מחקר זה השתמש בריצוף 16S rRNA כדי להשוות את מיקרוביום המעי בקרב ביקורת בריאה, חולי PD שלא טופלו ומטופלים עם PD בפיריבדיל, וזיהה הבדלים בהרכב המיקרוביאלי הקשורים לטיפול בפיריבדיל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מחקר זה השתמש בריצוף 16S rRNA כדי להשוות את מיקרוביום המעי בקרב ביקורת בריאה, חולי PD שלא טופלו ומטופלים עם PD בפיריבדיל, וזיהה הבדלים בהרכב המיקרוביאלי הקשורים לטיפול בפיריבדיל.
מחקר זה נועד לקבוע האם טיפול בפיריבדיל משנה את המיקרוביום במעי של חולי פרקינסון (PD), ובכך לספק מקור תיאורטי להבנת שינויים במיקרוביוטה במעיים הנגרמים על ידי פיריבדיל והשלכותיהם הקליניות האפשריות. דגימות צואה נותחו באמצעות ריצוף גנים של RNA ריבוזומי 16S (16S rRNA). בוצעו השוואות בין מטופלים עם PD שלקחו פיריבדיל (קבוצת פיריבדיל), מטופלים עם PD שלא נטלו פיריבדיל (קבוצת PD), וקבוצת ביקורת בריאה (קבוצה ריקה). בהשוואה לקבוצה הריקה, השפע היחסי של סטפילוקוקוס, רודוקוקוס וסוגים אחרים היה גבוה יותר בקבוצת הפרקינסון, בעוד שהשפע היחסי של אקרומובקטור ודלפטיה היה נמוך יותר. יתרה מזאת, השפע היחסי של אקרומובקטרים, דלפטיה וסטנוטרופומונאס היה גבוה יותר בקבוצת הפיריבדיל לעומת קבוצת הפרקינסון, בעוד שהשפע היחסי של סטפילוקוקוס, רודוקוקוס ומינים אחרים היה נמוך יותר. בהשוואה לאנשים בריאים, המיקרוביום המעי של חולים עם פרקינסון הראה שינויים משמעותיים. המיקרוביום של המעי של מטופלים הנוטלים פיריבדיל שונה משמעותית מזו של מטופלים שלא טופלו. תוצאות אלו מצביעות על קשר בין פיריבדיל למיקרוביום מעי משתנה אצל חולים עם פרקינסון.
שכיחות מחלת פרקינסון (PD) עולה בהדרגה; עם זאת, האטיולוגיה והפתוגנזה שלו טרם הובארו במלואם. מחקרים נוספים הצביעו על כך שמיקרוביום המעי קשור קשר הדוק להופעת והתפתחות הפרקינסון. הוא ואחרים תיעדוכי הרכב המיקרוביום במעי אצל חולים עם PD משתנה מזה של אנשים בריאים, וכי עלייה בפתוגנים במעי עשויה להיות קשורה להופעת PD. Scheperans ואחרים אישרו כי השפע היחסי של Prevotella ו-Bacteroides במעי של חולי PD מופחת, ושהסוגים החיידקיים הללו קשורים באופן חזק לתפקוד מחסום מעיים.
מספר מחקרים חקרו את הקשר בין מיקרוביום המעי ל-PD. מחקרים מצביעים על כך שדיסביוזה עשויה למלא תפקיד מרכזי בפתופיזיולוגיה של PD, ומשפיעה על תסמינים מוטוריים ולא מוטוריים באמצעות מנגנונים רבים, כולל דלקת והפרעות מטבוליות3. בנוסף, הוכח כי טיפולים תרופתיים לפרקינסון משנים את הרכב המיקרוביום של המעי 4,5, מה שמדגיש את האינטראקציה המורכבת בין התרופות למיקרוביום המעי.
כאגוניסט לא סלקטיבי לקולטני דופמין, פירידיל הוא גורם מרכזי בניהול PD; הוא יכול לשפר תסמינים מוטוריים אצל מטופלים על ידי גירוי קולטני דופמין6. עם זאת, השימוש הקליני בו מוגבל לעיתים קרובות על ידי תגובות לוואי, בעיקר תסמינים במערכת העיכול כולל בחילה, הקאותואי נוחות בבטן. המנגנון הבסיסי של תופעות הלוואי הללו נותר לא ברור, והאם הן קשורות לשינויים במיקרוביום המעי שנגרמים על ידי פיריבדיל עדיין לא ידוע.
הקשר בין מיקרוביום המעי לתגובות שליליות של תרופות עורר עניין גובר בשנים האחרונות. היל-ברנס ואח'ניתחו את המיקרוביום במעי אצל חולים עם פרקינסון ומצאו כי מגוון המיקרוביום במעי קשור לתגובה לטיפול תרופתי. בנוסף, אגוניסטים של דופמין עשויים להשפיע על תנועתיות המעייםוהרכב המיקרוביאלי. המנגנונים מאחורי שינויים אלו נחשבים לשינויים בתזמון העברת המעי, אשר משפיעים בתורם על המגוון והשפע המיקרוביאולי. יתרה מזאת, מיקרוביום המעי יכול להשפיע על ספיגת התרופה ועל חילוף החומרים10, ובכך להשפיע על היעילות ותופעות הלוואי של תרופות אלו. עם זאת, עדיין קיימת מחקרים שיטתיים על השאלה האם וכיצד פיריבדיל, חומר נפוץ למחלת פרקינסון, מווסת את מבנה המיקרוביום במעי, וכן את הקשר בין שינויים מיקרוביאליים אלו לתגובות השליליות במערכת העיכול.
במחקר הנוכחי, השווינו את מבנה המיקרוביום במעי בקרב ביקורת בריאה, חולי פרקינסון שלא טופלו, ומטופלים שטופלו בפירידיל. השענו שטיפול בפיריבדיל קשור לשינויים מובחנים בהרכב המיקרוביום במעי אצל חולים עם PD, וכי שינויים מיקרוביאליים אלו עשויים להיות קשורים לתופעות לוואי במערכת העיכול הקשורה לפיריבדיל. מטרתנו לזהות שינויים מיקרוביאליים ספציפיים הקשורים לפיריבדיל ולבחון את הקשר הפוטנציאלי שלהם לתופעות לוואי במערכת העיכול, ובכך לספק בסיס תיאורטי להבנת מנגנון התגובות השליליות הקשורות לפיריבדיל.
המיקרוביום של המעי הוא כיוון חשוב למחקר על הפתוגנזה שלPD 11. על ידי התבוננות בהשפעות הפיריבדיל על המיקרוביום במעי אצל חולים עם PD, מחקר זה מסייע להבהיר את המשמעות הקלינית של שינויים במיקרוביום המעי הקשורים לתרופות ומספק נקודת ייחוס לאופטימיזציה של השימוש הקליני וניהול הבטיחות של פיריבדיל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה נבדק על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת אנחווי לרפואה סינית (מספר סקירת אתיקה: 2025AH-101, תאריך אישור אתי: 2025-07-02).
נושאי מחקר
מטופלים עם פרקינסון וביקורת בריאה בבית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת אנחווי לרפואה סינית נרשמו. נאספו דגימות צואה טריות לניתוח מעקב. דגימות צואה טריות נאספו, הועברו לצינורות EP סטריליים, הוקפאו מיד בחנקן נוזלי, ואז אוחסנו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לשימור ארוך טווח. הקריטריונים להכללה של חולים עם PD היו כדלקמן: (1) PD שאובחן קלינית; (2) בן >70; (3) עבור קבוצת פיריבדיל: החל בטיפול מונותרפי של פירידיל לאחר ההרשמה ולא היה חשוף לתרופה זו; לקבוצת PD: לא לעבור טיפול בתרופות נגד פרקינסון; (4) אין מחלות מערכתיות חמורות אחרות, כגון מחלות לב חמורות, מחלות כבד, מחלת כליות או סרטן. לפני ההרשמה, התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל משתתף. הקריטריונים להוצאה היו כדלקמן: (1) סיבוכים חמורים של PD, כגון תפקוד מוטורי לקוי חמור; (2) קיבל לאחרונה טיפול אנטיביוטי; (3) נוכחות של מצבים בריאותיים נוספים שעשויים להשפיע על תוצאות המחקר, כגון מחלת מעי דלקתית, תסמונת המעי הרגיז ועוד; (4) אלרגי לפיריבדיל. הנבדקים הבריאים בביקורת (קבוצת בלנק) היו אנשים מותאמים לגיל (גיל >70) ללא היסטוריה של מחלות נוירולוגיות או מחלות גסטרואנטסטינליות חמורות.
כל המשתתפים נדרשו לשמור על הרגלי התזונה הרגילים שלהם לפני ההרשמה. אף אחד מהם לא קיבל פרוביוטיקה, פרה-ביוטיקה, תוספי סיבים תזונתיים או תוספי תזונה אחרים. בנוסף, כל המשתתפים לא קיבלו טיפול אנטיביוטי לפחות שלושה חודשים לפני איסוף הדגימה. לא בוצעה התערבות תזונה סטנדרטית במהלך המחקר, אך כל המשתתפים קיבלו הוראה לשמור על אורח חיים ותזונה יציבים כדי למזער השפעות מבלבלות פוטנציאליות על המיקרוביום של המעי.
קבוצת מחקר
קבוצת המחקר הזו חולקה לשלוש קבוצות: קבוצת PD (n = 10): דגימות צואה שנאספו מחולי פרקינסון שלא נטלו תרופות נגד פרקינסון. קבוצת פיריבדיל (n=10): דגימות צואה שנאספו מחולי פרקינסון לאחר 21 ימים רצופים של טיפול בפיריבדיל (50 מ"ג, פעמיים ביום). קבוצת ביקורת ריקה (n=5): דגימות צואה שנאספו מאנשים בריאים.
ריצוף RNA ריבוזומלי 16S
ריצוף בוצע על פלטפורמת ריצוף, כפי שדווח במחקרים אחרים12,13, בקצרה, DNA מיקרוביאלי כולל בודד מדגימות צואה באמצעות שיטת סודיום דודציל סולפט (SDS) 14,15,16. שלמות ה-DNA שהופק אושרה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1%, וריכוז וטוהר ה-DNA נקבעו באמצעות ספקטרופוטומטר. האזור ההיפר-משתנה V3-V4 של גן חיידקי 16S rRNA הוגבר מ-DNA גנומי באמצעות פריימרים מנוונים 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') ו-806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') עם תרמחזור תגובת שרשרת פולימראז (PCR). ההגברה של גן החיידק rRNA 16S בוצעה בתנאים התרמיים הבאים: שלב קדם-דהנאטורציה ראשוני ב-94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 28 מחזורים הכוללים דנאטורציה של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, אנילינג של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה של 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. הארכה אחרונה בוצעה בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והתגובה נשמרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. תערובות ה-PCR מכילות 2× PCR מאסטר 25 מיקרוליטר, פריימר קדמי (10 מיקרומון) 2 מיקרוליטר, פריימר הפוך (10 מיקרומ') 2 מיקרוליטר, DNA תבנית 10 ננוגרם, ולבסוף ddH2O עד 50 מיקרוליטר. תגובות PCR בוצעו בשלוש פעמים. תערובות ה-PCR מכילות 2× PCR מאסטר 25 מיקרוליטר, פריימר קדמי (10 מיקרומון) 2 מיקרוליטר, פריימר הפוך (10 מיקרומון) 2 מיקרוליטר, DNA תבנית 10 ננוגרם, ולבסוף ddH2O עד 50 מיקרוליטר. תגובות PCR בוצעו בשלוש פעמים. מוצר ה-PCR הופק מג'ל אגרוז 2% וטוהר באמצעות ערכת חילוץ ג'ל. ערכת ההכנה לספריית DNA של Universal Plus עבור MGI V2 שימשה לבניית הספרייה: (1) קישור מפצל; (2) להשתמש במסך חרוזים מגנטיים להסרת הקטעים הצמודים למפרקים; (3) העשרת תבניות ספרייה באמצעות הגברת PCR; (4) חרוזים מגנטיים לשחזור מוצרי PCR; (5) מחזוריות של מוצרי PCR. לאחר אימות הספרייה, בוצע ריצוף.
נקודות ביקורת איכותיות: נקודת ביקורת 1 (איסוף דגימות): הדגימות הוקפאו מיד לאחר האיסוף ונשמרו בטמפרטורה של −80°C. כל דגימה עם סימני הפשרה או זיהום נראים נזרקה. נקודת ביקורת 2 (חילוץ DNA): טוהר מקובל: A260/A280 = 1.8–2.0, A260/A230 ≥1.8; שלמות מאומתת על ידי רצועה אחת במשקל מולקולרי גבוה על ג'ל אגרוז 1%. נקודת ביקורת 3 (הגברת PCR): פס יחיד ב~460bp על ג'ל אגרוז 2% מצביע על הגברה מוצלחת (פריימרים 341F/806R, אזור V3-V4); אם חסר או לא ספציפי, כוון את טמפרטורת האנילינג או ריכוז התבנית. נדרש ריכוז התאוששות ≥0.5 ng/μl להכנה לספרייה. נקודת ביקורת 4 (הכנת ספרייה וריצוף): מבוצעת על ידי מתקן הרצף בהתאם לפרוטוקולים המאומתים הסטנדרטיים שלהם; לא הותקן נקודת ביקורת פנימית נוספת (למשל, גודל ביואנלייזר).
בטיחות והשלכת פסולת: כפפות ומעילי מעבדה נלבשו במהלך כל הטיפול בדגימות. משטחי העבודה נוקו עם 70% אתנול. כל הצרכנים המזוהמים (קצות, צינורות, ג'לים) עברו אוטוקלב (121°C, 20 דקות) לפני ההשלכה כפסולת ביו-מסוכנת.
ביואינפורמטיקה
קריאות ריצוף גולמיות של גן 16S rRNA עברו תחילה דה-מולטיפלקס, עברו סינון איכותי באמצעות fastp (גרסה 0.20.0), והורכבו באמצעות FLASH (גרסה 1.2.11) תחת קריטריוני סקר סטנדרטיים. בקצרה: (i) רצפי 300 bp גולמיים קוצצו כאשר ציון האיכות הממוצע ירד מתחת ל-20 בתוך חלון החלקה של 50 בסיסים. קריאות עם אורכים מקוצרים קצרים מ-50 בסיסים או עם בסיסים מעורפלים הוסרו; (ii) הרכבת רצף בוצעה רק עבור חפיפות העולות על 10 bp, כאשר יחס האי-התאמה המרבי של אזור החפיפה נקבע על 0.2. קריאות לא מזווגות שלא הורכבו בוטלו; (iii) דגימות בודדות חולקו לפי רצפי ברקוד ופריימר לצורך התאמת כיוון מאוחרת. התאמת ברקוד בוצעה ביישור מדויק, בעוד שהתאמת פריימר אפשרה מקסימום 2 אי-התאמות נוקלאוטידיות. קריאות rRNA של 16S נותחו באמצעות צינור התובנות הכמותיות לאקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME) (גרסה 1.8.0)17. רצפי תגיות צורפו לקריאות בקצה זוגי באמצעות FLASH (גרסה 1.2.11)18. החיתוך בוצע באמצעות UPARSE (גרסה 7.0.1090) עם אורך מינימלי של 200 bp ואיכות ממוצעת של 25, ואחריו התקשלות ב-97% ליצירת יחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs)19. קריאות OTU מייצגות סווגו טקסונומית באמצעות RDP Classifier 2.2, עם מגבלת אמון ≥0.6. שפע התגיות והקריאה נקבע בהשוואה באמצעות USEARCH global20. זיהוי רצפי כימריקה התבסס על השוואות עם מאגר Gold באמצעות UCHIME (v4.2.40)21. ניתוח קואורדינטות עיקרי (PCoA) בוצע לאחר מכן על מאגר נתונים דליל המבוסס על אי-דמיון בריי–קרטיס, כאשר סף השוויון ברצף נקבע על 97% לאשכולות. OTUs מייצגים ופרופילים טקסונומיים תואמים נותחו בהמשך באמצעות תוכנת R (גרסה 3.1.1). אלגוריתם LEfSe (Linear Discriminant Effect Size), המבוסס על גודל אפקט ניתוח ליניארי (LDA), יושם על סמנים ביולוגיים במסך עם שפע דיפרנציאלי משמעותי ברמת ה-OTU. שיטה זו מדגישה הן מובהקות סטטיסטית והן על רלוונטיות ביולוגית על ידי זיהוי תכונות עם הבדלים עקביים בין קבוצות (באמצעות מבחן Kruskal-Wallis להשוואה בין קבוצות) ואז הערכת גודל ההשפעה של כל תכונה ששופעת באופן דיפרנציאלי באמצעות LDA. ציון LDA >2.0 מוגדר כעלייה משמעותית בשפע22.
שיטות סטטיסטיות
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות SPSS. נתונים מבוזרים בדרך כלל נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA). נתונים שלא עקבו אחרי ההתפלגות הנורמלית נותחו באמצעות מבחן סכום הדירוג של וילקוקסון. כל הנתונים הכמותיים הוצגו כממוצע ± שגיאת תקן (SE) עבור פרמטרים התואמים התפלגות נורמלית, בעוד שנתונים לא מבוזרים נורמלית הוצגו כחציון עם טווח בין-רבעוני. ערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הבדלים במגוון מיקרוביאלי הקשורים לטיפול בפיריבדיל
תוצאות בקרת איכות של חילוץ DNA (טווח ריכוז, טוהר) מוצגות בטבלה משלימה 1. בקרת איכות של הגברת PCR (גודל פס, ריכוזי התאוששות) מוצגת בטבלה משלימה 2. מדדי בקרת איכות של ריצוף (ספירת קריאה, עומק, כיסוי) מפורטים בטבלה משלימה 3. מדדי ACE, Chao1, InvSimpson, Shannon ו-Simpson שימשו לניתוח המיקרוביום של המעי בדגימת הצואה. התוצאות ממדדי ACE ו-Chao1 לא הראו הבדלים משמעותי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחלת פרקינסון מדורגת כמחלה הנוירודגנרטיבית השנייה השכיחה ביותר בעולם, ולפניה רק מחלת אלצהיימר23. מאז 1970, פירידיל, כאגוניסט קולטני דופמין, משמש באופן נרחב בטיפול ב-PD24. עם זאת, בפרקטיקה הקלינית, פיריבדיל עלול לגרום לתגובות שליליות מסוימות, כגון בחילות, הקאות ואי נוחות במערכת העיכול. מחקר הולך וגדל מראה כי התפתחות מחלת פרקינסון, כמו גם התערבות טיפולית עם אגוניסטים לקולטני דופמין, מסוגלים לעצב מחדש את פרופילי הקהילה המיקרוביאלית במעיים.
...הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מציינים שאין אינטרסים מתחרים.
מחקר זה נתמך על ידי פרויקט מימון מועמדים למילואים למנהיגים אקדמיים של מחוז אנחווי (מס' 2022H287), פרויקט הכישרונות המצטיינים של ההיגיינה והבריאות של מחוז אנחווי (No. ahsjhmypygc20230074), פרויקט המחקר המדעי של מחוז אנחווי על ירושה וחדשנות ברפואה הסינית המסורתית (2025CCCX017), והפרויקט המיוחד לאינטגרציה בסיסית-קלינית של אוניברסיטת הרפואה הסינית באנחווי (JCLCA2025009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | קנגוויי | CW0690 | |
| אגרוז | (כללי) | לא חל | דרגת ביולוגיה מולקולרית |
| ערכת חילוץ ג'ל DNA AxyPrep | Axygen Biosciences | (לא נמסר) | |
| צנטריפוגה קירור במהירות גבוהה על שולחן | Hunan Kosei | GTR116C | |
| חומרי חילוץ DNA (SDS, פנול, כלורופורם, אתנול) | (כללי) | לא חל | |
| פלטפורמת רצף DNBSEQ-G99 PE300 | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| מכשיר אלקטרופורזה ג'ל | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| מערכת הדמיית ג'ל | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| תוכנת LEfSe | (קוד פתוח) | גרסת און-ליין | |
| ספקטרופוטומטר NanoDrop | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| מכונת PCR | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| פריימרים: 341F ו-806R (סינתטיים) | (סינתזה מותאמת אישית) | לא חל | |
| תוכנת QIIME | (קוד פתוח) | http://qiime.org | גרסה 1.8.0 |
| פוטומטר Quantus | Promega | E6150 | |
| פוטומטר Qubit 4.0 | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (סודיום דו-דציל סולפט) | (כללי) | לא חל | |
| תוכנת UPARSE | (קוד פתוח) | http://drive5.com/uparse | גרסה 7.0.1090 |
| ערכת VAHTS Universal Plus DNA Library Prep ל-MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |