מיוגרפיה של חוט עבור אאורטה גבית ועורקי עמידות מזנטרית מעכברים וחולדות

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול מפורט למיוגרפיה של חוטים זה לצד זה להערכת תגובתיות כלי דם בעורקי תעלות לעומת עורקי התנגדות המבודדים מעכברים וחולדות.

תקציר

מיוגרפיה חוטית היא טכניקת אקס ויבו נפוצה להערכה כמותית של תפקוד כלי דם בעורקים מבודדים. מכיוון שעורקי תעלה גדולה ועורקי התנגדות קטנים שונים מהותית במבנה ובתפקיד הפיזיולוגי, ניתוח שני סוגי כלי הדם במקביל באמצעות עורקים שנקטפו מאותו עכבר או עכבר מאפשר השוואות זוגיות שמפחיתות שונות בין בעלי חיים וחושפת שינויים תפקודיים ספציפיים לכלי. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב להערכת תגובתיות כלי דם בצינורות עכברים מבודדים ועורקי התנגדות באמצעות מיוגרפיה איזומטרית של חוטים. אנו מתארים את הכנת חיץ פיזיולוגי טרי ומחומצן; נתיחה, ניקוי והרכבה מדוקדקים של מקטעי עורק; ונרמוליזציה כדי למקם את הכלים לאורך האופטימלי שלהם ליצירת כוח פעיל. מדריך לפתרון תקלות ודוגמה לרצף ניסיוני ליצירת עקומות ריכוז-תגובה מצטברות למכווצי כלי דם ומרחיבי כלי דם סטנדרטיים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של תפקוד האנדותל והשריר החלק ומקל על זיהוי שינויים ספציפיים לכלי דם בתגובתיות כלי הדם הקשורים למחלות כלי דם, כגון יתר לחץ דם.

מבוא

יתר לחץ דם מאופיין בשינוי בתגובתיות כלי דם, כגון תפקוד לקוי של האנדותל והיפר-ריאקטיביות של השריר החלק הווסקולרי למכווצי כלי דם¹. שינויים תפקודיים אלו, יחד עם שיקום מיקרווסקולרי ונדירות, תורמים לפגיעה בפרפוזיה ברקמות ולחוסר בוויסות לחץ דם ^2,3,4. בדיקות אקס ויבו של כלי דם מבודדים הן כלים רבי עוצמה לפירוק המנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בטון כלי הדם בבריאות ובמחלה, שכן הן מאפשרות שליטה מדויקת על מיקרו-סביבת כלי הדם ומניפולציה פרמקולוגית סלקטיבית של מסלולי האיתות של שריר חלק ואנדותל.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות שנקבעו ואושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים בקמפוס מדעי הבריאות של אוניברסיטת טולדו.

אזהרה: לפני שתתחיל, אנא פעלו לפי הנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) וועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (IBC) בכל עת; שימוש בציוד מגן אישי (PPE); זהירות בעת שימוש בכלים כירורגיים או חדים אחרים; להתייעץ ולעמוד בגיליונות נתוני בטיחות (SDS) הרלוונטיים בעת טיפול בכימיקלים ורקמות ביולוגיות; לטפל בקרבוגן כצילינדר גז בלחץ באמצעות רגולטורים מאושרים ואחסון מאובטח; ולהיפטר מפסולת ביולוגית וכימית בהתאם לנהלים מוסדיים.

1. הכנת בופר ביקרבונט קרבס (Krebs) מ....

תוצאות

סכמטיקה המתארת את זרימת העבודה הכוללת של מיוגרפיית חוטים בעורקי תעלות והתנגדות המבודדים מעכברים או חולדות מוצגת באיור 1. תמונות מייצגות של בידוד והרכבה של טבעת אאורטה חזה בעכבר ו-MRA מדרגה שנייה מוצגות באיור 2 ובאיור 3, בהתאמה. צילומי מסך של תוכנה המתארים פרה-מתיחה ותהליכי נרמול באמצעות טבעת אאורטה של עכברוש ו-MRA מוצגים באיור 4A,B, בהתאמה.

דיון

מיוגרפיה של חוטים נותרה גישה עוצמתית ורזולוציה גבוהה לחקירת תפקוד כלי דם מחוץ לחיים (ex vivo). כאשר מבוצעת בזהירות, שיטה זו מספקת נקודות קצה כמותיות אמינות שמטפלות בשאלות ביולוגיות מובחנות, תוך אפשרות השוואה קפדנית בין מיטות מאקרו-וסקולריות ומיקרווסקולריות באותו בעל חיים. מחקרי עורקי תעלות חושפים שינויים במכניקה העורקית הגלובלית ובתגובתיות כלי הדם הגדולים הרלוונטיים ללחץ הדופק ולנוקשות האאורטה, בעוד שניסויים בעורקי ההתנגדות בודקים טון מיקרווסקולרי ומנגנונים השולטים ישירות בעמידו.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות צנטריפוגה חרוטיים בנפח 15 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	14-959-70C
צינורות צנטריפוגה חרוטיים בנפח 50 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	14-959-49A
חומצה אצטית	תרמו פישר סיינטיפיק	A490-212
אצטילכולין	מיליפור סיגמא	A6625-100G
איזון אנליטי	מטלר טולדו	MX304
CaCl2	תרמו פישר סיינטיפיק	C79-500
פחמימות (95% O2/5% CO2)	איירגז	CD USP50
מיקרוסקופ ניתוח	צייס	ZEISS Stemi 305
צלחת פטרי ניתוח	מערכות אינסטרומנטציה	DD-90-S-BLK
פיני ניתוח	טכנולוגיית מיו הדנית	400626
ערכת כלים לניתוח	טכנולוגיית מיו הדנית	101017	הערכה כוללת מספרי חיתוך (1), מספריים רב-תכליתיים (1), צלחות פטרי (5), מלקחיים (3) וסיכות חיתוך.
דומון #5 - מלקחיים עדינים	כלי המדע המדויק	11254-20
EDTA	תרמו פישר סיינטיפיק	BP2482-500
מקפיא (-20 & דרג; C)	תרמו פישר סיינטיפיק	TSG2325FA
קופסאות עם צירי מקפיא	USA Scientific	2310-5848
כפפות (גדולות)	תרמו פישר סיינטיפיק	19-041-171D
כפפות (בינוניות)	תרמו פישר סיינטיפיק	19-041-171C
כפפות (קטנות)	תרמו פישר סיינטיפיק	19-041-171B
גלוקוז	תרמו פישר סיינטיפיק	D16-500
צילינדר מדורג	תרמו פישר סיינטיפיק	08-572G
פריזמת GraphPad	תוכנת GraphPad	לא זמין	ניתוח נתונים והצגה גרפית
תמיסת חומצה כלורית	תרמו פישר סיינטיפיק	SA48-1
דלי קרח	תרמו פישר סיינטיפיק	03-395-156
KCl	תרמו פישר סיינטיפיק	P217-500
KH2PO4	תרמו פישר סיינטיפיק	P380-500
תוכנת LabChart 8	AD אינסטרומנטס	לא זמין	תוכנת לכידת נתונים
מקרר מעבדה	תרמו פישר סיינטיפיק	FBG49RPGA
מקור אור LED	תרמו פישר סיינטיפיק	AMPSILED21
מערבל מגנטי	תרמו פישר סיינטיפיק	FB30786159
מוטות ערבוב מגנטיים (גדולים)	תרמו פישר סיינטיפיק	14-513-68
מוטות ערבוב מגנטיים (מדיום)	תרמו פישר סיינטיפיק	14-513-61
MgSO4	תרמו פישר סיינטיפיק	M63-500
סט דגימת מיקרו כף ומרית	תרמו פישר סיינטיפיק	S43322
צינורות מיקרוצנטריפוגה	USA Scientific	1615-5510
מיני-מיקרוצנטריפוגה	תרמו פישר סיינטיפיק	07-203-954
מיני מברג	תרמו פישר סיינטיפיק	NC1349489
מערכת מיוגרף רב-חוטית	טכנולוגיית מיו הדנית	DMT 620M
NaCl	תרמו פישר סיינטיפיק	S271-3
NaHCO3	תרמו פישר סיינטיפיק	S233-500
מד pH	תרמו פישר סיינטיפיק	01-912-351	כולל מד pH, חיישן LE420, התקנה QuickGuide, וחבילת התחלה לבופר pH
פנילאפרין	מיליפור סיגמא	P6126-5G
בקר פיפט	תרמו פישר סיינטיפיק	01-001-023
טיפים לפיפטה במדפים (10 ומיקרו; L)	USA Scientific	1111-3810
טיפים של פיפט במדפים (1000 ומיקרו; L)	USA Scientific	1111-2830
קצות פיפטה במדפים (200 ומיקרו; L)	USA Scientific	1111-1810
בקבוקי אחסון מדיה רב-פעמיים PYREX	תרמו פישר סיינטיפיק	06-414-1D
פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)	תרמו פישר סיינטיפיק	02-923-204
פיפטות סרולוגיות (25 מ"ל)	תרמו פישר סיינטיפיק	02-923-205
מיקרופיפטה חד-ערוצית רב-חבילה	תרמו פישר סיינטיפיק	13-684-250	3x פיפטות (0.5-10 & mu; L, 10-100 & mu; L, 100-1000 & mu; L)
חוט נירוסטה (40 ו-mu; m)	טכנולוגיית מיו הדנית	400447
טיימר	תרמו פישר סיינטיפיק	02-261-840
מערכת מים טהורים במיוחד	סארטוריוס	H2O-MM-UV-SET-US
מספריים אביביים של ואנאס	כלי המדע המדויק	15000-00
בקבוק וולומטרי	תרמו פישר סיינטיפיק	13-756-400
מערבל מערבולת	תרמו פישר סיינטיפיק	10-320-807
אמבט מים	תרמו פישר סיינטיפיק	07-202-155
שקילת כלים	תרמו פישר סיינטיפיק	02-202-101