הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיוגרפיה של חוט עבור אאורטה גבית ועורקי עמידות מזנטרית מעכברים וחולדות

615 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

27 בפברואר 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול מפורט למיוגרפיה של חוטים זה לצד זה להערכת תגובתיות כלי דם בעורקי תעלות לעומת עורקי התנגדות המבודדים מעכברים וחולדות.

תקציר

מיוגרפיה חוטית היא טכניקת אקס ויבו נפוצה להערכה כמותית של תפקוד כלי דם בעורקים מבודדים. מכיוון שעורקי תעלה גדולה ועורקי התנגדות קטנים שונים מהותית במבנה ובתפקיד הפיזיולוגי, ניתוח שני סוגי כלי הדם במקביל באמצעות עורקים שנקטפו מאותו עכבר או עכבר מאפשר השוואות זוגיות שמפחיתות שונות בין בעלי חיים וחושפת שינויים תפקודיים ספציפיים לכלי. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב להערכת תגובתיות כלי דם בצינורות עכברים מבודדים ועורקי התנגדות באמצעות מיוגרפיה איזומטרית של חוטים. אנו מתארים את הכנת חיץ פיזיולוגי טרי ומחומצן; נתיחה, ניקוי והרכבה מדוקדקים של מקטעי עורק; ונרמוליזציה כדי למקם את הכלים לאורך האופטימלי שלהם ליצירת כוח פעיל. מדריך לפתרון תקלות ודוגמה לרצף ניסיוני ליצירת עקומות ריכוז-תגובה מצטברות למכווצי כלי דם ומרחיבי כלי דם סטנדרטיים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של תפקוד האנדותל והשריר החלק ומקל על זיהוי שינויים ספציפיים לכלי דם בתגובתיות כלי הדם הקשורים למחלות כלי דם, כגון יתר לחץ דם.

מבוא

יתר לחץ דם מאופיין בשינוי בתגובתיות כלי דם, כגון תפקוד לקוי של האנדותל והיפר-ריאקטיביות של השריר החלק הווסקולרי למכווצי כלי דם1. שינויים תפקודיים אלו, יחד עם שיקום מיקרווסקולרי ונדירות, תורמים לפגיעה בפרפוזיה ברקמות ולחוסר בוויסות לחץ דם 2,3,4. בדיקות אקס ויבו של כלי דם מבודדים הן כלים רבי עוצמה לפירוק המנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בטון כלי הדם בבריאות ובמחלה, שכן הן מאפשרות שליטה מדויקת על מיקרו-סביבת כלי הדם ומניפולציה פרמקולוגית סלקטיבית של מסלולי האיתות של שריר חלק ואנדותל.

תגובתיות כלי דם בעורקים מבודדים מוערכת בדרך כלל באמצעות שתי טכניקות אקס ויבו משלימות יחסית: מיוגרפיית חוט ומיוגרפיית לחץ 5,6. במיוגרפיה של חוטים, טבעות או מקטעים של כלי שיט מותקנים על פינים או חוטים, והכוח האיזומטרי נרשםב-7,8. במיוגרפיית לחץ, מקטעי כלי דם שלמים עוברים קנולציה ולחצים ללחץ תוך-לומינלי מוגדר, וקוטר הכלי נמדד באמצעות מיקרוסקופ וידאו9. בניגוד למיוגרפיה של חוטים, מיוגרפיית לחץ מאפשרת שליטה בלחץ הטרנסמורלי ובזרימה התוך-לומינלית. לכן, הוא מסכם בצורה מדויקת יותר את הסביבה ההמודינמית בעורקי ההתנגדות ומשמש בדרך כלל לחקר טון מיוגני, תגובות מתווכות זרימה, ותכונות מבניות או מכניות וסקולריות 9,10. לעומת זאת, מיוגרפיית חוט טכנית קלה יותר ליישום (ללא קנולציה או מיקרוסקופיית וידאו), תומכת בקצב העברה גבוה יותר באמצעות מערכות מסחריות רב-תאיות, ומתאימה היטב ליצירת עקומות ריכוז-תגובה פרמקולוגיות שחוזרות בעורקים קטנים עד בינוניים בקוטרים בסדר גודל של עשרות עד מאות מיקרומטרים 5,6. בהתאם לכך, מיוגרפיה חוטית מועדפת לעיתים קרובות לפרופיל פרמקולוגי צמוד של תגובתיות כלי דם בצינורות ועורקי עמידות המבודדים מעכברים או חולדות.

עורקי צינורות (אלסטיים גדולים) ועורקי התנגדות (שרירים קטנים) שונים מהותית במבנה ובתפקוד, והבדלים אלו מכתיבים שיקולים ניסיוניים ונקודות קצה מובחנות. עורקי תעלות (למשל, אאורטה חזה יורדת) מכילים כמויות גדולות של רקמה אלסטית ומסת שריר חלק משמעותית; עורקי ההתנגדות (למשל, עורקי מזנטריים) בעלי יחס שריר חלק ללומן גבוה יחסית גבוה יותר והם גורמים מרכזיים לעמידות פריפרית ולויסות המקומי11,12. מכיוון שאותו אגוניסט יכול להפעיל תגובות מולקולריות שונות במיטות כלי דם אלו, השוואה זו לצד זו של צינורות וכלי עמידות מאותו בעל חיים מספקת מידע משלים שימושי. לדוגמה, בעורקי צינור, שחרור תחמוצת החנקן שמקורה באנדותליום הוא הנתיב המרפה הדומיננטי שבו אצטילכולין (ACh) מעורר הרפיית כלי דם13,14. לעומת זאת, בעורקי עמידות קטנים, ACh גורם להרפיה באמצעות חנקן אוקסיד, פרוסטציקלין, וחשוב מכך, גורמי היפרפולריזציה שמקורם באנדותליום (EDHF)15,16. בהתאם לכך, מיוגרפיה צמודה של צינורות ועורקי התנגדות שנאספו מאותו עכבר או עכבר מאפשרת השוואות זוגיות שמאפשרות זיהוי שינויים פונקציונליים ספציפיים לכלי שיט תוך הפחתת שונות בין בעלי חיים.

פירוש מדויק של נתוני מיוגרפיית חוטים תלוי בתשומת לב קפדנית למגוון משתנים טכניים: הרכב וחמצון של תמיסת המלח הפיזיולוגית (PSS), טיפול וניתוח רקמות, טכניקת התקנה, מתיחת מנוחה אופטימלית (נרמל), טמפרטורת אמבטיה, ובחירת בקרות פרמקולוגיות מתאימות6. נורמליזציה מתייחסת להליך הטכני של קביעת נקודת הפעולה המכאנית של הכלי כך שהתפתחות הכוח הפעיל תהיה אופטימלית ומקרב את תנאי הפעולה הפיזיולוגיים5. מעשית, עבור טבעות אאורטליות, נהוג להשתמש במתח קבוע, שנקבע לעיתים אמפירית כדי למנוע התפשטות מופרזת תוך מתן תגובות יציבות. עבור עורקי התנגדות קטנים, מתבצעת נרמול על ידי קביעת ההיקף הפנימי המתאים ללחץ טרנסמורלי שווה ערך של 100 מ"מ כספית (IC100). לאחר מכן מכוונים את הכלי לשבר מוגדר של ערך זה כדי לקבוע את ההיקף הפנימי המנורמל (IC1). בפועל, פרוטוקולים רבים מגדירים IC1 קרוב ל-0.9 × IC100 עבור MRA בעכברים וכ-1.0 × IC100 ל-MRA בעכברים, אם כי ערכים אלו יכולים להיות מותאמים לפי סוג כלי כלי, מין ומטרות ניסוי 5,17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות שנקבעו ואושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים בקמפוס מדעי הבריאות של אוניברסיטת טולדו.

אזהרה: לפני שתתחיל, אנא פעלו לפי הנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) וועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (IBC) בכל עת; שימוש בציוד מגן אישי (PPE); זהירות בעת שימוש בכלים כירורגיים או חדים אחרים; להתייעץ ולעמוד בגיליונות נתוני בטיחות (SDS) הרלוונטיים בעת טיפול בכימיקלים ורקמות ביולוגיות; לטפל בקרבוגן כצילינדר גז בלחץ באמצעות רגולטורים מאושרים ואחסון מאובטח; ולהיפטר מפסולת ביולוגית וכימית בהתאם לנהלים מוסדיים.

1. הכנת בופר ביקרבונט קרבס (Krebs) מ-PSS/מותאם

הערה: הרכב בופר קרבס (ריכוזים סופיים, pH 7.4): 130 מ"מ NaCl, 4.7 מ"מ KCl, 1.17 מ"מ MgSO4, 1.18 מ"מ KH2PO4, 1.6 מ"מ CaCl2, 25 מ"מ NaHCO3, 5.5 מ"מ גלוקוז, ו-0.03 מ"מ EDTA.

  1. הכינו ציר בנפח גדול: המיס את כל המרכיבים פרט ל-NaHCO3, גלוקוז ו-CaCl2 במים מזוקקים כפול כדי להכין ציק. אחסן את המלאי הזה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. ביום הניסוי, יש להגדיל את נפח המלאי הנדרש (למשל, 1 ליטר), להוסיף ברצף NaHCO3, גלוקוז וקאלוק2, ולחמצן ברציפות עם קרבוגן (95% O2/5% CO2).
    הערה: כדי למזער את השקיעת מלח הסידן, יש להכין ולאחסן ציר של 1 מטר CaCl2 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והוסף את הנפח הנדרש לאט לבופר רק לאחר ש-NaHCO3 מומס לחלוטין, תוך ערבוב רציף. שמרו על בועות קרבוגן במהלך הוספת CaCl2 (ראו שלב 1.3) כדי להפחית את היווצרות סידן קרבונט. אם מתרחשים משקעים נראים לעין, יש להשליך ולהכין חומר חיץ חדש.
  3. לאיזון ה-pH, בועות על הבופר עם קרבוגן לפחות 20 דקות, ואז מדדו pH והתאימו ל-pH 7.4 במידת הצורך.
    הערה: pH טיפוסי לפני בועות ≈ 7.7; בועות רציפות מורידה את ה-pH ל-≈7.4 פיזיולוגי.
  4. הכינו תאי מיוגרף על ידי מילוי בבופר קרבס טרי והתחילו לבעבע בעדינות עם קרבוגן. כוון את קצב הבועות כדי להבטיח החלפת גז מספקת ללא ערבוב עז.
  5. שמרו אליקו של בופר קרבס טרי ומחומצן ומקררים אותו על קרח לניתוח רקמות. חממו את הבופר המחומצן הנותר ל-37 מעלות צלזיוס (עם בועות קרבוגן רציפות) לשימוש במהלך ניסויים.

2. ניתוח האאורטה התוראקית והקשת המזנטרית היורדת

  1. הורד את החיה לפי הנחיות ה-IACUC. לאחד את תזמון המתת החסד של בעלי חיים וקטיף רקמות בתוך חלון של שעתיים כדי למזער את ההשפעות הצירקדיות האפשריות.
  2. פתח מיד את חללי החזה והבטן דרך חתך בקו האמצע והחזיר את דופן החזה לצד כדי לחשוף את הלב וכלי הדם הגדולים.
    הערה: אין לבצע פרפוזיה מערכתית בתנאים סטנדרטיים, שכן הדבר עלול לגרום בטעות לנזק לאנדותל. יתרה מזאת, דם שנשאר בכלי הדם המזנטריים משפר את ההבחנה הוויזואלית בין עורקים לוורידים ומקל על הערכת שלמות העורקים. עם זאת, בחלק מהמודלים הפתולוגיים (למשל, הפרעות טרומבוטיות), ייתכן שמומלץ לבצע פרפוזיה עדינה בלחץ נמוך עם בופר פיזיולוגי הפאריני וקר לקרח כדי לנקות את הטרומבים החוסמים תוך מזעור פגיעה באנדותל.
  3. להסיר את האאורטה התוראקית היורדת. כדי להקל על הניתוח, הסרת הריאות והוושט לשיפור הדמיה. אין לאחוז ישירות באאורטה החזה היורדת; במקום זאת, החזק בעדינות את קשת האאורטה או השומן הפרידונציאלי, הרם מעט וחתך בזהירות את כלי הדם הבין-צלעיים מתחת לאאורטה. הסרת האאורטה החזה היורדת על ידי חיתוך רגע לפני שהיא עוברת דרך הסרעפת והנח אותה בצלחת פטרי מצופה סילגארד המכילה בופר קרבס מחומצן קר.
    הערה: שמרו על טמפרטורה קרה כדי למזער צליל ספונטני ולשמור על החיוניות. סילגארד השחור מגדיל את הניגודיות לפירוק כלי הדם.
  4. להסיר את כל הארקייד המזנטרי. הרימו בעדינות את הארקדה המזנטרית כדי לאתר את העורק המזנטרי העליון המתפצל מהאאורטה הזנבית של הבטן אל הסרעפת. חתכו את העורק המזנטרי העליון קרוב ושחררו את הארקדה המזנטרית מרקמת החיבור הסובבת ללא מניפולציה ישירה של כלי הדם. המקם את הארקדה המזנטרית בצלחת פטרי נפרדת מצופה סילגארד המכילה בופר קרבס מחומצן קר.

3. בידוד והרכבה של טבעות אאורטה במיוגרפי פין

  1. קשור את הקצוות הפרוקסימלי והדיסטלי של האאורטה החזה היורדת עם סיכות כריתה ליישר את כלי הדין. הימנעו ממתיחה מופרזת כדי למנוע נזק מכני.
    הערה: הניחו סיכות בשומן הפרידונציאלי במקום דרך דופן כלי הדם כדי למזער נזק.
  2. מתחת למיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ עם מקור אור חיצוני, יש להסיר בזהירות שומן פריאדונציאלי ורקמת חיבור באמצעות מספריים ואנאס דקים ומלקחיים. הימנע מנזק לדופן הכלי.
    הערה: נהוג להסיר את השומן הפריאדוונציאלי אלא אם המטרה היא לחקור את תפקיד הרקמות האדוונטיאליות הפריוסקולריות בוויסות הטון הווסקולרי.
  3. חותכים טבעות אאורטליות בקוטר 2 מ"מ, ויצרו חיתוכים נקיים וניצבים. להשליך טבעות שנפגעו או ניזוקות לעין. ככל האפשר, יש לדגום מיקומים דומים בין בעלי חיים כדי למזער שונות.
  4. נתק תא אחד המכיל בופר קרבס מחומצן ממכונת המיוגרפיה והעבר אותו בזהירות לסטריאומיקרוסקופ.
    הערה: הזזת התא עלולה להשפיע על הטרנסדוסר ועלולה לשנות את התוצאות, לכן החזק את התא בזהירות והניח אותו בעדינות.
  5. מתחת לסטריאומיקרוסקופ, השתמש במיקרומטר כדי לקבץ את פיני המיוגרף ולהחליק את טבעת האאורטה אל הפינים, כדי למזער את המניפולציה של פני השטח הלומינליים.
  6. שימו לב לקריאת המיקרומטר כשהטבעת רפויה לחלוטין; יש מתיחה קלה כדי לאבטח את הרקמה להובלה.
  7. חבר את התא למכשיר והחזיר את הכלי לקריאת המיקרומטר המקורית.
  8. לאחר התקנת כל הטבעות, חממו את התאים ל-37 מעלות צלזיוס ומדדו על הטמפרטורה עם הגשן הסופק (בדרך כלל 20-30 דקות עד להגיע ל-37 מעלות צלזיוס).
  9. אפס את קריאות הכוח בממשק המשתמש, הפעל את תוכנת איסוף הנתונים והתחל להקליט.
  10. יש להחיל מתיחה הדרגתית על טבעות האאורטה לערך קבוע המתאים לכלי הדם באמצעות המיקרומטר.
    הערה: ערך מתיחה אופייני לטבעות אאורטה בעכבר הוא 5 מיליוניוטון (mN)5. בעוד שערכי המתיחה המדווחים לטבעות אאורטה של חולדה משתנים בין מחקרים, אופטימיזציה קודמת תומכת במתח מוקדם של 10 mN בפרוטוקול18 זה.
  11. איזון טבעות האאורטה למשך 45-60 דקות במתיחה שנבחרה, עם שינויים חוזרים בבופר באמצעות קרבס של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: נפוץ שטבעות האאורטה מאבדות חלקית מתח ולכן דורשות התאמת קדם-מתיחה עדינה מספר פעמים באמצעות המיקרומטר לפני שהמתח מתייצב.
  12. האפס את קריאות הכוח בממשק המשתמש לפני תחילת פרוטוקולי הניסוי.

4. בידוד והתקנה של MRA על מיוגרפי חוט

  1. הצמיד את הקשת המזנטרית בתבנית עם כיוון השעון כדי ליישר את הענפים המזנטריים. התחילו בקביעת הצום, ואז הצמידו מתיחות עוקבות של המעי הדק בכיוון השעון כדי למתוח בעדינות את כלי הדם המזנטרי מבלי להימתח יתר על המידה. החלף את הבופר בקרבס טרי לפי הצורך כדי להסיר דם או לכלוך.
  2. זהה את העורק המזנטרי העליון במרכז הצלחת, שם מקרינים קשתות.
  3. בחרו MRA מתאים לבידוד; מטרות טיפוסיות: קוטר פנימי 200-250 מיקרון (נקבע מאוחר יותר במהלך הנרמליזציה).
    הערה: בבעלי חיים ניסיוניים בוגרים, זה בדרך כלל מתאים לשני ענפים מסדרשני בעכברים ושלושה ענפים מדרגהרביעית בעכברים. סדר הענף מוגדר על ידי פיצולים עוקבים עוקבים מהעורק המזנטרי העליון. ענפים מדרגה 1 סט נובעים ישירות מהעורק המזנטרי העליון, שני ענפים מדרגהשנייה נוצרים מענפים מסדרראשון, וכן הלאה.
  4. מתחת למיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ, נתח את הווריד הנלווה והסר שומן פריאדוונציאלי ורקמת חיבור באמצעות מספריים ואנאס ומלקחיים.
    הערה: ניתן להבחין בין MRAs לוורידים על ידי דפנותיהם העבות יותר ולומנים קטנים יותר, הנראים בקלות על ידי נוכחות דם תוך-לומינלי שאריתי.
  5. הרפו את סיכות המעיים הסמוכות שמותחות את דופן המעי הסמוכה לכלי הדם הנבחר לפני כריתת העורק כדי למנוע רתיעה של כלי הדם.
  6. להסיר את כל אורך ה-MRA שנבחר (צריך להיות באורך >2 מ"מ), וליצור חיתוכים נקיים וניצבים. באמצעות מלקחיים דקים, אחיזה בקצה אחד של העורק והעבירה לצלחת פטרי נקייה המכילה בופר קרבס קרח (צלחות רגילות שאינן מצופות סילגארד מסייעות להרכבה נוספת). לבדוק את העורק לאיתור נזק; נוכחות דם תוך-לומינלי מקלה על הערכה חזותית של שלמותו.
  7. הוצאה של קטע באורך כ-2 מ"מ מאזור לא פגוע. השליכו כל אזור שטופל במהלך ההובלה או שמראה נזק נראה לעין.
    הערה: שימוש בצלחות שקופות שאינן מצופות סילגארד מאפשר למקם סרגל מתחת לצלחת כדי למדוד במדויק את אורך הכלי.
  8. הכינו שני חוטי נירוסטה באורך 2.5 ס"מ בגודל 40 מיקרון להרכבה.
  9. בעזרת מלקחיים דקים, הברג בזהירות את החוטים, אחד אחד, דרך הלומן כך שיהיה מספיק חוט בולט משני הקצוות להרכבה. מזער טראומה באנדותליה. לאחר הכנסת שני החוטים, יש להקליט את האורך המדויק עם סרגל לשימוש בתהליך הנרמול (ראו שלב 5.2).
    הערה: זהו אחד השלבים המאתגרים ביותר מבחינה טכנית וגוזלי זמן בפרוטוקול ודורש סבלנות ותרגול חוזר כדי למזער נזק לאנדותל. לאחר הכנסת החוט הראשון, לעיתים קל יותר לחבר את שני החוטים יחד ולהעביר אותם דרך הכלי.
  10. נתק תא אחד המכיל בופר קרבס מחומצן ממכונת המיוגרפיה והעבר אותו בזהירות לסטריאומיקרוסקופ.
  11. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו-מיקרוסקופ, העבר את ה-MRA (המחזיק חוטים בשני הקצוות) לתא המיוגרפיה. באמצעות המיקרומטר, הביאו את לסתות המיוגרף יחד כדי להדביק את קצות החוט בין הלסתות כך שהעורק תלוי בחופשיות ביניהן.
    הערה: בשלב זה מומלץ להדביק את החוטים כך שישכבו זה על זה. זה מאבטח את החוטים במקום ומונע מהם להסתובב.
  12. אבטח את החוט העליון מתחת לברגי ההרכבה בצד הקרוב למיקרומטר על ידי עטיפת הקצוות בכיוון השעון; חזור על זה עבור החוט השני בצד הטרנסדוסר.
    הערה: הדק את הברגים בעדינות אך בחוזקה. אם הברגים רפויים מדי, הכלי עלול להחליק; אם מהודקים יתר על המידה, החוט או המתמר עלולים להיפגם. לאחר חיבור הקצה הראשון, פתחו מעט את המרווח בין לסתות המיוגרף לפני שמאבטחים את הקצה הנגדי כדי להבטיח מתיחות אחידה של החוטים.
  13. הזיזו מעט את הלסתות ויישרנו את החוטים כך שישכבו במקביל ובמישור, כמעט נוגעים.
    הערה: בצע את כל התאמות החוטים הרחק מהכלי המותקן כדי למזער נזק.
  14. התקנה חוזרת לכל ה-MRAs.
  15. חימום תאים ל-37 מעלות צלזיוס ומדד טמפרטורת מוניטור (20-30 דקות בדרך כלל).
  16. האפס את קריאות הכוח בממשק המשתמש לפני שמתחילים את תהליך הנירמל.

5. הליך נרמול ל-MRA

הערה: טבעות האאורטה מותקנות במתיחה קבועה ומוגדרת מראש. לכן, לא מתבצע שלב נרמול נפרד.

  1. הגדר פרמטרי נרמול בתוכנת רכישת הנתונים: כיול עינית = 1; לחץ מטרה = 13.3 קילופסקל (≈ 100 מ"מ כספית); היקף פנימי מנורמל (IC1) = 0.9 עבור MRAs של עכברים ו-1.0 עבור MRAs בעכברים; זמן ממוצע = 2 שניות; עיכוב = 60 שניות.
  2. הזן את הפרמטרים הספציפיים לכלי לתוך מודול הנרמול כך:
    1. עבור נקודות קצה רקמה (mm): הגדר a1 = 0 ו-a2 = אורך ה-MRA הנמדד במילימטרים (האורך המדויק שנמדד במהלך הכריתה).
    2. הזן את קוטר החוט: 40 מיקרון.
    3. קריאת מיקרומטר: הזן את ערך המיקרומטר הבסיסי שנרשם כאשר הכלי מותקן ומשוחרר לחלוטין.
  3. התחל את תהליך הנרמול על ידי מתיחה הדרגתית של ה-MRA המותקן במרווחים של 50 מיקרון. לאחר כל מתיחה, הזן את קריאת המיקרומטר החדשה למודול הנרמול והמתין 60 שניות בין הקטעים.
    הערה: ירידות פתאומיות במתח לאחר התאמה של מיקרומטר בדרך כלל מעידות על החלקת כלי הדם. יש להדק את הברגים בעדינות אך בחוזקה.
  4. המתינו שמודול הנירמול ישרטט את מתח קיר המנוחה (mN/mm) מול ההיקף הפנימי (μm) ויתאים עקומה מעריכית. באמצעות המיקרומטר, המשך מתיחה מדרגתית עד שעקומת המתח-היקף מצטלבת עם איזובר 100 מ"מ כספית. כאשר הם קרובים לצומת, הקטין את גודל המדרגה ל-10-30 מיקרון כדי למנוע מתיחה מוגזמת של הכלי.
  5. כאשר העקומה חוצה את האיזובר של 100 מ"מ כספית, שים לב להיקף הפנימי המחושב בתוכנה והגדר את המיקרומטר לערך המתאים שחושב על ידי המודול כך שההכנה תנוח על ההיקף הפנימי המנורמל (IC₁) של היעד.
    הערה: התאמת עקומה לקויה בדרך כלל מצביעה על פרמטרים שגויים שהוזנו לתוכנה, כגון אורך הרקמה, קוטר החוט או קריאות מיקרומטר.
  6. חזור על תהליך הנרמול עבור כל ה-MRA המותקנים, ואז אפשר לכלי השיט להתאזן למשך 30-45 דקות עם החלפות בופר חוזרות באמצעות קרבס 37 מעלות צלזיוס.
  7. אפס את קריאות הכוח בממשק המשתמש מיד לפני תחילת הניסויים.
    הערה: הבדלים מרכזיים בפרמטרים בין עכברים לחולדות מסוכמים בטבלה 1.
פרמטרעכברעכברוש
ערך מתיחת פרונציה לטבעות אאורטליות5 מילי-ניוטון10 מילי-ניוטון
יחס ICיעד 1 עבור MRA10.9
הזמנה טיפוסית של סניף MRA לקוטר פנימי של 200-250 מיקרון2סיבוב 3-4

טבלה 1: הבדלים מרכזיים בפרמטרים בין עכברים לחולדות.

6. פרוטוקול ניסויי (רצף לדוגמה)

  1. בדיקת כדאיות: מעוררת תגובה כיווצית עם אתגר K⁺ גבוה דה-פולריזציה (למשל, 120 mM KCl).
    הערה: בופר ה-K⁺ הגבוה (KPSS) מוכן על ידי החלפה אקווימולרית של NaCl ב-KCl מבופר קרבס הסטנדרטי לשמירת האוסמולריות והוא מחומצן באופן רציף עם 95% O2/5%CO2. כדי למנוע הלם קור, חמם את ה-KPSS ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הרכב בופר KPSS (ריכוזים סופיים, pH 7.4): 120 mM KCl, 14.7 mM NaCl, 1.17 mM MgSO4, 1.18 mM KH2PO₄, 1.6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5.5 mM גלוקוז, ו-0.03 mM EDTA.
  2. בצע לפחות שלוש שטיפות רצופות עם בופר קרבס מחומצן חדש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשיקום מתח בסיסי פסיבי יציב.
    הערה: כל שלבי הכביסה מתבצעים על ידי הסרת תמיסת הרחצה לחלוטין והחלפתה בבופר קרבס מחומצן חדש של 37 מעלות צלזיוס. למיוגרפים מסחריים יש בדרך כלל פונקציית שטיפה מובנית שמנקזת את תאי המיוגרפיה.
  3. יצירת עקומת ריכוז-תגובה מצטברת (CRC) לפנילאפרין (PE), תוך הוספת ריכוזים עולים (דוגמה טווח של 10⁻9 עד 10⁻4 מ'). אפשר לכל ריכוז להגיע למישור לפני הוספת הריכוז הבא עד שמושג רמה מקסימלית יציבה.
  4. בצע לפחות שלוש שטיפות רצופות עם בופר קרבס מחומצן חדש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשיקום מתח בסיסי פסיבי יציב.
  5. הערכת תפקוד האנדותליאל: קדם-התכווצות בריכוז תת-מקסימלי של PE, אפשרו לתגובה להתייצב, ולאחר מכן הערכו הרפיה תלויה באנדותליום עם ACh (דוגמה טווח 10⁻⁹ עד 10⁻⁵ M). אפשר לכל ריכוז להגיע למשטח לפני הוספת הריכוז הבא עד להשגת הרפיה מקסימלית יציבה. אחוז שיא של הרפיה ביחס לטון הקדם-מכווץ (ראו שלב 7.4). הכנות עם <70% הרפיה אינן כלולות.
    הערה: מחלות דופן כלי דם, כמו יתר לחץ דם, קשורות לעיתים קרובות לתפקוד לקוי של האנדותל, שלעיתים מוביל לפגיעה בתגובה של רפיית כלי הדם התלויה באנדותליום ל-ACh19. בתנאים אלו, הכנות המציגות הרפיה של <70% לא צריכות להיפסל אוטומטית, שכן ייתכן שזה ייצג תפקוד לקוי אמיתי הקשור למחלה ולא כשל טכני.
  6. בצע לפחות שלוש שטיפות רצופות עם בופר קרבס מחומצן חדש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשיקום מתח בסיסי פסיבי יציב.
  7. בדוק חומרים ואזואקטיביים נוספים, עם ובלי מעכבים ספציפיים למסלול, כפי שנדרש בשאלה הניסויית.
  8. בסיום הניסוי, להסיר את כל הכלים המותקנים, לנקות את כל התאים עם 8% חומצה אצטית, לאחר מכן שלוש שטיפות מים, ולבסוף לכבות את מיכל הדלק ואת המכונה.
  9. סילוק פסולת ביולוגית וכימית בהתאם לנהלים מוסדיים.

7. ניתוח נתונים ודיווח

  1. הגדרה בסיסית והקלטה. יש לתעד את המתח הבסיסי מיד לפני תחילת כל אתגר של מכווצת כלי דם (כלומר, אתגר K⁺ גבוה, CRC מכווץ כלי דם, או התכווצות מוקדמת לפני CRC מרחיב כלי דם).
    הערה: לניתוח מאוחר יותר, קל בפועל לאפס את קריאות הכוח בממשק המשתמש לאחר שטיפה מספקת של כל גירוי קודם, מיד לפני תחילת כל אתגר התכווצות כלי הדם (כלומר, מתח בסיסי מוצג = 0).
  2. אתגר High-K⁺. חשב את הכוח הפעיל כך: כוח פעיל = טון מקסימלי לאחר KCl - מתח בסיסי (יחידות: mN). הבעת הכוח הפעיל המנורמל לאורך יחידה (mN/mm) או שטח חתך (mN/mm 2) של הקטע העורקי המותקן. מדידת שטח החתך דורשת ניתוח היסטולוגי נוסף של מקטעי העורק המותקנים כדי לקבוע את עובי הדופן.
    הערה: מכיוון שטבעות אאורטליות לעיתים קרובות מייצרות תגובה שאינה מתייצבת, מדוד את התגובה המקסימלית של K⁺ גבוה בתוך זמן מוגדר מראש (למשל, 10 דקות) בכל ההכנות, כדי למזער שונות. ב-MRAs, תגובת K⁺ גבוהה מקסימלית מושגת בדרך כלל תוך שניות לאחר הגירוי.
  3. CRCs מתכווצים. עבור כל ריכוז ב-CRC מצטבר כיווץ (למשל, PE), חשב את הכוח הפעיל כך. הביעו את הכוח הפעיל בכל ריכוז כאחוז מהתגובה שנוצרה על ידי אתגר ה-K⁺ הגבוה. השתמש בערכי האחוזים הללו להתאמת CRCs מתכווצים (ראו שלב 7.5).
    כוח פעיל = טון מקסימלי לאחר יישום תרופה - מתח בסיסי (יחידות: mN)
    הערה: מצבים מסוימים עשויים לגרום לשונות בתגובות המקסימליות של K⁺ גבוה בין ההכנות (למשל, שינויים במסת השריר החלק או במצב התמיינות הנובעים מפתולוגיה). בנסיבות אלו, יש לבטא את הכוח הפעיל בכל ריכוז המנורמל לאורך יחידה (mN/mm) או שטח חתך (mN/mm 2) של קטע העורקי המותקן.
  4. CRCs מרגיעים. עבור CRCs של הרפיה לאחר טרום-היצרה תת-מקסימלית (טון קדם-כיווצים), מחשבים אחוז הרפיה בכל ריכוז כדלקמן. השתמשו בערכי האחוזים הללו להתאמת CRCs של הרפיה (ראו שלב 7.5).
    הרפיה = (טון קדם-התכווצות - טון לאחר יישום התרופה) / (טון קדם-התכווצות - מתח בסיסי) × 100.
  5. התאמת עקומה. עבור CRCs מצטברים מכווצים או מרפיים, גרף log [ריכוז אגוניסטים] על ציר ה-x לעומת התגובה המנורמלת בציר y. התאמת העקומה המצוירת עם מודל לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים באמצעות רגרסיה לא ליניארית. יש להפיק Emax (אפקט מקסימלי) ו-pEC50 (−logEC50) להשוואות סטטיסטיות, כאשר EC50 הוא ריכוז האגוניסטים שמייצר 50% מ-Emax.
  6. הצגת נתונים: הצג את ה-CRCs המנורמלים. לכל אחת מנקודות הנתונים בעקומה, השתמש בממוצע קבוצתי ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) או סטיית התקן (SD). כלול עקבות מקוריות מייצגות וספק טבלת פרמטרים המסכמת את ערכי Emax ו-pEC50 (ממוצע ±SEM או SD).
  7. ניתוח סטטיסטי:
    1. השוו CRCs בין קבוצות ניסוי באמצעות ניתוח מדידות חוזרות דו-כיווני של שונות (ANOVA) עם מבחן פוסט-הוק מתאים (למשל, Bonferroni). עם זאת, בדוק הנחות (כדוריות, נורמליות) ומשתמש בגישות חלופיות (למשל, מודלים של השפעות מעורבות) כאשר הנתונים חסרים או לא מאוזנים.
    2. השווה בין pEC50 ל-Emax בין שתי קבוצות ניסוי באמצעות מבחן t לא מזווג, או ANOVA חד-כיווני אם משווים יותר משתי קבוצות ניסוי. לחילופין, יש להשתמש במבחנים שאינם פרמטריים כאשר הפרות את הנחות ההומוגניות והנורמליות של שונות. קבע מובהקות סטטיסטית ב-p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סכמטיקה המתארת את זרימת העבודה הכוללת של מיוגרפיית חוטים בעורקי תעלות והתנגדות המבודדים מעכברים או חולדות מוצגת באיור 1. תמונות מייצגות של בידוד והרכבה של טבעת אאורטה חזה בעכבר ו-MRA מדרגה שנייה מוצגות באיור 2 ובאיור 3, בהתאמה. צילומי מסך של תוכנה המתארים פרה-מתיחה ותהליכי נרמול באמצעות טבעת אאורטה של עכברוש ו-MRA מוצגים באיור 4A,B, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מיוגרפיה של חוטים נותרה גישה עוצמתית ורזולוציה גבוהה לחקירת תפקוד כלי דם מחוץ לחיים (ex vivo). כאשר מבוצעת בזהירות, שיטה זו מספקת נקודות קצה כמותיות אמינות שמטפלות בשאלות ביולוגיות מובחנות, תוך אפשרות השוואה קפדנית בין מיטות מאקרו-וסקולריות ומיקרווסקולריות באותו בעל חיים. מחקרי עורקי תעלות חושפים שינויים במכניקה העורקית הגלובלית ובתגובתיות כלי הדם הגדולים הרלוונטיים ללחץ הדופק ולנוקשות האאורטה, בעוד שניסויים בעורקי ההתנגדות בודקים טון מיקרווסקולרי ומנגנונים השולטים ישירות בעמידו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

העבודה נתמכה על ידי פרס NHLBI (HL153896 ראנד ל-I.O.) וקרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת טולדו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה חרוטיים בנפח 15 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק14-959-70C
צינורות צנטריפוגה חרוטיים בנפח 50 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק14-959-49A
חומצה אצטיתתרמו פישר סיינטיפיקA490-212
אצטילכוליןמיליפור סיגמאA6625-100G
איזון אנליטימטלר טולדוMX304
CaCl2תרמו פישר סיינטיפיקC79-500
פחמימות (95% O2/5% CO2)איירגזCD USP50
מיקרוסקופ ניתוח צייסZEISS Stemi 305
צלחת פטרי ניתוחמערכות אינסטרומנטציהDD-90-S-BLK
פיני ניתוחטכנולוגיית מיו הדנית400626
ערכת כלים לניתוחטכנולוגיית מיו הדנית101017הערכה כוללת מספרי חיתוך (1), מספריים רב-תכליתיים (1), צלחות פטרי (5), מלקחיים (3) וסיכות חיתוך.
דומון #5 - מלקחיים עדיניםכלי המדע המדויק11254-20
EDTAתרמו פישר סיינטיפיקBP2482-500
מקפיא (-20 & דרג; C)תרמו פישר סיינטיפיקTSG2325FA
קופסאות עם צירי מקפיאUSA Scientific2310-5848
כפפות (גדולות)תרמו פישר סיינטיפיק19-041-171D
כפפות (בינוניות)תרמו פישר סיינטיפיק19-041-171C
כפפות (קטנות)תרמו פישר סיינטיפיק19-041-171B
גלוקוזתרמו פישר סיינטיפיקD16-500
צילינדר מדורגתרמו פישר סיינטיפיק08-572G
פריזמת GraphPadתוכנת GraphPadלא זמיןניתוח נתונים והצגה גרפית
תמיסת חומצה כלוריתתרמו פישר סיינטיפיקSA48-1
דלי קרחתרמו פישר סיינטיפיק03-395-156
KClתרמו פישר סיינטיפיקP217-500
KH2PO4תרמו פישר סיינטיפיקP380-500
תוכנת LabChart 8AD אינסטרומנטסלא זמיןתוכנת לכידת נתונים
מקרר מעבדהתרמו פישר סיינטיפיקFBG49RPGA
מקור אור LEDתרמו פישר סיינטיפיקAMPSILED21
מערבל מגנטיתרמו פישר סיינטיפיקFB30786159
מוטות ערבוב מגנטיים (גדולים)תרמו פישר סיינטיפיק14-513-68
מוטות ערבוב מגנטיים (מדיום)תרמו פישר סיינטיפיק14-513-61
MgSO4תרמו פישר סיינטיפיקM63-500
סט דגימת מיקרו כף ומריתתרמו פישר סיינטיפיקS43322
צינורות מיקרוצנטריפוגהUSA Scientific1615-5510
מיני-מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק07-203-954
מיני מברגתרמו פישר סיינטיפיקNC1349489
מערכת מיוגרף רב-חוטיתטכנולוגיית מיו הדניתDMT 620M
NaCl תרמו פישר סיינטיפיקS271-3
NaHCO3תרמו פישר סיינטיפיקS233-500
מד pHתרמו פישר סיינטיפיק01-912-351כולל מד pH, חיישן LE420, התקנה QuickGuide, וחבילת התחלה לבופר pH
פנילאפרין מיליפור סיגמאP6126-5G
בקר פיפטתרמו פישר סיינטיפיק01-001-023
טיפים לפיפטה במדפים (10 ומיקרו; L)USA Scientific1111-3810
טיפים של פיפט במדפים (1000 ומיקרו; L)USA Scientific1111-2830
קצות פיפטה במדפים (200 ומיקרו; L)USA Scientific1111-1810
בקבוקי אחסון מדיה רב-פעמיים PYREXתרמו פישר סיינטיפיק06-414-1D
פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק02-923-204
פיפטות סרולוגיות (25 מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק02-923-205
מיקרופיפטה חד-ערוצית רב-חבילהתרמו פישר סיינטיפיק13-684-2503x פיפטות (0.5-10 & mu; L, 10-100 & mu; L, 100-1000 & mu; L)
חוט נירוסטה (40 ו-mu; m)טכנולוגיית מיו הדנית400447
טיימרתרמו פישר סיינטיפיק02-261-840
מערכת מים טהורים במיוחדסארטוריוסH2O-MM-UV-SET-US
מספריים אביביים של ואנאסכלי המדע המדויק15000-00
בקבוק וולומטריתרמו פישר סיינטיפיק13-756-400
מערבל מערבולתתרמו פישר סיינטיפיק10-320-807
אמבט מיםתרמו פישר סיינטיפיק07-202-155
שקילת כליםתרמו פישר סיינטיפיק02-202-101

מקורות

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תגובתיות כלי דםעורקים מזנטרייםמיוגרפיה איזומטריתדיסקציה של עורקיםתפקוד כלי דםתפקוד אנדותליאליתפקוד שריר חלק

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.