ניתוח טרנסקריפטומי חושף תת-קבוצות מונעות על ידי מיטוכונדריה בנגעים אטופיים של דרמטיטיס

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

ניתוח טרנסקריפטומי חושף תת-קבוצות מונעות על ידי מיטוכונדריה בנגעים אטופיים של דרמטיטיס

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרמטיטיס אטופית (AD) היא מחלת עור דלקתית כרונית עם הטרוגניות מולקולרית משמעותית. מחקר זה מזהה שתי תת-קבוצות AD מובחנות מבחינה טרנסקריפטומית, המונעות על ידי ביטוי גנים שונה של מיטוכונדריה וחדירה חיסונית, וחושף ארבעה גנים מרכזיים כביוסמנים פוטנציאליים לסטרטיפיקציה של מטופלים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרמטיטיס אטופית (AD) היא מחלת עור דלקתית שכיחה וכרונית, עם שכיחות עולמית. ההטרוגניות הקלינית והמנגנונים המולקולריים המורכבים שלה מציבים אתגרים משמעותיים לפיתוח טיפולים יעילים. לחקור הטרוגניות מולקולרית של AD באמצעות נתוני טרנסקריפטומיה של עור נגעי, לאפיין את הפרופילים הביולוגיים והחיסוניים שלהם, ולזהות גנים מרכזיים שמאחורי ההבדלה. גנים שהובאו באופן שונה זוהו באמצעות DESeq2, ואחריהם ניתוחי מסלול וביטוי משותף באמצעות GSEA ו-WGCNA, בהתאמה. גנים הקשורים למיטוכונדריה הופקו על ידי הצטלבות מודולי DEGs ו-WGCNA עם מאגר הנתונים MitoCarta3.0, והרלוונטיות התפקודית שלהם הוערכה באמצעות העשרת GO ו-KEGG. גני Hub זוהו באמצעות ניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון, אשר שימשו לאחר מכן לבניית מודל סיווג. רגולטורים שעתוקיים נחזו באמצעות hTFtarget, בעוד שהחדירה של תאי החיסון נמדדה באמצעות CIBERSORT. זוהו שתי תת-קבוצות מולקולריות. אשכול 1 היה מועשר באיתות תאים ובמסלולי הידבקות, בעוד שאשכול 2 הראה עלייה בוויסות של פוספורילציה חמצונית ותהליכים הקשורים לפרוטאזום. בסך הכל 85 גנים הקשורים למיטוכונדריה, המעורבים בעיקר במטבוליזם אנרגיה, בוטאו באופן שונה בין אשכולות. ניתוח רשת PPI זיהה ארבעה גני hub (BAD, BOLA1, CHCHD5 ו-ISOC2), אשר היו מוגברים משמעותית באשכול 1. מסווג מבוסס גן hub הראה כוח הבחנה חזק (שטח מתחת לעקומה > 0.7). הרגולטורים המרכזיים של שעתוק צפויים כללו ATF3, BRD2, BRD4 ו-CEBPA. פרופילינג חיסוני חשף חדירת תאי T רגולטורית גבוהה יותר באשכול 1 ועלייה בתאי T עוזרים זקיקים באשכול 2. מחקר זה חושף שני תת-סוגים מולקולרית ואימונולוגית מובחנים של AD, המאופיינים בתפקוד מיטוכונדריה שונה ובחתימות מיקרו-סביבה חיסונית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרמטיטיס אטופית (AD) היא מחלת עור דלקתית שכיחה וכרונית, המשפיעה על עד 20% מהילדים ו-10% מהמבוגרים¹. הוא מאופיין בגירוד עז ובנגעים אקזמטיים חוזרים². קלינית, AD נובע מאינטראקציה דינמית של רגישות פוליגנית (למשל, מוטציות של אובדן תפקוד ב-FLG), חוסר ויסות חיסוני, וחשיפות סביבתיות כמו לחות נמוכה ודיסביוזה מיקרוביאלית³. בעוד של-AD יש כמה תכונות פתופיזיולוגיות חולקות עם פסוריאזיס, ההופעות הקליניות שלהן הן סותריות, עם השפעות גנטיות שונות במסלולים משותפים ושינויים חיסוניים מובחנים⁴.

AD היא מחלה הטרוגנית, המאופיינת בפרופילי טרנסקריפטום מגוונים בקבוצות מטופלים שונות ותסמיני מחלה⁵. ניתוחים משולבים של רקמות עור ותאי דם מונו-גרעיניים היקפיים הראו כי תכונות קליניות כמו אדמומיות ופפולציה קשורות לחתימות אימונולוגיות מובחנות, המשקפות את האינטראקציה בין העור המקומי לתגובות החיסוניות המערכתיות⁶. מחקרים טרנסקריפטומיים רחבי היקף מדגישים עוד יותר את תפקיד מסלולי IL-13 בפתוגנזה של AD, בעוד ש-AD מציג הטרוגניות מולקולרית גבוהה יותר מפסוריאזיס, עם שינויים בדפוסי ביטוי גנים הקשורים לחומרת המחלה, גיל ההופעה ורקע גנטי ^5,7. הבדלים אלו מדגישים את המורכבות של פתוגנזה של AD ואת הצורך בגישות מותאמות אישית במחקר ובטיפול.

חלבוני מיטוכונדריה ממלאים תפקיד חשוב בפתוגנזה של AD דרך לחץ חמצוני לא מבוקר ומסלולי מטבוליזם. מחקרים מגלים עלייה בפעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי I ו-II בקרטינוציטים לא-נגעיים של AD, מה שמוביל לחמצון יתר של חומצות שומן ארוכות שרשרת ולייצור ROS מוגבר, מה שמגביר את תפקוד המחסום האפידרמלי ^8,9. במקביל, ניתוחים פרוטאומיים מזהים חלבונים ממופחדים במסלול NRF2-נוגדי חמצון ורכיבים מיטוכונדריאליים באפידרמיס AD, ומפחיתים את רזולוציית הלחץ החמצוני¹⁰. נזק ל-DNA מיטוכונדריאלי תורם עוד יותר לתגובות דלקתיות, בעוד שהתערבויות כמו שימוש בנוגדי חמצון ממוקדים למיטוכונדריה מראות יעילות בשיקום ההומאוסטזיס האפידרמלי על ידי הפחתת ROS^11,12. ממצאים אלו מדגישים את החלבונים המיטוכונדריאליים הן כמניעים לפתולוגיית AD והן כמטרות טיפוליות פוטנציאליות.

ניתוחי טרנסקריפטום עדכניים של AD קידמו משמעותית את ההבנה של הארכיטקטורה הגנטית וההטרוגניות המולקולרית שלו. הפרופיל הראשון של ריצוף RNA של AD חשף את הביטוי המוגבר במסלול TREM-1 ובציטוקין IL-36¹³. ניתוח רשת ביטוי משותף של גנים משוקלל המבוסס על פרופיל ביטוי גנים חשף עוד מודולים מולקולריים וגנים מרכזיים מובחנים, כגון HSPA4, LCE3E ו-LCE3D, שמארגנים תגובות דלקתיות וקרטיניזציה, ומדגיש מטרות טיפוליות פוטנציאליות¹⁴. מחקרים אלו מדגישים את הערך של טרנסקריפטומיקה רב-רקמתית ומודלים של סיכון פוליגני בשיפור חיזוי המחלות ובגילוי היסודות המורכבים של AD. עם זאת, מחקרים קיימים התמקדו בעיקר בטרנסקריפטומיקה הכוללת של AD מבלי לפתור במפורש את תפקיד הגנים המיטוכונדריאליים בהגדרת תת-קבוצות מולקולריות. המחקר הנוכחי מתקדם מעבר לניתוחים טרנסקריפטומיים קודמים על ידי שילוב מאגרי נתונים מרובים של GEO לזיהוי תת-קבוצות של AD מבוססות אשכולות קונצנזוס וחיתוך שיטתי של גנים מבוטאים באופן שונה, מודולי WGCNA וקטלוג גנים מיטוכונדריאלי מאושר, כדי לאתר גנים מיטוכונדריאליים מרכזיים שמגדירים זהות תת-קבוצה ועשויים לשמש כסמנים ביולוגיים חדשים.

עם ההשערה שעור הפריהמה הנגעי מכיל תת-קבוצות טרנסקריפטומיות מולקולרית מובחנות, המאופיינות בביטוי גנים מיטוקונדריאלי שונה, מה שעשוי לתמוך בהטרוגניות הקלינית של AD. כדי לבדוק זאת, המחקר שילב נתוני ריצוף RNA ממחקרים שפורסמו ואסף נתוני ביטוי גנים של דגימות עור נגעים מ-266 חולי AD. תתי-קבוצות מולקולריות זוהו בהתבסס על קיבוץ קונצנזוס של ביטוי גנים, והבואה הגנטית הושווה בין שתי תת-הקבוצות המולקולריות. הגנים שמניעים את ההבדל הזה מראים העשרה פונקציונלית באיתות תאים ובפוספורילציה חמצנית. יתרה מזאת, נבדקו גנים מיטוכונדריאליים שמבדילים בין שתי הקבוצות המולקולריות, וגנים מרכזיים זוהו בתוך רשת אינטראקציה חלבון-חלבון. ממצאים אלו מדגישים את ההטרוגניות הגנטית של מחלת אלייזם ומרחיבים את הידע על תפקידי חלבוני המיטוכונדריה בפתולוגיה של AD.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה השתמש במאגרי ביטוי גנים זמינים לציבור ממאגר Gene Expression Omnibus (GEO). לא נאספו נתונים מזוהים על ידי מטופלים, ולא נאספו דגימות חדשות של מטופלים. לכן, לא נדרשה אישור ועדת ביקורת מוסדית (IRB) או הסכמת מטופל לניתוח משני זה של נתונים זמינים לציבור. התוכנה ומאגרי המידע בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1 נתונים ומשאבים

נתוני טרנסקריפטום של חולי דרמטיטיס אטופי (AD) התקבלו ממאגר GEO, כולל ארבעה מחקרים: GSE121212 (N = 55⁾⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ ו-GSE277961 (N = 43)¹⁷. כל מערכי הנתונים הכילו נתוני ספירה גולמיים או מנורמלים מראש מביופסיות עור נגעיות. מטריצות ספירה גולמיות הורדו ושולבו בין מחקרים. השפעות אצווה במחקרים צולבות תוקנו באמצעות שיטת ComBat-seq (חבילת sva R, v3.44.0) כדי לאזן פרופילי ביטוי בין ארבעת מערכי הנתונים GEO לפני ניתוח הזרם המורד. כל ארבעת מערכי הנתונים מבוססים על RNA-seq שבוצע על דגימות ביופסיה של עור אנושי והותיאם לגנום הייחוס האנושי GRCh38 באמצעות צינורות ספציפיים למחקר. כימות ביטוי ברמת הגן בוצע באמצעות אנוטציה גנטית של Ensembl (v105).

2 קיבוץ קונצנזוס

קיבוץ קונצנזוס לא מפוקח בוצע באמצעות חבילת ConsensusClusterPlus R (v1.64.0)¹⁸ כדי לסווג 266 דגימות עור נגעיות של חולי AD בהתבסס על פרופילים טרנסקריפטומיים. לפני השיכול, נתוני ספירה גולמיים מכל המחקרים אוחדו, והשפעות האצווה בין מחקרים תוקנו באמצעות פונקציית removeBatchEffect מחבילת הלימה. נתוני ביטוי הגנים עברו לאחר מכן טרנספורמציה מייצבת שונות (VST) באמצעות DESeq2 וסוננו כדי לשמור על 5,000 הגנים המשתנים המובילים. הקיבוץ בוצע באמצעות אשכולות היררכיים עם קורלציה של פירסון וקישור ממוצע ב-1,000 איטרציות, תוך דגימה תת-ממדית של 80% מהדגימות בכל איטרציה. המספר הטוב ביותר של אשכולות (k נע בין 2 ל-10) נקבע על ידי הערכת פונקציית ההתפלגות המצטברת הקונצנזוס (CDF), גרפים של אזור דלתא וציוני קונצנזוס בין אשכולות. האשכולות שהתקבלו אומתו באמצעות מפות חום קונצנזוס ו-PCA ושימשו בניתוחים ביולוגיים וקליניים במורד הזרם.

3 ניתוח ביטוי גנים שונה

רמות ביטוי הגנים הושוו בין תת-קבוצות מולקולריות באמצעות חבילת DESeq2 R (v1.46.0)¹⁹. נתוני ספירה גולמיים הוזנו כדי להעריך פיזור גנטי ולהתאים למודל בינומי שלילי. גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) זוהו באמצעות מבחן וולד, והתוצאות סוננו באמצעות סף מובהקות של ערך p מותאם < 0.01 ושינוי מוחלט ב-log2 פי > 1.

4 ניתוח העשרת קבוצות גנים

ניתוח העשרת מערך גנים (GSEA) בוצע באמצעות חבילת clusterProfiler R (v4.12.6)²⁰. כל הגנים דורגו לפי שינוי log2 כפול שלהם בניתוח הביטוי הדיפרנציאלי, ופונקציית ה-GSEA יושמה עם פרמטרים eps = 0, minGSSsize = 10, ו-maxGSSsize = 500, בעוד שהגדרות אחרות נשמרו כברירת מחדל. העשרה בוצעה נגד קבוצות הגנים MSigDB Hallmark. לכל אשכול מולקולרי (אשכול 1 ואשכול 2), שלושת המסלולים המועשרים העליונים נבחרו על בסיס ערך p נומינלי וציון ההעשרה המנורמל (NES). התוצאות הוצגו באמצעות חבילת GseaVis R (v0.1.0)²¹.

5 ניתוח רשת ביטוי משותף של גנים משוקללים

WGCNA בוצע על פרופיל ביטוי הגנים של חולי AD כדי לזהות מודולי הבעה משותפת גנטית הקשורים לזהות תת-הסוג הטרנסקריפטומי באמצעות חבילת R WGCNA (v1.73)²². הגנים עברו סינון כדי לשמור על 75% העליונים עם השונות הגבוהה ביותר בכל הדגימות. רשת קו-ביטוי חתומה נבנתה באמצעות הספק סף רך שנבחר מ-1 עד 30 כדי להעריך טופולוגיה חופשית בקנה מידה. מודולי גנים זוהו באמצעות אשכולות היררכיים וכריתת עצים דינמית. אסוציאציות מודול-תכונה נחקרו על ידי קישור בין אורגנים עצמיים מודולים מבוטאים יחד עם תוויות תת-הסוג המולקולרי, ומודולים שהראו קורלציה משמעותית (p < 0.05) עם תת-הסוג המולקולרי נבחרו לניתוח במורד הזרם.

6 חלבוני מיטוכונדריה בתת-קבוצות מולקולריות של AD

כדי לזהות גנים הקשורים למיטוכונדריה בתוך מודולי DEGs ו-WGCNA, קבוצות גנים אלו חופפו עם רשימת החלבונים המיטוכונדריאלית שנאספה מ-MitoCarta3.0²³. הגנים המצטלבים נחשבו לחלבונים מיטוכונדריאליים פוטנציאליים הרלוונטיים להקשר מחלת האזהרום.

7 אונטולוגיית גנים וניתוח העשרת KEGG

לזהות את תפקודי התאים המרכזיים והתהליכים הביולוגיים שמבדילים בין תת-קבוצות מולקולריות. בוצעו ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG עבור גנים הקשורים למיטוכונדריה באמצעות clusterProfiler. העשרת GO בוצעה בנפרד עבור קטגוריות תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF) באמצעות פונקציית enrichGO עם OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "ALL", ופרמטרים ברירת מחדל. העשרת מסלול KEGG בוצעה באמצעות פונקציית enrichKEGG, כאשר האורגניזם מוגדר ל-"has". מונחים מועשרים עם ערך p מותאם < 0.05 נחשבו למשמעותיים.

8 רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון

85 DEGs וגנים מיטוכונדריאליים הקשורים ל-AD חופפים נשאלו במסד הנתונים STRING (https://string-db.org)²⁴ כדי לאסוף PPIs ידועים וחזויים. ניתוח טופולוגיית רשת בוצע באמצעות שבעה מדדים (דרגה, קרבה, בין, וקטור עצמי, PageRank, Hub ו-Authorities) כדי לדרג את חשיבות הצומת של כל חלבון. נבחרו 30 הגנים המדורגים ביותר בכל מדד, והצמתים בין כל שבע הגישות הוצגו באמצעות גרף UpSet. ארבעת הגנים החוצים מהמדדים שימשו לבניית מודל סיווג המבוסס על רמות ביטוי הגנים שלהם. דיוק המודל, רגישות, ספציפיות ושטח תחת עקומת ROC (AUC) חושבו להערכת ביצועי הסיווג.

9 ניתוח ויסות שעתוק

מאגר הנתונים hTFtarget (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ נבדק כדי לשחזר אינטראקציות TF-יעד הנתמכות ניסויים עבור ארבעה גנים מצטלבים בצומת Hub. רשת הוויסות של גן TF שנוצרה נבנתה והוצגה באמצעות חבילות igraph²⁶ ו-ggraph²⁷ R.

10 ניתוח חדירת תאי RNA-seq בכמויות גדולות

אלגוריתם CIBERSORT²⁸ (https://cibersort.stanford.edu/) שימש להערכת היחסים היחסיים של 22 סוגי תאי חיסון בנתוני טרנסקריפטום עור נגעי. נתוני ביטוי גנים מנורמלים הוזנו ל-CIBERSORT (v0.1.0) יחד עם מטריצת החתימה LM22. הניתוח בוצע עם 1,000 פרמוטציות ונרמול קוונטילי מושבת. דגימות עם ערכי p-output של CIBERSORT < 0.05 נשקלו לניתוח במורד הזרם. חלקי תאי החיסון המוערכים הושוו בין תת-קבוצות מולקולריות באמצעות מבחן סכום דירוג של וילקוקסון עם תיקון FDR להשוואות מרובות בין 22 סוגי תאי החיסון (p.adjust.method = "FDR"), והתוצאות הוצגו באמצעות תרשימי קופסה באמצעות חבילת ggplot2²⁹ R.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תת-קבוצות שעתוק בדרמטיטיס אטופי

נתוני RNA-seq מ-266 דגימות חולי AD נותחו כדי לבדוק הטרוגניות שעתוק בתוך המחלה. לאחר בקרת איכות ותיקון של השפעות אצווה במספר מחקרים, קיבוץ קונצנזוס לא מפוקח חשף שתי תת-קבוצות מולקולריות מובחנות (איור 1A). יציבות האשכולות ומספר האשכול האופטימלי הוערכו באמצעות תרשים פונקציית ההתפלגות המצטברת (CDF) (איור 1B), תרשים שטח דלתא (איור 1C), ומפת חום מטריצת קונצנזוס (איור 1D). יחד, תוצאות אלו תומכות בקיומם של שני תת-סוגים שעתוקיים חזקים ב-AD, המשקפים את ההטרוגניות הגנטית הבסיסית.

גנים מבוטאים באופן שונה בין תת-קבוצות של AD

תרשים t-SNE המבוסס על מטריצת ביטוי גנים מנורמלת אימת עוד יותר את תת-הקבוצות השעתוקיות שזוהו על ידי קיבוץ קונצנזוס. תרשים t-SNE חשף שני אשכולות מופרדים היטב, שכל אחד מהם תואם לאחת מתת-הקבוצות שהוגדרו קודם (איור 2A), התומכים בקיומם של פרופילים מולקולריים מובחנים בקרב חולי AD. הביטוי הדיפרנציאלי בין שתי תת-הקבוצות נותח לאחר מכן באמצעות DESeq2, עם סף p מותאם < 0.01 ו-|log₂ שינוי קפל| > 1. תרשים הר געש שהתקבל (איור 2B) הראה גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs), המצביעים על התפצלות שעתוק חזקה. עשרת הגנים המוסדרים ביותר הם ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN ו-AHNAK באשכול 1 ו-C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D ו-PMPCA באשכול 2 (איור 2C).

קבוצת גנים קשורה לתת-קבוצה של AD

ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) חשף פרופילי העשרה פונקציונליים מובחנים בין שני אשכולות הטרנסקריפטומיים (איור 3A). אשכול 1 הראה העשרה משמעותית במסלולים המעורבים באיתות תא ובהידבקות, כולל הידבקות מוקדית (איור 3B) ומסלול איתות MAPK (איור 3C), מה שמרמז על מצב פעיל המאופיין באינטראקציות משופרות בין תא-תא-מטריצה חוץ-תאית והתפשטות. לעומת זאת, אשכול 2 הראה העשרה חזקה לזרחון חמצוני (איור 3D) ולתפקוד פרוטאזום (איור 3E), מה שמרמז על פנוטיפ מטבולי חמצוני ופרוטאוליטי פעיל.

גנים מבוטאים יחד בקבוצות מולקולריות של AD

כדי לזהות מודולי קו-ביטוי הקשורים לתת-סוגים טרנסקריפטומיים, בוצעה WGCNA לאחר עיבוד נתונים מוקדם. דגימות חריגות זוהו והוסרו תחילה בהתבסס על קיבוץ היררכי של מרחקי הדגימה כדי להבטיח עמידות בבניית הרשת במורד הזרם (איור 4A). לאחר מכן נבחר עוצמה עם סף רך באמצעות קריטריון הטופולוגיה ללא קנה מידה, כאשר החזקה של 6 נבחרה להשגת R² ללא סקאלה > 0.85 (איור 4B). מודולי גנים זוהו באמצעות אשכולות היררכיים וכריתת עצים דינמית, ואחריהם אשכולות גנים עצמיים למיזוג מודולים קרובים זה לזה (איור 4C ואיור 4D). רשת הגנים שהתקבלה הוצגה באמצעות מפת חום של חפיפה טופולוגית, המאשרת את קיומם של דפוסי הבעה משותפים מובחנים (איור 4E). ניתוח יחסי מודול-תכונה חשף מתאם חזק ומשמעותי בין מודול MEyellow (_גן N = 743) לתת-הקבוצה המולקולרית (איור 4F).

העשרה פונקציונלית של גנים מיטוכונדריאליים הקשורים לתת-הקבוצה ל-AD

לאחר מכן בוצע ניתוח העשרת GO ו-KEGG על הגנים המצטלבים (N = 85) בין DEGs, גנים במודול MEyellow, ורשימת חלבונים מיטוכונדריאליים מ-MitoCarta3.0 (איור 5A) כדי לחקור את התפקידים הפונקציונליים של גנים הקשורים למיטוכונדריה שמניעים את ההבדלים השעתוקיים בין אשכולות. ניתוח מסלולי KEGG זיהה העשרה בזרחון חמצוני ובמסלולים מטבוליים (איור 5B). ניתוח העשרת GO חשף ייצוג יתר משמעותי של מונחים הקשורים לתפקוד מיטוכונדריאלי, כולל סינתזת ATP מונעת כוח של פרוטונים, קומפלקס שרשראות נשימתיות ופעילות דה-הידרוגנאז של NADH (איור 5C), מה שמרמז כי גנים אלו קשורים בעיקר למטבוליזם של אנרגיה מיטוכונדרית ולוויסות אנרגיה.

גנים מיטוכונדריאליים מרכזיים בהבדלה מולקולרית של AD

כדי לזהות את הגנים המרכזיים ב-85 הגנים הקשורים לתת-קבוצה של טרנסקריפטום מיטוכונדריאלי, נבנתה רשת PPI (איור 6A). בהתבסס על הדירוג בכל אחד משבעת המדדים הטופולוגיים (ראו שיטות), נבחרו 30 הגנים המובילים, והחיתוכים שלהם נותחו והוצגו בגרף UpSet (איור 6B). ניתוח זה הוביל לכך שארבעה גני hub זוהו בעקביות כצמתים מרכזיים בהתבסס על כל קריטריוני הדירוג (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2). פרופילי הביטוי שלהם נבדקו בשני אשכולות הטרנסקריפטומיים ונמצאו שכל ארבעת גני המרכז היו מוגברים משמעותית באשכול 1 לעומת אשכול 2 (איור 6C). ניתוח מתאם ביטוי גנים זוגי הראה מתאמים חיוביים בין כל ארבעת הגנים, מה שמעיד על ויסות מתואם, כאשר CHCHD5 ו-ISOC2 הציגו את המתאם החזק ביותר (איור 6D). יתרה מזאת, מודל סיווג שבנינו באמצעות ביטוי של ארבעת הגנים הללו הראה עוצמה מובחנת חזקה בין שני האשכולות, כאשר עקומת ROC הראתה שטח מתחת לעקומה (AUC) > 0.7 (איור 6E). בנוסף, בוצע ניתוח רשתות רגולטוריות של פקטור שעתוק (TF) כדי לחקור את המנגנונים הרגולטוריים השולטים בביטוי ארבעת הגנים המרכזיים שזוהו. כל גורמי השעתוק הידועים והחזויים שעשויים לווסת את גני המרכז הללו נשאלו מ-hTFtarget, והתוצאות שולבו והוצגו כרשת רגולציה שעתוקית (איור 7). ברשת רגולציה של גני TF-hub, ל-BAD היה המספר הגבוה ביותר של גני TF, ו-ATF3, BRD2, BRD4 ו-CEBPA כל אחד מהם אינטראקציה עם כל ארבעת גני האב, מה שמרמז על מנגנון ויסות משותף.

השוואת חדירת תאי חיסון בין תת-קבוצות של AD

כדי לחקור את הנוף האימונולוגי הקשור לתת-הקבוצות הטרנסקריפטומיות, בוצע ניתוח חדירת תאי חיסון באמצעות CIBERSORT, שמעריך את היחסים היחסיים של 22 סוגי תאי חיסון בהתבסס על נתוני טרנסקריפטום נרחבים (איור 8). מבין תת-הקבוצות החיסוניות, תאי T רגולטוריים (Tregs) נמצאו נפוצים משמעותית יותר באשכול 1, מה שמרמז על מיקרוסביבה מדכאת חיסון שעשויה להיות קשורה לפעילות מיטוכונדריאלית ולמסלולי איתות מווסתים בקבוצה זו. לעומת זאת, תאי T עוזרים זקיקים הועשרו משמעותית באשכול 2, מה שמעיד על תגובה חיסונית אדפטיבית פעילה יותר בתת-קבוצה זו.

זמינות נתונים:

הנתונים הטרנסקריפטומיים שנותחו במחקר זה זמינים לציבור במאגר Gene Expression Omnibus (GEO) תחת מספרי גישה GSE121212, GSE157194, GSE193309 ו-GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

figure-results-1
איור 1: קיבוץ קונצנזוס של דגימות נגע אטופי דרמטיטיס בהתבסס על פרופילים טרנסקריפטומיים. (א) מפת חום ואשכול היררכי של מטריצת הקונצנזוס בין דגימות דרמטיטיס אטופיות (AD). (B) גרף פונקציית התפלגות מצטברת קונצנזוס (CDF) המשמש לקביעת מספר האשכולות האופטימלי (k = 2–10). (ג) תרשים שטח דלתא המראה את השינוי היחסי בשטח מתחת לעקומת ה-CDF עבור כל k. (D) הקצאת אשכולות קונצנזוס עבור k = 2. כל עמודה מייצגת מדגם בודד, והצבעים מציינים חברות באשכול (אשכול 1, אדום; אשכול 2, טורקיז). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: ביטוי גנים שונה של תת-סוגים מולקולריים של דרמטיטיס אטופי. (A) גרף הטמעת שכן סטוכסטי בהתפזרות t (t-SNE) של דגימות AD. כל נקודה מייצגת דגימה המוקרנת לשני ממדים והיא צבועה בהתאם להקצאת אשכולות. (B) גרף הר געשי של גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) בין אשכול 1 לאשכול 2. כל נקודה מייצגת גן, המסומן על ידי שינוי קיפול log2 (ציר x) וערך p מותאם −log10 (ציר y). נקודות אדומות וכחולות מצביעות על גנים מוגברים באופן משמעותי באשכול 1 ובאשכול 2, בהתאמה, בעוד שנקודות אפור מצביעות על גנים לא משמעותיים. (ג) מפת חום של עשרת הגנים המובעים ביותר באשכול 1 ואשכול 2. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: ניתוח העשרת קבוצות גנים של תת-סוגים מולקולריים של דרמטיטיס אטופי. (א) תרשים בר דו-צדדי המציג תוצאות GSEA בין אשכול 1 לאשכול 2, עם המסלולים העליונים המועשרים משמעותית. המסלולים המועשרים באשכול 1 מוצגים מימין, ואלו שהועשרו באשכול 2 מוצגים משמאל. (B–E) גרפים ייצוגיים של העשרה להידבקות מוקדית, מסלול איתות MAPK, פוספורילציה חמצונית ונתיבי פרוטאזום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: ניתוח רשת קו-ביטוי גנטית משוקללת של דגימות דרמטיטיס אטופי. (א) דנדרוגרם מקבצות דגימות בהתבסס על פרופילי ביטוי גנים. (ב) אינדקס התאמה טופולוגיית ללא קנה מידה וקישוריות ממוצעת בין כוחות סף רך (1–30). (C) אשכולות ומפת חום של אורגנים עצמיים של מודולים, כאשר צבעים מצביעים על מתאמים זוגיים. (ד) דנדרוגרם אשכולות היררכי המציג גנים מקובצים למודולים מבוטאים במשותף. (ה) מפת חום של מטריצת החפיפה הטופולוגית (TOM), המייצגת דמיון משותף בין זוגות גנים. (ו) מפת חום של יחסי מודול-תכונה, המראה מתאמים בין הגנים העצמיים של המודול לתכונות קליניות. מקדמי קורלציה מוצגים בתוך כל תא, ועוצמת הצבע מציינת את עוצמת וכיוון המתאם (אדום, חיובי; כחול, שלילי). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: אונטולוגיה גנטית והעשרת מסלול KEGG של גנים מיטוכונדריאליים הקשורים לתת-סוג. (א) דיאגרמת ון המראה חפיפה בין DEGs, גנים מודוליים קשורים לתת-סוג, וגנים מיטוכונדריאליים. (B) תרשים בועה של 20 מסלולי KEGG העשירים המובילים של גנים מצטלבים. (ג) עשרת המונחים העשירים ביותר באונטולוגיה גנטית (GO) עבור תהליך ביולוגי (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF). כל ניתוחי ההעשרה בוצעו באמצעות ערך p מותאם < 0.05 (שיעור גילוי שגוי) כסף המובהקות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון וזיהוי גני הציר. (א) רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) הכוללת 85 גנים מצטלבים. צמתים מייצגים חלבונים, וקשתות מציינות אינטראקציות חזויות או מאומתות ניסיוניות ממסד הנתונים של STRING. (B) תרשים UpSet המציג חיתוכים בין 30 הגנים המדורגים המובילים בהתבסס על שבעה מדדי מרכזיות רשת. (C) תרשימי קופסה המציגים רמות ביטוי של ארבעה גנים מרכזיים באשכול 1 ואשכול 2. (D) ניתוח קורלציה זוגית בין ארבעת גני הציר. (ה) עקומת מאפיין תפעול מקלט (ROC) המציגה ביצועי סיווג, כאשר רגישות מוצגת מול ספציפיות. השטח מתחת לעקומה (AUC) מציין דיוק כללי. המובהקות הסטטיסטית בפאנל (C) הוערכה באמצעות מבחן סכום הדירוג של וילקוקסון (*p < 0.05). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 7: רשת רגולטורית של גני האב. עיגולים אדומים מייצגים גני hub ומעגלים כחולים מייצגים גורמי שעתוק (TFs) נלווים. הקצוות מציינים אינטראקציות רגולטוריות. גודל כל צומת גן מרכזי משקף את מספר ה-TFs האינטראקטיביים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: השוואת חדירת תאי מערכת החיסון בין תת-קבוצות של דרמטיטיס אטופי. תרשימי קופסה המציגים את הפרופורציות המשוערות של 22 סוגי תאי החיסון בכל אשכול (אשכול 1, אדום; אשכול 2, טורקיז). כוכבי (*) מצביעים על הבדלים מובהקים סטטיסטית בין אשכולות, שהוערכו באמצעות מבחן סכום הדירוג של וילקוקסון עם תיקון שיעור גילוי שגוי עבור השוואות מרובות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרמטיטיס אטופית היא הפרעת עור דלקתית נפוצה והטרוגנית גנטית, המציבה אתגרים משמעותיים לאסטרטגיות טיפול מותאמות אישית. מחקר זה מספק תובנות לגבי ההטרוגניות המולקולרית של AD על ידי זיהוי שתי תת-קבוצות שעתוק מובחנות ב-266 דגימות עור נגעיות של חולי AD. תת-קבוצות אלו מציגות העשרת תפקודים ביולוגיים שונים וחדירת תאי חיסון, כאשר אשכול 1 מאופיין באיתות תאים פעילים ומסלולי הידבקות והעשרת תאי T רגולטוריים (Tregs), בעוד אשכול 2 מוגדר על ידי פוספורילציה חמצונית מוגברת ותפקוד פרוטאזום, לצד עלייה בתאי T עוזרים בזקיקים. חשוב לציין כי זוהו ארבעה גנים הקשורים למיטוכונדריה (BAD, BOLA1, CHCHD5 ו-ISOC2) שעולים בוויסות באשכול 1. אלו הם גני המרכז ברשת PPI של 85 גנים שמגדירים את שני תת-הסוגים הטרנסקריפטומיים וניתן לווסתם בו-זמנית על ידי גורמי שעתוק, כולל ATF3, BRD2, BRD4 ו-CEBPA.

שני האשכול הייחודי זוהו בהתבסס על דפוס ביטוי הגן, מה שמרמז כי ל-AD יש הטרוגניות משמעותית בביטוי גנים. מחקרים קודמים הראו כי הטרוגניות זו יכולה להיות מונעת על ידי מנגנונים גנטיים, אפיגנטיים ומונעים על ידי מערכת החיסון שמגדירים אנדוטיפים מולקולריים מובחנים ^5,30,31. בין שני האשכולות נצפתה גם חדירת תאי חיסון שונים, אשכול 1 מאופיין בתאי T רגולטוריים ואשכול 2 מועשר בתאי T עוזר זקיקים (Tfh), מה שמעיד על הטרוגניות אימונולוגית בסיסית ואולי מנגנוני מחלה שונים בקבוצה של AD. אשכול הנשלט על ידי טרג מצביע על סביבה חיסונית שבה מנגנוני רגולציה בולטים, מה שעשוי לשקף ניסיונות לשלוט בדלקת או תגובה מפצה להפעלה חיסונית כרונית^32,33. עם זאת, ב-AD, תפקוד ה-Treg עלול להיפגע למרות עלייה במספרים, מה שעשוי לא לדכא דלקת בצורה יעילה. לעומת זאת, אשכול מעשיר ב-Tfh מצביע על שיפור בסיוע תאי B, פעילות מוגברת במרכז הנבטים, וסביר להניח שייצור IgE מוגבר, שהם סימני היכר של תגובות אלרגיות וצורות חמורות או חיצוניות יותר של AD^34,35. תאי Tfh ידועים כתומכים בהבדלות תאי B ובהחלפת מחלקות נוגדנים, וההתרחבות שלהם קשורה לפעילות מחלה ולרגישות אלרגית³⁶. נוכחותם של אשכולות מובחנים אלו עשויה לשקף פנוטיפים קליניים שונים, חומרת מחלה או תגובות לטיפול, ומדגישה את חשיבות הגישות המותאמות אישית במחקר ובטיפול ב-AD.

ידוע כי תפקוד לקוי של מיטוכונדריה משחק תפקיד משמעותי בפתוגנזה של AD באמצעות מנגנונים כמו שמירה על מחסום האפידרמלי³⁷, ייצור מין חמצן פעיל³⁸, וויסות תגובת תאי החיסון³⁹. ארבעה חלבונים מיטוכונדריאליים זוהו כצמתים מרכזיים של גנים הקשורים להתמיינות טרנסקריפטומית, שיכולים לחזות את תת-הסוג המולקולרי בדיוק גבוה (AUC>0.7). למרות שאף מחקר קודם לא הראה את הקשר הישיר בין גנים אלו ל-AD, תוצאות אלו מצביעות על כך שהם יכולים להיות ביומרקרים פוטנציאליים לשיבוץ חולי AD ולהערכת תפקוד לקוי של מיטוכונדריה אצל חולי AD. BAD (אגוניסט הקשור ל-BCL2 למוות תאי) הוא חבר פרו-אפופטוטי ממשפחת BCL-2 המעורב באיתות אפופטוטי מיטוכונדריאלי; העלאת הוויסות שלה באשכול 1 עשויה לשקף פריימינג אפופטוטי מיטוכונדריאלי מוגבר בתת-סוג זה. BOLA1 הוא חלבון מיטוכונדריאלי המעורב בביוגנזה של אשכולות ברזל-גופרית ובוויסות לחץ חמצוני. CHCHD5 (תחום סליל-סליל-סליל המכיל 5) הוא חלבון ממברנה פנימית מיטוכונדריאלי המקושר לארגון קריסטה וליעילות שרשרת העברת אלקטרונים. ISOC2 (תחום איזוכוריזמטאז המכיל 2) נקשר לתהליכים מטבוליים ותפקוד מיטוכונדריאלי. ההגברה המתואמת של ארבעת הגנים הללו באשכול 1 מצביעה על מצב של פעילות מטבולית מיטוכונדריאלית מוגברת ואיתות אפופטוטי בתת-קבוצה זו של AD.

למחקר זה יש מספר מגבלות. בעוד שמחקר זה זיהה שתי תת-קבוצות מולקולריות עם ביטוי גנים מובחן בגנים מיטוכונדריאליים וחדירה מופרדת של תאי חיסון, חסרים לנו נתוני פנוטיפ קליניים מפורטים שיאפשרו לנו לקשר בין הסטרטיפיקציה לחומרת המחלה ולתגובות הטיפול לאורך זמן. כדי להבין במלואו מה משמעות הביטוי הגבוה של ארבעת הגנים המרכזיים באשכול 1, מחקרים עתידיים צריכים לשלב מטא-דאטה קלינית מקיפה ולבצע אימות תפקודי במודלים של קרטינוציטים או עכברים. בנוסף, מחקר זה נשען על נתוני RNA-seq בכמויות גדולות הזמינים לציבור; למרות שהוא חזק בניתוח בקנה מידה גדול, הוא חסר רזולוציה בסוגי תאים מסוימים. מגבלה זו מקשה לקבוע האם הביטוי השונה הנצפה של גנים מיטוכונדריאניים נובע מקרטינוציטים, תאי חיסון חודרים או אוכלוסיות תאים תושבות עור אחרות. עם השימוש הנרחב בגישות טרנסקריפטומיות חד-תאיות ומרחביות, מחקר עתידי ירוויח רבות מכוח הפירוק של אותות הביטוי ומתן סקירה מדויקת יותר של פרופיל הטרנסקריפטומיה ברמה התאית. בנוסף, כל הנתונים התקבלו מדגימות ביופסיה של פונץ', שדגמו עור בעובי מלא. מחקרים עתידיים שיכללו RNA-seq סרט-סרט עשויים להציע גישה משלימה, לא פולשנית, לפרופיל הטרנסקריפטום האפידרמלי השטחי, ויכולים לאמת את חתימות תת-הקבוצה שזוהו בסביבה זעיר-פולשנית. אינטגרציה עתידית של נתוני RNA-seq של תאים בודדים ונתונים טרנסקריפטומיים מרחביים תקדם עוד יותר את הפתרון של חתימות מיטוכונדריאלית ספציפיות לסוג תאים בעור AD.

לסיכום, מחקר זה בחן את ההטרוגניות הטרנסקריפטומית של AD ב-266 דגימות, זיהה גנים מיטוכונדריאליים מרכזיים וחדירת תאי חיסון ייחודית, והבדיל בין תת-הקבוצות. ממצאים אלו משפרים את ההבנה של ההטרוגניות המולקולרית של AD ומדגישים את הפוטנציאל לפיתוח גישות טיפול מדויקות המבוססות על פרופילים מולקולריים ספציפיים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
סיברסורט	אוניברסיטת סטנפורד	v0.1.0; דה-קונבולוציה של תאי חיסון; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	ביו-קונדוקטור	v4.12.6; ניתוח העשרה של GSEA ו-GO/KEGG; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	ביו-קונדוקטור	v1.64.0; קיבוץ קונצנזוס לא מפוקח; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	ביו-קונדוקטור	v1.46.0; ניתוח ביטוי גנים שונה; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
אוסף ביטוי גנים (GEO)	NCBI	מאגר נתונים טרנסקריפטומי ציבורי; מערכי נתונים GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	קראן	ויזואליזציה של נתונים; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	קראן	ויזואליזציה של גרפים ורשת; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; ויזואליזציה של GSEA; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	אוניברסיטת הואאז'ונג למדע וטכנולוגיה	מאגר יעד של גורמי שעתוק אנושיים; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
איגרף	קראן	בניית רשת והדמיה; https://igraph.org
לימה	ביו-קונדוקטור	הפונקציה reGetBatchEffect; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	מכון ברוד	מאגר חלבונים מיטוכונדריאלי מאושר; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (קבוצות גנים של Hallmark)	מכון ברוד	מאגר סט גנים עבור GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	ביו-קונדוקטור	מאגר נתונים להערות גנום אנושי; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	קבוצת הליבה R	סביבת מחשוב סטטיסטית; https://www.r-project.org
מיתר	EMBL	גרסה 12.0; מאגר אינטראקציות חלבון-חלבון; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	ביו-קונדוקטור	v3.44.0; תיקון אפקט אצווה; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	קראן	v1.73; ניתוח רשת ביטוי משותף של גנים משוקלל; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

ניתוח טרנסקריפטומי חושף תת-קבוצות מונעות על ידי מיטוכונדריה בנגעים אטופיים של דרמטיטיס

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles