מאמר שיטה

טכניקה לייצוב חלבוני ממברנה בננו-דיסקים

DOI:

10.3791/70283

⸱

30 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר את ההליך לשיקום חלבון הממברנה הרגיש לחומצה ב-TWIK, ערוץ K+ 2 (משימה 2) לננו-דיסקים. ההרכבה המוצלחת אושרה על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרון חד-חלקיק, שהניב ממוצעים דו-ממדיים מוגדרים היטב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני ממברנה רבים מציגים יציבות ירודה, אובדן פעילות והטרוגניות לדגימה כאשר הם מופקים בסביבות מבוססות חומר ניקוי, מה שמציב אתגרים משמעותיים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני-קריו-ברזולוציה גבוהה. טכנולוגיית הננודיסק מתמודדת עם מגבלות אלו באמצעות שימוש בחלבוני פיגום ממברנה (MSPs) ופוספוליפידים כדי לשחזר חלבוני מטרה לשכבת ליפידים דו-צדדית דמוית מקומית. במחקר זה, תעלת האשלגן האנושית Task2 בוטאה, התמוססה וטוהרה בנוכחות חומרי ניקוי מתאימים לפני הרכבת הננודיסק. הפרוטוקול שנוצר יוצר תהליך עבודה שניתן לשחזור עבור משימת 2 של ננו-דיסקים, כפי שמודגם בשלבי אימות מרכזיים: שינוי ברור בפרופילי הכרומטוגרפיה של הדרת גודל (SEC) המאשר הגדלת חלקיקים, הגירה משותפת של Task2 ו-MSP ב-SDS-PAGE, וממוצעים דו-ממדיים מוגדרים היטב עם תכונות מבנה משניות נראות לעין. שחזור תלת-ממדי ראשוני מאשר עוד יותר את שלמות החלבון המוטמע בננו-דיסק. על ידי שיפור טוהר הדגימה, ההומוגניות ואיכות החלקיקים, גישה זו מספקת פלטפורמה איתנה למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של משימה 2 ומציעה מסגרת מתודולוגית החלה על חלבוני ממברנה אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני ממברנה ממלאים תפקיד מרכזי בהעברת אותות תאי, בהעברת מטבוליטים, בשמירה על שלמות מבנית של התא ותגובות חיסוניות. דיסרגולציה של חלבוני ממברנה קשורה למחלות שונות, מה שהופך אותם למטרות בולטות לפיתוח תרופות1. הופעת מיקרוסקופ אלקטרון קריו-אלקטרוני (קריו-EM) אפשרה מחקרים מבניים של חלבוני ממברנה גדוליםודינמיים 2. אתגר מרכזי בהשגת מבנים ברזולוציה גבוהה טמון בהפקת חלבונים אלה משכבות הליפידים הטבעיות שלהם, תוך שמירה על המבנה הטבעי והתפקודים הביוכימיים שלהם. יתרה מזאת, הקונפורמציה הדינמית מאוד של חלבוני ממברנה ומורכבות סקר הנוגדנים מהווים מכשולים נוספים לגילוי תרופה ממוקד 3,4. שיטות מסורתיות להפקת חלבון ממברנה משתמשות לעיתים קרובות בדטרגנטים כדי לחקות את תכונות שכבת הליפידים ההידרופובית. עם זאת, גישה זו לעיתים קרובות פוגעת ביציבות חלבוני הממברנה, מה שמוביל להצטבר או להתפתחות חלקית5. בנוסף, חומרי ניקוי עשויים להסיר מולקולות ליפידים חיוניות הקריטיות לייצוב מבנה החלבון, מה שעלול לשנות את מבנה החלבון או אפילו לפגוע בתפקוד, ובכך להגביל את יישומם בסריקת נוגדנים וביישומים אחרים במורד הזרם6.

טכנולוגיית הננודיסק הוצגה לראשונה על ידי סליגאר ועמיתיו7. מבנה ההרכבה העצמית הזה מורכב בדרך כלל מנגזרות אפוליפופרוטאין A1 (ApoA1), כלומר MSPs, יחד עם ליפידים סינתטיים או טבעיים, ומספקים סביבה יציבה לחלבוני ממברנה 7,8,9. ה-MSP יוצר מבנה בצורת דיסק על ידי הקפת הקצוות ההידרופוביים של שכבת הליפידים. מבנה זה כולל משטח הידרופובי שמקיים אינטראקציה עם זנבות הליפידים של האציל, מייצב את חלבון הממברנה, ומשטח הידרופילי הפונה החוצה, מה שמאפשר לחלבון הממברנה להישאר מסיס בתמיסות מימיות10. ננו-דיסקים משמשים כפלטפורמה רב-שימושית למחקר חלבוני ממברנה. על ידי שימור חלבוני ממברנה מטוהרים בסביבה כמעט ילידית של שומן, הם מתגברים על המגבלות של שיטות מסורתיות מבוססות חומרי ניקוי, ושומרים על מבנה החלבונים ותפקודם הביולוגי במבחנה. כתוצאה מכך, שיטה זו הפכה לכלי עוצמתי למחקרים מבניים של חלבוני ממברנה. בהשוואה לסביבות ניקוי מסורתיות, שכבת הליפידים בננו-דיסקים מספקת תמיכה מבנית לחלבוני ממברנה, ומייצבת את המבנה הטבעי שלהם — תכונה קריטית לחלבונים הנוטים להשבתה, כמו קולטני G המקושרים לחלבון וערוצים יונים11. בנוסף, האופי האחיד מאוד של חלקיקי ננו-דיסק לאחר ההרכבה מספק תמיכה חזקה יותר בקבלת נתוני קריו-EM איכותיים ונתוני קינטיקה אמינים של רזוננס פלזמוני/אינטרפרומטריה בשכבת ביולוגית12.

בעשור האחרון, טכנולוגיית הננודיסקים הפכה לכלי עוצמתי לחקר חלבוני ממברנה בסביבות ליפידים טבעיות. לדוגמה, ויילה ועמיתיו13 הקימו מסגרת שיטתית להרכבת ננו-דיסקים על ידי אופטימיזציה של תנאי הבנייה מחדש ואימות איכות הרכיבים הסופיים. במיוחד, הם שילבו כרומטוגרפיה של הדרת גודל (SEC) עם מדדים כמותיים (כולל יעילות הרכבה וסימטריית שיא) כדי להעריך באופן אובייקטיבי את ההומוגניות של הדגימות13. כיום, ננו-דיסקים הפכו לפלטפורמה רב-שימושית. באמצעות שימוש בקריו-EM חד-חלקיקי לזיהוי חלבונים שננו-דיסקים משוחזרים, ניתן להשיג מבנים ברזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה, ויישומם הוכח היטב. תכונת צפיפות הטבעת הכפולה של רצועת MSP היא הראיה המבנית המכרעת לקישור מוצלח 10,14,15. יתרה מזאת, ננו-דיסקים משמשים ככלי חשוב הן לניתוח תפקודי של חלבוני ממברנה בסביבות שכבת ליפידים והן ליישומם במחקרי תהודה מגנטית גרעיניתבתמיסה 16,17.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להרכבת חלבון הממברנה Task2 האנושי לננו-דיסקים. Human Task2 הוא חבר עם שער pH ממשפחת התעלות K+ (K 2 P) הדו-נקבוביות K+ (K2P)18,19. כמו ערוצי K2P אחרים, Task2 הוא הומודימר עם החלפת דומיין, כאשר כל שרשרת פרוטומרים מכילה ארבעה הליקסים החוצים ממברנה (TM1–TM4), שני הליקסים נקבוביים חוזרים (PH1 ו-PH2), שני מסנני סלקטיביות (SF1 ו-SF2), ושני הליקסים חוץ-תאיים ליצירת כובע (CH1 ו-CH2). חלבון המטרה היה צורה מקוצרת של Task2 ללא חומצות האמינו C-terminal 166—אזור שצפוי להיות ברובו לא מובנה—שנמצא כי משפר את ביטוי החלבון והיציבות הביוכימית. המשקל המולקולרי של משימה 2 המשולבת מחדש הוא כ-72 קילו-דלטון עם תג GFP. הוא הומס וטוהר מראש באמצעות חומר ניקוי. הוא שולב עם ליפידים ו-MSP ביחס סטוכיומטרי מחושב במדויק. לאחר הסרת חומר ניקוי באמצעות Bio-Beads, הדגימה טוהרה עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל (SEC) לקבלת תכשיר מתאים לקריו-EM. לאחר מכן נוצרו ממוצעים דו-ממדיים (דו-ממדיים) מנתוני קריו-EM חד-חלקיקים כדי לאמת את שלמות הדגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מלאי שומנים

  1. הכנת שומנים
    1. הכינו תערובות ליפידים באמצעות שלושה פוספוליפידים: 1,2-דיולאול-sn-גליצרו-3-פוספואתנולאמין (DOPE), 2-אולאיל-1-פאלמיטויגלגליצרו-3-פוספוכולין (POPC), ו-1-פאלמיטויל-2-אולואילפוספטידילסרין (POPS).
    2. השתמש בתמיסות מוכנות מראש של ליפידים אלו בכלורופורם, כל אחד בריכוז של 25 מ"ג/מ"ל.
      הערה: נדרש ציוד מגן אישי בעת טיפול בכלורופורם, וכל ההליכים חייבים להתבצע באמצעות מכסה אדים. אחסן כלורופורם בארון כימי ייעודי.
    3. עקב התנודתיות של כלורופורם, כאשר מודדים עם מיקרומזרק, יש לוודא שנפח תמיסת מלאי השומנים תואם את הנפח הראשוני שנרשם לפני כל שימוש. אם מתרחש אידוי, יש למלא את התמיסה בכלורופורם טהור לנפח המקורי ולערבב היטב.
      הערה: לפני כל מדידה, שטוף את המיקרוסינג' פעמיים בכלורופורם.
    4. הכינו תערובת שומנים של 100 מיקרוליטר עם יחס מסה של DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. בהתבסס על יחס זה, יש לשלב 50 מיקרוליטר VDOPE, 25 מיקרוליטר VPOPC ו-25 מיקרוליטר VPOPS. מדוד את הנפח המתאים לפי המספר המחושב. הוסיפו אותו למבחנה הזכוכית וערבבו היטב.
    5. הניחו את מבחנה הזכוכית באמבט מים כדי להפחית את ההתנדפות של כלורופורם ולשמור על טמפרטורת הסביבה יציבה.
  2. הכנת סרט שומן
    1. אידוי את הכלורופורם תחת זרם עדין של גז חנקן עד שכל הנוזל מוסר ונוצר שכבת ג'ל שקופה והומוגנית בתחתית המבחנה.
      הערה: ודא ששכבת שומנים אחידה ויבשה נראית בתחתית צינור הזכוכית, ללא טיפות נוזל שנותרו. הימנעו מזרימת חנקן מופרזת, שכן היא עלולה לגרום לבועות ולמנוע ייבוש מוחלט של הכלורופורם.)
    2. הוסיפו כ-2 מ"ל של n-פנטאן בטיפה למבחנה מזכוכית. לאחר מכן מאדים את הממס באמצעות שיטת ייבוש חנקן המתוארת ב-1.2.1 כדי לקבל שכבת ליפידים יבשה ושקופה. n-פנטיין מתאדה במבחנה מזכוכית בשל האינרטיות הכימית שלו ותאימות לממסים אורגניים. זכוכית מונעת את הסיכון לחליפת פלסטיק או התדרדרות הקשורה לחומרים רבים של כלי מעבדה, ובכך שומרת על טוהר השומנים במהלך יצירת הסרט.
      הערה: יש לאחסן את n-Pentane בארון תגובות ייעודי, וכאשר משתמשים בו, לטפל בו בזהירות בתוך מכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
    3. שחרר את מכסה המבחנה והניח אותו במייבש ואקום. פנו את המייבש ושמרו אותו בוואקום כדי להסיר ממסים שנותרו. הניחו סיליקה ג'ל מסמן עצמי בתחתית המייבש כדי לספוג לחות.
      הערה: אידוי שאריות כלורופורם ו-n-פנטאן ליובש בתוך מכסה אדים.
  3. הידרציה של שומנים והכנת תמיסת ציר
    1. הסר את שכבת השומנים ממייבש הוואקום והרוויח אותה על ידי הוספת 250 מיקרוליטר של בופר מלח נמוך ללא דטרגנציה (LSB) (טבלה משלימה 1). זה מניב ריכוז ליפידים סופי של 10 מ"ג/מ"ל.
      הערה: נבחר בופר מבוסס יוני אשלגן כי משימה 2 היא ערוץ יוני אשלגן
    2. לאחר החזרת הליפיד, חלקו את הליפיד באופן שווה לארבעה צינורות זכוכית וסוניק את התלייה עד שהם הופכים לשקופים ושקופים, מה שמעיד על היווצרות ליפוזום מוצלחת (כ-1.5 שעה). בצע סוניקציה בעוצמה של 60% באמצעות מחזור של 4 שניות דלוק ו-6 שניות כבוי.
    3. איחד את תמיסת השומן המובהקת והפרש 1.5 מ"ל לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים. שטוף מיד את מרווח הראש של כל צינור בגז חנקן ואחסן בטמפרטורה של -80°C עד השימוש.

2. ביטוי יתר וטיהור של MSP

  1. ביטוי פרוקריוטי של MSP
    1. טרנספורמציית פלסמיד: השתמשו בפלסמיד MSP1D1 הנושא תג 7×His כדי להמיר את התאים המתאימים ל-E. coli BL21 (DE3). הפלטה את תערובת הטרנספורמציה על לוחות אגר לוריה-ברטאני (LB) המכילות קאנמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) ודוגרים במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לקבלת מושבות בודדות.
    2. הגברת תרבית: בחרו שיבוט יחיד והחריסו אותו ב-5 מ"ל מדיום LB המכיל קאנמיצין ודגרו לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור. החרינו את התרבית הלילית במדיום נוזלי LB ביחס של 1:100, ואז גדלו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עד שצפיפות האופט ב-600 ננומטר (OD600) מגיעה ל-2.0–3.0.
    3. השראת ביטוי חלבון: השראת ביטוי MSP על ידי הוספת איזופרופיל β-d-1-תיוגלאקטופיראנוסיד (IPTG) לריכוז סופי של 0.5–1 מ"מ. המשיכו לגדל את התאים בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 16–20 שעות עם ניעור.
  2. שיבוש תאים
    1. איסוף כדורים: צנטריפוגה את תרבית החיידקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. זרוק את הסופרנטנט ושמור על כדור התא.
    2. ניתוק חיידקים: השעיה מחדש את הכדור שמקורו בליטר תרבית ב-100–150 מ"ל של בופר ליזיס (טבלה משלימה 1). הומוגניזציה יסודית עד להשגת השעיה אחידה ללא גושים נראים לעין. הוסיפו PMSF למתלים כדי לעכב פרוטאזות ולהפחית קצף.
    3. סוניקציה: השתמש במכשול תאי אולטרסוני מקורר כדי לשבור את החיידקים. הגדר את ההספק ל-35% והפעיל מחזורים של פולסים של 3 שניות ואחריהם הפסקות של 6 שניות. כדי למנוע התחממות יתר, אפשר מנוחה של 2 דקות אחרי כל 15 דקות של זמן סוניקציה מצטבר. המשך עד שהליזאט הופך לבהיר וחום בהיר.
    4. הבהרה: צנטריפוגה את הליזאט ב-30,000 גרם למשך 45 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואיסוף הסופרנטנט לשלבים הבאים.
  3. טיהור MSP
    1. הכנת שרף Ni-NTA: קחו 3–5 מ"ל שרף Ni-NTA וארזו אותם בעמוד כבידה (גודל: 26.4×134.8 מ"מ). שטוף את השרף עם 3 נפחים (CV) של מים מזוקקים ומאוזן אותו עם 3 נפחים של Wash Buffer 1 (טבלה משלימה 1).
    2. קישור MSP לשרף: לאחר צנטריפוגציה של ליזאט התא, ערבב את הסופרנטנט עם שרף Ni-NTA מאוזן. הוסיפו את האימידאזול לריכוז סופי של 5 מ"מ ודגרו את התערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם סיבוב עדין בחושך.
    3. שטוף להסרת זיהומים: שטוף ברצף עם גרדיאנטים של Wash Buffer 1, Wash Buffer 2 (טבלה משלימה 1) ו-Wash Buffer 3 (טבלה משלימה 1), תוך שימוש לפחות 50 מ"ל מכל בופר. יש לעקוב אחרי ספיגת ה-UV ב-280 ננומטר (A280) של הזרימה דרך ה-280 ולהמשיך לשטוף עד שערך A280 יורד מתחת ל-0.01.
    4. הלוי: לשטוף את החלבון היעד עם בופר ההסטה (טבלה משלימה 1) ולאסוף את חלקי האלוויין. ממשיכים בתהליך ההסרה, אוספים שברים עד ש-A₂₈₀ של הנוזל יורד מתחת ל-0.01.
    5. ניטור וניתוח תהליכים: איסוף דגימות משלבים מרכזיים של טיהור — כולל הסופרנאנט, המשקעים, הזרימה, חלקי השטיפה ושברי ההסטה. נתחו אותם באמצעות SDS-PAGE כדי להעריך את יעילות הטיהור (איור משלים 1).
    6. דיאליזה להחלפת בופר: העבר את האלואט המאוגד לצינורות הדיאליזה ודיאליזציה מול בופר הדיאליזה (טבלה משלימה 1) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין במהלך הלילה.
    7. אולטרה-פילטרציה וריכוז: ריכוז התמיסה המדוברת באמצעות מכשיר אולטרה-פילטרציה לריכוז MSP סופי של 2–5 מ"ג/מ"ל. ה-MSP המטוהר והמרוכז מוכן כעת לשימוש בהרכבת ננו-דיסק חלבוני ממברנה.

3. הפעלה של חרוזי ביו

  1. שקילה
    1. שקלו כ-250 מ"ג של חרוזי ביו לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל באמצעות איזון אנליטי.
  2. שטיפות מתנול
    1. הוסיפו 25–30 מ"ל מתנול לצינור. סובבים או מערבבים היטב את התערובת בחושך, ואז דגרו במשך 20 דקות. השליכו בזהירות את הסופרנטנט לאחר הדגירה.
    2. חזור על שלב שטיפת המתנול שלוש פעמים בסך הכל.
      הערה: בשל התנודתיות של המתנול, יש לבצע הליך זה במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים. לאסוף מתנול משומש ולטפל בו כנוזל פסולת ביולוגית.
  3. שטיפות מימיות
    1. הוסיפו 25–30 מ"ל dH2O לחרוזים. נער או סובב את הצינור כדי לערבב ולדגור במשך 20 דקות.
    2. זרוק את הסופרנטנט. חזור על שלב השטיפה המימי הזה שלוש פעמים.
  4. איזון עם LSB
    1. הוסיפו 25–30 מ"ל של LSB ללא דטרגנט לחרוזים. נער או סובב את הצינור על שולחן מסתובב כדי לערבב ולדגור במשך 20 דקות.
    2. זרוק את הסופרנטנט. חזור על שלב האיזון של LSB זה שלוש פעמים כדי למצב את החרוזים במלואם.
  5. אליקיוטינג ואחסון
    1. חלק את חרוזי הביולוגיה המופעלים שווה בשווה לשלושה צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. ודאו שהחרוזים נשארים רטובים בכמות קטנה של LSB.
    2. עטוף את הצינורות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ואחסן אותם על קרח לשימוש מיידי.

4. הרכבת הננו-דיסק

  1. הכנת ליפידים ו-MSP
    1. הבהרת מאגר השומן: שלפו אליקו אחד של מלאי השומנים המוכן מראש והפשרו אותו. מיד צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 7,000 x g למשך 5 שניות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את התכולה בתחתית.
    2. עשו אולטרסוניקה באמבט מים ועקוב אחרי הבהירות והטמפרטורה כל 5–10 דקות כדי למנוע התחממות יתר. בצע סוניקציה במשרעת של 60%. יש לבצע אולטרסוניקציה של המאגר של הליפידים עד שהחומר הופך לשקופ ונקי.
    3. הפשרת MSP: הפשרה של 1 אליקוט של תמיסת MSP מוכנה באמבט מים קרים.
  2. הכינו את הבופר לפי היחס הסטוכיומטרי.
    1. כימות את חלבון הממברנה: בודד את חלבון הממברנה המטוהר (משימה 2), הממוסס ב-0.025% DDM/0.005% CHS, באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל (SEC). הזרקת נפח דגימה של 500 מיקרוליטר בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה לעמודת Superose 6 Increase (ציטיבה). אספו את השיא היוצא ב-14.8 מ"ל וריכזו אותו (איור 1). קבעו את ריכוז החלבון באמצעות NanoDrop.
    2. חשב את כמות המולר של החלבון: חשב את הכמות המולרית (n) של חלבון הממברנה היעד באמצעות הנוסחה: n = C × V, כאשר C הוא הריכוז המולרי ו-V הוא הנפח.
    3. קבעו את נפחי ה-MSP והליפידים: חישבו את נפחי ה-MSP והחומרים הנדרשים של תמיסות מאגר הליפידים בהתבסס על יחס סטואיכיומטרי מולרי של חלבון היעד: MSP : ליפיד = 1 : 5 : 250.
    4. הכנת תערובת המאסטר: בהתבסס על תוצאות החישוב, משלבים את נפחי הליפיד וה-MSP המתאימים להכנת תערובת מאסטר של 300 מיקרוליטר.
      הערה: ודאו שדטרגנט כלול בתערובת זו כדי לשמור על ריכוז התואם לזה שבתמיסת החלבון, ובכך למנוע הצטברות מוקדמת.
  3. הסרת חומרי ניקוי והרכבת ננו-דיסקים
    1. דגירה ראשונית עם תערובת שיקום: דגרו את בופר התערובת המוכנה (טבלה משלימה 1) על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, מוסיפים לאט 50 מיקרו-ליטר מהתערובת לתמיסת החלבון המרוכזת, תוך ערבוב עדין באמצעות פיפטינג כדי להבטיח הומוגניות.
    2. איזון תערובת חלבון-שומן: מניחים את התערובת המשולבת על קרח למשך שעה. הפוך בעדינות את הצינור כל 15 דקות כדי לערבב היטב.
    3. דגירה ראשונה עם חרוזי ביו: צנטריפוגה קצרה את התערובת בעוצמה של 7,000 x גרם למשך 5 שניות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את תמיסת החלבון בתחתית הצינור. קחו אליקו אחד מהביו-Beads המופעלים מראש, שאבו את שאריות ה-LSB, הוסיפו את תמיסת החלבון לחרוזים, ודגרו עם סיבוב בחושך במשך שעה אחת כדי למנוע פירוק של חלבון המטרה שנגרם מאור על ידי אור.
    4. דגירה שנייה עם חרוזי ביו: צנטריפוגה את התערובת ב-7,000 x גרם למשך 5 שניות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והעבירה בזהירות את הסופרנטנט לאליקו שני של חרוזי ביו (שממנו נשאף גם ה-LSB) וערבבו היטב בהיפוך עדין בחושך למשך 4–8 שעות או לילה.
    5. דגירה סופית עם חרוזי ביולוגיה: שלפו את תמיסת החלבון לאחר דגירה לילה, בצנטריפוגה קצרה, והעבירו את הסופרנטנט לחלק השלישי והאחרון של חרוזי ביו-Beads המופעלים מראש. דגרו עם סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה.
    6. לאחר צנטריפוגה קצרה, העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי וצנטריפוגה בטמפרטורה של 17,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להסרת כל אגרגט.
      הערה: השליכו חרוזי ביולוגיה משומשים כפסולת ביולוגית.
    7. טיהור ננו-דיסקים: טיהור קומפלקסי הננו-דיסק-משימה 2 באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל (SEC): הזרקת נפח דגימה של 500 מיקרוליטר בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה לעמודת Superose 6 Increase ואיסוף שיא הנפילה של 15 מ"ל (איור 2).
    8. ריכוז התוצר הסופי: לאגד את חלקי השיא מהשחרור של SEC ולרכז אותם לריכוז סופי של ננו-דיסק-משימה 2 של 1.2–1.5 מ"ג/מ"ל, המתאים להכנת דגימות קריו-EM.

5. לוודא שהרכבה של הננו-דיסק הצליחה

  1. ניתוח SDS-PAGE: דגימות אליקווט מהחלקים המטוהרים ב-SEC.
    1. נתחו את הדגימות באמצעות 12% SDS-PAGE לאישור נוכחות רכיבים מרכזיים (למשל, MSP וחלבון ממברנה יעד), מה שמעיד על הרכבת ננו-דיסק מוצלחת (איור 3).
  2. הכנת וניתוח דגימות קריו-EM.
    1. ריכזו את הדגימה שהורכבה בהצלחה לריכוז סופי של 1.2–1.5 מ"ג/מ"ל לצורך הכנת דגימת קריו-EM.
    2. התחילו בצנטריפוגה של הדגימה בטמפרטורה של 17,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הפקיד טיפה של 3 מיקרוליטר על רשתות זהב קואנטיפויל R1.2/1.3 (300 רשתות, פחמן חורי).
    3. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בלחות של 100% למשך 5 שניות. לכבוש את הרשת ל-4 שניות ב-Vitrobot Mark IV והקפאה באתאן נוזלי שנשמר בטמפרטורת חנקן נוזלי.
    4. אסוף ערימות סרטים ברזולוציה על-על באמצעות תוכנת EPU על טיטאן קריוס G4 קריו-EM הפועל בתדר 300 קילו-וולט ומצויד בגלאי אלקטרונים ישיר של Falcon G4i.
    5. הגדר את זמן החשיפה ל-2.78 שניות, התואם לגודל פיקסל של 0.73 Å (165k ×) ומנה מצטברת של כ-50 e⁻/Å 2 לכל ערימת סרט EER.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנה מוצלחת של מאגר הליפידים נרשמה על ידי יצירת תמיסה שקופה ושקופה לאחר סוניקציה. עבור ה-MSP, כרומטוגרפיה עם נטיות ניקל הניבה מוצר טהור גבוה בכ-3 מ"ג/מ"ל. הרכבת הננו-דיסקים אושרה על ידי SEC, שהציגה פרופיל שחרור אופייני (איור 2). בהשוואה לפרופיל SEC של משימה 2 שהושג לפני הרכבת הננודיסק (איור 1), שיא החלבון משתנה לנפח שחרור גבוה יותר (שחרור מאוחר יותר) לאחר ההרכבה. כפי שמוצג באיור 2, פרופיל ה-SEC מציג שני פסגות עיקריות: קומפלקס הנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה מיועדת לשחזור חלבוני ממברנה ממוססים בדטרגנט לננודיסקים באמצעות הסרת חומר ניקוי, ובכך מספקת סביבה דו-שכבתית שומנים טבעית יותר. הצלחת תהליך ההרכבה הזה תלויה במספר גורמים מרכזיים. הבולט שבהם הוא היחס המדויק בין חלבון הממברנה, MSP והליפידים. יחסים סטוכיומטריים לא תקינים עלולים להוביל להצטברות חלבונים או להרכבה לא מוצלחת. לדוגמה, הניסיון הראשון להרכיב ננו-דיסקים ביחס 1:2:50 הוביל לאגרגציה מלאה של משימה 2. לכן, יש צורך באופטימיזציה של היחס הסטוכיומטרי כדי להשיג הרכבה מוצלחת. הכנת מלאי הש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לצוות מרכז הקריו-EM באוניברסיטת הנאן, וכן לפרופסור ווי וואנג, על תמיכתם המקצועית. המימון סופק על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים 32371261 ל-B.L. ו-32301011 ל-R.Z.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חרוזי ביולוגיהביו-רד1523920
כולסטריל המיסוצינאטאנטרייספרק 210
כלורופורםסינוראג'נטשימוש במכסה אדים
סמיםאוונטי850725P
מתנולסינוראג'נט
n-דודציל-בטא-D-מאלטוסידאנטרייסD310
נ-פנטייןאדמאסשימוש במכסה אדים
POPCאוונטי850457P
פופסאוונטי840034P
SECביו-רדפעלו לפי פרוטוקול היצרן לשימוש נכון
צינור הדיאליזה של SnakeSkinתרמו68011
Superose  6 עלייה 10/300 GLציטיבה29091596
עמודות סיבוב אולטרפילטרציה אמיקון אולטרה-15מיליפורUFC905008

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Task2SECSDS PAGE

מאמרים קשורים