מאמר שיטה

סבב עבודה מעשי לניתוח נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית: מרכישת נתונים ועד לניתוחים מתקדמים

75 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70188

⸱

21 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Rehabilitation Medicine, Nanjing Medical University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה הניתנת לשחזור לניתוח נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית (spatial transcriptomics), ומנחה את המשתמשים החל מרכישת נתונים ציבוריים ובקרת איכות מבוססת Seurat, דרך אינטגרציה, זיהוי מאפיינים מרחביים, דה-קונבולוציה של סוגי תאים, אנוטציה של אזורי עניין (ROI) וניתוח תקשורת בין-תאית, כולל נקודות ביקורת מעשיות התומכות בביצוע שקוף.

תקציר

טרנסקריפטומיקה מרחבית (ST) ממתה את הביטוי הגני ברחבי הגנום תוך שמירה על ההקשר המרחבי הדו-ממדי של מולקולות mRNA בתוך חתוכי רקמה, דבר המאפשר מחקר של ארכיטקטורת הרקמה וביולוגיה הקשורה למיקרו-סביבה. עם זאת, ניתוח ST נותר מאתגר מכיוון שייבוא נתונים, בקרת איכות, אינטגרציה, דקונבולוציה (deconvolution), סטטיסטיקה מרחבית וויזואליזציה דורשים לעיתים קרובות סביבות תוכנה מרובות ובחירות פרמטרים הניתנות לשחזור. פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה חישובית מעשית עבור מאגרי נתוני ST ציבוריים ב-R, המתחילה ברכישת נתונים והגדרת התוכנה וממשיכה בטעינת נתונים מבוססת Seurat, בקרת איכות, נורמליזציה, אינטגרציה של מספר דגימות, אשכול (clustering) וניתוח גנים בעלי שונות מרחבית. זרימת העבודה מיישמת לאחר מכן אסטרטגיות דקונבולוציה משלימות, כולל ניתוח SPOTlight מונחה-ייחוס ומודל נושאים (topic modeling) של STdeconvolve ללא פיקוח, ולאחריהם ניתוח תקשורת בין-תאית מרחבית מבוסס Giotto ובחירה אינטראקטיבית של אזורי עניין (ROI) באמצעות אפליקציית Python Dash מותאמת אישית. על ידי דגש על ביצוע מבוסס סקריפטים, נימוקים מפורשים לפרמטרים, פלטים צפויים ונקודות בדיקה לפתרון בעיות, הפרוטוקול מספק מסגרת גמישה עבור מאגרי נתוני ST סטנדרטיים מבוססי מערכים ופלטפורמות קשורות, לאחר הערכת פרמטרים ספציפיים למאגרי הנתונים ולפלטפורמה.

מבוא

טרנסקריפטומיקה מרחבית (ST) היא משפחה טרנספורמטיבית של טכנולוגיות המודדות ביטוי גנים ברחבי הגנום תוך שמירה על הקואורדינאטות המרחביות של מולקולות RNA שליח (mRNA) בתוך חתכי רקמה. שיטות ST כוללות גישות מבוססות ריצוף המשתמשות במערכי ברקודים לפי מיקום, וגישות דימוי in situ הממפות אותות שעתוק בתוך מיקרו-סביבות רקמה שלמות1,2. על ידי שימור ההקשר המרחבי, ST מאפשרת ניתוח של ארכיטקטורת הרקמה, ארגון השכנויות התאיות, תקשורת בין תאים ותהליכים ביולוגיים הקשורים למיקרו-סביבה שאינם ניתנים לפתרון מלא לאחר פירוק הרקמה3.

הצמיחה המהירה של מאגרי נתונים ציבוריים של ST יצרה הזדמנויות חסרות תקדים לניתוח משני ולפיתוח שיטות3. משאבים כגון מאגר הנתונים CROST מאחצרים מאות מערכי נתונים של טרנסקריפטומיקה במטרה מרחבית (spatially resolved transcriptomic) על פני מינים רבים ופלטפורמות טכנולוגיות שונות, בעוד שאוספים מתמחים כמו STOmicsDB מתמקדים במתודולוגיות ספציפיות כגון Stereo-seq4,5. למרות שפע זה של נתונים, הניתוח החשובי נותר מאתגר בשל המורכבות של מבני נתונים מרחביים, המגוון של כלי ניתוח והמכשולים הטכניים במימוש של זרימות עבודה (workflows) הדירות6,7,8,9,10,11.

כדי להתגבר על המגבלות הנובעות מהסתמכות על סביבת תוכנה אחת, מוצג כאן זרימת עבודה חישובית משולבת המשתמשת בכלים אנליטיים משלימים. מערכות קומפלהנסיביות קיימות לניתוח ST כוללות בעיקר את Seurat, Giotto ומסגרות מבוססות Python כגון Squidpy6,7,12. למרות שכלים מבוססי Python כמו Squidpy מציעים פונקציונליות נרחבת לניתוח גרפים מרחביים, איחוד צינור העיבוד החישובי המרכזי בתוך סביבת שפת תכנות אחת מצמצם מכשולים טכניים הנובעים ממעבר בין שפות. כתוצאה מכך, צינור העיבוד המרכזי מיושם בעיקר ב-R כדי להפחית מכשולים טכניים בין-שפתיים. בתוך זרימת עבודה זו המבוססת על R, נעשה שימוש ב-Seurat לצורך טעינת נתונים, בקרת איכות, נורמליזציה, הפחתת ממדיות, ויזואליזציה ואינטגרציה של מספר דגימות, מה שמשקף את השימוש הנפוץ בו בזרימות עבודה של טרנסקריפטומיקה מרחבית וחד-תאית. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-Giotto לבניית רשת מרחבית ולניתוח תקשורת בין-תאית המבוססת על ליגנד-רצפטור. לפיכך, צינור עיבוד זה מקשר בין עיבוד מקדימ ואינטגרציה מבוססי Seurat לבין ניתוח מרחבי מבוסס Giotto, תוך שמירה על העברת נתונים מפורשת וניתנת לשחזור בין שני סטים של כלים.

במסגרת זו, מיושמות שתי אסטרטגיות דה-קונבולוציה (deconvolution) משלימות: SPOTlight, שיטה מונחית-רפרנס המשתמשת בנתוני scRNA-seq להערכת פרופורציות של סוגי תאים, ו-STdeconvolve, שיטת מידול נושאים (topic-modeling) לא-מפוקחת המזהה תבניות שחזור שחלומיות (latent transcriptional patterns)8,11. התוצאות מספקות מבטים משלימים של הטרוגניות תאית מרחבית, אך אינן נחשבות כאישוש כמותי (quantitative cross-validation) אלא אם המשתמשים מבצעים את ניתוח התאימות האופציונלי המתואר בפרוטוקול. אפליקציית Python Dash מותאמת אישית, Select Spatial Spots, משולבת לצורך סימון אינטראקטיבי של אזורי עניין (ROI) ומייצאת קבצי סימון סטנדרטיים מבוססי קואורדינטות שניתן להשתמש בהם בניתוחים המשכיים (downstream analyses).

בכל הנוגע ליישום מעשי, זרימת עבודה זו מיועדת בעיקרה לנתוני ST סטנדרטיים מבוססי מערך (למשל, Visium ברזולוציה של 55 µm), וייתכן שניתן יהיה להתאימה לסוגי רקמות אחרים לאחר הערכת פרמטרים. יש לשקול מגבלות מרכזיות לפני ביצוע האנליזה. ראשית, מודול הדה-קונוולוציה (deconvolution) המונחה על ידי רפרנס תלוי ברפרנס scRNA-seq איכותי המותאם לרקמה. שנית, פלטפורמות ברמה התת-תאית או קרובות לרזולוציה של תא בודד עשויות לדרוש עיבוד מקדימ (pre-processing) שונה, אגרגציה של סלילים מרחביים (spatial bin aggregation), או סגמנטציה של תאים מבוססת תמונה לפני האינטגרציה2. מערך הנתונים המייצג של מעי גס של עכבר משמש כמקרה הדגמה כדי להראות כיצד זרימת העבודה יכולה להעריך דומיינים מרחביים וארגון רקמה המוגדר על ידי מרקרים, ולא כהוכחה לתאימות אוניברסלית של הפלטפורמה.

פרוטוקול

כל מאגרי הנתונים הביולוגיים שנותחו בפרוטוקול זה זמינים לציבור ומשמשים אך ורק לצורכי הדגמה. מספרי גישה ספציפיים למאגרי נתונים ומאגרי המקור מסופקים בשלבים הרלוונטיים. מאגרי הנתונים המקוריים הופקו על ידי החוקרים המקוריים בהתאם להנחיות האתיקה המוסדיות החלות על כל מחקר מקור. עיין בטבלת החומרים כדי לוודא את גרסאות התוכנה וחבילות ה-R הנדרשות.

דרישות חומרה: הזיכרון החישוב הרשמי הנדרש עבור תהליך עבודה זה משתנה בהתאם למספר הדגימות והנקודות (spots) המנותחות. עבור מערך נתונים טיפוסי של טרנסקריפטומיקה מרחבית (למשל, כ-3,000 נקודות לדגימה עבור עד שלוש דגימות), תחנת עבודה סטנדרטית עם מינימום 16 GB של RAM מספיקה להרצת הצינור (pipeline). עם זאת, מומלץ להשתמש ב-32 GB של RAM או יותר כדי להבטיח ביצועים ויציבות אופטימליים, במיוחד במהלך שלבים חישוביים עתירי זיכרון כגון נרמול SCTransform ופירוק מטריצות במהלך דה-קונבולוציה (deconvolution).

1. רכישת נתונים והכנת מבנה הספריות

  1. השג נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית ציבוריים (למשל, מספר גישה GEO GSE169749, עם תאריך הגשה של 26 במרץ 2021 ותאריך עדכון אחרון של 6 במרץ 2022) ונתוני ייחוס של single-cell RNA-seq (למשל, מספר גישה GEO GSE264408, עם תאריך הגשה של 19 באפריל 2024 ותאריך עדכון אחרון של 10 בדצמבר 2024).
  2. הורד את ארכיון הנתונים הגולמיים (למשל, GSE169749_RAW.tar) מהמאגר וחלץ את הארכיון.
    הערה: עבור מערך הנתונים המייצג המשמש בפרוטוקול זה, הספריה שחולצה מכילה קבצים מרובים עבור כל דגימה, כאשר שמות הקבצים כוללים בדרך כלל את מספר הגישה של דגימת ה-GEO (למשל, GSM5213483).
  3. ארגן את הקבצים במבנה ספריות סטנדרטי התואם לפונקציית Load10X_Spatial של Seurat.
    1. צור ספריה ראשית לנתונים (למשל, ./data/).
    2. צור ספריה משנית ייעודית עבור כל דגימה (למשל, ./data/sample_A1/).
    3. העבר (העתק או הזז) את הקבצים החיוניים הבאים עבור כל דגימה לספריה המשנית המתאימה.
      1. מקם את הקובץ filtered_feature_bc_matrix.h5 בספריה המשנית הראשית של הדגימה.
      2. צור תיקיית משנה spatial/ בתוך כל ספריה של דגימה.
      3. מקם את הקבצים הבאים בתיקיית המשנה spatial/: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz, ו-tissue_hires_image.png.gz.
    4. בצע דה-קומפרסיה לקבצי ה-.gz בתיקיית ה-spatial/. וודא ששמות הקבצים המקוריים נותרים בדיוק כפי שנדרש על ידי פונקציית Load10X_Spatial (למשל, tissue_positions_list.csv).
      הערה: המבנה הסופי והמאורגן לטעינה חלקה חייב לעקוב אחר תבנית זו, תוך שימוש בדגימה A1 כדוגמה:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. הגדרת סביבת התוכנה

  1. התקינו את R (גרסה 4.4.3 או גבוהה יותר).
  2. השיגו את סקריפטי הניתוח (מ-1_ReadSpatialData.R ועד 8_Giotto_Communication.R) ממאגר ה-GitHub (בכתובת https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, ב-commit hash ‏2d85e18 לצורך שחזור הניסוי).
  3. התקינו את חבילות ה-R הנדרשות מ-CRAN ומ-Bioconductor על ידי הרצת הסקריפט setup.R.
    הערה: רשימה מקיפה של גרסאות החבילות הספציפיות שנעשה בהן שימוש בתזרים עבודה זה מופיעה ב-טבלת החומרים וזמינה גם בקובץ session_info.txt בתוך מאגר ה-GitHub הנלווה (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
  4. התקינו את Giotto Suite על ידי הרצת פקודות ההתקנה המסופקות בתיעוד הרשמי.
    1. עברו לכתובת ההתקנה הרשמית כדי לאחזר את סקריפטי ההגדרה: https://giottosuite.com/articles/installation.html
    2. אתחלו את סביבת ה-Python הנדרשת ואת תלויות המערכת בהתאם להוראות השלב-אחרי-שלב.
  5. התקינו חבילות נוספות לויזואליזציה משופרת.
    1. הריצו: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
  6. התקינו את הכלי המותאם אישית Select Spatial Spots. ודאו שמערכת ההפעלה היא Windows, macOS או Linux, ושמותקנת גרסת Python 3.8 או גבוהה יותר. שלב זה הוא אופציונלי.
    1. השיגו את הכלי על ידי מעבר למאגר ה-GitHub (בכתובת https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, ב-commit hash ‏d20946e לצורך שחזור הניסוי) והורדת קוד המקור.
    2. עברו לספריית הכלי והתקינו את תלויות ה-Python: pip install -r requirements.txt
  7. התקינו את חבילת glmGamPoi על ידי הרצת BiocManager::install("glmGamPoi") כדי להאיץ את נורמליזציית ה-SCTransform.
    הערה: תזרים העבודה המרכזי דורש רק את החבילות המופיעות בשלבים 2.1–2.3 ו-2.6. החבילה Rfast2 משמשת לה speeding up של חישוב סטטיסטיקת Moran's I. החבילות האופציונליות בשלב 2.5 נועדו ליצירת גרפים מוכנים לפרסום עם עיצוב בסגנון prism (חבילת ggprism) ולגישה לפלטת צבעים ידידותית לעיוורון צבעים (חבילת colorBlindness). הכלי בשלב 2.6 מאפשר את פונקציונליות בחירת הנקודות האינטראקטיבית. הרצו את הפקודה sessionInfo() ושמרו את פלט הקונסול המלא לקובץ טקסט. פעולה זו מתעדת את גרסאות התוכנה המדויקות ואת תלויות החבילות, שהן קריטיות להבטחת שחזור הניסוי לטווח ארוך.

3. טעינת נתונים מרחביים ובקרת איכות(1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

  1. טעינת נתוני המרחב לאובייקטי Seurat.
    1. השתמש ב- Read10X_Image כדי לטעון ידנית את תמונת הרקמה ברזולוציה גבוהה, תוך הגדרת ה-image.dir וה-image.name.
    2. השתמש ב- Load10X_Spatial כאשר הפרמטר image מוגדר לאובייקט התמונה שנוצר בשלב 3.1.1, כדי ליצור את אובייקט ה-Seurat.
  2. חישוב מדדי בקרת איכות (QC).
    1. חשב את אחוז הקריאות המיטוכונדריאליות באמצעות PercentageFeatureSet עם התבנית ^mt-.
  3. ויזואליזציה ופרשנות של הנתונים בהתבסס על מדדי ה-QC.
    1. צור תרשימי כינור (violin plots) של nCount_Spatial, nFeature_Spatial ו- percent.mt באמצעות VlnPlot.
    2. צור תרשימי מאפיינים מרחביים (spatial feature plots) של מדדים אלו באמצעות SpatialFeaturePlot כדי לזהות נקודות (spots) מחוץ לאזור הרקמה.
      הערה: נקודת בקרה ויזואלית: נקודות מחוץ לאזור הרקמה מציגות בדרך כלל ספירות UMI נמוכות (nCount_Spatial < 500) וזיהוי גנים נמוך (nFeature_Spatial < 200)
    3. לצורכי הדגמה, החל פילטרים להסרת נקודות באיכות נמוכה (למשל, subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). זהו שלב רשות.
      הערה: המטרה העיקרית של QC בטרנסקריפטומיקה מרחבית היא לזהות ולסמן ארטיפקטים טכניים, כגון נקודות מחוץ לרקמה. עבור נתוני Visium של מעי הגס המשמשים להדגמה, nFeature_Spatial > 200 ו-nCount_Spatial > 500 מסירים נקודות בעלות מורכבות נמוכה או נקודות רקע. עבור רקמות עם תכולת RNA נמוכה או חתכים מדוגדרים, יש לבחון את תרשימי הכינור ואת תרשימי המאפיינים המרחביים לפני העלאת הסף; עבור רקמות דחוסות או בעלות UMI גבוה, ספים מחמירים יותר עשויים להיות מתאימים. הימנע מפילטור המבוסס אך ורק על ערכי ביטוי גבוהים, אלא אם נראים דאבלטים (doublets), קיפולי רקמה או ארטיפקטים ברורים. לעיתים קרובות לא מומלץ לבצע פילטור כיוון שהוא מסיר פיזית מיקומים מרחביים, מה שעלול לפגוע ברצף של מבנה הרקמה לצורך אנליזה מרחבית בהמשך.

4. עיבוד מקדים של נתונים, אינטגרציה ואשכול (Clustering) (3_IntegrationAndClustering.R)

  1. נרמול ועיבוד מקדימה של דגימות בודדות.
    1. החל את נרמול ה-SCTransform על כל דגימה בנפרד עם assay = Spatial.
  2. אינטגרציה של מספר דגימות.
    1. הכן את רשימת האובייקטים שעברו נרמול SCT לצורך אינטגרציה. ודא שלכל אובייקט יש assay מסוג "RNA" על ידי העתקת ה-"Spatial" assay: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​הערה: העתקת ה-"Spatial" assay לתוך חריץ (slot) סטנדרטי של "RNA" assay משמשת כפתרון עוקף הכרחי להבטחת תאימות עם פונקציות אינטגרציה המשך, שתוכננו במקור עבור אובייקטי Seurat של תא בודד.
    2. השתמש ב-SelectIntegrationFeatures וב- PrepSCTIntegration כדי לזהות מאפיינים משתנים משותפים.
    3. מצא עגני אינטגרציה (integration anchors) באמצעות FindIntegrationAnchors עם normalization.method = "SCT".
    4. בצע אינטגרציה לנתונים באמצעות IntegrateData עם normalization.method = "SCT".
  3. ביצוע הפחתת ממדים והקבצה (clustering) על ה-assay המשולב.
    1. הרץ PCA על הנתונים המשולבים באמצעות RunPCA.
    2. קבע את המספר האופטימלי של רכיבים ראשיים (PCs) לניתוחים המשכיים על ידי חישוב השונות המצטברת המוסברת. זהה את נקודת המרפק באופן תכנותי (למשל, הנקודה שבה השונות המצטברת עולה על 90% והרווח השולי יורד מתחת ל-0.1%), באמצעות הקוד ב-3_IntegrationAndClustering.R, שורות 36-38. מספר ה-PCs שהתקבל יכונה להלן pc.use.
    3. הרץ RunUMAP עם dims = 1:pc.use.
    4. בצע הקבצה לתאים באמצעות FindNeighbors עם dims = 1:pc.use ו-FindClusters עם resolution = 0.5. התאם את הרזולוציה רק לאחר בדיקת יציבות ההקבצות ועקביות הגנים המסמנים.
    5. בצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בין קבוצות מטרה (למשל, "B1_colon_d14" לעומת "A1_colon_d0") באמצעות הפונקציה FindMarkers.
      ​הערה: נקודת בקרה ויזואלית: אינטגרציה מוצלחת תציג ערבוב הולם של הדגימות בגרף ה-UMAP תוך שמירה על מקבצים נבדלים ביולוגית.
  4. זיהוי גנים בעלי שונות מרחבית.
    1. עבור כל דגימה מקורית, הרץ FindSpatiallyVariableFeatures באמצעות שיטת "moransi" על ה-"SCT" assay כדי לחשב אוטוקורלציה מרחבית.

5. עיבוד מקדים של נתוני ייחוס מתאי בודדים (4_scDataPreProcessing.R)

  1. קראו את מטריצת הספירות של single-cell RNA-seq באמצעות Read10X וצרו אובייקט Seurat.
  2. בצעו בקרת איכות (QC) סטנדרטית, נרמול וקיבוב (clustering).
    1. חשבו את אחוז הקריאות המיטוכונדריאליות (percent.mt) וסננו תאים (למשל, nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
    2. נרמלו את הנתונים באמצעות SCTransform, כאשר vars.to.regress = "percent.mt".
    3. הריצו PCA ו-UMAP, ובצעו קיבוב של התאים באמצעות שיטת בחירת ה-PC הדינמית המתוארת בשלב 4.3.2.
  3. בצעו אנוטציה לסוגי התאים.
    1. חשבו ציוני מודול (module scores) עבור גנים מסמנים קנוניים של סוגי תאים באמצעות AddModuleScore.
    2. בצעו אנוטציה לאשכולות (clusters) בהתבסס על ציוני המודולים וביולוגיה ידועה. לחלופין, ייבאו אנוטציות שחושבו מראש מתוך המטא-דאטה.

6. דה-קונבולוציה מודרכת-ייחוס באמצעות SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

  1. הכנה של נתונים עבור SPOTlight.
    1. המרה של אובייקט Seurat של תאים בודדים עם הערות ואובייקט Seurat מרחבי לאובייקטים מסוג SingleCellExperiment.
    2. ביצוע נורמליזציה לוגריתמית לנתוני התאים הבודדים באמצעות logNormCounts.
  2. הרצת דה-קונבולוציה (deconvolution) באמצעות SPOTlight.
    1. זיהוי גנים היפרא-וריאבליים (HVGs) בנתוני התאים הבודדים באמצעות modelGeneVar ו-getTopHVGs.
    2. חישוב גנים מסמנים (marker genes) לסוגי התאים באמצעות scoreMarkers וסינון עבור מסמנים באיכות גבוהה (למשל, mean.AUC > 0.8).
    3. ביצוע דגימה מופחתת (downsampling) של רפרנס התאים הבודדים עבור כל סוג תא למספר ניהולי (למשל, 50 תאים) כדי להפחית את זמן החישוב.
    4. ביצוע דה-קונבולוציה באמצעות הפונקציה SPOTlight עם weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", and gene_id = "gene".
  3. ויזואליזציה וייצוא של התוצאות.
    1. חילוץ של מטריצת תוצאות הדה-קונבולוציה (פרופורציות של סוגי תאים לכל נקודה/spot).
    2. שימוש ב-plotSpatialScatterpie כדי להציג ויזואלית את ההרכב התאי על גבי הקואורדינטות המרחביות.
    3. הוספת תוצאות הדה-קונבולוציה למטא-דאטה של אובייקט Seurat המרחבי באמצעות AddMetaData. פלט צפוי: מטריצת דה-קונבולוציה עם עמודי פרופורציות של סוגי תאים עבור כל נקודה מרחבית, תרשימי scatterpie מרחביים המראים הרכב תאי מקומי, ואובייקט Seurat המכיל את פרופורציות הדה-קונבולוציה כמטא-דאטה.

7. דה-קונבולוציה ללא רפרנס באמצעות STdeconvolve(7_STdeconvolve.R)

  1. הכינו את הנתונים המרחביים.
    1. חלצו את מטריצת הספירות הגולמית מאובייקט Seurat המרחבי באמצעות GetAssayData עם slot = "counts".
    2. הסירו נקודות (spots) וגנים באיכות נמוכה באמצעות cleanCounts מ-STdeconvolve (למשל, min.lib.size = 100).
  2. זהו את סוגי התאים החבויים (latent cell types).
    1. סננו עוד יותר את הקורפוס עבור גנים המבטאים בחלק מינימלי של נקודות באמצעות restrictCorpus (למשל, removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
    2. התאימו מודל Latent Dirichlet Allocation (LDA) על פני טווח של מספרי נושאים (K) פוטנציאליים (למשל, Ks = seq(2, 9, by = 1)) באמצעות fitLDA.
    3. בחרו את המודל האופטימלי על בסיס הפרפלקסיה (perplexity) המינימלית באמצעות optimalModel עם opt = "min".
  3. נתחו והציגו את התוצאות באופן ויזואלי.
    1. חלצו את פרופורציות סוגי התאים (נושאים) (theta) ואת פרופילי הגנים (beta) מהמודל האופטימלי באמצעות getBetaTheta.
    2. כדי לסייע בפרשנות הביולוגית של הנושאים שעברו דקונבולוציה (deconvolution), ייבאו הערות של אזורי עניין (ROI) שנוצרו על ידי הכלי "Select Spatial Spots" (ראו שלב 9.3.3). השתמשו בהערות אלו כפרמטר groups בפונקציה vizAllTopics כדי להשליך את פרופורציות סוגי התאים שעברו דקונבולוציה בחזרה על הקואורדינטות המרחביות ולצבוע את הנקודות לפי ה-ROI שלהן. זהו שלב אופציונלי.
      הערה: פלט צפוי: STdeconvolve אמורה להחזיר ערכי theta המייצגים פרופורציות של נושאים לכל נקודה וערכי beta המייצגים פרופילי גנים לכל נושא. אם המשתמשים מעוניינים להשוות כמותית את תוצאות STdeconvolve הבלתי מפוקחות עם פלטי SPOTlight המונחים על ידי רפרנס (משלב 6), הם יכולים לייצא את שתי מטריצות הפרופורציות (theta מ-STdeconvolve ואת מטריצת SPOTlight) ולחשב מדדי קורלציה או התאמה (concordance) לכל נקודה (למשל, קורלציית פירסון או ספירמן) באמצעות פונקציות R סטנדרטיות. השוואה כמותית בין SPOTlight ל-STdeconvolve היא אופציונלית ואינה נדרשת לביצוע זרימת העבודה המרכזית; עם זאת, מטריצות הפלט הרלוונטיות זמינות משלבים 6.3.1 ו-7.3.1 למשתמשים המעוניינים לבצע אנליזה כזו.

8. תקשורת מרחבית בין תאים באמצעות Giotto(8_Giotto_Communication.R)

  1. המירה של אובייקט Seurat לאובייקט Giotto.
    1. השתמשו בפונקציה createGiottoObject, תוך אספקת מטריצת הספירה הגולמית והקואורדינטות המרחביות.
  2. עיבוד מקדימה של אובייקט ה-Giotto והוספת תוצאות הדקונבולוציה.
    1. נרמלו את הנתונים באמצעות normalizeGiotto.
    2. הוסיפו את ההערות של סוגי התאים (למשל, סוג התא המרכזי מדקונבולוציית SPOTlight) למטא-נתוני התאים באמצעות addCellMetadata.
  3. הסקה של תקשורת בין-תאית מודעת למרחב.
    1. צרו רשת מרחבית באמצעות createSpatialNetwork עם method = "Delaunay" ו-name = "Delaunay_network".
    2. טענו מאגר נתונים של ליגנד-רצפטור לסביבת ה-R. ודאו שהאובייקט שנטען מעוצב כ-data frame עם שתי עמודות נפרדות המייצגות את סמלי הגנים של הליגנד והרצפטור (למשל, רשת עכברים מקומפלת מראש מ-Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, גרסה v6, שפורסמה ב-7 באפריל 2025).
    3. הריצו את exprCellCellcom עם cluster_column = "celltype_major" כדי לזהות אינטראקציות משמעותיות של ליגנד-רצפטור בין סוגי תאים הנמצאים בקרבה מרחבית. פלט צפוי: טבלת תוצאות המכילה זוגות ליגנד-רצפטור, שילובי סוגי תאים של מקור ויעד, ערכי log2 fold-change וערכי P מותאמים; שמרו אינטראקציות משמעותיות (למשל, p.adj < 0.05) לצורך ויזואליזציה.

9. בחירה אינטראקטיבית של נקודות באמצעות select spatial spots (6_SelectSpatialSpots.R)

  1. הכנת הנתונים עבור הכלי האינטראקטיבי.
    1. חילוץ הקואורדינטות המרחביות מאובייקט ה-Seurat באמצעות GetTissueCoordinates.
  2. עיצוב וייצוא הנתונים.
    1. עיצוב מסגרת הנתונים (data frame) של הקואורדינטות כך שתכיל את כותרות העמודות המדויקות: CELL_ID, X, and Y.
    2. ייצוא מסגרת הנתונים המעוצבת לקובץ CSV.
  3. ביצוע ניתוח אזור עניין (ROI).
    1. הפעלה של אפליקציית ה-Dash המותאמת Select Spatial Spots וטעינה של קובץ ה-CSV.
    2. בחירה אינטראקטיבית של נקודות (spots) על בסיס מיקום מרחבי.
    3. ייצוא רשימת הנקודות שנבחרו ותוויות הקבוצה/ROI שהוקצו להן כקובץ CSV חדש. הפלט הצפוי: קובץ CSV עם מזהי נקודות, קואורדינטות X/Y ותוויות קבוצה/ROI שהוקצו, שניתן להצמידם חזרה לאובייקט ה-Seurat באמצעות ה-CELL_ID.

תוצאות

יישום זרימת העבודה ואינטגרציית נתונים ממחישים מאפייני רקמה מרכזיים

תהליך העבודה החישובִי הוחל על נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית של מעי גרוס של עכבר כדי להדגים את התוצרים הצפויים לאורך השלבים האנליטיים. כפי שמוצג בסכמת תהליך העבודה (איור 1), הצינור (pipeline) התחיל ברכישת נתונים ובקרת איכות, שבה תרשימי מאפיינים מרחביים תיחמו את גבולות הרקמה (איור 2A,B). לאחר מכן נעשה שימוש בתהליך האינטגרציה מבוסס-העגנים (anchor-based integration) של Seurat כדי להפחית השפעות של ווריאביליות טכנית (batch effects) תוך שימור שונות ביולוגית ניתנת לפירוש. ויזואליזציות UMAP הראו את יישור הדגימות ודפוסי ההקבצה המרחבית לאחר האינטגרציה (איור 2C,D). בחירה כמותית ודינמית של רכיבים ראשיים (PCs) על בסיס שונות מצטברת יושמה כדי להנחות את הפחתת הממדים ואת ההקבצות הבאות (ראה איור משלים 1). ניתוח מפת חום של גנים מסמנים הראה פרופילים תעתוקיים מובחנים העומדים בבסיס ההקבצות המרחביות (איור 2E).

כדי להעריך האם האשכולות החישוביים תואמים לארכיטקטורה האנטומית הידועה של היסטולוגיית המעי הגס, נבחנו פרופילי הביטוי של גנים מסמנים קנוניים הספציפיים לשכבות. שכבת אפיתל הרירית הראתה ביטוי של סממנים לתאי אפיתל, כולל Epcam ו-Krt8, לצד הסמן לתאי גביע Muc2. סממנים מזנכימליים וסטרומליים כגון Col1a1 ו-Vim סימנו את ה-lamina propria ואת אזורי הסוב-מוקוזה, בעוד ששכבת ה-muscularis propria החיצונית סומנה על ידי גנים מבניים של שריר חלק כגון Acta2 ו-Tagln. ההגבלה המרחבית של סממנים אלו הקשורים לשושלת תומכת בפרשנות לפיה זרימת העבודה של האינטגרציה והאשכולה (clustering) שימרה את הלמינציות ההיסטולוגיות העיקריות של רקמת המעי הגס לאורך הציר מהרירית ל-muscularis (ראה Supplementary Figure 2).

בעקבות תיקוף הצבירים, בוצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי כדי לזהות גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs) בין התנאים הניסיוניים (איור 2F,G). יתרה מכך, זוהו גנים עם שונות מרחבית באמצעות הסטטיסטיקה Moran's I, אשר הדגישה גנים בעלי התפלגות מרחבית לא אקראית מובהקת ברחבי הרקמה (איור 2H).

דה-קונוולוציה תאית ורשתות אינטראקציה מרחביות חושפות את המיקרו-ארגון של הרקמה

עיבוד נתוני הייחוס של ה-single-cell RNA-seq הניב השמות (annotations) הנתמכים על ידי סינון QC (איור 3A), אשכולה ללא פיקוח (unsupervised clustering) (איור 3B), תיקוף של גנים מסמנים (איור 3C), והלימה עם השמות עצמאיים (איור 3D). ההרכב התאי (איור 3E) הכווין את אסטרטגיית ה-downsampling עבור הדה-קונבולוציה (deconvolution). SPOTlight העריך את פרופורציות סוגי התאים המונחות על ידי ייחוס על פני נקודות מרחביות (spatial spots) (איור 4A,B), בעוד ש-STdeconvolve סיפק מבט של מודל נושאים (topic-modeling) ללא פיקוח של דפוסים תאיים מרחביים (איור 5B). הכלי המותאם אישית Select Spatial Spots סיפק הקשר היסטולוגי לדפוסים אלו (איור 5A). לבסוף, באמצעות השיויים של סוגי התאים לאחר דה-קונבולוציה, ניתוח תקשורת מרחבית זיהה אינטראקציות ליגנד-רספטור בין קבוצות של סוגי תאים סמוכים מרחבית (איור 6A,B).

תצפיות לפתרון בעיות מאופטימיזציה של הפרוטוקול

במהלך אופטימיזציית הפרוטוקול, זוהו מספר בעיות שהובילו לקביעת נקודות בקרה מעשיות. תוצאות דקונבולוציה (deconvolution) לא אופטימליות התרחשו כאשר רפרנסים של תאים בודדים לא תאמו היטב את ההקשר הרקמתי, דבר המצביע על הצורך להשתמש בנתוני scRNA-seq התואמים את סוג הרקמה והמין כאשר אלו זמינים. ניסיונות אשכול (clustering) ראשוניים עם פרמטרים ברירת מחדל לא תמיד הניבו את המבנים הביולוגיים הצפויים; בחינת בחירת ה-PC, רזולוציית האשכול והקוהורנציה של הגנים המסמנים (marker genes) סייעה בזיהוי דומיינים בעלי פרשנות מרחבית התואמים את האנטומיה של הרקמה. תצפיות אלו מספקות דוגמאות מעשיות לאופן שבו משתמשים יכולים לאבחן בעיות אנליטיות נפוצות במהלך ביצוע זרימת העבודה.

תרשים זרימה של ניתוח נתוני scRNA-seq. תהליכים: נורמליזציה, אינטגרציה, אשכול (clustering).
איור 1תהליך עבודה לניתוח טרנסקריפטומיקה מרחבית משולבת. ייצוג סכמטי של צינור העיבוד האנליטי, מרכישת נתונים ועיבוד מקדימה ועד לניתוחים מרחביים מתקדמים. השלבים המרכזיים כוללים: (1) טעינת נתונים, בקרת איכות ואינטגרציה של דגימות מרובות באמצעות Seurat; (2) אשכולות מרחביים וזיהוי של גנים עם שונות מרחבית; (3) דקונבולוציה של סוגי תאים באמצעות שיטות מבוססות-רפרנס (SPOTlight) ושיטות ללא פיקוח (STdeconvolve); (4) ניתוח תקשורת מרחבית בין תאים באמצעות Giotto ובחירה אינטראקטיבית של אזורים תחת עיון (region-of-interest) באמצעות כלי מותאם אישית, בחירת נקודות מרחביותהתוצאות מכל המודולים מסונתזות כדי להסיק תובנות ביולוגיות לגבי ארכיטקטורת הרקמה והמיקרו-סביבה התאית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח טרנסקריפטומיקה מרחבית עם תרשימי כינור, אשכולות t-SNE, תרשים הרי געש ומפת חום של נתונים.
איור 2: אינטגרציה של נתונים, אשכול (clustering) וניתוח ביטוי דיפרנציאלי. (A,B) מדדי בקרת איכות עבור דגימות מרחביות A1 ו-B1, המראים את ההתפלגויות של ספירות גנים, ספירות UMI ואחוזי גנים מיטוכונדריאליים. (C) ויזואליזציית UMAP של נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית משולבים, צבועים לפי מקור הדגימה (שמאל) וזהות האשכול (ימין). (D) השלכה מרחבית של זהויות אשכולים על נתחי רקמה. (E) מפת חום של גני הסימון המובילים עבור כל אשכול מרחבי. (F) תרשים הרי געש המציג גנים עם ביטוי דיפרנציאלי בין התנאים A1_colon_d0 ו-B1_colon_d14. (G) תבניות ביטוי מרחביות של גנים מייצגים עם ביטוי דיפרנציאלי על פני נתחי רקמה. (H) מפות ביטוי מרחביות של הגנים בעלי השונות המרחבית הגבוהה ביותר שזוהו via סטטיסטיקת Moran's I, כאשר שני הפאנלים השמאליים מציגים גנים מדגימה A1_colon_d0 ושני הפאנלים הימניים מציגים גנים מדגימה B1_colon_d14. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח scRNA-seq: תרשימי כינור, מקבצי UMAP, ציוני סוגי תאים והתפלגות בתרשים עמודות.
איור 3: עיבוד ואנוטציה של נתוני ייחוס של תאים בודדים. (A) מדדי בקרת איכות עבור נתוני ייחוס של scRNA-seq לפני ואחרי סינון. (B) ויזואליזציית UMAP של נתוני scRNA-seq הצבועים לפי מקבצים לא מונחים. (C) תרשים נקודות (Dot plot) המראה ציוני ביטוי של גנים מסמנים קנוניים לסוגי תאים על פני המקבצים. (D) ויזואליזציית UMAP עם אנוטציה של נתוני scRNA-seq עם סימון של סוגי התאים העיקריים. (E) ההרכב התאי של מערך נתוני הייחוס של scRNA-seq. הקו האדום המקווקו מציין את סף הדגימה מחדש (n = 50 תאים לסוג) שהוחל במהלך דקונבולוציית SPOTlight כדי לאזן בין יעילות חישובית לייצוג של סוגי התאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

התפלגות סוגי תאים, תמונות מיקרוסקופיה; ניתוח תאי B, תאים אנדותליאליים ופיברובלסטים ברקמות.
איור 4: דה-קונוולוציה (deconvolution) מרחבית של הטרוגניות תאית. (A,B) גרפי scatterpie מרחביים מדה-קונוולוציית SPOTlight המראים את ההרכב הפרופורציונלי של סוגי התאים העיקריים בכל נקודה (spot) עבור דגימות A1 (A) ו-B1 (B). (C) התפלגות מרחבית מייצגת של תאי B בדגימות A1 (שמאל) ו-B1 (ימין), המדגימה את דפוסי המיקום ברזולוציה מרחבית של אוכלוסיית תאי חיסון ספציפית שזוהתה באמצעות דה-קונוולוציה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

ניתוח ביטוי גנים מרחבי, תרשים המראה סוגי תאים וקבוצות פיקסלים בחתך רקמה.
איור 5: ניתוח אינטראקטיבי של אזורי עניין והשוואה של דקונבולוציה לא מונחית. (A) ממשק כלי ה-"Select Spatial Spots" המותאם אישית, המראה בחירה אינטראקטיבית של אזורים המתאימים למעי הגס הפרוקסימלי, למעי הגס הדיסטלי ולתחומי רקמה אחרים. (B) ויזואליזציית scatterpie מרחבית של תוצאות דקונבולוציה לא מונחית (STdeconvolve) עבור דגימה A1, כאשר הנקודות צבועות בהתאם לאזורים שסומנו ידנית ב-(A), מה שממחיש את ההתאמה בין הסימון המבוסס על היסטולוגיה לבין התפלגויות נושאי התאים שנגזרו חישובית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים תקשורת בין-תאית עם אינטראקציות ליגנד-קולטן וערכי log2fc; דיאגרמת בועות.
איור 6: רשתות תקשורת בין-תאית מבוססות מרחב. (A,B) רשתות אינטראקציית ליגנד-קולטן שהוצאו על ידי Giotto עבור דגימות A1 (A) ו-B1 (B). צמתים מייצגים סוגי תאים, קשתים מייצגות זוגות ליגנד-קולטן משמעותיים (FDR < 0.05), ועובי הקשת תואם לעוצמת האינטראקציה. כדי להבטיח השוואתיות ובהירות ויזואלית, הוחל סף מובהקות אחיד (FDR < 0.05) על פני כל הדגימות, ומוצגות 20 האינטראקציות המובילות המדורגות לפי log2FC עבור כל תנאי. הרשתות מדגישות דפוסי תקשורת ספציפיים לסוג התא בתוך ההקשר המרחבי של רקמת מעברון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הערכה כמותית של אופטימיזציית פרמטרים להורדת ממדיות. תרשים המרפק (elbow plot) מדגים את הגישה התוכנית של זרימת העבודה לבחירה דינמית של המספר האופטימלי של רכיבים ראשיים (PCs). הבחירה מחושבת על בסיס סטיית תקן מצטברת וספי שונות שוליים, המיוצגים על ידי הקו האנכי האדום, כדי ללכוד שונות ביולוגית תוך הפחתת רעש טכני לפני שלב ההקבצה (clustering) הבא.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: תיקוף של צבירה מרחבית באמצעות סממנים קנוניים ספציפיים לשכבות המעי הגס. (A) תרשים נקודות המראה ביטוי מועשר של סממני אפיתל, סממני סטרומה וסממני שריר חלק על פני צבירים חישוביים. (B) תרשימי מאפיינים מרחביים הממפים סממנים מייצגים (Epcam, Col1a1, Acta2) חזרה לקואורדינטות הרקמה.נא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה חישובית מקיפה לניתוח נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית, המאזנת בין עומק אנליטי לבין נגישות מעשית. הגישה השלבית מדריכה חוקרים לאורך כל צינור הניתוח, החל מרכישת הנתונים הראשונית ועד לניתוחים מרחביים מתקדמים, תוך הדגשת נקודות החלטה קריטיות ומלכודות פוטנציאליות.

מספר שלבים בפרוטוקול דורשים תשומת לב מיוחדת בשל השפעתם על התוצאות הבאות. יש להתאים בקפידה את ספי בקרת האיכות והסינון לסוגי רקמות ספציפיים ולפלטפורמות טכנולוגיות, שכן סינון מחמיר מדי עלול להסיר נקודות בעלות רלוונטיות ביולוגית, בעוד שספים רפואים עלולים להכניס רעש טכני. לבחירת שיטת הנרמול השפעה משמעותית על תוצאות הצבירה (clustering) והביטוי הדיפרנציאלי. לדוגמה, הצינור (pipeline) משתמש ב-SCTransform במקום בנרמול לוגריתמי סטנדרטי, מכיוון שדווח כי SCTransform ממדל ומפחית שונות טכנית הקשורה לעומק הריצוף ולהשפעות טכניות אחרות בתהליכי עבודה של תאי יחיד ומרחב14,15. במהלך האינטגרציה, בחירת מאפייני האינטגרציה ופרמטרי הרזולוציה דורשת שיקול דעת מעמיק כדי לאזן בין עוצמת האינטגרציה לבין שימור האות הביולוגי. עבור זיהוי גנים עם שונות מרחבית, נבחר Moran's I בשל יכולת ההרחבה החישובית וההתאמה לניתוח אוטוקורלציה מרחבית בנתונים מבוססי מערכים (arrays), אם כי ניתן לשקול זיהויים חלופיים כגון SPARK, בהתאם לגודל מערך הנתונים ומטרות המחקר16.

רכיב פתרון הבעיות של זרימת עבודה זו מתמקד בבעיות תאימות נפוצות המתרחאות בעת העברת פלטים מחבילה אחת לבאה אחריה. במקום להסתמך על שלב המרה גנרי בודד, זרימת העבודה משתמשת בהמרות פורמט מותאמות אישית בכל ממשק תוכנה: נתוני ספירה מרחביים מועתקים לסלוט (slot) סטנדרטי של RNA assay לפני אינטגרציית Seurat; אובייקטים של Seurat ואובייקטי ייחוס של תא בודד מומרים לאובייקטי SingleCellExperiment עבור SPOTlight; מטריצות ספירה מרחביות מעוצבות מחדש עבור STdeconvolve; ספירות, קואורדינטות ומטא-נתונים של סוגי תאים המופקים מ-Seurat מומרים לאובייקט Giotto לצורך ניתוח תקשורת בין תאים; ואנוטציות של ROI מ-Select Spatial Spots מיוצאות כקבצי CSV עם CELL_ID, קואורדינטות X/Y ותוויות קבוצה, כדי שניתן יהיה למפות אותן בחזרה לאובייקט Seurat. שלבים אלו מסייעים למשתמשים לזהות ולתקן בעיות נפוצות כגון סלוטים של assay שאינם תואמים, מזהי נקודות (spots) שאינם תואמים, עמודי מטא-נתונים חסרים, פורמט קואורדינטות שגוי, וחוסר התאמה בסמלי גנים של ליגנד-רספטור.

מאפיין נוסף של תהליך עבודה זה הוא השימוש בשתי אסטרטגיות דה-קונבולוציה (deconvolution) משלימות, במקום הסתמכות על אלגוריתם יחיד. SPOTlight משתמש במסמכי ייחוס קודמים של scRNA-seq להערכה מונחית-ייחוס של פרופורציות סוגי תאים, בעוד ש-STdeconvolve מאפשר גילוי של נושאים שעתוקיים חבויים ללא צורך בייחוס. במערך הנתונים להדגמה, הנושאים ב-STdeconvolve תאמו לאזורים שהוגדרו היסטולוגית (איור 5B), דבר התומך בפרשנות ביולוגית. השוואה כמותית ישירה בין שתי השיטות לא בוצעה בפרוטוקול זה; משתמשים המעוניינים לבצע להן בנצ'מרק על נתוניהם שלהם יכולים לעקוב אחר המסגרת המוצגת בשלב הפרוטוקול 7.3.2. יתרה מכך, הפרוטוקול תומך בשמישות ובניתנות למעקב על ידי שימוש בסקריפטים עבור פונקציות ליבה, תוך שהוא מציע ממשק גרפי (Select Spatial Spots) לבידוד אינטואיטיבי של ROI.

קישור בין Seurat ל-Giotto מאפשר לזרימת העבודה לשלב עיבוד מקדימה ואינטגרציה מבוססי Seurat עם סטטיסטיקה מרחבית וניתוח רשתות מבוססי Giotto. Seurat מספקת סביבה מבוססת לחוקרים בעלי ניסיון ב-scRNA-seq ותומכת באינטגרציה של מספר דגימות, בעוד שהעברת הנתונים ההרמוניים ל-Giotto מאפשרת בניית רשת מרחבית וניתוח ליגנד-רספטור. תכנון זה מאפשר למשתמשים לנצל את נקודות החוזק המתועדות של שתי הפלטפורמות, מבלי לרמוז שהן נבחנו כאן מול Squidpy או מסגרות עבודה אחרות. עבור תקשורת בין תאים, נעשה שימוש בהסקת ליגנד-רספטור מבוססת רשת Delaunay של Giotto, מכיוון שהיא משלבת סמיכות מרחבית בתוך אותה סביבת ניתוח; מסגרות עבודה כגון CellChat מספקות מאגרי נתונים נרחבים של איתותים, אך אינן מוערכות בפרוטוקול זה17.

יש להביא בחשבון מספר מגבלות. גישת ה-deconvolution מבוססת-הרפרנס תלויה באופן קריטי בזמינות של רפרנסים באיכות גבוהה של תאים בודדים (single-cell) התואמים את הדגימה. יתרה מכך, ההנחות היסודיות העומדות בבסיס ניתוח התקשורת הבין-תאית מסתמכות על ביטוי משותף של תמלילים (transcript co-expression) כמדד עקיף לאינטראקציה חלבונית פיזית, מה שדורש תיקוף ניסיוני בהמשך. לבסוף, תהליך עבודה זה פותח בעיקר עבור מערכי נתונים סטנדרטיים של Visium. ככל שהתחום יתקדם לעבר טכנולוגיות ברזולוציה קרובה לרמת התא הבודד, כגון Visium HD, השיקולים האנליטיים ישתנו; נתונים ברזולוציה גבוהה יותר עשויים לדרוש פרמטרים שונים של עיבוד מקדמי (pre-processing) ולהפחית את הצורך המוחלט ב-spot deconvolution. כדי להתאים תהליך עבודה זה למערכי נתונים של Visium HD, ניתן לאגד חישובית את ה-bins ברזולוציה הגבוהה לתוך bins מרחביים גדולים יותר, או לדלג על מודולי ה-spot-deconvolution לטובת סגמנטציה של תאים מבוססת תמונה18.

תכונות אלו מרמזות על פוטנציאל יישום בתחומי ביולוגיה שונים, כולל ביולוגיה התפתחותית, מדעי המוח, חקר הסרטן ואימונולוגיה19,20,21,22. העיצוב המודולרי מאפשר לחוקרים להתאים רכיבים ספציפיים לצרכיהם, בין אם המיקוד הוא בזיהוי תחומי מרחב, תקשורת תאית או התמחות אזורית. ככל שהטכנולוגיות המרחביות ממשיכות להתפתח ומסדי הנתונים מתרחבים, פרוטוקול זה מספק תשתית שניתן להרחיב כדי לשלב שיטות אנליטיות חדשות ולהתייחס לשאלות ביולוגיות עולות.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים פיננסיים.

תודות

המחברים מודים למפתחי ומסייעי חבילות התוכנה Seurat, Giotto ו-SPOTlight על תמיכתם והתיעוד שסיפקו. כמו כן, הם מביעים תודה על תרומתם של מאגרי נתונים ציבוריים ושל החוקרים ששיתפו בנדיבות את מערכי הנתונים שלהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ggplot2Posit Software, PBCv4.0.0(CRAN)ויזואליזציה מתקדמת של נתונים
GiottoDries Labv4.2.2 (GitHub)ניתוח רשתות מרחביות ותקשורת בין-תאית
patchwork Thomas Lin Pedersenv1.3.2 (CRAN)הרכבה וסידור של גרפים
R software R Foundation for Statistical Computingv4.4.3סביבת הרצה מרכזית (macOS aarch64)
scaterDavis McCarthy et al.v1.34.1 (Bioconductor)בקרת איכות וויזואליזציה של תאים בודדים
scranAaron Lun et al.v1.34.0 (Bioconductor)מידול שונות וזיהוי סמנים של תאים בודדים
Select Spatial Spots (Custom Python Tool)LeafLightv1.0.0 (GitHub)בחירה אינטראקטיבית של אזורי עניין (ROI) מרחביים (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat Satija Labv5.3.0 (CRAN)עיבוד מקדים, אינטגרציה וצבירה (clustering) של נתונים מרחביים
SeuratObject Satija Labv5.2.0 (CRAN)מבני נתונים עבור נתוני תאים בודדים ונתונים מרחביים
SingleCellExperimentBioconductor Core Teamv1.28.1 (Bioconductor)מיכל נתונים סטנדרטי עבור scRNA-seq
SPOTlightMarc Elosua-Bayes et al.v1.10.0 (Bioconductor)דה-קונבולוציה (deconvolution) מרחבית מונחית-רפרנס
StdeconvolveJean Fan Labv1.3.2 (Bioconductor)מידול נושאים חבויים (latent topic modeling) ללא פיקוח
tidyversePosit Software, PBCv2.0.0 (CRAN)חבילת כלים מרכזית למניפולציה ועיצוב של נתונים

מקורות

  1. Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
  2. Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
  3. Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
  4. Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933
  5. Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.
  6. Chen JG, Chávez-Fuentes JC, O’Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w
  7. Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.
  8. Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.
  9. McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.
  10. Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2
  11. Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.
  12. Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.
  13. Luecken MD, Büttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.
  14. Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.
  15. Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.
  16. Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.
  17. Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell–cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.
  18. Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell–cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.
  19. Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.
  20. Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.
  21. Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.
  22. Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SeuratSPOTlight
סבב עבודה מעשי לניתוח נתוני טרנסקריפטומיקה מרחבית: מרכישת נתונים ועד לניתוחים מתקדמים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.