדיה
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)VWR, צרפת23500.322ממס אורגני
לולאות חיסון חד-פעמיותVWR, איטליהVWRI612-935710 & mu; לולאות חיסון L
צינורות אפנדורףVWR, סיןVWRI525-1164צינורות נעילה בטוחים של אפנדורף בנפח 1.5 מ"ל
Escherichia coliאוסף תרבות הטיפוס הספרדית (CECT)434זן ההתייחסות ששימש במחקר זה
אתנולVWR, צרפת83813.36להסרת חומר עבודה, חומר וידיים
יוגנול 99%סיגמא-אלדריץ', ארה"ב163333פיטוכימיה
צינורות פלקוןVWR, ארה"בVWRI525-1085צינורות פלקון בנפח 15 מ"ל
צינורות פלקוןVWR, בלגיהVWRI525-1109צינורות פלקון בנפח 50 מ"ל
GraphPad Prism 9.0 ל-Windows 11לה חויה, קליפורניה, ארה"ב-תוכנה לניתוח מתמטי וסטטיסטי
לציטיןאלפא אסאר, גרמניהQ04A010-
L-היסטידיןמרק, ארה"ב1.04351.0025-
חממה מסלוליתVWR, ארה"בVWR 5000I אינקוביטינג שייקר 230V-
חומצה פראצטית 15%AppliChem, גרמניה143495-1211ביוצייד
צלחות פטריVWR, איטליהVWRI391-0582-
פיפטה 1 - 10 מ"לVWR, ארה"ב-
Pipette 100 - 1000 & mu; LVWR, ארה"ב-
טיפים לפיפטה 100 - 1000 ו-mu; Lפרילאבו, פורטוגל1-202-50-0-
פיפט 20 - 200 & mu; LVWR, ארה"ב-
קצות פיפט 1 - 10 מ"לVWR, בלגיהVWRI613-7094-
טיפים לפיפט 2 - 200 & mu; LVWR, מקסיקוvwri613-6418-
פלטה קאונט אגרVWR, בלגיה84608-0500בידוד וגידול מיקרואורגניזמים
פוליסורבט 80VWR, ארה"ב20E2756726-
כלוריד אשלגן - KCl VWR, בלגיה11D110008-
פספט דיהידרוגן אשלגן - KH2PO4VWR, גרמניה26931.263-
חומצה סציליציתסיגמא-אלדריץ', ארה"ב84210-500Gפיטוכימיה
סאפוניןVWR, גרמניה21A124103-
נתרן כלוריד - NaClVWR, בלגיה27788.297-
נתרן מימן פוספט - Na2HPO4VWR, בלגיה28026.26-
נתרן תיוסולפט - Na2S2O3VWR, ארה"ב18D2056589-
ספקטרופוטומטרVWR, ארה"בספקטרופוטומטר UV-1600PCהתאמת צפיפות אופטית
Staphylococcus aureusאוסף תרבות הטיפוס הספרדית (CECT)976זן ההתייחסות ששימש במחקר זה
מרק סויה טריפטי  מרק, גרמניה1.05459.0500בידוד וגידול מיקרואורגניזמים
מים אולטרה-טהורים--להכנת דגימה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salam, M. A., et al. Antimicrobial resistance: A growing serious threat for global public health. Healthcare. 11 (13), 1946(2023).
  2. Szabó, S., et al. An overview of healthcare associated infections and their detection methods caused by pathogen bacteria in Romania and Europe. Journal of Clinical Medicine. 11 (11), 3204(2022).
  3. Dadi, N. C. T., Radochová, B., Vargová, J., Bujdáková, H. Impact of healthcare-associated infections connected to medical devices - An update. Microorganisms. 9 (11), 2332(2021).
  4. Russotto, V., et al. What healthcare workers should know about environmental bacterial contamination in the intensive care unit. BioMed Research International. 2017, 6905450(2017).
  5. Ssekitoleko, R. T., et al. The role of medical equipment in the spread of nosocomial infections: A cross-sectional study in four tertiary public health facilities in Uganda. BMC Public Health. 20 (1), 1561(2020).
  6. Bongiovanni, M., Barilaro, G., Zanini, U., Giuliani, G. Impact of the COVID-19 pandemic on multidrug-resistant hospital-acquired bacterial infections. Journal of Hospital Infection. 123, 191-192 (2022).
  7. Witt, L. S., Howard-Anderson, J. R., Jacob, J. T., Gottlieb, L. B. The impact of COVID-19 on multidrug-resistant organisms causing healthcare-associated infections: A narrative review. JAC-Antimicrobial Resistance. 5 (1), dlac130(2023).
  8. Wieler, L. H., Ewers, C., Guenther, S., Walther, B., Lübke-Becker, A. Methicillin-resistant staphylococci and extended-spectrum beta-lactamases-producing Enterobacteriaceae in companion animals: Nosocomial infections as one reason for the rising prevalence of these potential zoonotic pathogens in clinical samples. International Journal of Medical Microbiology. 301 (8), 635-641 (2011).
  9. Ghosh, S., Basu, S., Anbarasu, A., Ramaiah, S. A comprehensive review of antimicrobial agents against clinically important bacterial pathogens: Prospects for phytochemicals. Phytotherapy Research. 39 (1), 138-161 (2025).
  10. McDonnell, G., Russell, A. D. Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance. Clinical Microbiology Reviews. 12 (1), 147-179 (1999).
  11. Maillard, J. Y. Antimicrobial biocides in the healthcare environment: Efficacy, usage, policies, and perceived problems. Therapeutics and Clinical Risk Management. 1 (4), 307-320 (2005).
  12. Muteeb, G., Rehman, M. T., Shahwan, M., Aatif, M. Origin of antibiotics and antibiotic resistance, and their impacts on drug development: A narrative review. Pharmaceuticals. 16 (11), 1615(2023).
  13. Coombs, K., Rodriguez-Quijada, C., Clevenger, J. O., Sauer-Budge, A. F. Current understanding of potential linkages between biocide tolerance and antibiotic cross-resistance. Microorganisms. 11 (8), 2000(2000).
  14. Russell, A. D. Similarities and differences in the responses of microorganisms to biocides. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (5), 750-763 (2003).
  15. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiology Spectrum. 6 (2), (2018).
  16. Russell, A. D. Bacterial adaptation and resistance to antiseptics, disinfectants and preservatives is not a new phenomenon. Journal of Hospital Infection. 57 (2), 97-104 (2004).
  17. Amsalu, A., et al. Efflux pump-driven antibiotic and biocide cross-resistance in Pseudomonas aeruginosa isolated from different ecological niches: A case study in the development of multidrug resistance in environmental hotspots. Microorganisms. 8 (11), 1647(2020).
  18. Sanchez, P., Moreno, E., Martinez, J. L. The biocide triclosan selects Stenotrophomonas maltophilia mutants that overproduce the SmeDEF multidrug efflux pump. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 781-782 (2005).
  19. Russell, A. D. Introduction of biocides into clinical practice and the impact on antibiotic-resistant bacteria. Journal of Applied Microbiology. 92 (s1), 121S-135S (2002).
  20. Sousa, M., Machado, I., Simões, L. C., Simões, M. Biocides as drivers of antibiotic resistance: A critical review of environmental implications and public health risks. Environmental Science and Ecotechnology. 25, 100557(2025).
  21. Gilbert, P., McBain, A. J. Potential impact of increased use of biocides in consumer products on prevalence of antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 16 (2), 189-208 (2003).
  22. Zhao, A., Sun, J., Liu, Y. Understanding bacterial biofilms: From definition to treatment strategies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 13, 1137947(2023).
  23. Grari, O., et al. A comprehensive review on biofilm-associated infections: Mechanisms, diagnostic challenges, and innovative therapeutic strategies. The Microbe. 8, 100436(2025).
  24. Almatroudi, A. Biofilm resilience: Molecular mechanisms driving antibiotic resistance in clinical contexts. Biology. 14 (2), 165(2025).
  25. Liu, H. Y., Prentice, E. L., Webber, M. A. Mechanisms of antimicrobial resistance in biofilms. npj Antimicrobials and Resistance. 2 (1), 27(2024).
  26. Sharif, S., Yadav, A. K. Bacterial biofilm and its role in antibiotic resistance. The Microbe. 7, 100356(2025).
  27. Assefa, M., Amare, A. Biofilm-associated multi-drug resistance in hospital-acquired infections: A review. Infection and Drug Resistance. 15, 5061-5068 (2022).
  28. Sandu, A. M., et al. Healthcare-associated infections: The role of microbial and environmental factors in infection control - A narrative review. Infectious Diseases and Therapy. 14 (5), 933-971 (2025).
  29. Ogbuagu, O., et al. Novel phytochemicals in traditional medicine: Isolation and pharmacological profiling of bioactive compounds. International Journal of Medical All Body Health Research. 3 (1), 63-71 (2022).
  30. Tegos, G., Stermitz, F. R., Lomovskaya, O., Lewis, K. Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (10), 3133-3141 (2002).
  31. Simões, M., Bennett, R. N., Rosa, E. A. S. Understanding antimicrobial activities of phytochemicals against multidrug resistant bacteria and biofilms. Natural Product Reports. 26 (6), 746-757 (2009).
  32. Górniak, I., Bartoszewski, R., Króliczewski, J. Comprehensive review of antimicrobial activities of plant flavonoids. Phytochemistry Reviews. 18 (1), 241-272 (2019).
  33. Lee, J. H., et al. Anti-biofilm activities of quercetin and tannic acid against Staphylococcus aureus. Biofouling. 29 (5), 491-499 (2013).
  34. Memariani, H., Memariani, M., Ghasemian, A. An overview on anti-biofilm properties of quercetin against bacterial pathogens. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 35 (9), 143(2019).
  35. Borges, A., et al. New perspectives on the use of phytochemicals as an emergent strategy to control bacterial infections including biofilms. Molecules. 21 (7), 877(2016).
  36. Gomes, I. B., Malheiro, J., Mergulhão, F., Maillard, J. Y., Simões, M. Comparison of the efficacy of natural-based and synthetic biocides to disinfect silicone and stainless steel surfaces. Pathogens and Disease. 74 (4), ftw014(2016).
  37. Fernández Fuentes, M. A., et al. Synergistic activity of biocides and antibiotics on resistant bacteria from organically produced foods. Microbial Drug Resistance. 20 (5), 383-391 (2014).
  38. El-Saadony, M. T., et al. Medicinal plants: Bioactive compounds, biological activities, combating multidrug-resistant microorganisms, and human health benefits - A comprehensive review. Frontiers in Immunology. 16, 1491777(2025).
  39. Barbieri, R., et al. Phytochemicals for human disease: An update on plant-derived compounds antibacterial activity. Microbiological Research. 196, 44-68 (2017).
  40. Popovic, L., Rijkers, G. T. Phytochemicals: Principles and practice. Biology. 15 (1), 18(2025).
  41. Yang, Y., Ling, W. Health benefits and future research of phytochemicals: A literature review. Journal of Nutrition. 155 (1), 87-101 (2025).
  42. Jain, A., Madu, C. O., Lu, Y. Phytochemicals in chemoprevention: A cost-effective complementary approach. Journal of Cancer. 12 (12), 3686-3700 (2021).
  43. Rezaee Danesh, Y., Mulet, J. M., Porcel, R. Bridging microbial biocontrol and phytochemical biopesticides: Synergistic approaches for sustainable crop protection. Plants. 14 (22), 3453(2025).
  44. Kocamaz, D., Merchan, O. Environmental perspectives on biopesticides: Current knowledge and research gaps. Pesticides - Balancing Efficient Pest Control with Environmental and Health Safety. , IntechOpen. (2026).
  45. Rahaman, M. T., Moshwan, M. M. Sustainable functionalization of biodegradable materials for mosquito repellent textiles: A review of sources, application, and research directions. Hybrid Advances. 12, 100600(2026).
  46. Sun, S., et al. Impact of extraction techniques on phytochemical composition and bioactivity of natural product mixtures. Frontiers in Pharmacology. 16, 1615338(2025).
  47. Poslinski, H., Hatley, M., Tramell, J., Song, B. H. Harnessing phytochemicals in sustainable and green agriculture. Journal of Agriculture and Food Research. 19, 101633(2025).
  48. Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: An interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
  49. Ormeneanu, V. P., et al. Synergistic interactions between natural phenolic compounds and antibiotics against multidrug-resistant K. pneumoniae: A pooled analysis of 216 in vitro tests. Microorganisms. 13 (11), 2497(2025).
  50. Fernandes, S., Gomes, I. B., Simões, M. Antimicrobial activity of glycolic acid and glyoxal against Bacillus cereus and Pseudomonas fluorescens. Food Research International. 136, 109346(2020).
  51. Peleg, M. Modeling the dynamic kinetics of microbial disinfection with dissipating chemical agents-a theoretical investigation. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (2), 539-549 (2021).
  52. Buzrul, S. The Weibull model for microbial inactivation. Food Engineering Reviews. 14 (1), 66-77 (2022).
  53. European Committee for Standardization. Chemical disinfectants and antiseptics – Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics used in food, industrial, domestic and institutional areas – Test method and requirements. , European Standard EN 1276. Brussels. (2019).
  54. Oh, S., et al. Microbial community degradation of widely used quaternary ammonium disinfectants. Applied and Environmental Microbiology. 80 (19), 5892-5900 (2014).
  55. Merchel Piovesan Pereira, B., Tagkopoulos, I. Benzalkonium chlorides: Uses, regulatory status, and microbial resistance. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00377-e00319 (2019).
  56. Kitis, M. Disinfection of wastewater with peracetic acid: A review. Environment International. 30 (1), 47-55 (2004).
  57. Lin, Y., et al. Underlying the mechanisms of pathogen inactivation and regrowth in wastewater using peracetic acid-based disinfection processes: A critical review. Journal of Hazardous Materials. 463, 132868(2024).
  58. Sykes, E. M. E., White, D., McLaughlin, S., Kumar, A. Salicylic acids and pathogenic bacteria: New perspectives on an old compound. Canadian Journal of Microbiology. 70 (1), 1-14 (2024).
  59. Kantouch, A., El-Sayed, A. A., Salama, M., El-Kheir, A. A., Mowafi, S. Salicylic acid and some of its derivatives as antibacterial agents for viscose fabric. International Journal of Biological Macromolecules. 62, 603-607 (2013).
  60. Ulanowska, M., Olas, B. Biological properties and prospects for the application of eugenol - A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3671(2021).
  61. Jeyakumar, G. E., Lawrence, R. Mechanisms of bactericidal action of eugenol against Escherichia coli. Journal of Herbal Medicine. 26, 100406(2021).
  62. Di Salvo, L. P., et al. The drop plate method as an alternative for Azospirillum spp. viable cell enumeration within the consensus protocol of the REDCAI network. Revista Argentina de Microbiología. 54 (2), 152-157 (2022).
  63. Bridier, A., Briandet, R., Thomas, V., Dubois-Brissonnet, F. Comparative biocidal activity of peracetic acid, benzalkonium chloride and ortho-phthalaldehyde on 77 bacterial strains. Journal of Hospital Infection. 78 (3), 208-213 (2011).
  64. Fink, R. Terpenoids as natural agents against food-borne bacteria - Evaluation of biofilm biomass versus viability reduction. Processes. 11 (1), 148(2023).
  65. Randall, T. E., et al. Bacterial repair and recovery after UV LED disinfection: Implications for water reuse. Environmental Science: Water Research and Technology. 8 (8), 1700-1708 (2022).
  66. Wang, M., Ateia, M., Hatano, Y., Yoshimura, C. Regrowth of Escherichia coli in environmental waters after chlorine disinfection: Shifts in viability and culturability. Environmental Science: Water Research and Technology. 8 (7), 1521-1534 (2022).
  67. Puxeddu, S., et al. Beyond one-size-fits-all: Addressing methodological constraints in novel antimicrobials discovery. Antibiotics. 14 (8), 848(2025).
  68. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 8, 364(2017).
  69. Maillard, J. Y. Bacterial target sites for biocide action. Journal of Applied Microbiology. 92 (s1), 16S-27S (2002).
  70. Lambert, R. J., Johnston, M. D. The effect of interfering substances on the disinfection process: A mathematical model. Journal of Applied Microbiology. 91 (3), 548-555 (2001).
  71. Cheng, K., et al. Staphylococcus aureus SOS response: Activation, impact, and drug targets. mLife. 3 (3), 343-366 (2024).
  72. Patacq, C., Chaudet, N., Letisse, F. Crucial role of ppGpp in the resilience of Escherichia coli to growth disruption. bioRxiv. , (2020).
  73. Kim, T. K., Jang, M., Hwang, Y. S. Adsorption of benzalkonium chlorides onto polyethylene microplastics: Mechanism and toxicity evaluation. Journal of Hazardous Materials. 426, 128076(2022).
  74. Jang, M. H., et al. Elucidating adsorption mechanisms of benzalkonium chlorides on polypropylene and polyethylene terephthalate microplastics: Effects of BACs alkyl chain length and microplastic characteristics. Journal of Hazardous Materials. 468, 133765(2024).
  75. Wang, Y. W. Evaluation of self-heating models for peracetic acid using calorimetry. Process Safety and Environmental Protection. 133, 122-131 (2018).
  76. Kamatou, G. P., Vermaak, I., Viljoen, A. M. Eugenol - From the remote Maluku Islands to the international market place: A review of a remarkable and versatile molecule. Molecules. 17 (6), 6953-6981 (2012).
  77. Mihara, S., Shibamoto, T. Photochemical reactions of eugenol and related compounds: Synthesis of new flavor chemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 30 (6), 1215-1218 (1982).
  78. Gangwang Liu, G., Liu, H., Zhang, N., Wang, Y. Photodegradation of salicylic acid in aquatic environment: Effect of different forms of nitrogen. Science of the Total Environment. , 435-577 (2012).
  79. Kassir, M., et al. Enhanced photocatalytic degradation of salicylic acid in water-ethanol mixtures from titanium dioxide grafted with hexadecyltrichlorosilane. Physics Procedia. 55, 403-408 (2014).
  80. Houchmandzadeh, B., Ballet, P. A novel procedure for CFU plating and counting. Journal of Microbiological Methods. 206, 106693(2023).
  81. Marro, F. C., Laurent, F., Josse, J., Blocker, A. J. Methods to monitor bacterial growth and replicative rates at the single-cell level. FEMS Microbiology Reviews. 46 (6), fuac030(2022).
  82. Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLOS ONE. 11 (2), e0148469(2016).
  83. Hussain, M. S., Tango, C. N., Oh, D. H. Inactivation kinetics of slightly acidic electrolyzed water combined with benzalkonium chloride and mild heat treatment on vegetative cells, spores, and biofilms of Bacillus cereus. Food Research International. 116, 157-167 (2019).
  84. Basavegowda, N., Baek, K. H. Combination strategies of different antimicrobials: An efficient and alternative tool for pathogen inactivation. Biomedicines. 10 (9), 2219(2022).
  85. Haindongo, E. H., et al. Antimicrobial resistance prevalence of Escherichia coli and Staphylococcus aureus amongst bacteremic patients in Africa: A systematic review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 32, 35-43 (2023).
  86. Kim, M., et al. Widely used benzalkonium chloride disinfectants can promote antibiotic resistance. Applied and Environmental Microbiology. 84 (17), e01201-e01218 (2018).
  87. Barros, A. C., Melo, L. F., Pereira, A. A multi-purpose approach to the mechanisms of action of two biocides: Benzalkonium chloride and dibromonitrilopropionamide. Discussion of Pseudomonas fluorescens viability and death. Frontiers in Microbiology. 13, 842414(2022).
  88. Pironti, C., et al. Comparative analysis of peracetic acid and permaleic acid in disinfection processes. Science of the Total Environment. 797, 149206(2021).
  89. Qiao, C., et al. Advances of carbon-based materials for activating peracetic acid in advanced oxidation processes: A review. Environmental Research. 263, 120058(2024).
  90. Marjani, A., Golalipour, M. J., Gharravi, A. M. The effects of subacute exposure of peracetic acid on lipid peroxidation and hepatic enzymes in Wistar rats. Oman Medical Journal. 25 (4), 256-260 (2010).
  91. Yoo, J. H. Review of disinfection and sterilization - Back to the basics. Infection and Chemotherapy. 50 (2), 101-109 (2018).
  92. Arif, T. Salicylic acid as a peeling agent: A comprehensive review. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 8, 455-461 (2015).
  93. Staroń, A., Pucelik, B., Barzowska, A., Pulit-Prociak, J. Synthesis and characteristics of biocidal oil composites enhanced with thymol and salicylic acid. Clean Technologies and Environmental Policy. 26 (10), 3481-3505 (2024).
  94. Reyes-Fernández, E. Z., Schuldiner, S. Acidification of cytoplasm in Escherichia coli provides a strategy to cope with stress and facilitates development of antibiotic resistance. Scientific Reports. 10 (1), 9954(2020).
  95. Song, X., Li, R., Zhang, Q., He, S., Wang, Y. Antibacterial effect and possible mechanism of salicylic acid microcapsules against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (19), 12761(2022).
  96. Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: Mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in Microbiology. 3, 12(2012).
  97. Shariati, A., et al. Inhibitory effect of natural compounds on quorum sensing system in Pseudomonas aeruginosa: A helpful promise for managing biofilm community. Frontiers in Pharmacology. 15, 1350391(2024).
  98. Pedreira, A., Fernandes, S., Simões, M., García, M. R., Vázquez, J. A. Synergistic bactericidal effects of quaternary ammonium compounds with essential oil constituents. Foods. 13 (12), 1831(2024).
  99. Cameron, S. J., Sheng, J., Hosseinian, F., Willmore, W. G. Nanoparticle effects on stress response pathways and nanoparticle-protein interactions. International Journal of Molecular Sciences. 23 (14), 7962(2022).
  100. Nabarro, J., et al. Lipopolysaccharide lateral mobility in the Gram-negative bacterial outer membrane is confined and governed by interactions within the conserved Lipid A anchor. bioRxiv. , (2025).
  101. Vaara, M., Nurminen, M. Outer membrane permeability barrier in Escherichia coli mutants that are defective in the late acyltransferases of lipid A biosynthesis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (6), 1459-1462 (1999).
  102. Garde, S., Chodisetti, P. K., Reddy, M. Peptidoglycan: Structure, synthesis, and regulation. EcoSal Plus. 9 (2), 0010-2020 (2021).
  103. Nikolic, P., Mudgil, P. The cell wall, cell membrane and virulence factors of Staphylococcus aureus and their role in antibiotic resistance. Microorganisms. 11 (2), 259(2023).
  104. Wang, M., Buist, G., van Dijl, J. M. Staphylococcus aureus cell wall maintenance - The multifaceted roles of peptidoglycan hydrolases in bacterial growth, fitness, and virulence. FEMS Microbiology Reviews. 46 (5), fuac025(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים