מחקר זה מזהה ירידה במגוון המיקרוביוטות במעי ובמסלולים מטבוליים משתנים בסוכרת סוג 2 (T2DM), ומדגיש עלייה בפרוטאובקטריה וירידה בטקסונים מועילים, מה שמרמז כי דיסביוזה מיקרוביאלית קשורה ל-T2DM ועשויה לתרום לפתופיזיולוגיה שלו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
מחקר זה מזהה ירידה במגוון המיקרוביוטות במעי ובמסלולים מטבוליים משתנים בסוכרת סוג 2 (T2DM), ומדגיש עלייה בפרוטאובקטריה וירידה בטקסונים מועילים, מה שמרמז כי דיסביוזה מיקרוביאלית קשורה ל-T2DM ועשויה לתרום לפתופיזיולוגיה שלו.
העלייה העולמית בסוכרת סוג 2 (T2DM) מדגישה את הצורך להבין טוב יותר את המנגנונים הביולוגיים הבסיסיים שלה, במיוחד אלה הכוללים אינטראקציות בין מארח למיקרוביום. מחקר זה נועד לאפיין את המגוון המיקרוביאלי במעי, הרכב טקסונומי ונתיבי מטבוליזם חזויים בקרב חולי T2DM שאובחנו לאחרונה בהשוואה לקבוצת הלא סוכרתית (NM). דגימות צואה טריות נותחו באמצעות ריצוף 16S rDNA. מגוון אלפא (מדדי Chao, ACE, Shannon ו-Simpson) וגיוון בטא חושבו להערכת מבנה קהילת המיקרוביאלים. ההבדלים הטקסונומיים הוערכו באמצעות מבחני סכום דרגה וילקוקסון וגודל אפקט ניתוח ליניארי מבחין (LEfSe). חיזוי מסלולים פונקציונליים בוצע באמצעות חקירה פילוגנטית של קהילות באמצעות שחזור מצבים שלא נצפו (PICRUSt2) בהתבסס על הערות KEGG ו-MetaCyc. ניתוח רנדומיזציה מנדלית (MR), כולל שקילול הפוך-שונות, MR-Egger ושיטות חציון משוקללות, יושם להערכת קשרים גנטיים חזויים בין טקסונים מיקרוביאליים ל-T2DM. התוצאות הראו ירידה בעושר המיקרוביאלי, כפי שמשתקף במדדי Chao ו-ACE נמוכים יותר, ושינוי במבנה הגיוון, כפי שמשתקף במדדי שאנון נמוכים וסימפסון גבוהים יותר, בקרב חולי T2DM, בליווי שינויים מורכבים משמעותיים. נצפו עלייה בשפע יחסי של פרוטאובקטריה וירידה בשפע של טקסונים מועילים כמו Lachnospiraceae ו-Blautia. חיזוי פונקציונלי הצביע על ירידה בשפע המסלולים הקשורים למסלול הפנטוז פוספט הלא-חמצוני, ביוסינתזה איזובוטנול וביוסינתזה של L-איזולאוצין. ניתוח MR סיפק ראיות משלימות התומכות בקשרים בין טקסונים מיקרוביאליים ספציפיים לרגישות ל-T2DM. לסיכום, T2DM קשור לירידה בעושר המיקרוביאלי, לשינוי במבנה המגוון ולשינויים טקסונומיים ותפקודיים מובחנים. ממצאים אלו מדגישים את הרלוונטיות של מיקרוביום המעי בסוכרת סוג 2 ותומכים בפוטנציאל של סמנים ביולוגיים מבוססי מיקרוביום ואסטרטגיות טיפוליות. נדרשים מחקרים נוספים כדי לאמת ממצאים אלו ולהבהיר את המנגנונים הבסיסיים.
סוכרת סוג 2 (T2DM) הפכה לאחת המחלות הכרוניות המתפתחות במהירות הגבוהה ביותר בעולם, מונעת על ידי עיור מהיר, דפוסי תזונה מערביים ואורח חיים יושב יותרויותר. הוא תורם מרכזי לתחלואה ותמותה עולמית ומטיל נטל בריאותי ציבורי משמעותי3. למרות שרגישות גנטית משחקת תפקיד, העלייה המהירה בשכיחות T2DM מדגישה את חשיבות הגורמים הסביבתיים והמטבוליים4. לכן, זיהוי מנגנונים ביולוגיים ניתנים לשינוי הוא חיוני לשיפור אסטרטגיות גילוי ומניעה מוקדמים. התקדמויות אחרונות זיהו את המיקרוביום המעי כרגולטור מרכזי של הומאוסטזיס מטבולי5. המערכת האקולוגית המיקרוביאלית של המעי משפיעה על מטבוליזם הגלוקוז, תפקוד מערכת החיסונית, שלמות מחסום המעי ודלקת כרונית בדרגה נמוכה, כולם מרכזיים לפתוגנזה של T2DM6. דיסביוזה נקשרה להשמנת יתר, עמידות לאינסולין, אנדוטוקסמיה ושינוי באיזון האנרגיה, מה שמרמז על קשר מכני בין שינויים מיקרוביאליים להתקדמות המחלה7. בנוסף, מטבוליטים מיקרוביאליים, כולל חומצות שומן קצרות שרשרת, חומצות מרה וחומצות אמינו מסועפות, היו מעורבים בוויסות רגישות לאינסולין ולמטבוליזם של המאכסן8.
בעוד שראיות מצטברות תומכות בתפקיד המיקרוביום של המעי בסוכרת סוג 2, רוב המחקרים הקיימים מסתמכים על עיצובים תצפיתיים, שמגבילים את ההסקה הסיבתית. גישות חלופיות, כמו מטגנומיקה של רובה ציד ומטבולומיקה ממוקדת, יכולות לספק תובנות פונקציונליות ברזולוציה גבוהה יותר, אך לעיתים מוגבלות על ידי עלות, מורכבות חישובית ויכולת מוגבלת במחקרים חקרניים או בקנה מידה פיילוט. לעומת זאת, ריצוף 16S rDNA הוא שיטה חסכונית ואומצה באופן נרחב לפרופיל הרכב קהילות מיקרוביאליות, אם כי הרזולוציה הטקסונומית שלה מוגבלת לרמת המין ואינה יכולה לכמת ישירות מטבוליטים פונקציונליים. לכן, נבחר למחקר זה ריצוף 16S rDNA כגישה חסכונית וניתנת להרחבה, המתאימה לקבוצות קליניות חקרניות, תוך אפשרות אינטגרציה עם חיזוי פונקציונלי במסגרת אנליטית משלימה במורד הזרם. לכן, שילוב פרופיל מיקרוביאלי מבוסס 16S עם חיזוי פונקציונלי ביואינפורמטי וגישות משלימות כמו רנדומיזציה מנדלית (MR) עשוי לספק מסגרת מאוזנת לחקירת קשרים קומפוזיוניים וסיבתיים פוטנציאליים.
ראוי לציין שעדיין קיימת מחסור יחסי בנתונים המתמקדים במיוחד במטופלי סוכרת סוג 2 שאובחנו לאחרונה ותמימים לטיפול. באוכלוסיות אלו, שינויים מיקרוביאליים פחות נוטים להתערבויות פרמקולוגיות, במיוחד מטפורמין, הידוע כמי שמשנה משמעותית את הרכב ותפקוד המיקרוביום במעי9. זהו פער חשוב בספרות הנוכחית, שכן מחקרים רבים קיימים כוללים אוכלוסיות מטופלים הטרוגניות עם חשיפות שונות לטיפול ושילוב מוגבל של פרופיל מיקרוביום עם גישות אנליטיות מבוססות גנטית.
בהקשר זה, המחקר הנוכחי נועד לאפיין את מגוון המיקרוביום במעיים, הרכב טקסונומי וחיזוי מסלולים תפקודיים בקרב חולי T2DM שאובחנו לאחרונה בהשוואה לקבוצת ה-NM, באמצעות ריצוף 16S rDNA וניתוח ביואינפורמטיקה. בנוסף, יושמה רנדומיזציה מנדלית באמצעות נתוני אסוציאציות גנומיים רחבי הציבור, כדי לחקור קשרים גנטיים צפויים בין טקסונים מיקרוביאליים ספציפיים לסיכון ל-T2DM. אסטרטגיה אנליטית משולבת זו מאפשרת תובנות משלימות מפרופיל קהילות מיקרוביאליות ונתונים גנטיים ברמת האוכלוסייה. באופן ספציפי, ריצוף 16S rDNA מספק אפיון ישיר של הרכב המיקרובים באוכלוסיית המחקר, בעוד שאקראיות מנדלית משתמשת בכלים גנטיים מקבוצות עצמאיות כדי להעריך האם הקשרים שנצפו תואמים ליחסים חזויים גנטית. אינטגרציה זו נועדה להתמודד עם מגבלה מרכזית של מחקרי מיקרוביום תצפיתיים על ידי מתן ראיות משלימות התומכות בעמידות הקשרים בין מיקרוביום ל-T2DM. לכן, שילוב גישות אלו נועד לספק אימות הדדי ולא כפילות, ובכך לחזק את יכולת הפרשנות של הקשרים בין מיקרוביוטה ל-T2DM.
המחקר הנוכחי מתמקד בשלושה היבטים. ראשית, הוא מעריך שינויים במיקרוביום המעי אצל חולי סוכרת סוג 2 עם אבחון חדש, תמימים לטיפול, במטרה להפחית בלבול כתוצאה מהתערבויות פרמקולוגיות. שנית, היא משלבת פרופיל טקסונומי עם מסלולים תפקודיים צפויים כדי לספק תצוגה ברמת המערכת של שינויים מטבוליים הקשורים למיקרוביוטה. שלישית, הוא משלב ניתוח אקראי מנדלי כדי להעריך האם הקשרים שנצפו תואמים ליחסים חזויים גנטית, ובכך מספק טריאנגולציה מתודולוגית. ביחד, היבטים אלו מספקים מסגרת משלימה וניתנת לשחזור לניתוח מיקרוביום במקום מחקר תיאורי בלבד, ומבדיל עבודה זו ממחקרים קודמים שבדרך כלל הסתמכו על עיצובים תצפיתיים חד-שיטותיים ואינם משלבים פרופיל מיקרוביאלי, חיזוי פונקציונלי והסקה גנטית במסגרת אנליטית מאוחדת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל ההליכים הכוללים משתתפים אנושיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים צ'נגצ'ינג צ'נג'יאצ'יאו (אישור מס' 20240131). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים לפני איסוף המדגם. כל דגימות הצואה ומידע המשתתפים טופלו באמצעות קודי מחקר שלא מזוהים אותם, כפי שמפורט בטבלת החומרים.
סינון והרשמה למשתתפים
חולים שאובחנו לאחרונה עם סוכרת סוג 2 שביקרו בבית החולים צ'נגצ'ינג צ'נג'יאקיאו בין יוני 2023 לדצמבר 2023 נבדקו לזכאות. המשתתפים נרשמו לקבוצת DM אם היו בגילאי 20 עד 65, קיבלו אבחנה חדשה של סוכרת סוג 2, הסכימו לספק דגימת צואה חדשה, והשלימו את הערכת ההיסטוריה הרפואית והבדיקות הקליניות הנדרשות. מתנדבים בריאים שגויסו באותה תקופה נכללו כקבוצת ההתאמה הלא-סוכרתית (NM) והותאמו לקבוצת DM ככל האפשר מבחינת גיל, מין ומאפיינים דמוגרפיים כלליים. המשתתפים הוצאו מהפרעות המטולוגיות, מחלות מערכת העצבים המרכזית, מחלות ראומטיות פעילות, מחלות אוטואימוניות, זיהום במערכת העיכול החריף או הכרוני, שלשולים כרוניים, עצירות, כיב מערכת העיכול פעיל או מחלים, מחלת מעי דלקתית, תסמונת המעי הרגיז, שחפת במעי, גידולים במערכת העיכול, ממאירות אחרות, אי ספיקת לב חמורה, חוסר ספיקת כבד חמורה, חוסר ספיקת כליות חמורה או מטבולית חמורה אחרת מחלות, תת-תזונה, חוסר חיסוני, הפרעות מטבוליות מולדת, מחלות פסיכיאטריות, שימוש בהרדמה-היפנוזה, או שימוש בסמים. המשתתפים גם הוצאו מהמצב אם קיבלו אנטיביוטיקה, חומרים מדכאי חומצה, תרופות לתנועתיות מערכת העיכול, פרוביוטיקה, גלוקוקורטיקואידים או מדכאי חיסון בתוך חודש לפני איסוף הצואה. בנוסף, אנשים שחוו שלשולים, עברו ניתוח מערכת העיכול או אנדוסקופיה של מערכת העיכול, או דיווחו על שינויים פתאומיים בסביבת המגורים או בהרגלי התזונה בתוך חודש לפני איסוף הצואה, הוצאו מהחוק. קוד מחקר ייחודי הוקצה לכל משתתף זכאי לפני איסוף המדגם. מתוך הקבוצה הזכאית נבחרו 12 משתתפים חדשים עם סוכרת סוג 2 ו-12 משתתפים מסוג נוני-מניים לצורך ריצוף וניתוח מיקרוביום של 16S במורד הזרם בהתבסס על זמינות המדגם ודרישות איכות הריצוף.
איסוף ואחסון דגימות צואה
לכל משתתף סופק מיכל איסוף צואה סטרילי שסומן רק בקוד המחקר שהוקצה להבטחת הסרת זיהוי. המשתתפים קיבלו הוראה לרוקן את שלפוחית השתן לפני הצואה כדי למזער זיהום שתן ולאסוף צואה טרייה ישירות למיכל הסטרילי ללא מגע עם מי אסלה, שתן, חומרי חיטוי או מזהמים פוטנציאליים אחרים. מיד לאחר האיסוף, כ-1–2 גרם צואה הועברה לצינור קריוגני סטרילי באמצעות כף דגימה חד-פעמית סטרילית. הצינור היה אטום היטב והונח מיד על קרח יבש או במיכל העברה מקורר מראש. כל הדגימות הועברו למעבדה בתוך שעתיים מהאיסוף. בהגעה למעבדה, קוד המחקר אומת, וכל צינור נבדק לאיתור דליפה או זיהום נראה. זמני האיסוף והאחסון נרשמו לכל הדגימות. דגימות הצואה אוחסנו לאחר מכן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד להוצאת DNA גנומי. הדגימות נחשבו מקובלות לניתוח במורד הזרם רק אם הן נשארו קפואות לחלוטין במהלך האחסון וההובלה ולא הראו עדות לדליפת צינור או זיהום חיצוני.
חילוץ DNA גנומי
דגימות צואה הוצאו מאחסון בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס והונחו על קרח לפני העיבוד. כל דגימה הופשרה רק עד שניתן היה לבצע הומוגניזציה כדי למזער את התדרדרות הקשורה למחזורי הקפאה-הפשרה החוזרים על עצמם. כ-200 מ"ג צואה הועברו לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי, ובופ הליזה שסופק בערכת חילוץ DNA הצואה נוסף בהתאם להוראות היצרן המפורטות בטבלת החומרים. הדגימות עברו מערבולת בעוצמה במשך 30 שניות להשגת הומוגניזציה מלאה ואז דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5–10 דקות כדי להקל על פירוק התאים. לאחר הניתוח, הדגימות צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט הועבר בזהירות לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש מבלי להפריע לכדור. ה-DNA הגנומי הוחלף לאחר מכן באמצעות בופר ההסרה שסופק עם הערכה או מים נטולי נוקלאז, בהתאם לפרוטוקול היצרן. ה-DNA שהופק נשמר בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס לשימוש קצר טווח או בטמפרטורה של −80 מעלות לשימור ארוך טווח. דגימות DNA שנחשבו מתאימות לניתוח במורד הזרם נראו נקיות וללא חלקיקים נראים לעין.
הערכת איכות DNA
איכות ה-DNA הוערכה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז וכימות מבוסס פלואורסנציה. ג'ל אגרוז 1% הוכן בבופר אלקטרופורזה, ודגימות ה-DNA שהופקו, מעורבבות עם בופר טעינה, נטענו לבארות הג'ל. אלקטרופורזה בוצעה עד שרצועות ה-DNA הופרדו כראוי, ולאחר מכן הג'ל נבדק תחת תאורה אולטרה-סגולה או כחולה. שלמות ה-DNA נחשבה מקובלת כאשר נצפתה רצועת DNA גנומית שלמה ללא התדרדרות משמעותית או טשטוש מופרז. ריכוז ה-DNA נמדד לאחר מכן באמצעות מערכת כימות DNA מבוססת פלואורסצנציה. הדגימות דוללו לריכוז הנדרש להגברת PCR במורד הזרם. דגימות DNA איכותיות הציגו בדרך כלל פס מובחן באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז והיו מרוכזות מספיק להליכי הגברה מאוחרים יותר.
הגברה של PCR באזור 16S rDNA V3–V4
אזור ההיפר-משתנים V3–V4 של rDNA חיידקי 16S הוגבר באמצעות פריימרים מקודדים. רצפי הפריימר היו כדלקמן: פריימר קדמי 5′-ACTCCTACGGGGGCAG-3′ ופריימר הפוך 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. תגובות PCR הוכנו על קרח בנפח סופי של 20 מיקרוליטר המכיל 4 מיקרוליטר של בופר PCR, 2 מיקרוליטר תערובת נוקלאוטידים (2.5 מ"מ/ליטר), 0.8 מיקרוליטר של פריימרים קדמיים ואחוריים (5 מיקרומול/ליטר), 0.4 מיקרוליטר של DNA פולימראז באיכות גבוהה, 10 נגרם DNA תבנית, ומים ללא נוקלאז לנפח. תערובות התגובה מעורבבות בעדינות באמצעות פיפטינג וצנטריפוגות קצרות כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור. הגברת PCR בוצעה בתנאי מחזור הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריה 25 מחזורי דנאטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חימוש ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם שלב הארכה סופי ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כדי למזער הטיית הגברה, כל דגימה הוגברה בתגובות משולשות, ומוצרי ה-PCR שהתקבלו מאותו דגימה אוגדו לאחר מכן לצינור יחיד. הגברה מוצלחת אושרה על ידי נוכחות רצועת אמפליקון שקופה בגודל הצפוי באלקטרופורזה בג'ל אגרוז.
אימות וטיהור מוצרי PCR
מוצרי PCR אומתו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 2%. מוצרי ה-PCR המשולבים מכל דגימה נטענו על הג'ל ואלקטרופורזה עד שרצועות המאמפליקון המטרה הופרדו בבירור. רצועות התואמות לגודל האמפליקון הצפוי נחתכו באמצעות להב סטרילי נקי וטוהרו באמצעות ערכת חילוץ ג'ל בהתאם להוראות היצרן המפורטות בטבלת החומרים. מוצרי PCR מטוהרים הושטשו לאחר מכן במים ללא נוקלאז. ריכוז כל מוצר PCR מטוהר נמדד באמצעות מערכת כימות DNA מבוססת פלואורסצנציה, וערכי הריכוז נרשמו להכנת ספרייה במורד הזרם. הגברה וטיהור מוצלחים אושרו על ידי פס אחד שקוף בגודל אמפליקון צפוי באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
הכנה ואיגוד ספרייה
ספריות הריצוף הוכנו באמצעות ערכת הכנת ספריית DNA בהתאם להוראות היצרן המפורטות בטבלת החומרים. רצפי מתאמי ריצוף חוברו למגברים המטוהרים בהתאם לתהליך ההכנה הסטנדרטי של הספרייה. מוצרים קשורים למתאם טוהרו לאחר מכן באמצעות חילוץ ג'ל או שיטת טיהור מבוססת חרוזים, בהתאם לפרוטוקול הכנת הספרייה שנבחר. מוצרי ספרייה מטוהרים הוערכו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 2% לאישור התפלגות מקטעים מתאימה. ריכוזי הספרייה נמדדו באמצעות מערכת כימות DNA מבוססת פלואורסצנציה. בהתבסס על ריכוז ה-DNA וגודל המקטעים, כל ספרייה נורמלה לאותו ריכוז מולר כדי להבטיח עומק ריצוף מאוזן בין הדגימות. כמויות מולריות שוות של ספריות בודדות אוחדו ביחס של 1:1 ליצירת מאגר ספריית הרצף הסופי. לפני ריצוף, הספרייה המאגדת עברה דטורציה לפי פרוטוקול פלטפורמת הריצוף לפני טעינת הדגימה. ספריות שנחשבו מתאימות לריצוף הציגו התפלגות ברורה של מקטעים בטווח הגודל הצפוי וריכוז מספק לניתוח ריצוף במורד הזרם.
רצף בקצה הזוגי
הספרייה המאגדת הסופית נטענה על פלטפורמת רצף זוג לפי נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של היצרן. ריצוף זוגות-קצה בוצע באמצעות תצורת ריצה של 2 × 250 bp או 2 ×-300 bp כדי להבטיח עומק ריצוף מספק לאפיון מקיף של המגוון המיקרוביאלי בכל דגימה. איכות הרצף נמדדה לאורך כל הריצה באמצעות מדדי איכות שנוצרו על ידי הפלטפורמה. לאחר השלמת הריצוף, קבצי FASTQ זווגים גולמיים יוצאו לכל דגימה לניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם. מערכי נתוני ריצוף נחשבו מקובלים כאשר הראו עומק קריאה מספק לכל מדגם, ציוני איכות מתאימים של Q30, והקצאת ברקוד מוצלחת.
עיבוד רצף גולמי
קבצי FASTQ גולמיים בקצה משולב יובאו לצינור ניתוח ביואינפורמטיקה מיקרוביום לעיבוד במורד הזרם. הרצפים פורקו על פי הברקודים שהוקצו לכל דגימה. לאחר מכן בוצעה סינון איכותי להסרת קריאות עם ציונים באיכות נמוכה, בסיסים מעורפלים או ארטיפקטים של ריצוף. בסיסים באיכות נמוכה שנמצאו בקצוות הקריאות קוצצו בהתבסס על חלוקת ציוני האיכות כדי לשפר את אמינות הרצף הכוללת. לאחר בקרת איכות, קריאות בקצה הזוגי אוחדו בין אזורים חופפים לשחזור רצפים באורך מלא. רק רצפים ממוזגים איכותיים נשמרו לניתוחי מיקרוביום מאוחרים יותר.
יצירת וריאנט של רצף אמפליקון (ASV) ואנוטציה טקסונומית
הסרת רעש ברצף בוצעה באמצעות אלגוריתם הסרת רעש מאומת, כולל DADA2 או Deblur, לתיקון שגיאות ריצוף ושיפור דיוק הרצף. רצפים כימריים זוהו והוסרו במהלך תהליך הסרת הרעשים. רצפי ASV מייצגים וטבלאות שפע ASV מתאימות נוצרו לאחר מכן עבור כל דגימה. הקצאה טקסונומית של רצפי ASV בוצעה באמצעות מסווג Naive Bayes, ובוצעה אנוטציה טקסונומית מול מסד הנתונים SILVA 138. טבלאות שפע טקסונומיות יוצאו ברמות הפילום, המשפחה והסוג לניתוח במורד הזרם. מאגר הנתונים הסופי של ASV כלל רצפים מייצגים, מידע על שפע, והערות טקסונומיות מתאימות לכל מדגם.
ניתוח גיוון אלפא ובטא
מדדי גיוון אלפא, כולל מדדי Chao, ACE, שאנון, סימפסון ו-Cover, חושבו להערכת גיוון ועושר מיקרוביאלי בתוך המדגם. מדדי גיוון אלפא הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ±. נורמליות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן שפירו–וילק. משתנים מבוזרים נורמלית הושוו בין קבוצות DM ו-NM באמצעות מבחני t של סטודנט, בעוד שמשתנים לא מבוזרים נורמלית נותחו באמצעות מבחני סכום דירוג של וילקוקסון. מרחקי מגוון בטא חושבו לאחר מכן באמצעות מטריצת מרחקים מתאימה להערכת הבדלים בהרכב קהילות מיקרוביאליות בין הדגימות. ניתוח קואורדינטות עיקריות (PCoA) בוצע כדי להמחיש הבדלים במבנה הקהילה המיקרוביאלית בין קבוצות. בנוסף, בוצע ניתוח דמיון (ANOSIM) כדי לקבוע האם ההבדלים בין הקבוצות עולים על השונות התוך-קבוצתית, ודווחו ערכי ANOSIM R ו-p המתאימים. ניתוח גיוון אלפא שיקף את המגוון המיקרוביאלי בתוך המדגם, בעוד שניתוח גיוון בטא העריך הבדלים בהרכב קהילות מיקרוביאליות בין קבוצות.
ניתוח טקסונומי דיפרנציאלי
הרכב הקהילה המיקרוביאלית סוכם ברמות הפילום, המשפחה והסוג. נוצרו גרפים של עמודים מצטברים כדי להמחיש את השפע היחסי של טקסונים דומיננטיים בין מדגמים בודדים וקבוצות מחקר. עקומות Pan/Core ודיאגרמות Venn נבנו בהמשך כדי להשוות ASV משותף וספציפי לקבוצה בין קבוצות DM ו-NM. ההבדלים בשפע הטקסונים בין קבוצות הוערכו באמצעות מבחני דירוג סכום וילקוקסון. ניתוח LEfSe בוצע לאחר מכן לזיהוי טקסונים מיקרוביאליים שתרמו הכי הרבה לאבחנה בין קבוצות. ניתוח טקסונומי דיפרנציאלי אפשר זיהוי טקסונים מיקרוביאליים המועשרים בקבוצת DM או NM.
חיזוי פונקציונלי
PICRUSt2 או צינור חיזוי פונקציונלי מאומת שווה ערך שימש להסקת מסלולים פונקציונליים מיקרוביאליים מפרופילי ריצוף 16S rDNA. נתוני השפע של ASV ננורמו בהתאם לדרישות צינור האנליט הנבחר, והפונקציות החזויות מופו להערות מסלול KEGG או MetaCyc. שפע המסלול החזוי הושוו לאחר מכן בין קבוצות DM ו-NM. מסלולים שונים באופן משמעותי הוצגו באמצעות מפות חום או גישות גרפיות מתאימות אחרות. הפונקציות החזויות פורשו כפוטנציאל מטבולי מיקרובי מוסכם ולא ככמות מטבוליטים שנמדדה ישירות. ניתוח חיזוי פונקציונלי אפשר זיהוי מסלולים מיקרוביאליים מועמדים השונים בין קבוצות, כולל מסלולים הקשורים למטבוליזם פחמימות וחומצות אמינו.
ניתוח רנדומיזציה מנדלית
סטטיסטיקות סיכום מחקר אסוציאציה גנומי (GWAS) עבור מיקרוביום המעי התקבלו ממאגרי נתונים זמיניםלציבור 10. נתוני אסוציאציה משמעותיים ברחבי הגנום עבור טקסונים מיקרוביאליים נאספו מקטלוג NHGRI-EBI GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) באמצעות מספרי גישה שנעו בין GCST90032172 ל-GCST90032644. נתונים מטאגנומיים נוספים נלקחו מקבוצת FINRISK 2002 דרך הארכיון האירופי לגנום-פנום (מזהה מחקר: EGAS00001005020). סטטיסטיקות סיכום של GWAS עבור סוכרת סוג 2 התקבלו גם מקטלוג NHGRI-EBI GWAS (מספר גישה: EBI-A-GCST006867). וריאנטים גנטיים הקשורים לטקסונים מיקרוביאליים נבחרו כמשתנים אינסטרומנטליים בהתאם לספים סטטיסטיים מוגדרים מראש, ווריאנטים בחוסר שיווי משקל קישורי הוצאו. מאגרי הנתונים של חשיפה ותוצאה שולבו כדי להבטיח כיוון אללים עקבי. ניתוח רנדומיזציה מנדלית בוצע לאחר מכן באמצעות שיטת השונות המשוקללת ההפוכה (IVW) כגישה האנליטית העיקרית. ניתוחי רגישות נערכו באמצעות MR-Egger ושיטות חציון משוקלל. עוצמת המכשיר הוערכה באמצעות סטטיסטיקת F, בעוד שהטרוגניות בין משתנים אינסטרומנטליים הוערכה באמצעות מבחן Q של קוקרן. פליאוטרופיה אופקית נבדקה באמצעות מבחן יירוט MR-Egger. תיקון בונפרוני יושם כדי להתחשב בהשוואות מרובות. ממצאי רנדומיזציה מנדלית פורשו כקשרים חזויים גנטית ולא כהוכחה חד-משמעית לסיבתיות.
פלט נתונים ונקודת קצה
התוצרים האנליטיים הסופיים כללו טבלאות שפע של ASV, גרפים של הרכב טקסונומי, מדדי גיוון אלפא, ניתוחי גיוון בטא, תוצאות טקסונומיות דיפרנציאליות, פרופילי מסלולים פונקציונליים חזויים, והערכות אקראיות מנדליאניות. כל מזהי המדגם במאגרי הריצוף אומתו כדי להבטיח עקביות עם קודי המחקר הלא מזוהים המתאימים. קבצי ריצוף גולמיים, טבלאות ASV מעובדות, פלטים סטטיסטיים וקבצי מקור איורים נשמרו לארכיון לניתוח וניהול נתונים במורד הזרם. הפרוטוקול נחשב שלם לאחר שנתוני ריצוף איכותיים, פרופילים טקסונומיים, מדדי גיוון, ניתוחי מסלולים פונקציונליים חזויים ותוצאות אקראיות מנדליאניות נוצרו ואומתו בהצלחה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאפיינים דמוגרפיים וקליניים בסיסיים של הקבוצה הקלינית שנבדקה לראשונה מוצגים בטבלה 1. תת-קבוצה מייצגת שכללה 12 משתתפים חדשים עם סוכרת סוג 2 ו-12 משתתפים ב-NM נבחרה לאחר מכן לריצוף 16S rDNA וניתוחי מיקרוביום במורד הזרם.
הערכת עומק רצף
מדד שאנון חושב, ועקומת ההתפצלות צוירה כדי להעריך את עומק הרצף. סך הכל זוהו 1,064,930 רצפים בכל הדגימות, המכסים 4,770 ASVs, מה שמעיד על עושר קהילתי גבוה. כל העקומות היו ש...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בשנים האחרונות, המיקרוביום האנושי, ובמיוחד המיקרוביום של המעי, הפך לגורם מורכב ומשפיע במטבוליזם של המארח, בוויסות החיסון ובהתפתחות מחלות. במארח בריא, המיקרוביום של המעי תורם להומאוסטזיס חיסוני ולשלמות מחסום המעי11. דיסביוזה נקשרה למגוון מצבים פתולוגיים, כולל הפרעות מטבוליות, מחלות אוטואימוניות וממאירויות 12,13,14,15,16.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להיחשב כניגוד עניינים פוטנציאלי.
תרומות המחברים:
לינרוי שיה וקממאו צ'ן ביצעו ניתוח נתונים וניסחו את כתב היד. שיקאן פאן השתתפה באיסוף דגימות ובהליכים ניסיוניים. שואמיי ג'ונג ושיאויו לי תכננו את המחקר, פיקחו על הפרויקט וערכו את כתב היד באופן ביקורתי. כל המחברים בדקו ואישרו את כתב היד הסופי.
המחברים מודים לכל המשתתפים והצוות המעורבים באיסוף דגימות ועיבוד נתונים על תרומתם למחקר זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | רצף אוניברסלי לבקטריה של אזור 16S |
| 80 °C Freezer | Haier Biomedical | DW-86L626 | אחסון דגימות לטווח ארוך |
| Agarose Gel System (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | אימות מוצר PCR |
| AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | טיהור DNA ובחירת גודל |
| Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | ליזה מכנית של תאים מיקרוביאליים |
| Bioinformatics Workstation | Dell | Precision 7920 | ניתוח נתונים באמצעות QIIME2 ו-R |
| DADA2 pipeline | Bioconductor | Version 1.28 | ניקוי רעש רצף ויצירת ASV; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Version 2023.5 | ניקוי רעש רצף ותיקוון שגיאות; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | מאגר מטאגנומי ציבורי; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accessions GCST90032172–GCST90032644 | מאגר ציבורי של סטטיסטיקות סיכום אסוציאציה גנומית רחבה; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq Sequencing System | Illumina | SY-410-1003 | פלטפורמת רצף תפוקה גבוהה |
| KEGG database | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Release 107 | מאגר ביאורים של מסלולי תפקוד; https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc database | SRI International | Version 27.1 | מאגר מסלולי מטבולי; https://metacyc.org |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | צנטריפוגה קירור להכנת דגימות |
| Nextera XT Library Prep Kit | Illumina | 20018705 | הכנת ספריה לרצף |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | ל-PCR מדויק מאוד |
| PCR Thermocycler | Bio-Rad | T100 | מכשיר להגברה ב-PCR |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Version 2.5.2 | חיזוי מסלולי תפקוד מ-rDNA של 16S; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | חילוץ DNA מדגימות צואה |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | טיהור DNA מג'ל אגרוז |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | כימות DNA |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.1 | ניתוח סטטיסטי וניתוח רנדומיזציה מנדלית; https://www.r-project.org |
| SILVA 138 database | SILVA ribosomal RNA database project | Release 138 | מאגר התייחסות לביאור טקסונומי; https://www.arb-silva.de |
| Stool Collection Tube | Sarstedt | 76.9923.001 | צינור לאיסוף דגימת צואה סטרילית |
| Stool DNA Kit | Omega | D4015-02 | ערכת חילוץ DNA |
| TwoSampleMR package | MR-Base | Version 0.5.7 | ניתוח רנדומיזציה מנדלית ב-R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |