פרוטוקול להעשרה מבוססת גודל של טיפות שומן מתאי אפיתל של שד בקר ורקמות שד

סיכום

פרוטוקול זה שואף להשיג הפרדה והעשרת טיפות ליפידים מבוססת גודל באמצעות צנטריפוגציה סדרתית, ולאפשר חקירה מדויקת וניתנת לשחזור של מנגנוני חילוף חומרים של שומנים ותהליכים ביולוגיים הקשורים לטיפות שומן.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר גישה צנטריפוגציה דיפרנציאלית סדרתית להעשיר טיפות ליפידים (LDs) בגדלים שונים מתאי אפיתל שד בקר (BMECs) ורקמות חליב, ומאפשר ניתוח בגודל שמעבר לשיטות בידוד לידול לאקווריום קונבנציונליות. כמרכזי ויסות דינמיים של חילוף חומרים תוך-תאי של שומן, LDs ממלאים תפקידים קריטיים בכך שהם מאגירים ליפידים ניטרליים (כגון טריגליצרידים ואסטרים כולסטריל) ומתיאמים את הסינתזה, ההידרוליזה וההובלה שלהם. הם ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס אנרגטי, בתמיכה בביוגנזה של הממברנה ובהקלת העברת אותות תאי. הפקת LD חיונית לחקירת מנגנוני הרגולציה של מטבוליזם השומנים. חקר מטבוליזם של שומנים בבלוטות השד משפיע משמעותית על התפתחות התינוק, בריאות האדם, כלכלה חקלאית וביולוגיה בסיסית של התאים. לכן, אנו מתארים שיטת צנטריפוגציה דיפרנציאלית להפקת צנטריפוגות דיפרנציאליות מ-BMECs ומרקמת בלוטת השד. בניגוד לגישות הקונבנציונליות לבידוד LD בכמויות גדולות, פרוטוקול זה מאפשר העשרה מבוססת גודל של תת-אוכלוסיות LD על ידי התאמת כוחות צנטריפוגליים ברצף. השלמות וההעשרה היחסית של חלקי LD מוערכים מראש באמצעות צביעת BODIPY493/503, ומספקת גישה מעשית וניתנת לשחזור לניתוחים במורד הזרם של מטבוליזם שומנים ותהליכים הקשורים ל-LD.

מבוא

טיפות ליפידים (LDs) הן אברונים דינמיים בתוך תאים המשמשים כאתרי אחסון ראשיים לליפידים ניטרליים¹. הצטברות לא תקינה של כבד שומני קשורה למגוון רחב של מחלות, הכוללות גם מחלות כמו מחלת כבד שומני², מחלות לב וכלי דם³, סוכרת⁴ וסרטן⁵. לעומת זאת, חוסר מספיק של תפקודים תפקודיים עלול גם לגרום לתוצאות חמורות, ולהוביל לאובדן מאגרי אנרגיה תאיים ולליקויים תפקודיים נלווים^6. בהקשר של כלכלה חקלאית, מחסור ב-LDs בעליית מעלים עלולה לגרום להפרשה לא מספקת של שומן חלב, מה שמוביל לדיכאון שומן חלב, אשר בתורו פוגע בערך התזונתי ובשיווקיות מוצרי החלב^. נכון להיום, ויסות חילוף החומרים של LD הפך לתחום מחקר משמעותי.

פיתוח טכניקות החילוץ ל-LDs מאז המאה ה-20 שאף בעקביות להפיק LDs בכמויות גדולות יותר, עם טוהר גבוה יותר ופעילות ביולוגית משומרת טוב יותר. זה כרוך בהקמה ואופטימיזציה מתמשכת של מתודולוגיות. נכון להיום, מספר חברות עיצבו ערכות מסחריות להפרדת LD⁸. למרות שערכות אלו מקצרות משמעותית את זמן ההפרדה ודורשות רק שימוש בצנטריפוגות קונבנציונליות, עבור דגימות שקשה להתנתק, לא ניתן לכוון את המגיב וקשה לאופטימיזציה של שלבי הבדיקה. יתרה מזאת, חילוץ כבד שומני ממלא תפקיד חיוני בהבהרת מנגנוני מחלה, כולל מחלות מטבוליות כמו כבד^{שומני 9}, סרטן¹⁰ ומחלות ניווניות נוירודגנרטיביות¹¹, ומשמש כבדיקה רב-ממדית לפענוח מסלולים פתולוגיים. ניתן גם לפרק את הרכב החלבונים והליפידים על ידי הפקת LDs כדי לחשוף את המגוון של הפונקציות הביולוגיות של LD¹².

היווצרות שומן חלב אינה רק תהליך של פירוק המצעים; במקום זאת, הוא מייצג תהליך סינתזה ואריזה של שומנים מתוזמר היטב המתבצע על ידי תאי אפיתל חלביים. ¹³. יצירת שומן החלב בפרות חלב מתבססת על מנגנון ההפרשה של הממברנה האפיקלית של תאים אלו: טריגליצרידים שמסונתזים ברשתית האנדופלזמית יוצרים LDs ציטופלזמיים, שמועברים לאחר מכן לממברנה האפיקלית ומופרשים באמצעות ניצנים. במהלך תהליך זה, ה-LDs עטופים בממברנת כדורי שומן חלב שמקורו בממברנה האפיקלית, מה שמוביל להיווצרות כדורי שומן חלב יציבים^{מבניים 14}. בלוטת החלב של הבקר משמשת כמודל קלאסי לחקר הנקה ביונקים, והמנגנונים המרכזיים השולטים בסינתזת והפרשה של LD שמורים מאוד בבני אדם¹⁵. קביעת שיטות להפקת LDs הן מ-BMECs והן מרקמת חזה יכולה לגשר בין ייצור בעלי חיים לבריאות האדם. ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים של ה-LDs המופקים יכולים לשמש לאחר מכן לשיפור תפוקת ואיכות החלב, תוך הבטחת בטיחות וביטחון.

השיטה הנוכחית מבוססת בעיקר על המאפיין של צפיפות נמוכה של ה-LDs, שגורם להם לצוף לראש הגרדיאנט במהלך צנטריפוגציה¹⁶. תהליך החילוץ מורכב משלושה שלבים עיקריים: איסוף דגימות, אולטרה-צנטריפוגציה לציפה של LD, ושטיפת LD. סוכרוז (2.5 מ') מוסיפים לבופר כדי להגן על ה-LDs, ואז מהירות הצנטריפוגה מותאמת בהתאם לדרישות הניסוי; בדרך כלל, לוחמי LD גדולים ניתן להעשיר בכוחות מתחת ל-10,000 x g, בעוד שמהירויות גבוהות יותר (מעל 10,000 x g) משמשות לחילוץ LD קטן, שכן לוחמים גדולים יותר עלולים להיקרע בתנאים אלה. לבסוף, ה-LD המוקצים עוברים שטיפות מרובות למניעת זיהום, וטוהר החילוץ נבדק מראש באמצעות צביעת BODIPY493/503.

שיטות בידוד LD קונבנציונליות משיגות בעיקר התאוששות נרחבת של אוכלוסיות LD הטרוגניות, ומגבלות את ניתוח ההבדלים המבניים והפונקציונליים התלויים בגודל. הפרוטוקול הנוכחי מרחיב גישות סטנדרטיות בכך שהוא מאפשר העשרה מבוססת גודל של תת-אוכלוסיות LD באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית רציפה, ומקלה על חקירת צנטריפוגה, תחלופה פנימית, תנועה תוך-תאית ושימוש שונה במסלולים ליפוליטיים או אוטופגיים. גישה זו משיגה העשרה ולא טיהור מוחלט, וחפיפה חלקית בין חלקי גודל עשויה להתרחש עקב התפלגויות גדלים רציפות ותכונות פיזיקליות משותפות.

פרוטוקול

קבעו את גודל טיפת השומנים היעד להעשרה (איור 1).

1. הגדרת ריאגנטים

1. PBS: משקל 8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 3.58 גרם Na₂HPO₄·12H₂O, ו-0.24 גרם KH₂PO₄ ל-800 מ"ל ddH₂O. כוון את ה-pH ל-7.4 עם HCl, ערבב היטב והעלה את הנפח ל-1 ליטר. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שנה לאחר האוטוקלב.
2. סוכרוז (2.5 מ'): שקול 856 גרם סוכרוז והמיס אותו ב-400 מ"ל של ddH₂O. ערבב היטב עד שהסוכרוז נמס לחלוטין, ואז כוון את הנפח ל-1 ליטר. אוטוקלב את התמיסה ואחסן בטמפרטורה של 4°C עד 3 חודשים.
3. בופר A: שקלו 1.79 גרם טריסין והמסים אותו ב-400 מ"ל ddH₂O. כוונו את ה-pH ל-7.8 עם KOH. לאחר התאמת ה-pH, הוסף 50 מ"ל של תמיסת סוכרוז מוכנה מראש של 2.5 מטר. ערבב היטב וכיוון את הווליום ל-500 מ"ל. לאחר האוטוקלב, ניתן לאחסן את הבופר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
4. בופר B: משקל 0.95 גרם HEPES, 1.49 גרם KCl ו-0.038 גרם MgCl₂·6H₂O בנפרד ב-180 מ"ל ddH₂O. כוון את ה-pH ל-7.4 עם KOH, ערבב היטב והביא את הנפח ל-200 מ"ל. לאחר האוטוקלב, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.
5. PMSF (1,000 פעם, 0.2 מ'): שקלו 0.175 גרם PMSF והמיסה ב-5 מ"ל DMSO. אחסון מוגן מאור בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך עד שנה.
   הערה: PMSF הוא מאוד רעיל; יש לנקוט אמצעי הגנה מתאימים. במהלך ההכנות, יש להבטיח הגנה מלאה מפני אור; PMSF קשה להמסה וניתן להפריד אותו לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.

2. חילוץ של LDs מתאים

1. תרבות BMEC
   1. שלפו חמישה שפופרות של תאי BMEC קפואים מהמקרר בטמפרטורה של -80°C והפשרו אותם במהירות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. צנטריפוגה את הצינורות בעוצמה של 250 x g למשך 4 דקות ו-30 שניות לאחר הפשרה מלאה.
   2. השליכו את מדיום השימור בהקפאה עם פיפטור, הוסיפו 1 מ״ל של 10% FBS כדי להחזיר את התאים, ערבבו ומוסיפים בעדינות את התאים לצלחת תרבית תאים בעובי 100 מ"מ המכילה 6 מ"ל של 10% FBS. נענעו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח חלוקה אחידה של התאים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   3. מעקב אחר מורפולוגיית התאים תחת מיקרוסקופ וביצוע תת-תרבות כאשר התאים מגיעים ל-80%–90% קונפלוקציה.
      הערה: יש להבטיח מצב תא מיטבי ומספר תאים מספק לפני חילוץ LD לשיפור התפוקה והשחזור.
   4. השליכו את מדיום התרבות המקורי בצלחת הפטרי עם פיפטה, והוסיפו 1 מ"ל PBS לאורך דופן כל צלחת. לאחר שטיפה פעמיים, מוסיפים 1 מ״ל טריפסין לכל כלי ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ו-30 שניות.
   5. בדוק אם התאים מתעכלים לחלוטין תחת המיקרוסקופ, הוסף 1 מ"ל של 10% FBS כדי לסיים את העיכול לאחר סיום העיכול. החזירו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג, העבירו אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל, ולצנטריפוגה ב-250 x גרם למשך 4 דקות ו-30 שניות.
   6. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על ההליכים המתוארים בשלב 1.2.
   7. הרחיב תאים באמצעות כ-30 צלחות תרבית או כלי תרבית גדולים יותר, או השתמש בצלחות תרבית גדולות יותר לתרבות תאים. הוסף 150 מיקרומול/ליטר t10,c12-CLA (מדולל ב-DMEM) לטיפול בתאים בלילה שלפני ההוצאה. השתמש ב-7 מ"ל מדיום תרבית לכל מנה של 100 מ"מ. זמן התרביות תלוי בגודל ה-LD שצריך להפריד.
      הערה: בהתבסס על אופטימיזציה קודמת, יש לטפל ב-BMECs ב-t10,c12-CLA במשך 6 שעות להעשיר LDs גדולים או ל-12–24 שעות להעשיר LD קטנים. מכיוון שלתאים יש מעט LDs, בדרך כלל מוסיפים חומצות שומן חיצוניות כדי לגרום להצטברות של LDs. במחקר זה, יש להוסיף t10,c12-CLA לתאים מתורבתים כדי לגרום להצטברות LDs.
2. איסוף דגימות
   1. להשליך את המדיום המקורי, להוסיף 1 מ״ל של PBS קר וקרח ולשטוף 3 פעמים. אל תזרקו PBS במהלך הכביסה הסופית. לדוגמה, 30 צלחות של תאים בקוטר 100 מ"מ, אסוף תאים מכל 10 לוחות לצינור צנטריפוגה אחד בנפח 15 מ"ל, כל צינור מכיל בערך 1x108, מה שמוביל לסך של 3 צינורות צנטריפוגות.
      הערה: שמרו על כל הדגימות בטמפרטורה של ≤4 מעלות צלזיוס לאורך כל תהליך החילוץ כדי למנוע פירוק חלבונים ב-LD.
   2. לאחר האיזון, צנטריפוגה ב-1,000 x g, 4 °C למשך 10 דקות.
   3. השליכו את ה-PBS. הוסיפו 10 מ"ל בופר A מוכן מראש ו-10 מיקרוליטר PMSF (1,000x, 0.2 M) לצינור הצנטריפוגה. ערבבו היטב ודגרו על קרח במשך 20 דקות.
3. ניתוק תאים ושבר התחלתי
   1. הפרעת תאים באמצעות הומוגניזר אולטרסוני מסוג פרוב הפועל במחזורי פולסים של 5 שניות ON ו-10 שניות OFF, מה שמוביל לזמן סוניקציה אפקטיבי כולל של 10 דקות לאורך תקופה של 30 דקות. כוון את המכשיר ל-40% הספק (התואם למשרעת גלאי של כ-76 מיקרון) באמצעות גשוש בקוטר 3 מ"מ.
      הערה: שמרו דגימות על הקרח לאורך כל ההליך כדי למנוע התחממות יתר.
   2. צנטריפוגה את ההומוגננט בטמפרטורה של 3,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר גרעינים ופסולת תאית. אסוף את הסופרנטנט כסופרנטנט פוסט-גרעיני (PNS).
4. אולטרה-צנטריפוגציה של צנצריפוגות צפות
   1. סנן את הסופרנטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרון.
   2. פיפט 10 מ"ל של PNS לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. הוסיפו 2 מ"ל סוכרוז (2.5 מ') ו-2 מ"ל בופר B ברצף לחלק העליון של ה-PNS (ניתן להקטין את נפח הסוקרוז כראוי תוך הגדלת נפח בופר B לשיפור טוהר ה-LD), ואז לראשונה צנטריפוגה (5,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, 20 דקות).
   3. לאחר הצנטריפוגה, אספו את שכבת ה-LD החלבית והקרמית בחלק העליון של הצינור. כדי לאסוף LDs, תחילה הוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר B לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, ואז השתמשו בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי לשאוב בעדינות את שכבת LD הצפה מספר פעמים, תוך איסוף כמה שיותר LDs.
      הערה: ה-LD יוצרים שכבת שמנת צפה בחלק העליון; הימנע משאיפת התמיסה הבסיסית ככל האפשר כדי למנוע זיהום.
   4. בצע צנטריפוגציה שנייה (10,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, 30 דקות) ואיסוף ה-LD.
   5. העבר את התמיסה לצינור אולטרה-צנטריפוגה התואם לרוטור דלי מתנדנד, סגור אותו ומאזן את הצינורות. בצע את הצנטריפוגה השלישית באולטרה-צנטריפוגה (50,000 x g, 4°C, 40 דקות) ואיסוף ה-LDs.
      הערה: איזון מדויק של צינורות (עד 0.0001 גרם) כדי להבטיח הפעלה בטוחה של אולטרה-צנטריפוגה.
   6. לאחר האיזון, יש לבצע את הצנטריפוגציה הרביעית (150,000 x g, 4°C, 50 דקות) להמשך איסוף ה-LD. אופטימיזציה של מהירות ומשך הזמן בהתאם לגודל ה-LD היעד.
      הערה: צנטריפוגה ממושכת או חוזרת במהירות גבוהה עלולה להפריע ל-LD (LDs). לעומת זאת, צנטריפוגה קצרה בעוצמה של 10,000 x גרם במהלך שטיפה מסירה בעיקר זיהומים ויש לה השפעה מינימלית על שלמות ה-LD. שיטה זו גמישה; ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה עבור סוגי תאים או רקמות שונים.
5. שטיפת LDs
   1. החזירו את ה-LD שנאספו בבופר B קר ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x g ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. הסר בזהירות את הסופרנטנט וחזור על שלב השטיפה לפחות ארבע פעמים תוך שימוש באותו נפח בופר, כוח צנטריפוגלי וזמן צנטריפוגה. ל-LD קטנים, יש להגדיל את הכוח הצנטריפוגלי לפי הצורך כדי להבטיח הפרדה יעילה.
   3. לאחר השטיפה הסופית, מאחדים את חלקי LD, ערבבו בעדינות, ואחסנו בטמפרטורה של −80°C.
      הערה: אל תשכחו את שלבי הכביסה, גם אם אובדן LD הוא בלתי נמנע. המשך לשטוף עד שלא יישאר שאריות ממברנה נראות לעין.

3. חילוץ LDs מרקמה

1. איסוף דגימות
   1. שלפו דגימות רקמת שד בקר מחנקן נוזלי. שקלו 5 גרם רקמה והפשרו אותן על קרח עד שלא יישארו גבישי קרח.
   2. שטוף את הרקמה עם PBS או סליין פיזיולוגי.
   3. חתוך את הרקמה לחתיכות בגודל 1-2 מ"מ באמצעות מספריים כירורגיות.
   4. העבר את הרקמה הטחונה למלט מקורר מראש המכיל 12 מ"ל בופר A ו-10 מיקרוליטר PMSF (1,000x, 0.2 מ'). טחנו את התערובת על קרח במשך כ-10 דקות.
   5. דגר את ההומוגננט על הקרח למשך 20 דקות.
   6. לאחר טחינה יסודית, אסוף את ההומוגננט לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
   7. צנטריפוגה ב-2,500 x g, 4°C למשך 10 דקות. הסופרנטנט שנוצר הוא PNS.
2. אולטרה-צנטריפוגציה של צנצריפוגות צפות
   1. סנן את הסופרנטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרון.
   2. פיפט 10 מ"ל של PNS לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. הוסיפו 2 מ"ל סוכרוז ו-2 מ"ל בופר B ברצף. בצע את הצנטריפוגה הראשונה (4,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, 20 דקות). אסוף את החומר החלבי, דמוי השמנת.
   3. בצע צנטריפוגה שנייה (7,000 x g, 4 °C, 30 דקות) ואיסוף ה-LDs.
   4. בצע צנטריפוגה שלישית (10,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, 40 דקות) ואסוף את ה-LD.
   5. העבר את הסופרנטנט לצינור SW40 ובצע אולטרצנטריפוגציה (50,000 x g, 4°C, 50 דקות). אסוף את ה-LDים.
   6. בצע צנטריפוגה חמישית (100,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, 60 דקות). אסוף את ה-LDים.
3. שטיפת LDs
   עיין בשיטת הכביסה ל-LDs המופקים מתאים.

4. אימות ראשוני של טוהר ה-LD על ידי צביעה

1. הכינו מראש תמיסת צבע פלואורסצנטי ניטרלית של 10 מיקרוגרם/מ"ל בתנאי אור מוגנים (BODIPY: בופר B = 1:100, V/V).
2. הוסיפו כמות מתאימה של ערכות מעורבות ו-Buffer B לצינור מיקרוצנטריפוגה. בתנאים מוגנים באור, הוסף כמות מתאימה של תמיסת צבע פלואורסצנטי ניטרלית ליפיד. ערבבו היטב ודגרו במשך 10 דקות.
3. הכינו שקופית מיקרוסקופ נקייה. שפוך 2.5 מיקרו ליטר מהתערובת על הכיסוי. הנח בעדינות את הסלייד מעל התערובת, תוך הימנעות מבועות אוויר. התבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך.

5. אימות טוהר LD באמצעות כתם מערבי

1. ריכוז החלבון של חלקי LD נמדד באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.
2. לניתוח ווסטרן בלוט, יש לערבב 20 מיקרוגרם חלבון מכל דגימה עם בופר טעינה של 5x SDS ולחמם בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להבטיח דהנאטורציה מלאה.
3. לאחר מכן, הפרדו את החלבונים באמצעות SDS–PAGE על ג'לים פוליאקרילאמידיים עם גרדיאנט 10% לפי משקלם המולקולרי.
4. לאחר האלקטרופורזה, מעבירים את החלבונים לממברנות PVDF מופעלות מראש, ואז חוסמים עם 5% BSA בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעה. בהמשך, iIncubate את הממברנות במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים, כולל אנטי-פריליפין 2 של הארנב (1:500) ואנטי-β-אקטין של ארנב (1:5000).
5. שטפו את הממברנות שלוש פעמים עם 1x TBST למשך 10 דקות כל אחת, ואז דגרו עם נוגדן משני נגד ארנב עם HRP (1:5000) למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
6. לאחר שלוש שטיפות נוספות עם TBST, זיהו רצועות חלבון באמצעות ערכת כימילומינסנציה משופרת (ECL) והמחישו באמצעות מערכת הדמיה ג'לית.

6. נקודות עצירה והנחיות אחסון

1. השאר את ה-PNS על הקרח עד שעה עד שעתיים לפני האולטרה צנטריפוגה.
2. שמור את ה-LD שנאספו על הקרח עד שעה עד שעתיים לפני הכביסה. לאחסון לטווח קצר, יש לאחסן את ה-LD בטמפרטורה של 4°C עד 24 שעות. לאחסון ארוך טווח, יש לאחסן את ה-LD בטמפרטורה של −80°C ולהגביל את מחזורי ההקפאה-הפשרה לאחד בלבד כדי לשמור על שלמות ה-LD.
3. במהלך כל הפסקות הניסוי, שמרו דגימות על קרח עם פקקי צינורות סגורים כדי למזער זיהום.

7. פתרון תקלות

1. שכבה צפה דקה: כוון את נפח הבופר או כוח הצנטריפוגה.
2. ציפה לקויה: הגדלת מהירות הצנטריפוגה או הארכת הזמן.
3. זיהום: להבטיח טיפול סטרילי ובופרים מסוננים.
4. קרע LD: שמור דגימות על קרח, הפחת את כוח הצנטריפוגה, או מחזיר את הדחף בעדינות.

תוצאות

תהליכי עבודה ומסגרת מתודולוגית
הוקם סכמטי של עץ ההחלטה (איור 1) כדי להנחות את בחירת תנאי הצנטריפוגציה בהתאם למטרות ניסוי. באופן ספציפי, כוחות צנטריפוגליים ≤10,000 x g שימשו להעשרת LDs גדולים (≥2 מיקרון), בעוד שכוחות >10,000 x g הופעלו להעשרת LDs קטנים (<1 מיקרון). מסגרת זו מספקת בסיס מעשי להשגת הפרדה מבוססת גודל. תהליך העבודה הכולל לבידוד LD מ-BMECs ורקמת שד מוצג באיור 2. למרות הבדלים במקור ...

דיון

LDs הם אבונים ייחודיים המאופיינים בליבת שומן ניטרלית הסגורה בשכבה מונופוליפידית. הם נבטים מהרשת האנדופלזמית ומשנים דינמית את גודלם ומספרם, מה שמקל על העברה תוך-תאית ותקשורת נרחבת עם מבנים תת-תאיים אחרים לתיאום הומאוסטזיס ליפידי תאי 17,18,19. התנהגות דינמית זו מווסת עוד יותר על ידי רמזים מטבוליים מערכתיים, שכן הוכח כי אינסולין מפעיל את השיח המטבולי בין גלוקוז לשומן, ובכך משפיע על מחזור ה-LD ועל א...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% trypsin-EDTA	גיבקו	25200072	ריאגנט
ערכות הכנה מהירה של ג'ל 10% PAGE	ביומן בייג'ינג	PG112	ריאגנט
100 & mu; מסננת תא M	ביוטיים	FSTR100	ריאגנט
צלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ	קורנינג	490167	ריאגנט
אמרשם אימג'ר 600	GE Healthcare Life Sciences	600	ציוד
אוטוקלאב	פנאסוניק	MLS-3751L	ציוד
ערכת בדיקת חלבון BCA	בייג'ינג דינגגואו.	BCA01	ריאגנט
בודיפי 493/503	Invitrogen	D3922	ריאגנט
צנטריפוגה	אפנדורף		ציוד
DMEM	הייקלון	SH30022.01	ריאגנט
DMSO	סולרביולוגיה	D8370	ריאגנט
סרום בקר עוברי	גיבקו	2492319	ריאגנט
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	ריאגנט
נוגדן משני אנטי-ארנב AffiniPure לעזים עם מצמיד HRP	פרויטנטק	SA00001-2	ריאגנט
KCl	הושי	20030666	ריאגנט
KH2PO4	הושי	10017608	ריאגנט
MgCl2	הושי	20059028	ריאגנט
Na2HPO4· 12H2O	הושי	S112623	ריאגנט
NaCl	הושי	10019328	ריאגנט
בופר טעינת חלבון מיידי Omni-Easy	טכנולוגיית ביו-רפואית של שנגחאי אפיזים	LT101S	ריאגנט
ערכת זיהוי כימילומינסנציה רגישה במיוחד Omni-ECL	טכנולוגיית ביו-רפואית של שנגחאי אפיזים	SQ201	ריאגנט
PBS	הייקלון	SH30256.01	ריאגנט
פניצילין & סטרפטומיצין 100 פעמים;	NCM ביוטכנולוגיה	CLOOC5	ריאגנט
מד pH	מטלר טולדו	S220K	ציוד
פיפטה	אפנדורף		ציוד
PMSF	קולייבר	CP8651	ריאגנט
ערכת העברת ממברנה PVDF	GenScript	eBlot L1	ריאגנט
ארנב אנטי-פרילפין 2	אבקאם	15294-1-AP	ריאגנט
ארנב אנטי-ובטא;-אקטין	פרויטנטק	20536-1-AP	ריאגנט
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך בדרגת מחקר	אולימפוס	IX73	ציוד
סוקרוזה	סולרביולוגיה	S8271	ריאגנט
רוטור SW 40 Ti	בקמן קולטר	331301	ציוד
טרנס-10, חומצה לינולאית מצומדת ציס-12	קיימן	90145	ריאגנט
טריסין	קולייבר	CT11331	ריאגנט
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	אופטימה XE-100	ציוד
מרוסקת תאים אולטרסוניים	SCIENTZ	JY92-11N	ציוד