מאמר שיטה

פיתוח ננוביסיקולות עטופות בממברנה של תאי גזע מזנכימיים לשיפור העברת הגנים

DOI:

10.3791/70316

⸱

17 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Faculty of Arts and Sciences, Beijing Normal University at Zhuhai, 2Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology, 3Guangdong Hengqin United Life Science Co., Ltd., 4Center for Biological Science and Technology, Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology of Ministry of Education, Zhuhai-Macao Biotechnology Joint Laboratory, Beijing Normal University at Zhuhai

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה לייצור וטיהור ביומימטיקה של וזיקולה חוץ-תאית שמקורם בתאי גזע מזנכימיים (MSC) לטיפול גנטי. הננווסיקולה מוגבלת לשכבות ליפידים שמקורן ב-MSC ומכילה AAVs רקומביננטיים הנושאים את הגן המעניין בלומן. ננו-ווסיקולה זו מספקת וקטור משופר להעברת גנים ב-in vivo .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בתאי גזע מזנכימליים (MSC) מחזיקות פוטנציאל רב ליישומים טיפוליים ולרפואה רגנרטיבית. EVs הם וזיקולות בקנה מידה ננומטרי המופרשים על ידי כל סוגי התאים הידועים, הנושאים מטענים מגוונים כולל חלבונים מעוגנים בממברנה, גורמים מסיסיים, מיני RNA מרובים ומטבוליטים המווסתים את הפיזיולוגיה וההתנהגות של תאים מקבלים. בעוד שרכבים חשמליים שמקורם ב-MSC או מהונדסים יכולים לספק חלבונים ו-RNA טיפוליים, העברת DNA בתיווך EV נותרת אתגר בשל חוסר מנגנונים יעילים למיון רצפי DNA לוסיקולות. עבודות קודמות של הקבוצה שלנו ושל אחרים הראה כי EVs המכילים וירוס אדנו-מקוש (AAV) מאפשרים משלוח גרעיני ממוקד וביטוי גנים מתמשך במבחנה ובחיי. עם זאת, הייצור והבידוד שלהם הוגבלו בשל פרוצדורות עם תפוקה נמוכה ופרוצדורות ארוכות זמן. כאן אנו מדווחים על התפתחות ננו-וזיקולות עטופות ממברנת MSC שנוצרו בשיטת אקסטרוזיה מוגדרת בגודל להעברת גנים יעילה. וזיקולות אלו, בקוטר של כ-200 ננומטר, מחקות את תכונות ה-EVs הטבעיות תוך קיפוזציה של וקטורי AAV רקומביננטיים הנושאים רצפי גנים טיפוליים. בהשוואה ל-AAVs קונבנציונליים, הוזיקולות MSC המהונדסות שיפרו את יעילות העברת הגנים והשיגו תפוקות גבוהות משמעותית עם זמן ועלות מופחדים יחסית ל-EV-AAV המופרשים באופן טבעי. לסיכום, אנו מציגים פלטפורמת ננו-ווסיקולות ממברנה מבוססת MSC חדשנית המשלבת את היתרונות של מבנים המחקים EV עם העברת גנים בתיווך AAV. גישה זו משפרת את יעילות האספקה ואת יכולת ההרחבה של הייצור, ומציעה אסטרטגיה מבטיחה לקידום טיפול גנטי לעבר תרגום קליני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול גנטי מייצג גישה טרנספורמטיבית לטיפול במחלות גנטיות ונרכשות על ידי הכנסה, החלפה או השתקה של גנים מסוימים לשיקום תפקוד תאי תקין. במהלך שני העשורים האחרונים, התקדמות בהנדסת וקטורים ואסטרטגיות הפצה הרחיבה משמעותית את הנוף הטיפולי של טיפול גנטי. מבין מערכות הווקטור השונות שפותחו, וירוס אדנו-קשור (AAV) הפך לאחת הפלטפורמות המצליחות והנפוצות ביותר בזכות פרופיל הבטיחות המועדף שלו, הטרנסדוקציה היעילה והביטוי הגנטי ארוך הטווח שלו הן בתאים מתחלקים והן בתאים לא מתחלקים 1,2. עד כה, מספר טיפולים מבוססי AAV קיבלו אישור רגולטורי לשימוש קליני, כולל טיפולים בניוון שרירי עמוד השדרה, דיסטרופיות רשתית והמופיליה, מה שמסמן אבני דרך חשובות ברפואה תרגומית3. הטרופיזם הרחב והאימונוגניות הנמוכה של וקטורי AAV אפשרו גם את יישומם במגוון רקמות, כולל הכבד, השריר, מערכת העצבים המרכזיתוהעין. כתוצאה מכך, AAV הפכה לפלטפורמה מובילה להעברת גנים ב-in vivo, התומכת במחקרים פרה-קליניים וקליניים מתמשכים המתמקדים בהפרעות מטבוליות, נוירולוגיות וכלי דם.

למרות הצלחתו הקלינית המרשימה, טיפול גנטי מבוסס AAV מתמודד עם מספר אתגרים מהותיים שממשיכים להגביל את יישומו הרחב. מגבלה מרכזית אחת טמונה בקיבולת האריזה המוגבלת של קפסיד AAV (~4.7 קילובייט), מה שמגביל את השימוש בו להעברת גנים טיפוליים גדולים או מרובים 5,6. בנוסף, ההתפלגות הביולוגית והטרופיזם התאי של וקטורי AAV נקבעים בעיקר על ידי הסרוטיפים שלהם, שכל אחד מהם מפגין זיקות ייחודיות לרקמות ספציפיות. למרות שאסטרטגיות הנדסת קפסידים והצגת פפטידים נרחבות שימשו לשיפור יעילות המיקוד והטרנסדוקציה של הרקמות, השגת טרופיזם מדויק וניתן לחיזוי בהקשרים ביולוגיים מגוונים נותרה מכשול משמעותי7. מגבלה קריטית נוספת היא השכיחות של נוגדנים מנטרלים קיימים (NAbs) נגד סרוטיפים טבעיים של AAV באוכלוסייה האנושית. אפילו רמות נמוכות של NAbs יכולות להפחית משמעותית את יעילות הטרנסדוקציה הווקטורית, להגביל את זכאות המטופל ולסבך מינון חוזר 8,9. אסטרטגיות שונות, כגון עיצוב מחדש של קפסיד רציונלי, משטרים מדכאי חיסון והחלפת פלזמה חולפת, נבדקו כדי להקל על ניטרול נוגדנים 10,11, אך גישות אלו מציעות הקלה חלקית או חולפת בלבד. ביחד, מגבלות אלו מפחיתות את היעילות הטיפולית הכוללת ואת השחזור של העברת גנים בתיווך AAV בסביבות קליניות.

בשנים האחרונות, נבחן AAV OVER-VESIKOLE (EV-AAV) חוץ-תאית כחלופה עם פוטנציאל להתגבר על מספר מגבלות מרכזיות של AAV קונבנציונליים 12,13,14,15. במהלך אריזת וקטור, חלק מחלקיקי AAV יכולים להפריש דרך מסלולי נדידה וזיקולריים ולהיסגר בתוך ווסיקולות חוץ-תאיות. תהליך זה נחשב למעורב בחלבון עזר מקושר ממברנה (MAAP) המקודד על ידי AAV, שמקל על יציאת וירוס ומקדם אסוציאציה לממברנה16,17. חלקיקי EV-AAV שנוצרו מציגים יעילות משופרת בטרנסדוקציה ועמידות מוגברת לנוגדנים מנטרלים בהשוואה ל-AAV קונבנציונלי, בעיקר בזכות ממברנת הוזיקולרית שמקדמת קליטה תאית ומספקת הגנה חלקית מזיהוי נוגדנים18. עם זאת, למרות היתרונות הללו, ייצור EV-AAV נותר לא יעיל. בדרך כלל, רק חלק קטן מהגנומים הווקטוריים (כ-0.5%-12%) מופרשים לתוך מדיום התרבית כ-AAV הקשורים ל-EV, בעוד שרובם נשארים תוך-תאיים או קיימים כ-AAV חופשיים12,13. כתוצאה מכך, נדרשת ייצור בקנה מידה גדול כדי להשיג תפוקת וקטורים מספקת. יתרה מזאת, ייצור EV-AAV הוכח בעיקר באמצעות תאי יצרן HEK293T, כאשר הרכבים החשמליים שלהם עשויים להראות ניקוי כבדי מהיר, מחצית חיים קצרה במחזור הדם, וחששות פוטנציאליים לבטיחות ביולוגית. מגבלות אלו מדגישות את הצורך באסטרטגיית עטיפת ממברנה יעילה ומותאמת אישית, המניעה את פיתוח פלטפורמת AAV עטופה בממברנת התא (CME-AAV) שהוצגה במחקר זה.

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) ותאי הגזע החשמליים שלהם נחקרו בהרחבה בשל פוטנציאל ההתחדשות שלהם ותכונותיהם התחמקות ממערכת החיסון. מעבר לטיפולים המבוססים על תאים או EVs מופרשים באופן טבעי, מחקרים עדכניים הראו גישה חלופית לשיפור אספקת התרופות באמצעות ננו-חלקיקים המוסווים בממברנות MSC 19,20,21. ציפוי ממברנת ה-MSC מעניק יכולת מיקוד פעילה, מפחית את הפינוי החיסוני ומאריך את זמן המחזור, שהשפעותיו ככל הנראה מיוחסות להרכב המולקולרי הפנימי של ממברנות שמקורן ב-MSC22,23. בהתבסס על רעיון זה, השתמשנו בחומר ממברנה שמקורו ב-MSC כדי לבנות ננווסיקולה עטופה בממרום התא (CME-AAV) להעברת גנים. לשם כך, מקטעי ממברנת MSC מטוהרים עורבבו עם חלקיקי AAV רקומביננטיים ועברו תהליך אקסטרוזיה מבוקר, טכניקה שנקבעה במקור לייצור ליפוזומים24,25. באמצעות אקסטרוזיה מוגדרת לגודל, רכיבי הממברנה מתאספים באופן ספונטני לוסיקולות בקנה מידה ננומטרי המכילים חלקיקי AAV. ה-CME-AAVs שהתקבלו טוהרו עוד יותר מ-AAV חופשי וללא מעטפת באמצעות צנטריפוגה מבוססת גרדיאנט צפיפות. אסטרטגיה זו מאפשרת הכנה יעילה וניתנת לשחזור של וקטורי AAV עטופים בממברנה, המפגינים יעילות העברה משופרת בהשוואה ל-AAVs קונבנציונליים ושומרים על עמידות דומה לנוגדנים מנטרלים כמו EV-AAVs. על ידי החלפת טרנסגנים שונים, פלטפורמת CME-AAV מחזיקה בפוטנציאל רחב לטיפול במחלות גנטיות ונרכשות שונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של אוניברסיטת בייג'ינג נורמל בז'והאי, סין. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנה ויצירת CME-AAV באמצעות אקסטרוזיה לפי גודל נקבוביות

  1. ייצור וקטורי AAV רקומביננטיים
    הערה: פרוטוקול ייצור ה-AAV עוקב אחר נהלים שפורסמו בעבר והיו בשימוש נרחב. שלבי אופטימיזציה מפורטים ושינויים תוארו במחקרים קודמים12,26.
    1. תרב HEK293T תאים בתווך גדילה מלא ושמור על מפגש של 70%-80% ביום הטרנספקציה.
    2. הכינו שלושה פלסמידים המקודדים (i) וקטור ההעברה של AAV הנושא את הגן המעוניין, (ii) גני ה-rep/cap של AAV התואמים לסרוטיפ הרצוי, ו-(iii) פונקציות עזר אדנו-ויראליות.
    3. קו-טרנספקט של תאי HEK293T עם שלושת הפלסמידים באמצעות שיטת טרנספקציה מוכרת (למשל, סידן פוספט או טרנספקטציה מבוססת פולימר), בהתאם לשיטות מעבדתיות סטנדרטיות.
    4. דגרו תאים שעברו טרנספקט במשך 48-72 שעות כדי לאפשר הרכבה והצטברות של AAV.
    5. לאסוף תאים ומדיום תרבית, ולשחרר חלקיקי AAV באמצעות מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים או שיטת ניתוק תאים מקבילה.
    6. צנטריפוגה את הליזאט במהירות נמוכה כדי להסיר פסולת תאים ולאסוף את הסופרנטנט המכיל חלקיקי AAV.
    7. לטהר חלקיקי AAV באמצעות גרדיאנט צפיפות באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה או שיטת טיהור מוכרת נוספת.
    8. החלפת וקטורים מטוהרים של AAV לסליין סטרילי עם בופר עם פוספט (PBS) ואחסן אליקואטים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. הכנת שבר ממברנת ה-MSC
    הערה: תאי גזע מזנכימיים אנושיים (MSCs) בודדו בהתאם להנחיות המוסדיות. התאים גודלו והורחבו בתנאים שנקבעו או בפרוטוקולים שעברו התאמות במעבדה. ניתן לאשר את זהות MSC על ידי הערכת הביטוי של סמנים פנוטיפיים כגון CD73, CD90 ו-CD105 באמצעות ציטומטריית זרימה. הרב-עוצמה של MSCs מאומת על ידי יכולתם להתמיין לאוסטאובלסטים, כונדרוציטים ושומנים במבחנה. התאים מוכנים לאיסוף כאשר הם מגיעים ל-70%-90% התנגשות. ההליכים הבאים אינם בהכרח נדרשים לביצוע בתנאים סטריליים.
    1. הסר את מדיום התרבית ונתק את ה-MSCs מהצלחת באמצעות מגרדת תאים.
    2. אסוף תאים מנותקים לצינור חרוטי המכיל PBS וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשחרר את התאים.
    3. שטוף את התאים פעמיים עם PBS, וצנטריפוגה בכל פעם ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. החזירו את כדור התא הסופי ב-PBS בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז.
    5. חשוף את תליית התא לשלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי לשבש את ממברנת הפלזמה וליצור ליזאט תאי גס.
    6. פיפט היטב של הליזאט כדי להומוגן, ואז צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאית.
    7. העבר את הסופרנטנט לצינור וצנטריפוגה חדשים ב-18,000 × גרם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לשחרר את שבר הממברנה.
    8. להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את כדור הממברנה שנוצר ב-PBS. תלייה זו מייצגת את שבר הממברנה הגולמי של MSC ותשמש לכיסוי AAV.
    9. הומוגניזציה של תליית הממברנה על ידי העברתה ברצף דרך מזרקים המצוידים במחטים של 20 G עד 27 G.
    10. קבעו את ריכוז החלבון של ההשעיה ההומוגנית של הממברנה באמצעות בדיקת BCA. עליקו ואחסנו את המתלה בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס, או המשיכו ישירות לשלבים הבאים. הומוגניזציה מחדש של תליית הממברנה באמצעות מזרק של 27 גרם לאחר כל מחזור הפשרה.
  3. היווצרות CME-AAV באמצעות אקסטרוזיה
    1. מערבבים את תליית הממברנה המוכנה עם AAVs ביחס מוגדר של 150 מיקרוגרם חלבון ממברנה לכל 1 ×10 עותקי גנום (g.c.) של AAV. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ניעור עדין.
    2. טעינו את תערובת הממברנה-AAV על מיני-אקסטרודר המצויד בממברנת פוליקרבונט (PC) של 400 ננומטר. העבירו את הדגימה דרך האקסטרודר 20 פעמים כדי לקדם את עטיפת הממברנה-AAV.
    3. החלף את ממברנת ה-PC של 400 ננומטר בממברנה של 200 ננומטר וחזור על תהליך האקסטרוזיה 20 פעמים כדי להפחית עוד יותר את ההטרוגניות של גודל הווסיקולה.
    4. אסוף את התערובת המעובדת. אם נדרשת כמות גדולה יותר, יש לאסוף מספר אצוות אקסטרוזיה. המתלה המתקבל מכיל CME-AAVs, יחד עם AAVs לא מקופלים ווזיקולות ממברנה ריקות. המשך מיד לטיהור CME-AAV.

2. טיהור CME-AAV באמצעות צנטריפוגה של גרדיאנט צפיפות

הערה: שלב זה מתאר את ההפרדה של CME-AAV טהור מ-AAV לא מכוסה, אגרגטים חלבונים וחומצות גרעין שאריתיות באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה בגרדיאנט צפיפות מבוססת יודיקסנול. ה-CME-AAV המטוהר שמתקבל בשלב זה מתאים הן למחקרים במבחנה והן למחקרים ב-invivo . מומלץ לבצע את כל ההליכים תחת מכסה תרבית רקמה סטרילי.

  1. הכנת גרדיאנט יודיקסנול
    1. הכינו תמיסות יודיקסנול של 40% ו-25% על ידי דילול תמיסת המאגר ב-10× PBS ומים דה-יוניים סטריליים להשגת ריכוז סופי ב-1× PBS.
    2. בצינור פתוח עם דפנות דקות ואולטרה-שקוף בנפח 13.2 מ"ל, יש לקבוע בזהירות גרדיאנט צפיפות לא רציף על ידי הנחת 1 מ"ל של 40% יודיקסנול ו-3 מ"ל של 25% יודיקסנול מלמטה.
    3. שכב בעדינות 7 מ"ל של המתלה המכיל CME-AAV שהתקבל משלב 1.14 על ראש השיפוע. איזון הצינורות וטען אותם לרוטור דלי סווינג אולטרה-צנטריפוגה.
  2. אולטרצנטריפוגציה ואיסוף שברים של CME-AAV
    1. צנטריפוגה את הגרדיאנט ב-150,000 × גרם למשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות האצה מהירה והאטה איטית (רמה 9 ורמה 1, בהתאמה).
    2. הסר בזהירות את הצינורות מהרוטור מבלי להפריע למדרון. אסוף שברים של 1 מ"ל מהחלק העליון לתחתית הצינור לצינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים בנפח 1.5 מ"ל (F1-F11). תשמור על כל השברים בקפיא.
    3. זהה ואיגד את החלקים F7 ו-F8, המכילים את ה-CME-AAV המטוהרים, לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה פתוח חדש. מוסיפים PBS לנפח כולל של 11 מ"ל ומערבבים בעדינות עם פיפטה של 1 מ"ל.
  3. שטיפה והתאוששות של CME-AAV
    1. צנטריפוגה שוב את החלקים המצטברים ב-150,000 × גרם למשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות האצה מהירה והאטה מהירה (רמה 9 לשתי ההגדרות).
    2. השליכו בזהירות את הסופרנטנט ותחזירו את כדור ה-CME-AAV ל-50-200 מיקרוליטר של PBS סטרילי, בהתאם לריכוז הרצוי.
    3. יש אליקווט לפי הצורך ואחסן בטמפרטורה של −80°C עד לשימוש נוסף.

3. אפיון CME-AAV באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים במעבר (TEM)

הערה: מיקרוסקופיית אלקטרונים במעבר (TEM) משמשת להמחשת המורפולוגיה, הגודל ומבנה הממברנה של חלקיקי CME-AAV. ההליך פועל לפי פרוטוקול צביעה שלילית סטנדרטי הדומה לזה המשמש לוזיקולות חוץ-תאיות. כל השלבים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

  1. הכנת דגימה וקיבוע
    1. דילל את המתלה המטוהרת CME-AAV שהתקבלה משלב 2 לריכוז של כ-1 × 109-1 ×10 חלקיקים למ"ל ב-PBS.
    2. קבע את הדגימה על ידי הוספת כמות שווה של פרפורמלדהיד טרי של 4% (ריכוז סופי של 2%) ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הנח רשת נחושת מצופה פורמבר/פחמן (200 רשתות) על יריעת סרט פרפין, צד הפחמן כלפי מעלה.
    4. פיפט של 10 מיקרוליטר של המתלה הקבוע CME-AAV אל הרשת ומאפשר ספיחה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הימנע מייבוש בזמן הספיחה.
    5. הסר בעדינות נוזל עודף מקצה הרשת באמצעות נייר פילטר מבלי לגעת במרכז.
  2. כביסה וקיבוע לאחר
    1. צף את הרשת, צד הדגימה כלפי מטה, על טיפה של 50 מיקרוליטר של PBS למשך 2 דקות לשטיפה. חזור פעמיים.
    2. העבר את הרשת לטיפה של 50 מיקרוליטר של 1% גלוטראלדהיד למשך 5 דקות לייצוב מבנה הממברנה.
    3. שטפו את הרשת ברצף 5 פעמים עם טיפות מים דה-יוניים (30 שניות כל אחת) כדי להסיר מלחי בופר. למרוח בעדינות אחרי הכביסה האחרונה.
  3. צביעה שלילית
    1. הנח את הרשת על טיפה של 50 מיקרו ליטר של 2% אורניל אצטט מימי למשך דקה אחת כדי להשיג צביעה שלילית.
    2. הסר כתמים עודפים על ידי נגיעה עדינה בקצה הרשת עם נייר פילטר ואפשר לו להתייבש באוויר לחלוטין בטמפרטורת החדר.
  4. הדמיה
    1. בדקו את הרשתות המוצבעות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הולכה הפועל בתדר 200 קילו-וולט.
    2. ללכוד תמונות מייצגות בהגדלות בין 30,000× ל-120,000× להערכת מורפולוגיית CME-AAV ושלמות הממברנה.
    3. באופן אופציונלי, למדוד קוטר חלקיקים באמצעות תוכנת ניתוח תמונות TEM כדי לאשר את עקביות גודל הווסיקולות עם תוצאות NTA.
      הערה: ריכוז הדגימה - כוונן את ריכוז CME-AAV לקבלת צפיפות חלקיקים מתונה; דגימות מרוכזות מדי גורמות לחפיפת חלקיקים, בעוד שדגימות מדוללות מדי מניבות מעט וזיקולות ניתנות לזיהוי. הימנעות מהחפצים - שטיפה לא שלמה עלולה להשאיר גבישי מלח שמסתירים את המחשת החלקיקים. ודאו שהרשתות נשארות לחות לאורך כל הצביעה כדי למנוע קריסת ממברנה. צבעים חלופיים - חומצה פוספוטונגסטית (PTA, 1%-2%, pH 7.0) עשויה לשמש כחלופה לאורניל אצטט אם חלות הגבלות טיפול רדיואקטיבי. אחסון - רשתות מוכנות יכולות להיאחסן במיכל נטול אבק בטמפרטורת החדר למשך מספר ימים לפני ההדמיה, אם כי מומלץ לצפות מיידית לניגודיות מיטבית.

4. כימות CME-AAV באמצעות qPCR

הערה: שלב זה מתאר שיטה מבוססת qPCR לכימות עותקי גנום CME-AAV (g.c./μL). הפרוטוקול מדגיש הכנת דגימות ספציפיות ל-CME-AAV ודיווח נתונים. כל שאר ההיבטים של הקמה ומחזור qPCR צריכים לעמוד בשיטות המעבדה הסטנדרטיות ובהוראות היצרן עבור ערכת ה-qPCR הנבחרת.

  1. דגימה והכנה סטנדרטית
    1. הפשיר את האליקוטים של CME-AAV מטוהר על קרח וערבב בעדינות באמצעות פיפטינג. הימנע ממערבולת.
    2. הכינו את הדילול הסטנדרטי של AAV מ-1 × 10⁶ ל-1 × 10³ g.c./μL על ידי דילול עוקב של 10 פעמים באמצעות מים דה-יוניים ללא נוקלאז או בופר TE. הכינו תקנים טריים או באליקווט ואחסנו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס לשימוש קצר טווח.
    3. הכינו את הבקרות הבאות: בקרה ללא תבנית (NTC; מים), בקרה שלילית (PBS או מטריצה ריקה), ובקרת בקרה חיובית (דגימת AAV בריכוז ידוע), אם קיים.
    4. הכינו תערובת מאסטר של qPCR על קרח בהתאם להוראות היצרן לכימיה שנבחרה (מבוססת צבע או גשוש).
  2. מחזור qPCR וניתוח נתונים
    1. הרץ את ה-qPCR לפי פרמטרי המחזור שמומלץ על ידי יצרן המיקס הראשי של qPCR.
    2. יצירת עקומה סטנדרטית על ידי ציור Ct (ציר y) מול log10 (ריכוז סטנדרטי ב-g.c./μL) (ציר x). מתאים רגרסיה ליניארית לקבלת שיפוע (m) ו-y-intercept (b).
    3. חישבו את ריכוז הגנום של CME-AAV עבור כל דגימה, שכפול באמצעות משוואת הרגרסיה:
      figure-protocol-1או
      figure-protocol-2
      כאשר C הוא עותקים גנומיים לכל μL.
    4. הממוצע הטכני משכפל ומדווח על ריכוז CME-AAV סופי כ-g.c./μL.
      הערה: מכיוון שדנטורציה של חום במהלך הכנת qPCR משבשת הן את הממברנה העוטפת והן את קפסידי ה-AAV, אין צורך בחילוץ DNA נפרד. אין לבצע טיפול ב-DNase בדגימות לפני פירוק חום; DNase יכול לגשת ולפרק את גנום AAV לאחר שהקפסידים/ממברנות מופרעות, אך לפני שהדגימה מגיעה לטמפרטורות שמבטלות את DNase. יש להתאים את התקנים כאשר ניתן: להכין עקומת תקן מתוך תקן AAV מאופיין היטב. אם הדגימות או הסטנדרטים שלך שונים בתצורת הגנום (AAV חד-גדילי לעומת AAV משלים עצמי/דו-גדילי), התאם את הערכים המדווחים בהתאם. עיצוב פריימר/פרוב: פריימרים יכולים לכוון לכל רצף AAV משומר; לדוגמה, משתמשים נפוצים בפריימרים המכוונים למקדם CMV (מעלה הגן המועבר).

5. כימות פרופילי חלקיקי CME-AAV

  1. השתמש בניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA), חישה פולסים עמידה ניתנת לכיוון (TRPS), או טכניקות ניתוח חלקיקים דומות כדי לקבוע את התפלגות הגודל והריכוז של חלקיקים של תכשירים CME-AAV.
  2. הפשרה דגימות CME-AAV מטוהרות על קרח והומוגניזציה עדינה על ידי פיפטינג לפני הניתוח. לבצע מדידות בהתאם לשיטות המעבדה הסטנדרטיות ולהוראות היצרן עבור המכשיר הנבחר, כפי שמתואר בפרוטוקולים שפורסמובעבר 12,27,28,29.

6. ניתוח חוץ גופי של העברת גנים בתיווך CME-AAV

הערה: שלב זה מתאר את ההליך להערכת העברת גנים בתיווך CME-AAV וביטוי גנים טרנסג'נים בתאים מתורבתים. הבדיקה מודגמת באמצעות תאי HEK293T ו-CME-AAV9. EGFP, אך ניתן להתאים אותו לסוגי תאים אחרים או למבני מדווח. AAV9 קונבנציונלי (לא עטוף ממברנה). EGFP משמש כבקרה חיובית, בעוד ש-PBS או חלקיקי AAV ריקים משמשים כבקרות שליליות.

  1. הכנת תאים
    1. תרבית HEK293T תאים בתנאים סטנדרטיים (DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין) בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂.
    2. תאי זריעה ללוחות של 48 בארים או 96 בארות כדי להגיע לכ-70% מפגש בזמן ההעברה (בדרך כלל 24 שעות לאחר הזריעה). כוון את צפיפות הזריעה לפי גודל הבאר (למשל, ~5 × תאים 10⁴ לבאר עבור לוח 48 בארות או ~1 × תאים 10⁴ לבאר לפלטת 96 בארות).
    3. אפשר לתאים להתחבר ולהתאזן במשך 24 שעות לפני הוספת וקטורים.
  2. יישום וקטורי
    1. הכינו CME-AAV9. EGFP ו-AAV9. פתרונות עובדים של EGFP ב-PBS סטרילי. מינון וירוסי טיפוסי: 5 × 10⁸ גרם לכל 48 בארות (מותאם לפי עוצמת המקדם, גן המטרה ומטרות הניסוי).
    2. לכל באר, יש להוסיף עותקים שגנום שווים (g.c.) של CME-AAV9. EGFP או AAV9. EGFP ישירות למדיום התרבותי.
    3. כלול בארות בקרה שליליות עם נפח שקול של PBS או חלקיקי AAV ריקים.
    4. סובבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח פיזור אחיד והחזרו לאינקובטור.
    5. המשך דגירה למשך 24-72 שעות, בהתאם לפעילות הפרומוטר ולקינטיקת ביטוי הגנים המועברים. עבור EGFP מונע CMV בתאי HEK293T, פלואורסצנציה חזקה נצפית בדרך כלל בתוך 48 שעות.
  3. הדמיה וניתוח תאים חיים
    1. כאשר אתה מוכן להדמיה, שאפו בעדינות את מדיום התרבית ושטפו תאים פעמיים עם PBS כדי להסיר חלקיקים לא קשורים. הימנעו מניתוק תאים.
    2. גרעיני תאי צבע עם Hoechst 33342 (תואם לתאים חיים) בהתאם להוראות היצרן. אל תשתמש ב-DAPI לתאים חיים.
    3. לבצע הדמיית פלואורסצנציה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד במסננים מתאימים (למשל, עירור 488 ננומטר/פליטה 513 ננומטר עבור EGFP; עירור 350 ננומטר/פליטה 460 ננומטר עבור Hoechst).
    4. השתמשו ביעדים של 10× או 20× לכימות יעילות ההעברה ומטרת 63× למיקום תת-תאי ברזולוציה גבוהה במידת הצורך.
    5. לרכוש לפחות חמישה שדות ראייה בכל באר (למשל, ארבע פינות ומרכז אחד) באמצעות פרמטרי הדמיה זהים (זמן חשיפה, רווח, צמצם וכו').
    6. שמור את כל התמונות בפורמטים גולמיים ואפורים לניתוח כמותי.
  4. ניתוח תמונה כמותי
    1. תמונות פתוחות בתוכנה ImageJ (FIJI) או בתוכנה מקבילה.
    2. למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת הן עבור ערוצי EGFP והן עבור ערוצי Hoechst לכל שדה.
    3. קביעת עוצמת הרקע על ידי בחירת אזור ללא אות פלואורסצנטי וממוצע ערכי פיקסלים.
    4. חשב עוצמה מתוקנת לכל ערוץ:
      תיקנתי =אני מתכוון -רקע
    5. מחשבים עוצמה מנורמלת לכל שדה כך:
      figure-protocol-3
    6. עוצמות ממוצעות מנורמליות לפחות מחמישה שדות בכל באר, ודיווחו על ממוצע ±SD בשלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.
      הערה: CME-AAV בדרך כלל מדגים עוצמת פלואורסצנציה מוגברת ביחס ל-AAV קונבנציונלי כאשר משתמשים עותקי גנום שווים, מה שמשקף קליטה תאית טובה יותר ו/או הגנה מפני נוגדנים מנטרלים. יעילות הטרנסדוקציה האופטימלית תלויה באיכות הכנת CME-AAV, סוג התא, חוזק הפרומטר וטיטר הוויראלי. אם נצפים אותות חלשים, יש להגדיל את קלט העתק הגנום, לאשר את שלמות הווקטור באמצעות qPCR, ולאמת את כיול המיקרוסקופ. מספרים פלואורסצנטיים אחרים (למשל, mCherry, mNeonGreen, tdTomato) או מבני לוסיפראז עשויים לשמש בהתאם לצרכים הניסיוניים. בעת עבודה עם תאים ראשוניים או לא דבוקים, יש להתאים את תנאי הזריעה וההדמיה בהתאם (למשל, ציפוי לוחות בפולי-L-ליזין או שימוש במחסניות תא).

7. הערכת CME-AAV - העברת גנים בתיווך במודל עכברו

הערה: שלב זה מתאר את הערכת העברת גנים בתיווך CME-AAV ב-vivo באמצעות מודל עכברים.

  1. הכנה לבעלי חיים
    1. השתמש בעכברים מסוג בר כמו C57BL/6. ודא שכל הליכי בעלי החיים מאושרים על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית ומבוצעים בהתאם לתקנות הרלוונטיות.
    2. בחרו עכברים בגיל 4-6 שבועות לעקביות מיטבית בין הניסויים.
    3. לשמור על בעלי חיים בתנאי מגורים סטנדרטיים עם גישה חופשית למזון ומים לפני ההזרקה.
  2. הכנה ומתן של וקטורים
    1. בחר סרוטיפ AAV בהתאם למטרת המחקר ולרקמת היעד. במחקר זה נעשה שימוש ב-AAV9 ו-CME-AAV9.
    2. הכינו וקטורים ויראליים המקודדים גן דיווח לוסיפראז (למשל, CME-AAV9.luciferase) להדמיה לא פולשנית.
    3. דילל את הווקטורים הוויראליים בסליין סטרילי לריכוז סופי של עותקי גנום 1 × 10¹° (g.c.) לכל 50 מיקרוליטר לכל עכבר.
    4. חממו את הזנב בעדינות באמצעות כרית חימום או מים חמים להרחבת הווריד לפני ההזרקה.
    5. טעין 50 מיקרוליטר של תלייה ויראלית לתוך מזרק אינסולין של 31 גרם והזרקה לאט לווריד הזנב הלטרלי כדי למזער דליפה וקרע בווריד.
    6. לאחר ההזרקה, החזירו את העכברים לכלוביהם ועוקבים אחריהם עד שיאוששו לחלוטין.
  3. הדמיה ביולומינצנצנטית ב-vivo
    1. שבועיים לאחר ההרדמה, יש להרדים את העכברים באיזופלוראן (לפי פרוטוקולים מאושרים על ידי המוסד) ולהזריק D-לוסיפרין (150 מיקרוגרם/גרם משקל גוף; סיגמא) תוך-פריטונית ב-PBS.
    2. הניחו את העכברים המורדמים במערכת הדמיה ביולומינציה.
    3. צלם תמונות זוהר כל 2 דקות לאחר ההזרקה עד שהאות מגיע לפלטו.
    4. כמת ביולומינסנציה באמצעות תוכנה מתאימה. הגדר אזורי עניין (ROIs) סביב אזורים זוהרים וחשב את שטף הפוטונים הכולל (פוטונים/שנייה) עבור כל בעל חיים.
    5. כלול קבוצות שטופלו ב-AAV9.luc וקבוצות שהוזרקו ב-PBS כביקורות חיוביות ושליליות, בהתאמה, להשוואה.
  4. הדמיה אקס-ויבו
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי.
    1. מיד לאחר הדמיה ב-invivo , בצע המתת חסד לעכברים ואיסוף איברים מרכזיים (כבד, לב, טחול, כליה ומוח).
    2. דמיינו את האיברים המבודדים תחת פרמטרי הדמיה זהים באמצעות אותה מערכת IVIS כדי לקבוע ביטוי לוסיפראז ספציפי לרקמה.
      הערה: ניתן לאמץ דרכי מתן חלופיות (למשל, הזרקה תוך-שרירית, תוך-מוחית או תוך-פרטונית) בהתאם למטרות הניסוי. עוצמת הביולומינסצנציה משקפת הן את יעילות העברת הגנים והן את הפצת הרקמות הביולוגית. ביטוי לוסיפראז המתוווך על ידי CME-AAV מציג בדרך כלל הופעה מוקדמת ושיפור בביטוי שיא בהשוואה ל-AAV חופשי, הנגרם מאנדוציטוזה המתווכת על ידי ממברנה על ידי תאים סופגים. ודא מינון לוסיפרין עקבי, תזמון והגדרות הדמיה בין דגימות להשוואה מדויקת. המינון הוויראלי המתואר (1 × 10¹° g.c. לעכבר) מספק בדרך כלל אות שניתן לזהות 2-4 שבועות לאחר ההזרקה, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה עבור וקטורים או מודלים של בעלי חיים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-MSCs ששימשו במחקר זה בודדו מרקמת חבל הטבור האנושית בהתאם להנחיות אתיות רלוונטיות. שברי ממברנת MSC הוכנו בהתאם לפרוטוקול המתואר. AAV9. EGFP יוצר פנימית באמצעות מערכת טרנספקציה כפולה של פלסמיד חולף בתאים HEK293T, כפי שדווח קודםלכן 12,26. לייצור CME-AAV, הכנות ממברנה ו-AAV9. ה-EGFP היה במצב דוגמה ביחס של 150 מיקרוגרם חלבון ממברנה ל-1 × 10¹° גנום ויראלי, כפי שמצוין בפרוטוקול. מיליליטר אחד מהתערובת נטען לאחר מכן למיני-אקסטרודר המצוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול CME-AAV

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת AAVs עטופים בממברנה של MSC, ומספר שלבים קריטיים ליצירת CME-AAV מוצלחת. ראשית, עיבוד מוקדם זהיר של ממברנת התא הוא חיוני. מטרת שלב זה היא להשיג שברי ממברנה המתאימים לאקסטרוזיה תוך מזעור זיהום מ-DNA גרעיני, חלבונים ציטוזוליים ואברונים תת-תאיים. בנוסף, גודל חלקי הממברנה הוא גורם מרכזי ליעילות האקסטרוזיה. שברים גדולים מדי עלולים לסתום את ממברנת האקסטרוזיה של הפוליקרבונט, בעוד שחומר ממברנה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד"ר דאופין וו הוא עובד בחברת גואנגדונג הנגצ'ין יונייטד לייף סיינס בע"מ. החברה לא סיפקה מימון למחקר זה ולא היה לה תפקיד בתכנון המחקר, איסוף הנתונים, ניתוח הנתונים, הכנת כתב יד או ההחלטה לפרסם. המחברים הנותרים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכה על ידי תוכנית ה-S&T של גואנגדונג (2023B0303010002) ל-DM, וקרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (2025A1515011134) ופרויקט מחקר בין-תחומי בפקולטה לאמנויות ומדעים של BNU (12900-311324240581) ל-YL. עבודה זו נתמכה עוד יותר על ידי המכשור והמומחיות הטכנית שסיפק מרכז הציוד והשירות למדע וטכנולוגיה באוניברסיטת בייג'ינג נורמל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bioluminescence imaging systemPerkinElmerIVIS Spectrum optical imaging system (Lumina III) 
D-Luciferin potassium saltYeasen Biotechnology40902ES03
Fetal bovine serum Yeasen Biotechnology40130ES76
Fluorescence microscopeZeiss Axio Observer 7
Formvar/carbon-coated copper grid 200 meshMillipore-SigmaTEM-FCF400CU
Glutaraldehyde Millipore-Sigma354400
HBSS GibcoC14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master MixYeasen Biotechnology11205ES08
High-glucose Dulbecco's modified Eagle's mediumHycloneSH30243
High-speed centrifugeBeckman CoulterAvanti J-E
Hoechst 33342 BeyotimeC1022
NTA instrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300 
Open-top thinwall ultra-clear tube for ultracentrifuge Beckman Coulter344059
OptiPrep iodixanol Millipore-SigmaD1556
Paraformaldehyde 4%BeyotimeP0099
PBSBiosharpBL302A
Penicillin-streptomycin Millipore-SigmaV900929
qPCR instrumentApplied Biosystems QS6 real-time PCR system 
Rotor for high-speed centrifugeBeckman CoulterJA-25.50 
SW 41 Ti Swing-bucket rotor for ultracentrifuge Beckman Coulter331362
Transmission electron microscope JEOLJEM-2100F 
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima XE-100
Uranyl acetate Electron Microscopy SciencesNC1375332
Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (200 nm)Cytiva10417004
Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (400 nm)Cytiva10417104

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 21 (4), 255-272 (2020).
  3. Mendell, J. R., et al. Current clinical applications of in vivo gene therapy with AAVs. Mol Ther. 29 (2), 464-488 (2021).
  4. Crunkhorn, S. Profiling aav tropism. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 183(2023).
  5. Kosaka, M., et al. Evaluation of the loading capacity and patterns of packaged DNA in AAV genomes of different sizes using long-read sequencing. Mol Ther Methods Clin Dev. 33 (2), 101474(2025).
  6. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Mol Ther. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  7. Lopez-Gordo, E., Chamberlain, K., Riyad, J. M., Kohlbrenner, E., Weber, T. Natural adeno-associated virus serotypes and engineered adeno-associated virus capsid variants: Tropism differences and mechanistic insights. Viruses. 16 (3), 442(2024).
  8. Louis Jeune, V., Joergensen, J. A., Hajjar, R. J., Weber, T. Pre-existing anti-adeno-associated virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy. Hum Gene Ther Methods. 24 (2), 59-67 (2013).
  9. Wei, C. Prevalence of adeno-associated virus-9-neutralizing antibody in Chinese patients with Duchenne muscular dystrophy. Hum Gene Ther. 35 (1-2), 26-35 (2024).
  10. Directed evolution of AAV mutants for enhanced gene delivery. Schaffer, D. V., Maheshri, N. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2004, 3520-3523 (2004).
  11. Zhao, W., et al. Engineering sialylated N-glycans on adeno-associated virus capsids for targeted gene delivery and therapeutic applications. J Control Release. 380, 563-578 (2025).
  12. Liu, B., et al. Aav-containing exosomes as a novel vector for improved gene delivery to lung cancer cells. Front Cell Dev Biol. 9, 707607(2021).
  13. Li, X. Extracellular vesicle-encapsulated adeno-associated viruses for therapeutic gene delivery to the heart. Circulation. 148 (5), 405-425 (2023).
  14. Wang, W., et al. Intravitreal injection of an exosome-associated adeno-associated viral vector enhances retinoschisin 1 gene transduction in the mouse retina. Hum Gene Ther. 32 (13-14), 707-716 (2021).
  15. Breuer, C. B., et al. In vivo engineering of lymphocytes after systemic exosome-associated AAV delivery. Sci Rep. 10 (1), 4544(2020).
  16. Cheng, M., et al. Probing aspects of extracellular vesicle-associated AAV allows increased vector yield and insight into its transduction and immune-evasive properties. Mol Ther Methods Clin Dev. 33 (1), 101407(2025).
  17. Elmore, Z. C., et al. The membrane-associated accessory protein is an adeno-associated viral egress factor. Nat Commun. 12 (1), 6239(2021).
  18. Deshetty, U. M., Sil, S., Buch, S. Gene therapy for the heart: Encapsulated viruses to the rescue. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (1), 114-118 (2024).
  19. Fan, X., et al. Targeted repair of spinal cord injury based on miR-124-3p-loaded mesoporous silica camouflaged by stem cell membrane modified with rabies virus glycoprotein. Adv Sci (Weinh). 11 (21), e2309305(2024).
  20. Yao, C., et al. Self-assembly of stem cell membrane-camouflaged nanocomplex for microRNA-mediated repair of myocardial infarction injury. Biomaterials. , 257-120256 (2020).
  21. Tian, Y., et al. Biomimetic mesenchymal stem cell membrane-coated nanoparticle delivery of mkp5 inhibits hepatic fibrosis through the Ire/xbp1 pathway. J Nanobiotechnology. 22 (1), 741(2024).
  22. Kang, K., et al. Exosomes secreted from CXCR4 overexpressing mesenchymal stem cells promote cardioprotection via akt signaling pathway following myocardial infarction. Stem Cells Int. 2015, 659890(2015).
  23. Han, X., et al. Mesenchymal stem cells in treating human diseases: Molecular mechanisms and clinical studies. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 262(2025).
  24. Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), 36(2016).
  25. Tackenberg, M. W., Kleinebud, P. Encapsulation of liquids via extrusion--A review. Curr Pharm Des. 21 (40), 5815-5828 (2015).
  26. Bai, J. -J., et al. Dean-flow-coupled elasto-inertial focusing accelerates exosome purification to facilitate single vesicle profiling. Anal Chem. 95 (4), 2523-2531 (2023).
  27. He, S., et al. Biomimetic gene delivery system coupled with extracellular vesicle-encapsulated AAV for improving diabetic wound through promoting vascularization and remodeling of inflammatory microenvironment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 242(2025).
  28. Smith, S. M., et al. Functional equivalence of stem cell and stem cell-derived extracellular vesicle transplantation to repair the irradiated brain. Stem Cells Transl Med. 9 (1), 93-105 (2020).
  29. Liang, Y., Lehrich, B. M., Zheng, S., Lu, M. Emerging methods in biomarker identification for extracellular vesicle-based liquid biopsy. J Extracell Vesicles. 10 (7), e12090(2021).
  30. Verma, S., et al. Seroprevalence of adeno-associated virus neutralizing antibodies in males with Duchenne muscular dystrophy. Hum Gene Ther. 34 (9-10), 430-438 (2023).
  31. Yan, B., Liang, Y. New therapeutics for extracellular vesicles: Delivering CRISPR for cancer treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15758(2022).
  32. Hu, C. M. Erythrocyte membrane-camouflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic delivery platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 10980-10985 (2011).
  33. Aryal, S., et al. Erythrocyte membrane-cloaked polymeric nanoparticles for controlled drug loading and release. Nanomedicine (Lond). 8 (8), 1271-1280 (2013).
  34. Zhang, W., Huang, X. Stem cell membrane-camouflaged targeted delivery system in tumor. Mater Today Bio. 16, 100377(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mesenchymal Stem CellsExtracellular VesiclesGene DeliveryNanovesicle PlatformAAV VectorsMembrane Enveloped NanovesiclesRegenerative MedicineTherapeutic Gene TransferEV MimickingSize Defined Extrusion

מאמרים קשורים