מאמר שיטה

דגימת DNA סביבתית מכלי שיט לצפייה בלווייתנים למעקב אחר יונקים

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70334

⸱

10 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה סטנדרטי לאיסוף דגימות DNA סביבתי (eDNA) של יוונקים ימיים מכלי שיט לצפייה בלווייתנים. היתכנות לחוקרים ולמדענים אזרחיים מיומנים היא בעדיפות גבוהה, בעוד שתנאי הסביבה, זמן הסינון, העכירות והלוגיסטיקה על הסיפון מגדירים את הגבולות המעשיים של יישומה.

תקציר

DNA סביבתי (eDNA) מציע גישה לא פולשנית למעקב אחר יונקי ימי, אך יישומו הנרחב בפלטפורמות תפעוליות דורש תהליכי דגימה סטנדרטיים ואפשריים. מחקר זה מתאר פרוטוקול לאיסוף eDNA של יוונקים ימיים מכלי שיט לצפייה בלווייתנים, שנועד ליישום על ידי חוקרים ומדענים אזרחיים מיומנים בתנאים סביבתיים ולוגיסטיים מוגדרים. הגישה משלבת איסוף מי ים ממוקד ב-flukeprint, סינון על הסיפון עם מסננים שומרים על עצמם, וניתוחים מולקולריים במורד הזרם כדי לתמוך ביצירת נתונים תפעולית בתנאים אמיתיים. הפרוטוקול יושם במהלך קמפיינים מתואמים שנערכו בשנת 2024 בשלושה אזורים בצפון האוקיינוס האטלנטי ובים התיכון (איסלנד, פורטוגל ואיטליה), וכללו מספר טקסונים של יוונקים ימיים. ביצועי השיטה הוערכו באמצעות מבחן PCR כמותי ייחודי למין שפותח לאחרונה, המכוון ל-DNA מיטוכונדריאלי של לווייתן גבנון (Megaptera novaeangliae), והדגים שיעורי זיהוי עקביים בתנאים סביבתיים ולוגיסטיים משתנים. על ידי מתן הנחיות מעשיות ליישום שטח ושליטה בזיהום, פרוטוקול זה תומך בניטור יונקי שכפול מבוסס eDNA ומקל על השוואה בין-אזורית במחקרי מגוון ביולוגי ימי.

מבוא

ניהול שימור יעיל של מגה-פאונה ימית, כולל יונקים ימיים ומינים רחבי טווח נוספים, הוא חיוני להגנה על המגוון הביולוגי. כטורפים מובילים ומהנדסי מערכות אקולוגיות, יונקי הים תורמים לוויסות טרופי, מחזור חומרים מזינים ועמידות אקולוגית באגן האוקיינוסים1. עם זאת, יצירת ידע אקולוגי מקיף עבור מינים ניידים אלה נותרת מאתגרת ולעיתים קרובות מתבססת על תוכניות ניטור עתירות משאבים2. גישות קונבנציונליות, כגון דגימת ביופסיה, זיהוי תמונות, ניטור אקוסטי פסיבי, טלמטריה לוויינית וסקרים אוויריים, סיפקו תובנות קריטיות לאקולוגיה של יוונקים ימיים 3,4,5,6,7, אך שיטות אלו לעיתים קרובות יקרות, תובעניות לוגיסטית, מוגבלות במרחב או פולשניות, וכפופות לפיקוח אתי ורגולטורי מחמיר 8 . כתוצאה מכך, תדירות הדגימה, הכיסוי הגאוגרפי וההזדמנויות להשתתפות בעלי עניין מוגבלים לעיתים קרובות, במיוחד במחקר של מינים נדירים או רחבי טווח.

דגימת DNA סביבתי (eDNA, המוגדר כחומר גנטי שנשפך על ידי אורגניזמים לסביבתם) הפכה לכלי עוצמתי ולא פולשני לזיהוי מינים מימיים מדגימות מים 9,10. בדיקות PCR כמותיות ספציפיות למין (qPCR) המיוקדות לשברי DNA מיטוכונדריאלי מאפשרות זיהוי רגיש וספציפי מאוד של טקסונים ימיים, כולל יונקיםימיים 11,12,14. מעבר לזיהוי נוכחות/היעדרות, עוצמת אות ה-eDNA היחסית ורצפי DNA יעד מספקים מידע חשוב הקשור לקרבה, שפע יחסי ודפוסים גנטיים ברמת האוכלוסייה 15,16,17,18,19. בנוסף, דגימות סביבתיות שנאספות בקרבת לווייתנים מכילות לעיתים קרובות DNA מטקסונים הקיימים במקביל, כולל מיני טרף, סימביונטים וטפילים, התומכים באסוציאציות אקולוגיות רחבותיותר 20,21,22. יחד, התקדמויות אלו מדגימות את הפוטנציאל של גישות מבוססות eDNA להשלים שיטות מסורתיות ולהרחיב את היקף מחקר היונקים במערכות ימיות23,24.

למרות היתרונות הללו, ניטור מבוסס eDNA של מגה-פאונה ימית מתמודד עם אתגרים מתמשכים הקשורים לדגימה מייצגת, כיסוי מרחבי ושחזור מתודולוגי, במיוחד במערכות ימיות פתוחות שבהן ה-DNA מדולל במהירות25,26 ומינים יעדים בעלי טווחים נרחבים ונמצאים בצפיפויות נמוכות. התמודדות עם מגבלות אלו דורשת מסגרות דגימה ניתנות להרחבה וניתנות ליישום בקנה מידה מרחבי וזמני רחבים. יוזמות מדע אזרחי הוכיחו את עצמן כיעילות בהרחבת איסוף הנתונים האקולוגיים תוך קידום מעורבות הציבור בשימור ימי, ובכך הופכות לנתיב מבטיח לניטור רחב היקף מבוסס eDNA 27,28,29,30. כלי שיט לצפייה בלווייתנים מהווים פלטפורמה לא מנוצלת אך מתאימה מאוד לדגימת eDNA, ומציעים גישה סדירה לבתי גידול של יונקים ימיים בעונות ובאזורים 31,32,33. תעשיית הצפייה הלווייתנית העולמית תומכת ברשתות תפעול נרחבות34, ומחקרים קודמים הוכיחו את היתכנות איסוף DNA e-e-לווייתנים מפלטפורמות אופורטוניסטיות אחרות, כגון כלי שיט מסחריים, מעבורות35, ובאמצעות דגימה ממוקדת משולבת עם זיהוי צילום ותצפיות התנהגותיות36,37. ההתרחבות המהירה של מחקר ה-eDNA הובילה לחדשנות מתודולוגית משמעותית, אך שונות ביולוגית בין מערכות ימיות וקצב ההתקדמות הטכנולוגית מסבכות את המאמצים לאחד פרוטוקולים ולהבטיח השוואה בין מחקרים. לכן, מתודולוגיות שטח סטנדרטיות אך גמישות הן חיוניות, במיוחד ליוזמות ניטור רב-לאומיות רחבות היקף38.

זיהוי eDNA מושפע מנפח מים מסונן, אסטרטגיית סינון, חומר סינון וגודל נקבוביות. סינון נפחים גדולים יותר בדרך כלל מעלה את תפוקת ה-eDNA ואת הסתברות הגילוי עבור מטרות חולייתנים, כולל יונקיםימיים 39,40,41,42. במים פרודוקטיביים או עכורים, לעומת זאת, יעילות הסינון עלולה להיות מוגבלת על ידי סתימה מהירהשל מסננים 43,44, מה שמחייב פשרות בין נפח אפשרי לכידיום תפעולי45,46. דגימה מטביעות פלוק — ההפרעה על פני השטח הנוצרת על ידי שבץ זנב לווייתן — הוכחה בעקביות כמשפרת את יכולת גילוי ה-eDNA של היונקים הימיים, שכן חומר ביולוגי שנשבר לאחרונה מרוכז בקרבת פני השטח 24,41,42,47,48. השימוש במערכות מסנן סגורות והשומרות את עצמן מפחית את שלבי הטיפול וסיכוני הזיהום, מה שהופך אותן למתאימות במיוחד ליישומי מדע אזרחי38,42. בנוסף, הכללת שכפולים ביולוגיים ובקרות שטח שגרתיות ממזערת כישלון בזיהוי ומשפרת את אמינות הנתונים 49,50,51.

פיתוח ואימות פרוטוקולים
פרויקט eWHALE52 הוא יוזמה טרנס-לאומית המשלבת חוקרים, מפעילי צפייה בלווייתנים ומדענים אזרחיים ברחבי אירופה כדי לנטר מגה-פאונה ימית באמצעות eDNA. מאמצי הדגימה כוונו למספר טקסונים של יונקים ימיים ברחבי צפון האוקיינוס האטלנטי והים התיכון, תוך שימוש בפרוטוקול ליבה עם התאמות אזוריות כדי להתחשב בתנאים הסביבתיים והלוגיסטיים המקומיים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי מהתחלה ועד סוף לאיסוף eDNA של יוונקים ימיים מכלי שיט לצפייה בלווייתנים, ששוכלל באמצעות ניתוח של 308 דגימות eDNA של מי ים, כולל שני שכפולים לכל דגימה ו-21 ביקורת שטח, שנאספו במהלך קמפיינים מתואמים בשטח ב-2024 במפרץ סקילפנדי (איסלנד), האזורים (פורטוגל) וים ליגורי (איטליה). השיטה משלבת איסוף מי ים ממוקדים על ידי טביעות פלוק, סינון על הסיפון באמצעות מסנני eDNA שמורים את עצמם, וניתוחים מולקולריים במורד הזרם.

פרוטוקול זה נועד ליישום בתנאי צפייה בלווייתנים במציאות על ידי חוקרים מיומנים ומדענים אזרחיים, שבהם ניתן לבצע סינון על הסיפון בתנאי ים רגועים עד מתונים מבלי להפריע לפעילות צפייה בלווייתנים. יישומו דורש תיאום עם ארגונים משתתפים (למשל, מפעילי צפייה בלווייתנים, ארגונים ללא מטרות רווח, מוסדות מחקר) כדי להגדיר אסטרטגיות דגימה ומטרות מחקר. בעוד שפרמטרי הליבה חייבים להישאר קבועים כדי להבטיח שחזוריות ויכולת השוואתיות בין מחקרים, ייתכן שיידרשו התאמות לפי הפרוטוקול באתרים עם עכירות גבוהה, תנועת כלי שיט או מגבלות בזמן, מרחב או כוח אדם. התאמות אלו כוללות את סוג המסנן, נפח מים מסונן אפשרי, וציוד עזר. יש ליישם אותן באופן עקבי בכל קמפיין דגימה ולדווח בשקיפות. הנחיות תפעוליות מפורטות ושיקולים לוגיסטיים מסופקים בשלבי הפרוטוקול והדיון, כדי לתמוך באיכות הנתונים, שקיפות ובהשוואה אזורית.

עיצוב מבחן qPCR
להערכת ביצועי הפרוטוקול, הוגבר eDNA של לווייתני גבנון (Megaptera novaeangliae), מין נודד שנחקר היטב ונפגש באופן קבוע במפרץ סקיאלפנדי (איסלנד)53 ונמצא עונתית באיים האזוריים54, מדגימות שנאספו בשטח. תהליכי עבודה של ניתוח DNA, חילוץ ו-qPCR עובדו בתחילה באמצעות בדיקת טבעת בין-מעבדתית שכללה ארבע מעבדות משתתפות בפרויקט eWHALE, ובכך שיפרו את העקביות והיישום בין מוסדות14.

כדי לזהות באופן אמין את נוכחות ה-eDNA של לווייתן הגיבנון, תוכנן ואומת מבחן qPCR ספציפי למין (קושר חריץ קטן) המיועד לאזור ND5 המיטוכונדריאלי בהתאם להנחיות55 (טבלה 1). פריימרים של אוליגונוקלאוטידים וגשוש נוצרו באמצעות תוכנה ליישור וניתוח רצפי DNA56, במטרה למקסם את הספציפיות של המין ויעילות ההגברה (קובץ משלים 1 - איור משלים S1). הספציפיות של הבדיקה הוערכה במבחנה באמצעות טקסונים מטרה ולא מטרה (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). ריכוזי ה-DNA ששימשו ליצירת עקומות סטנדרטיים של qPCR נמדדו מתוך תקן DNA שמקורו ברקמה 42,57,58,59,60. גבול הגילוי (LOD) של הבדיקה, שהוגדר כרכוז הנמוך ביותר שמניב הגברות חיוביות ב-95% מהשכפולים של המדגם, נקבע11,61. זיהוי eDNA של לווייתן גבנון הוערך עבור דגימות שטח על ידי הערכת יחס התגובות החיוביות ועוצמת האות (כלומר, סף מחזור, ערך Ct) עבור כל דגימה, תוך שכפול במדידות qPCR משולשות, כדי להתחשב בשונות ההגברה ולשפר את אמינות הגילוי 57,60,62. זיהוי המינים אומת לאחר מכן באמצעות ריצוף סנגר דו-כיווני, ולאחר מכן אושר באמצעות ניתוח BLAST63.

נתוני qPCR מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). המובהקות הסטטיסטית בין הקבוצות הוערכה באמצעות מבחן Mann-Whitney U הלא-פרמטרי ומבחן t דו-מדגמי של וולש. ההבדלים נחשבו משמעותיים ב-p < 0.05. כל הניתוחים בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי64.

פרוטוקול

אתיקה ועמידה ברגולציה
כל מאמצי התצפית על יונקים ימיים ודגימת מים לאחר מכן חייבים להתבצע בהתאם לתקנות חיות הבר הלאומיות והאזוריות. לבצע דגימות אך ורק מכלי שיט מורשים הפועלים תחת היתרי צפייה או מחקר תקפים. שמרו על מרחקי גישה מינימליים מהמין המטרה כפי שמוגדרים בתקנות המקומיות והימנעו מכל תמרון שמטרתו רק לדגימה. דגימות רקמת לווייתן ששימשו לאימות בדיקה נאספו תחת היתרים אזוריים שונים וחולקו בין שותפי פרויקט eWHALE בהתאם לתקנות הלאומיות והמוסדיות.

הערה: עיין במסמכים הבאים לפני כל פעילות דגימה ואספו את הציוד הנדרש: טבלת חומרים, ערכת דגימת eDNA (קובץ משלים 1 - איור משלים S2), חומרים המשמשים לאיסוף דגימות DNA סביבתיות (איור 1) וסקירה של שלבי הדגימה ותהליך הסינון על הסינון (איור 2).

1. הכנת דגימת eDNA

  1. הכינו חומרי תיעוד שטח, כולל דפי נתונים שטח ופרוטוקול שטח למינציה (קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3).
  2. הכינו כפפות רזרביות, מסננים רזרביים (מסנן אחד לכל שכפול דגימה), סמן עמיד למים, ומיכל פסולת ייעודי (איור 1A).
    הערה: השתמשו במסנני eDNA שומרים על עצמם סגורים (גודל נקבוביות 1.2 מיקרון) כדי למזער סיכוני טיפול וזיהום65,66.
  3. הכינו דליים קשיחים אחדים או יותר, המתאימים לסוג הכלי ולתצורה שעל הסיפון (קובץ משלים 1 - איור משלים S3).
    1. סמן דליים ב-10 ליטר באמצעות טוש קבוע. הכינו כמה דליים קטנים יותר אם טיפול ב-10 ליטר לא מעשי.
    2. חבר חבל היטב לדלי אם הטווח מעל המים מוגבל.
      הערה: השתמשו בדליים עם מכסה כדי למזער שפיכה כאשר תנועת כלי השיט מופרזת (איור 1B).
    3. הכינו מיכל eDNA משני לשילוב נפחים קטנים יותר ותיבת הובלה נוספת להבטחת הובלה ללא זיהום במידת הצורך (איור 1C).
  4. הכינו משאבת מים פריסטלטית או ואקום ניידת (איור 1D). טען את המשאבה במלואה לפני העלייה למשאבה ונתק את החשמל מיד לפני השימוש.
  5. הקצה תפקידי דגימה, סינון ורישום נתונים לפני היציאה.
    זהירות: לבשו כפפות במהלך כל טיפול בציוד והחליפו כפפות בין משימות.

figure-protocol-1
איור 1: חומרי עבודה בשטח המשמשים לאיסוף דגימות DNA סביבתיות. (א) ערכת כלים עם מסנני eDNA משמרים את עצמם, מיכל פסולת, בקבוק סחיטה עם אקונומיקה ביתית מדוללת (1:10), כפפות, דף נתונים שטח ועט עמיד למים; (B) דוגמאות לסוגי דליים לדגימת eDNA; (ג) דוגמאות למכולות eDNA נוספות להובלה וסינון נפחים גדולים ומיכל להובלת דליים על הסיפון; (D) דוגמאות למשאבות ניידות לסינון מים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-2
איור 2: דיאגרמה מושגית של דגימת DNA סביבתית על סירות צפייה בלווייתנים. האיור מתאר שלבים מונחים, כולל איסוף דגימות מים וסינון על הסיפון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. ניקוי ציוד

  1. שים כפפות חד-פעמיות לפני הניקוי.
  2. הכינו תמיסת אקונומיקה על ידי דילול אקונומיקה ביתית (5-6% נתרן היפוכלוריט) ביחס 1:10 עם מים מטוהרים (~50 מ"ל לכל נסיעה).
  3. מרחו את התמיסה על ידי השפרזה אחידה על כל המשטחים על כל הדליים, המכסים והצינורות של המשאבות. שמרו על זמן מגע מינימלי עם אקונומיקה של 2-5 דקות על כל המשטחים.
  4. שטוף היטב עם מי ברז 3 פעמים (איור 3).
  5. ייבוש את החומרים באוויר במקום מאובטח ואחסן אותם במקום בטוח ונקי לפני העלייה למטוס.

figure-protocol-3
איור 3: שלבים לציוד ניקוי. (א) מרח את תמיסת האקונומיקה הביתית המדוללת (1:10); (ב) פיזור באופן שווה באמצעות כפפות ללא DNA; (ג) לשטוף היטב שלוש פעמים במי הברז; ו-(D) לחזור על התהליך עבור חומרים נוספים במידת הצורך (למשל, מיכלי eDNA). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. איסוף דגימות מים

הערה: יש לעמוד בכל תקנות הבטיחות בכל כלי שיט או פלטפורמה, כולל שימוש בחגורות הצלה או סרבל ציפה בעת הצורך.

  1. הביאו את כל החומרים לספינה לפני הגעת הנוסעים ואחסנו אותם באזור נקי וייעודי.
  2. תאם דגימה, תזמון ומיקום הספינה עם צוות הספינה.
  3. התבוננו בדפוסי העלייה כדי לצפות צלילות לווייתנים (איור 4). תלבש כפפות חדשות לפני שאתה טועם.
  4. אסוף 20 ליטר מי ים בהקדם האפשרי (לא יותר מ-10 דקות של זמן) מהפלוקפרינט לאחר צלולת הלווייתן, כדי ליצור שני שכפולים של 10 ליטר.
  5. העבר את המים שנאספו לתחנת סינון ייעודית על הספינה, באמצעות מכסים או מיכל סטרילי נוסף כדי למנוע שפיכה (אם נדרש).
  6. רשמו זהות מין, קואורדינטות GPS, זמן וזיהוי שכפול דגימה בגיליון הנתונים.
  7. החלפת כפפות מיד אחרי הדיווח.

figure-protocol-4
איור 4: רצף העלאת פני השטח של לווייתן גבן. (א) פיצוץ לווייתן; (ב) קימור הגב והרמת הזנב לפני צלילה; (C) תבנית טביעת פלוק על פני השטח לאחר הצלילה של הלווייתן. ייחוס תמונה: משימות אוקיינוס (A,B,C, 2024). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. סינון eDNA

  1. פתח את שקית הסינון וטפל במסנן רק ליד השקע (קובץ משלים 1 - איור משלים S4).
  2. הכנס את הפתח לסנורקל וחבר את צינור המשאבה ליציאה (איור 5A,B).
  3. טבלו את השנורקל בדגימת מים מבלי לטבול את מארז המסנן (איור 5C).
  4. הגדר את המשאבה (ראה טבלת חומרים לסוגי משאבות) לקצב זרימה מהיר ויציב.
  5. סנן 10 ליטר ברציפות תוך כדי ניטור יציבות זרימה (בדוק בועות אוויר, קרעים, קרעים או תקלות באיטום).
    הערה: להפסיק את הסינון למשך מקסימלי של 45 דקות.
  6. הפוך את המסנן והפעיל את המשאבה במשך 30-60 שניות כדי להסיר שאריות מים. ודאו שאין לחות נראית לעין במארז הפילטר.
  7. כבה את המשאבה ונתק את הצינור.
  8. השליכו את השנורקל במיכל הפסולת, הניחו את המסנן בשקית המקורית ותייגו אותו מיד.
  9. אחסנו את המסננים על הספינה במיכל סגור וקשיח או בתיבת קירור (אם טמפרטורה סביבתית > 20 מעלות צלזיוס), הרחק מאור שמש ישיר ואזורים לנוסעים.
  10. החלפת כפפות וחזרה על הסינון בשכפול השני.

figure-protocol-5
איור 5: שלבים להגדרת מערכת הסינון המובנית. (א) לחבר את פתח הפילטר (החלק הלבן) לסנורקל (צינור); (ב) לחבר את צינור המשאבה ליציאת המסנן (החלק הצהוב); ו-(C) טבילה חלק מהשנורקל בדגימת מים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

5. בקרות שליליות בשדה ודיווח נתונים

  1. סנן בקרה שלילית שדה אחת לאחר כל חמש דגימות פלוקפרינט.
  2. השתמש במים נטולי DNA מיד לאחר החזרה לחוף ולפני ניקוי הציוד.
  3. העבר את כל הנתונים לגיליון הדגימה הדיגיטלי של eDNA לאחר כל נסיעה (קובץ משלים 4).

6. אחסון וסינון ומשלוח

  1. אחסן מסנני eDNA שומרים על עצמם במיכל בטוח ויבש בחדר מוצל בטמפרטורת הסביבה — או במקרר אם טמפרטורת הסביבה עולה על 20 מעלות צלזיוס — למשך לא יותר מ-3 חודשים לפני המשלוח.
  2. בדקו את שקיות הסינון באופן ויזואלי לאיתור לחות לפני המשלוח.
  3. תיוג ושלח מסננים במיכלים מבודדים עם שקיות קרח למעבדה המיועדת.

7. ניתוח מעבדה

הערה: לבצע את כל ההליכים המעבדייתיים בחדרים ייעודיים עם חיטוי UV עם אוורור מספק וספסלי עבודה נפרדים ל-PCR, תוך שימוש בכפפות ללא DNA ובגדי מגן 55,67,68.

  1. ניתוק DNA
    1. לסמן צינור תגובה של 2 מ"ל לכל פילטר.
    2. הנח את המסנן בבקבוק ארלנמאייר בנפח 200 מ"ל וזרוק את המכסה הגומי (איור 6A).
    3. באמצעות מלקחיים ללא DNA, מקפלים את הממברנה (קובץ משלים 1 - איור משלים S5) למשולש ומעבירים אותו לצינור התגובה בקוטר 2 מ"ל, כאשר הקצה מכוון כלפי מטה (איור 6B-D).
    4. הוסף 380 מיקרוליטר של בופר TES ו-20 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (ראו טבלת החומרים) לכל צינור תגובה, מה שמוביל ל-400 מיקרוליטר של בופר ליזיס (איור 6E).
    5. מערבולת לזמן קצר ודגירה בטמפרטורה של 56°C למשך ≥3 שעות עם ערבוב (איור 6F).
    6. צינורות צנטריפוגה ב-18,626 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: ליזאט שקוף עד בהיר מציין עיכול מוצלח.
      הערה: ייתכן שהפרוטוקול יופסק זמנית בשלב זה אם הליזטים מאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. חילוץ DNA
    1. ליזאט אינקובאט בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני ההוצאה.
    2. תגובות לחילוץ פיפטות בלוחות שטיפה ולוחות שחרור, תוך התחשבות בבקרות שליליות ושגיאות פיפטינג69 (ראו קובץ משלים 1 - טבלה משלימה S1).
    3. כלול ריק חילוץ אחד לכל לוח באמצעות מאגר TES.
    4. העבר 300 מיקרו-ליטר של ליזאט לכל באר בלוח הקישור. יש להוסיף 300 מיקרוליטר של אלכוהול בופר ו-300 מיקרוליטר אלכוהול איזופרופיל לכל באר. יש להשתמש במספר לוחות קישור אם נפח הליזאט הכולל עולה על 300 מיקרוליטר. מערבולת ומוסיפים חלקיקים מגנטיים של 30 מיקרו-ליטר לקשירת חומצות גרעין בכל באר לפלטת הקישור הראשונה (טבלת חומרים).
    5. כסה את לוח הקישור עם כיסוי מוט.
    6. הרץ את תוכנית קליטת ה-DNA הראשונית לשני לוחות קישור (סה"כ 400 מיקרוליטר ליזאט; ראו טבלת החומרים ואיור 7) ואת פרוטוקול החילוץ האוטומטי על רובוט מעבדה מבוסס חרוזים מגנטיים.
    7. השליכו כימיקלים למיכל פסולת ייעודיים.
    8. העבר DNA שנפלט לצינורות תגובה מסומנים בנפח 1.5 מ"ל ואחסן בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ייתכן שהפרוטוקול יופסק זמנית בשלב זה. ניתן לבצע שלבים נוספים להסרת מעכבים בשלב זה.
  3. qPCR
    1. הכינו וכמתו תקני DNA של מינים יעדיים באמצעות תמציות רקמה ובדיקת dsDNA רגישה גבוהה מבוססת פלואורסצנציה, בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים). יצירת עקומת תקן בת שמונה נקודות על ידי דילול סדרתי (1:10) החל מ-10ng/μL11.55. תקני Aliquot לפני qPCR למזעור מחזורי הקפאה והפשרה.
      הערה: ייתכן שהפרוטוקול יופסק זמנית בשלב זה.
    2. הכינו את כל תגובות qPCR בשלושה עותקים באמצעות לוחות 96 בארות.
    3. כלול בקרה אחת ללא תבנית (מים בדרגה מולקולרית) ולוח ריק אחד לחילוץ לכל לוח qPCR.
    4. הכינו את התערובת הראשית לפי קובץ משלים 1 - טבלה משלימה S2 ואיור 8A.
    5. במכסה טעינת DNA, יש להוסיף את תקני ה-DNA שהוכנו מראש ו-3 מיקרוליטר תמצית DNA לכל באר המכילה את תערובת המאסטר (איור 8B).
    6. אטימו את הפלטה עם שכבת איטום (איור 8C).
    7. צנטריפוגה בעוצמה של 3,500 × גרם למשך 10 שניות וטעינה לתרמחזור PCR כמותי בזמן אמת (איור 8D,E).
    8. הרץ את המבחן בתנאי מחזור אופטימליים, כפי שצוינו בטבלה 2, ורשום נתונים באמצעות תוכנת היצרן (טבלת חומרים)11.

figure-protocol-6
איור 6: תהליך עבודה לניתוק DNA. (א) הסרת הפקק הגומי ממסנן ה-eDNA השומר את עצמו והנחתו בבקבוק ארלנמייר; (ב) לעקר שני זוגות מלקחיים על ידי להבה שלוש פעמים; (ג) לקפל את ממברנת הסינון; (ד) להכניס אותו לצינור של 2 מ"ל; (E) להוסיף בופר ליזיס ו-Proteinase K, ו-(F) לדוג דגימות בטמפרטורה של 56°C למשך 3 שעות. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור.

figure-protocol-7
איור 7: חומרים וציוד המשמשים לחילוץ DNA. (א) כריכה, שטיפה והסרה לוחות, חומרים מתכלים ותגובים להכנת חילוץ; ו-(B) רובוט המעבדה המבוסס חרוזים מגנטיים המשמש לעיבוד דגימות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-8
איור 8: תהליך עבודה עבור qPCR. (א) הכנת מיקס מאסטר בחדר שעבר סטריליזציה של UV (מתחת למכסה מנוע עבודה המיועד להכנת תערובות מאסטר); (ב) טעינת תקני DNA, חילוצים ובקרות בתחנת טעינת DNA בהתאם לדפוס המוצג; (ג) לוח איטום; (D) צנטריפוגה; (E) טעינה לתרמוסייקלר PCR כמותי בזמן אמת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

בסך הכל נאספו 154 דגימות טביעות פלוק (308 מסנני eDNA) בשנת 2024 באמצעות פרוטוקול אופטימלי זה, כולל 96 מסננים במפרץ סקאלפנדי (איסלנד; 9 מסננים בשדה ו-76 שכפולים של לווייתן גיבן) שנאספו בין מרץ לנובמבר, 151 מסננים באיים האזוריים (פורטוגל; 12 מסננים בשדה ו-15 שכפולים של לווייתן גיבן) שהושגו ביולי ו-61 מסננים בים ליגורי (איטליה; 4 מסננים בשטח) שנאספו בין מאי לאוקטובר. כל הדגימות כללו איסוף של עד 10 ליטר מי ים (שני שכפולים לכל דגימת פלוקטביע) באמצעות מסנני eDNA משמרים את עצמם (טבלה 3). שני סוגי בקרות שליליות נאספו במהלך עבודת שטח: מים מטוהרים שסננו לאחר ניקוי אקונומיקה של הציוד, ומי ים שנאספו בעת הכניסה מחדש לנמל(ים)42. האחרון סינן בכוונה לפני ניקוי האקונומיקה כדי להעריך זיהום צולב אפשרי עם eDNA יונקי במהלך הדגימה. דגימות נשלחו מכל אתר דגימה בשתי מנות ליחידת המחקר האקולוגיה של בעלי החיים היישומי, המחלקה לזואולוגיה, אוניברסיטת אינסברוק (אוסטריה) לעיבוד מעבדתי.

ביצועי בדיקה ושליטה
תת-קבוצה של 44 מסננים (30 רפליקות כולל 2 בקרות שדה ממפרץ סקיאלפנדי, איסלנד ו-14 מסננים כולל בקרה שדה אחד מהמים סביב האיים פיאל ופיקו, האיים האזוריים, פורטוגל) נותחו לאי eDNA של לווייתן גבנון (איור 9). האות נמדד בתגובות qPCR משולשות. דגימה (כלומר, מסנן eDNA) נחשבה חיובית, אם אחד מתוך שלושה שכפולים של qPCR מוגבר. גבול הגילוי (LOD) של המבחן במחקר זה חושב כ-0.0001 ng/μL (Ct ממוצע של LOD = 35.8). מתוך 41 המסננים שנבדקו, 20 (49%) הניבו הגברות, בעוד 24 (58%) לא הראו הגברה. אי-גילוי (ללא ערך Ct) ככל הנראה משקף או היעדר או ריכוזים נמוכים מאוד של DNA המטרה. אי-זיהוי כללו 5 מתוך 13 מסננים מהאיים האזוריים (38%) ו-19 מתוך 28 מסננים מאיסלנד (68%). בדיקות חילוץ נבדקו ל-DNA של חולייתנים ימיים באמצעות מבחן MarVer370 ולא הראו הגברה ניתנת לזיהוי, מה שמעיד על היעדר זיהום צולב במהלך חילוץ ה-DNA. בקרות שדה (NC) ובקרות qPCR (NT) לא הניבו הגברות, מה שאישר את היעדר זיהום במהלך עבודת השטח וסקר qPCR (טבלה 4).

מבין 20 המסננים החיוביים, תשעה (22%) הניבו לפחות ערך Ct אחד מתחת לגבול הגילוי של הבדיקה (LOD; 0.0001 ng/μL) ולכן סווגו כזיהוי אמין. אלה כללו 4 מתוך 8 מסננים מהאיים האזוריים (50%) ו-5 מתוך 12 מאיסלנד (42%). 11 מסננים נוספים (27%) הפיקו ערכי Ct אחד או יותר מעל LOD, שכללו 4 מסננים מהאיים האזוריים (50%) ו-7 מאיסלנד (58%), מה שמעיד על גילויים סבירים (איור 10). ניתוח השוואתי חשף ערך סף ממוצע במחזור (Ct) נמוך במעט עבור מסנני האיים האזוריים (34.7 ± 3.60; n = 8) בהשוואה למסנני איסלנד (36.9 ± 3.60; n = 10). מבחן מאן-וויטני U הראה שההבדל הזה אינו מובהק סטטיסטית (U = 199.0, p = 0.204). בהינתן הקשר ההפוך בין ערך ה-Ct לעוצמת אות ה-DNA, התוצאות מצביעות על ריכוזים מעט גבוהים יותר של eDNA לווייתן גבנון במטרה במסנני האיים האזוריים (איור 11).

מגבלות היתכנות
מספר דגימות הטביעות הפלוק בכל נסיעה השתנה בהתאם למשך הנסיעה ולתנאי מזג האוויר. כ-2 עד 3 דגימות (עם עד שישה מסנני eDNA) נאספו במהלך סיורים של 3 שעות באיים האזוריים, שתיים עד ארבע דגימות במהלך ~8 שעות באיטליה (הניבו עד שמונה מסננים), ודגימה אחת עד שתיים (עד 4 מסננים) במהלך סיורים של 3.2 שעות באיסלנד. ביצועי הסינון היו בדרך כלל גבוהים באיים האזוריים ובאיטליה. באיים האזוריים, 10 ליטר מי ים סיננו בעקביות תוך 10-15 דקות, בעוד שבאיטליה אותו נפח סינן בכ-10 דקות. באיסלנד, נפחי הסינון נעו בין 4.5 ל-10 ליטר (ממוצע = 8.5 ליטר), עם זמן סינון ממוצע ~40 דקות עקב סתימות תכופה במסננים, ככל הנראה עקב חלקיקים במים באזור המחקר. באופן ספציפי, 10 L סוננו בהצלחה עבור 46 מתוך 98 המסננים (47%), נפחים בין 7 ל-10 L הושגו עבור 31 מסננים (32%), ונפחים בין 4 ל-7 L עבור 21 מסננים (21%) (קובץ משלים 1 - טבלה משלימה S3).

הפרוטוקול ממליץ על סינון של בקרה שלילית שדה אחת לאחר כל חמש דגימות טביעת פלוק. עם זאת, בתנאי צפייה תפעולית בלווייתנים, לא ניתן היה למלא זאת במלואו במחקר המקרה המתואר בשל מגבלות לוגיסטיות, כולל זמינות מוגבלת של מסננים, מגבלות זמן ועיכובים במשלוחים. זה הפחית את יחס השליטה למדגם האפשרי ל-1:10.7 באיסלנד (9/96), 1:12.6 באיים האזוריים (12/151), ו-1:15.3 באיטליה (4/61). למרות הסטיות הללו, לא הופיעו בקרות שליליות בשדה או במעבדה.

figure-results-1
איור 9: סקירה של מיקומי מדגם. נקודות שחורות במפה מייצגות מיקומים שבהם נלקחו דגימות מטביעת לווייתן גבן במפרץ סקיאלפנדי (איסלנד) ובאזורים. שם מסנן ה-eDNA מצוין קרוב לאזור הדגימה המתאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 10: זיהויים מתת-קבוצה של מסנני eDNA מהאיים האזוריים ואיסלנד. qPCR ערכי Ct ממוצעים ועוצמת אות DNA עבור זיהויים חיוביים באיים האזוריים ואיסלנד (לפחות שכפול PCR חיובי אחד), עם SD ו-LOD. הפסים נצבעים לפי עוצמת האות ביחס ל-LOD: כחול כהה = אות חזק (Ct ≤ 35.8) מציין זיהוי אמין, כחול בהיר = אות חלש (Ct > 35.8) מציין גילוי סביר. שורות השגיאה של SD מייצגות שונות בין שכפולים של PCR. הקו האדום המקווקו מציין את LOD (Ct = 35.8). ערכי Ct ממוצעים מוצגים מעל כל פס. קיצורים: Ct = סף מחזור; SD = סטיית תקן; LOD = גבול גילוי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 11: ערכי סף מחזור ממוצעים לזיהוי DNA של לווייתני גבנון מהאיים האזוריים ואיסלנד. הקווים השחורים בתוך גרפים קופסה מציינים את החציון, וריבועים אדומים מייצגים את ערכי Ct הממוצעים (SD), בעוד שפמים מייצגים את הערכים המינימליים והמקסימליים של האזורים ואיסלנד. מבחן מאן-וויטני U הראה שההבדל הזה אינו מובהק סטטיסטית (U = 199.0, p = 0.204). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1: רצפי פריימר ופרוב עבור מבחן qPCR המיועד ל-ND5. רצפים אלו כוללים פריימרים קדמיים ואחוריים, רצפי גלאי MGB (5′-3′), טמפרטורת חישוש אופטימלית, וגבול זיהוי מבחן (LOD). (*) LOD מוגדר כרכוז ה-DNA הנמוך ביותר (ng/μL) ב-DNA של המין היעד, שבו ≥95% משכפולי PCR הניבו הגברה חיובית. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2: תנאי מחזור אופטימליים למבחן qPCR של לווייתן הגיבן. הגדרות qPCR האופטימליות הללו הן 95°C למשך 10 דקות (הפעלת אנזימים), ואז 40 מחזורים ב-95°C למשך 15 שניות (דנאטורציה) ו-60°C למשך 90 שניות (אנילינג/הארכה). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3: סקירה של תצורת דגימת שדה. סקירה של אזורי דגימה, שותפי שדה, סוגי כלי שיט, מיני יעד, תקופות דגימה ושכפולים של דגימות ברחבי האזורים, איסלנד ואיטליה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 4: סיכום זיהוי qPCR עבור דגימות סביבתיות ובקרות. זיהויים חיוביים (מסומנים בצהוב), qPCR משכפל ערכי Ct ותוצאות גילוי מוצגות; הדגימות סווגו כחיוביות כאשר לפחות אחד מהשכפולים של qPCR הראה הגברה. "אין Ct" מציין שאין הגברה, הביקורות השליליות לא הראו הגברה, וסדרת הדילול התקני M. novaeangliae המשמשת להגדרת ביצועי הבדיקה וה-LOD כלולה בתחתית הטבלה. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

קובץ משלים 1: מכיל איורים וטבלאות משלימים המספקים מידע נוסף על יישום הפרוטוקול, כולל ערכת דגימת eDNA בעיצוב פריימר, סוגי כלי שיט לצפייה בלווייתנים, מאפייני מסנני eDNA משמרים את עצמם, נפחי תגובות לחילוץ DNA ותגובות qPCR, ושינויים בקצב הסינון בין אזורי דגימה. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: דף נתונים שדה ששימש במהלך דגימת eDNA של יוונקים ימיים. טופס סטנדרטי לרישום מטא-דאטה של שייט, תצפיות על יוונקים ימיים, ומידע על דגימה וסינון. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 3: פרוטוקול שטח שלב אחר שלב לדגימת eDNA של יונקים ימיים על כלי שיט לצפייה בלווייתנים, כולל ניקוי ציוד, איסוף מי ים וסינון על הסיפון, דיווח דגימות ואחסון. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 4: תבנית גיליון אלקטרוני לדגימת eDNA של יונקים ימיים. טופס סטנדרטי לרישום מידע דגימה לאחר איסוף דגימות וסינון על הסיפון. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

היתכנות מבצעית ויישום בשטח
הפרוטוקול המוצג כאן תורם תהליך עבודה סטנדרטי של eDNA שמאזן בין רגישות גילוי למגבלות מהעולם האמיתי. על ידי שילוב דגימה בנפח גדול, ממוקד בטביע פלוק, סינון מובנה באמצעות מסננים סגורים ששומרים על עצמם, ואמצעי בקרה סטנדרטיים על זיהומים, הפרוטוקול מספק מסגרת שניתן לשחזר אותה ניתן ליישם באזורים וקמפיינים שונים של דגימה. גישה זו מתיישבת עם ההכרה הגוברת ב-eDNA כהשלמה חסכונית וניתנת להרחבה לשיטות ניטור ימיות קונבנציונליות 9,10,22.

מחקרים קודמים על eDNA של יונקים ימיים התבססו בעיקר על דגימת מי ים מבוססת טרנסקט מספינות מחקר גדולות או על דגימה אופורטוניסטית בנפח קטן בקרבת תצפיות של יוונקים ימיים. גישות מבוססות טרנסקט מאפשרות כיסוי מרחבי רחב אך לעיתים קרובות לוכדות אותות DNA מדוללים ומנותקים בזמן, מה שמגביל גילוי מינים נדירים או חולפים71, אפילו כאשר הדגימה מתבצעת קרוב לפני השטח, ובדרך כלל דורשות כלים ותשתיות מיוחדים 25,37,72. לעומת זאת, דגימה בנפח קטן בקרבת לווייתנים העולים על פני השטח משפרת את הספציפיות למפגשים אך נשארת חשופה לשליליות שגויות בשל נפחי מים מוגבלים ופרקטיקות סינון לא עקביות72,73. על ידי מיקוד מפורש בטביעות פלוק וסינון נפחים גדולים על הספינה, זרימת העבודה המוצגת כאן מגדילה את הסיכוי ללכוד eDNA של יונקים ימיים בריכוז נמוך תוך שמירה על אפשרות תחת מגבלות זמן ומרחב האופייניות לפעילות צפייה בלווייתנים. השימוש במסננים סגורים ושומרים את עצמם מפחית עוד יותר את סיכוני הטיפול והזיהום, מבטל את הצורך בבופרים לשימור בשטח ומפשט לוגיסטיקה בתנאים מוגבלים על הסיפון42,66.

כדי להבטיח השוואה בין מחקרים חוציים, יש להישאר הפרמטרים הבאים קבועים במהלך קמפיין הדגימה: איסוף מי ים ישירות מטביעות פלוק נראות לעין של יונקים ימיים; שני שכפולים ביולוגיים של 10 ליטר לכל טביעת פלאק; שימוש במסנני eDNA משמרים את עצמם מאיץ סינון פנימי במהלך אמצעי בקרה סטנדרטיים לזיהום, כולל בקרות שליליות בשדה רגיל בתדירות מינימלית מוגדרת; וסקר qPCR ספציפי למין שבוצע בשלוש עותקים עם בקרות מתאימות. פרמטרים אחרים עשויים להשתנות מבלי לפגוע במסגרת המתודולוגית, בתנאי שהם מיושמים בעקביות ובשקופות, כולל ציוד איסוף מים וטיפול, גודל נקבוביות המסנן, סוג המשאבה ותצורת הצינורות, משך הסינון ונפח סינון אפשרי בתנאי סתימה, לוגיסטיקת דגימות על הסיפון ותנאי אחסון קצרים לפני המשלוח. מכיוון שלבי עיבוד רבים במחקרי eDNA נותרו משתנים, מומלץ בחום לדווח קפדני על כל שלבי הדגימה והניתוח.

היתכנות הפרוטוקול הזה היא הגבוהה ביותר במצבי ים רגועים עד בינוניים (≤ Beaufort 3), עם עכירות נמוכה עד בינונית, כאשר הזמן והמרחב על הסיפון מאפשרים עיבוד שני מסנני eDNA לכל טביעת פלאק ונפח מים מסונן של 10 ליטר לכל מסנן. בפועל, מדענים מיומנים יכולים לדגום עד בופורט 3, אך מדענים אזרחיים צריכים לעבוד רק בתנאים רגועים (בופורט 1-2), בשל תנועת כלי השיט והטורבולנציה, למרות סיורי צפייה בלווייתנים שלעיתים מתקיימים בבופורט 3. הסינון צריך להתחיל בהקדם האפשרי לאחר איסוף המים כדי למזער את התדרדרות ה-DNA47,74. אסטרטגיות דגימה שממזערות דילול eDNA על פני השטח על ידי המדחף, כמו דגימה מצד הרוח והתחתון של הספינה, תומכות עוד יותר בדיוק המטרה ובגילויים אמינים47. הימנעות מתמרון הפוך ומניעת חבלים (המחוברים לדליים) ממגע עם דגימות מי ים מפחיתה עוד יותר את הסיכון לזיהום, בהתאם לשיטות העבודה המומלצות של eDNA ימי38. בהתאם לתצורת כלי השיט וללוגיסטיקה (למשל, גובה הספינה, תנועה והשטח הזמין על הספינה), שתי אסטרטגיות דגימה נתמכות אם הן מיושמות בעקביות: (i) איסוף וסינון עצמאיים של שני שכפולים של 10 L באמצעות שני דליים נפרדים, או (ii) איסוף דגימת מים אחת בנפח 20 ליטר המועברת למיכל סטרילי אטום להובלה בטוחה על הסיפון, ולאחר מכן מחולקת לשני שכפולים של 10 ליטר לסינון. נפח סינון של 10 ליטר לכל מסנן מייצג פשרה מעשית בין הסתברות גילוי למאמץ הסינון בתנאי צפייה בלווייתנים.

נפחים גדולים יותר מגבירים את הסיכוי ללכידת eDNA נדיר או בריכוז נמוך, ומפחיתים שליליים שגויים הנפוצים במחקרים של יונקיםימיים 39,40,75, תוך שמירה על אפשרות תפעולית כאשר הם משולבים עם מסננים שומרים על עצמם וגדלי נקבוביות גדולים,42. עומסי חלקיקים מוגברים, תנועת כלי שיט, שטח סיפון מוגבל או מגבלות זמן עלולים להפחית את יעילות הסינון ואת הנפחים האפשריים, ובכך להגביל את יישום הפרוטוקול. במקרים כאלה, ייתכן שיידרשו התאמות מותאמות לפרוטוקול, כגון הפחתת נפחי מים או גודל נקבובי מסנן חלופי, ויש ליישם אותן בעקביות בקמפיינים לדגימה כדי לשמור על השוואת נתונים. משך המסלול, תזמון המפגשים עם הלווייתנים ויכולת הסינון קובעים את מספרי המדגם האפשריים. בסיורי צפייה סטנדרטיים של 3 שעות, ניתן בדרך כלל להשלים דגימה אחת עד שתיים של טביעות לווייתן (לעיתים שלוש) מבלי להפריע לפעילות או לחוויית המדע האזרחי. במהלך משלחות ארוכות יותר, קיבולת הדגימה משתדלת בהתאם למאמץ הצפייה היומי בלווייתנים (למשל, ~8 שעות ביום במחקר המקרה שלנו באיטליה). בפועל, ניתן ליישם דגימת eDNA בכל שלושת המקומות במהלך שיא פעילות תיירותית.

הצלחת הגברת eDNA ושליטה בזיהום
דגימות סביבתיות, במיוחד אלו שנאספו במים עשירים בחומרים מזינים, עשויות להכיל מעכבי PCR המסוגלים לדכא הגברה וליצור שליליות שגויות76. למרות שלא זוהתה עיכוב בניתוחים קודמים מדגימות איסלנדיות באותו פרויקט42, הכללת שלב הסרת המעכבים הבטיחה הצלחת הגברה עקבית (ראו טבלת חומרים) והיא תואמת את ההמלצות המומלצות לשיטות עבודה מומלצות לזרימות עבודה של eDNA ימי14,55.

ביצועי זיהוי qPCR עקביים באזורים שונים מצביעים על כך שהפרוטוקול לוכד באופן אמין את eDNA של יוונקים ימיים בתנאים סביבתיים מגוונים. שינויים קלים ב-Ct ככל הנראה משקפים הבדלים אזוריים בטמפרטורה, עכירות ופרודוקטיביות, המשפיעים על שחרור, פירוק ופיזור eDNA75,76. גבול הגילוי של המבחן (0.0001 ng/μL) נמצא בטווח הרגישות שדווח עבור בדיקות יונקים ימיות מאומתות אחרות שפותחו בפרויקט eWHALE 14,11,42. שיעורי הגילוי היו תואמים לחקירות מבוססות טביעות פלוק שפורסמו בעבר, מה שהדגיש את השפעת התנהגות המין ותדירות ההופעה על הצלחת הגילוי 41,42,47. תקני DNA נגזרים ברקמה שימשו לכימות qPCR, המשקפים פרקטיקה נפוצה במחקר eDNA ימי 57,72,77,78,79. בעוד שגישה זו עשויה להכניס שונות בכימות מוחלט 11,61,80,81,82,83, במיוחד עבור דגימות סביבתיות בריכוז נמוך והטרוגניות 84,85, היא משקפת מורכבות מדגם אמיתית55,86. שימוש בתקנים סינתטיים עשוי לשפר את השכפול הכמותי ואת ההשוואה בין המחקרים ומומלץ ליישומים עתידיים11,87.

מקורות זיהום פוטנציאליים כוללים העברת דגימה חוצה, וכן הכנסת DNA סביבתי אנושי או לא ממוקד במהלך שלבי הטיפול, מה שעלול להוביל לזיהוי חיובי שגוי88. בקרה קפדנית על זיהום חיונית לאורך כל העיבוד בשטח ובמעבדה, במיוחד בתנאים המוגבלים האופייניים לפעילות מדעית אזרחית. החלפות כפפות שגרתיות, שימוש בציוד נטול DNA, מערכות סינון סגורות, הכשרה סטנדרטית, הכללת בקרות שטח ומעבדה שגרתית, תיעוד אירועי זיהום פוטנציאליים ואימות בדיקות לפי מסגרות שנקבעו הם קריטיים להבטחת אמינות הנתונים וזיהוי מינים 11,31,49,51,55,89. למרות שהשימוש בפלסטיק הוא מגבלה בלתי נמנעת של דגימה מולקולרית מבוססת שדה, הצריכה הוצמצמה ככל האפשר, והשתמשו בחומרי סינון מתכלים חלקית66.

מגבלות, יכולת הרחבה והשלכות עתידיות
סתימת מסננים נותרה מגבלה מרכזית בסביבות עכורות או יצרניות כמו מפרץ סקילפנדי (איסלנד), שם חומר אורגני תלוי וצפיפות פלנקטון ככל הנראה הפחיתו את יעילות הסינוןב-43.90. רישום משך הסינון, אינדיקטורים לסתימת מסננים כגון זרימה מופחתת, בועות אוויר נראות במסנן, או מאמץ משאבה, והגבלת זמן הסינון לכ-45 דקות לכל שכפול תומכים בפרשנות והשוואה במורד הזרם. שימוש במכשיר צף מחוטא לתליית המסנן או שקיות סינון המוזנות בכוח הכבידה יכול לקצר את זמן הטיפול במהלך הסינון, אם כי האחרון עלול להיות לא תואם למסנני eDNA ששומרים את עצמם ונפחים גדולים (≥1 L)91. מסנני נקבוביות גדולים יותר (≥ 5 מיקרון) עשויים לשפר עוד יותר את קצב הסינון, אם כי יש להעריך את יעילות הגילוי הספציפית לטקסונים במהלך דגימת פיילוט ל-eDNA ליוונקיםימיים 45,92.

שיקולים מרכזיים לפני דגימה בקנה מידה מלא כוללים: העדפת סינון על הסינון על פני עיבוד מאוחר, שמירה על נפחי מים ותצורת מסננים אחידים, ביצוע דגימת פיילוט לאופטימיזציה של הסינון בתנאים מקומיים, והתאמת מאמצי הדגימה עם קיבולת הספינה ומשך הנסיעה. כלי הזנת נתונים דיגיטליים המאפשרים רישום מובנה בשטח על ידי מדענים אזרחיים מומלצים ליישומים עתידיים93.

היישום המוצלח של תהליך עבודה זה מהתחלה ועד סוף מדגים עמידות תחת מגבלות תפעוליות תוך הדגשת מגבלות הקשורות למרחב, זמן, מזג אוויר וסיכוני זיהום הטבועים בהקשרים של מדע אזרחי10,94. למרות מגבלות אלו, כלי שיט לצפייה בלווייתנים מהווים פלטפורמה חזקה ולא מנוצלת מספיק לניטור eDNA של יונקים כאשר ניתנים הכשרה ופיקוח סטנדרטיים 31,32,42,95. שילוב זרימת עבודה זו עם כלי ניטור יוונקים מוכרים, כגון זיהוי פוטוגרפי, אקוסטיקה פסיבית ודגימת ביופסיה, יכול לקשר בין גילויים גנטיים לנתונים התנהגותיים ודמוגרפיים. בעוד שמחקר זה מתמקד בזיהוי מבוסס qPCR ספציפי למין, יישומים עתידיים עשויים לשלב מטה-ברקידוד DNA או ניתוחים גנטיים של אוכלוסיות, ולהרחיב עוד יותר את הערך האקולוגי והשימורי של ניטור eDNA של יונקים ימיים.

ככל שגישות מבוססות eDNA ממשיכות לשגשג, תהליך עבודה זה מספק בסיס ניתן להרחבה לשילוב ניטור גנטי בתוכניות תצפית ושימור ימיות קיימות, במיוחד בנקודות חמות של יוונקים ימיים ובמערכות אקולוגיות רגישות.

גילויים

בלן גרסיה אובידה היא מייסדת ומנכ"לית Ocean Missions, ארגון ללא מטרות רווח המתמקד בשימור האוקיינוסים וממוקם בהוסאביק, צפון-מזרח איסלנד. משימות האוקיינוס מתאמת דגימה מכלי שיט לצפייה בלווייתנים באיסלנד, וכן מספינות משלחת ארקטי. היא גם משמשת כנציגת North Sailing, חברת צפייה בלווייתנים בהוסאביק, במסגרת פרויקט eWHALE. השתייכויות אלו לא השפיעו על עיצוב המחקר, איסוף הנתונים, ניתוח או פרשנות התוצאות.

תודות

ברצוננו להודות לכל האנשים המעורבים בעבודת שטח ובעבודת מעבדה, כלומר:

i) איידן מייבי, מתאו טוסאטו, אנוק אדולף, ז'אן לפורטה, רומי נירוט ואיזבל אוסטרלה, שהשתתפו בדגימות שנאספו במפרץ סקיאלפנדי, איסלנד; ii) דניה טסיי, מייקל קוסטה, ריטה נורברטו, מרלן שוונדט, ריטה לייטאו, ריקרדו ונטורה, מרטיין שוטן, ג'אדה ויסקונטיני, קתרינה ליב, אנתוני לה פלוך, פרנסיסקו נונס, רנאטו קרדוסו, פאוסטין דריוס, מוניק שוטן, לורה ביט באיים האזוריים (פורטוגל); iii) סנדרה שאלהרט, יאנה רוברטסון באוסטריה; וד) סבינה איירולדי, מריו גבואלדי, מרינה קוסטה, מורגנה ויגי, נינו פיראנטוניו, רוברטו ריינרי לאיסוף נתונים במקלט פלגוס (איטליה).

מחקר זה מומן על ידי Biodiversa+, השותפות האירופית למגוון ביולוגי, במסגרת קריאה משותפת של BiodivProtect לשנים 2021-2022 להצעות מחקר, במימון משותף של הנציבות האירופית (GA מס' 101052342) ועם הארגונים המממנים: 1) המרכז האיסלנדי למחקר (RANNÍS), (מענק מס' 229030), 2) משרד האוניברסיטאות והמחקר (MUR), מחשבון FIRST ו-IGRUE המיוחד בנוגע לשותפות האירופית Biodiversa+ Call 2021 - פרויקט eWHALE, 3) קרן המדע האוסטרית (FWF) [doi: 10.55776/I6389] וקרן הפרסום של אוניברסיטת אינסברוק.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסנני eDNA חלופיים: SterivexTM /Waterraמרק מיליפור/ווטרה פאפס בע"מSVHVL10RC/NA0.45 ומיקרו; גודל נקבוביות. נדרש מאגרי שימור eDNA  
AW1, AW2, מאגרי AEQiagen   19081, 19072, 19077תמיסות בופר המשמשות לטיהור DNA במהלך החילוץ
תמיסת אקונומיקה (1:10)DM - Denk mit, Hygienereinigerמותאם אישיתניקוי שטח. כל השלבים בתהליכי מעבדה
דלייםחנויות שיט, ציוד דיג, אמזוןנוקשה. גומי או פלסטיק קשה (יותר מ-10 ליטר). אחת או יותר, תלוי במבנה הדגימה ובלוגיסטיקה המובנית
תגובת ניקוי, אקספרס PCR ExoSAP-IT75001.1.EAהכנת מוצרי PCR לריצוף סנגר
תיבת קירורדיורמיכל קשיח מבודד או שקית קירור
כפפות חד-פעמיות, גדלים גדולים (L) ובינוניים (M),
ללא אבקה		קימברלי-קלארק43431, 55090כפפות ניטריל או לטקס חד פעמיות, קופסה של 100 יחידות. הכמות הנדרשת: קופסה אחת לכל 10 - 15 נסיעות
תקני DNA (3 & mu; L) NAמותאם אישיתרקמת DNA נגזרת - דילול סדרתי (8 נקודות, 10 ng/µ L) מלווייתן גבנון. כיול ב-qPCR
בגדי מעבדה בטוחים ל-DNAפאלאנו, PP-כללי081-2900כל השלבים בתהליכים במעבדה.
מיכל eDNAחנויות מגורים או חומרי בנייןNAעם מכסה, עמיד, שקוף (מעל 10 ליטר). 
פלטת הסחתה, כיסוי מוט, לוחות כביסה, לוח קשירהקיאגן19581, 997004, 1031656, 302570פלסטיקים המשמשים להפקת DNA  
אתנול (8:10)Endure, ACS ISO צלצלמגווןחיטוי ספסל. כל שלבי המעבדה
גיליונות נתונים בשטח
בדיקת רגישות גבוהה מבוססת פלואורסצנציהתרמו פישר סיינטיפיקQ32851בדיקת רגישות גבוהה של קיוביט dsDNA (Thermo Fisher Scientific, וולטהם, ארה"ב)
צנטריפוגה מהירה (24,000 סל"ד)Hettich Zentrifugen  מפריד בין סופרנטנט המכיל DNA לבין פסולת. ניתוק DNA
חבילות קרחחנויות מגוריםקירור הדגימות בתוך מכולת המשלוח
פריימרים קדימה ואחוריים של IPCטכנולוגיות DNA משולבותNAמוצר מותאם אישית המשמש להגדלת DNA של מין יעד
גלאי IPC פריים טיים qPCRטכנולוגיות DNA משולבותNAמוצר מותאם אישית המשמש להגדלת DNA של מין יעד
מכסה זרימה למינרי מוצרי המעבדה של קנדרוVFS1206סביבה סטרילית להכנת תגובות בהכנת qPCR
פרוטוקול שדה מאויר למינציה  מותאם אישית
בופר Lysisקיאגן79216בופר ליזיס DNeasy AL. חלופה ל-TES Buffer + Proteinase K
חרוז מגנטי & נדש; רובוט מבוסס DNAראש PCR קינגפישר אפקס 965400910תוכנה: BindIx PC 
חלקיקים מגנטיים לקשירת חומצות גרעין (30 ומיקרו; L)קיאגן67563חלקיקי MagAttract (חלקיקי MagTract). מקל על קישור DNA לחרוזים מגנטיים בהפקת DNA
מאסטר מיקס (5 ו-mu; L)EMM, Life Technologies4396838TaqMan Environmental Master Mix (2.0)
צנטריפוגה מיני עם סיבוב לוחות LabnetC1000סובב טיפות נוזל ועיבוי מ-PCR ולוחות מיקרו
ערכת הסרת מעכבי PCR OneStep-96מחקר ZYMOD6035טיהור והסרת מזהמים בתמציות eDNA  
לוחות PCRביו-ראדHSP9601באר 96 קשיחות
פיפטות + קצוות מסוננים סטרילייםפיפטות: BIOHIT, טיפים לסינון: Biozym Safe  טיפים לחותמות   מקצועימגווןניתן להשתמש בפיפטות ידניות או אלקטרוניות בנפחים מקסימליים שונים
צנטריפוגה עם ספינר לוחות NANAמסיר בועות לפני qPCR 
פרוטאנאז KAvantor VWRA4392.0010מעכל חלבונים כדי לסייע בשחרור DNA במהלך הליזה
מים מטוהריםMilliQNAמים ללא RNase, המשמשים לבקרות שליליות ותמיסת ניקוי  
צינורות תגובה (2 מ"ל)אפנדורף30120094ניתוק DNA
תרמחזור PCR כמותי בזמן אמתAnalytikjenaNAפלטפורמת QTower 3G. מגבירה וכמתת את ה-DNA בזמן אמת
חבליםשיט, חנויות כלי עבודה, נמלי דיגNAחומר חזק (למשל, פוליאתילן או חבל קלוע). אורך לפחות פי שניים מגובה הכלי
סרט איטום, דבק, אופטיביו-ראדMSB1001מיקרוסיל 'ב'. אטום לוחית PRC לפני PCR
מסנני eDNA משמרים את עצמםסמית'-רוט 11579-251.2 ומיקרו; גודל נקבוביות. כמות לכל קמפיין דגימה: לפי הצורך
מכולת הובלהמעבדות, בתי מרקחת, אמזוןמגווןקלקר מבודד
תוכנה ליישור וניתוח רצפים ביולוגייםעריכת ביוגרפיהגרסה 7עורך ותוכנת ניתוח יישור רצפים ביולוגיים ידידותית למשתמש עבור Windows 95/98/NT
בקבוק סחיטהמעבדות, בתי מרקחתמגווןמלא באקונומיקה ביתית (1:10)
תוכנת ניתוח סטטיסטיR Studio Team. (2023)גרסה 4.2.1
כפפות מחוטאות ללא DNASempercare  מהדורה79712כל השלבים בתהליכי מעבדה.  
בופר TESמוצר מותאם אישית, המקביל ל-DNeasy lysis buffer
מיכל פסולת רעילהסילוק בטוח של פסולת מסוכנת. כל השלבים
מנורת UV SterilAIRחיטוי מכסה המנוע להכנת qPCR
Vortex-genie 2 vortex mixer תרמו פישר סיינטיפיק50728002הומוגניזציה ומערבבת ריאגנטים. ניתוק DNA, חילוץ
מיכל פסולתחנויות מגוריםמיכל קשיח קטן
משאבת מים (פריסטלטיקה/ואקום)אייקלקמפ; סולינסט/סמית'-רוט 12.34.SB; 410/12099משאבות ניידות
טוש עמיד למיםמגוון

מקורות

  1. Hammerschlag, N., et al. Ecosystem function and services of aquatic predators in the Anthropocene. Trends Ecol Evol. 34 (4), 369-383 (2019).
  2. Sequeira, A. M. M., et al. Overhauling ocean spatial planning to improve marine megafauna conservation. Front Mar Sci. 6, 639(2019).
  3. Noren, D. P., Mocklin, J. A. Review of cetacean biopsy techniques: Factors contributing to successful sample collection and physiological and behavioral impacts. Mar Mamm Sci. 28 (1), 154-199 (2012).
  4. Evans, P. G. H., Hammond, P. S. Monitoring cetaceans in European waters. Mammal Rev. 34 (1-2), 131-156 (2004).
  5. Bittencourt, L., et al. Mapping cetacean sounds using a passive acoustic monitoring system towed by an autonomous Wave Glider in the Southwestern Atlantic Ocean. Deep Sea Res Part I. 142, 58-68 (2018).
  6. Balmer, B. C., et al. Advances in cetacean telemetry: A review of single-pin transmitter attachment techniques on small cetaceans and development of a new satellite-linked transmitter design. Mar Mamm Sci. 30 (2), 656-673 (2014).
  7. Angliss, R. P., et al. Comparing manned to unmanned aerial surveys for cetacean monitoring in the Arctic: Methods and operational results. J Unmanned Veh Syst. 6 (3), 109-127 (2018).
  8. Jahoda, M., et al. Mediterranean fin whale (Balaenoptera physalus) response to small vessels and biopsy sampling assessed through passive tracking and timing of respiration. Mar Mamm Sci. 19 (1), 96-110 (2003).
  9. Fu, M., Hemery, L., Sather, N. Cost efficiency of environmental DNA compared to conventional methods for biodiversity monitoring at marine energy sites. PNNL Rep. , PNNL-32310(2021).
  10. Sahu, A., et al. Environmental DNA (eDNA): Powerful technique for biodiversity conservation. J Nat Conserv. 71, 126325(2023).
  11. Klymus, K. E., et al. Development and testing of species-specific quantitative PCR assays for environmental DNA applications. J Vis Exp. (165), e61825(2020).
  12. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: The importance of primer specificity. PLoS ONE. 8 (3), e59520(2013).
  13. Wilcox Talbot, L. A., et al. Validated environmental DNA assay for detection of the rare Rice's whale (Balaenoptera ricei). Environ DNA. 7 (2), e70074(2025).
  14. Rodriguez, L. K., et al. Inter-laboratory ring test for environmental DNA extraction protocols: Implications for marine megafauna detection using novel qPCR assays. Metabarcoding Metagenomics. 9, e128235(2025).
  15. Adams, C. I., et al. Beyond biodiversity: Can environmental DNA cut it as a population genetics tool. Genes. 10 (3), 192(2019).
  16. Parsons, K. M., et al. Water everywhere: Environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species. R Soc Open Sci. 5 (8), 180537(2018).
  17. Rourke, M. L., et al. Environmental DNA as a tool for assessing fish biomass: A review. Environ DNA. 4 (1), 9-33 (2022).
  18. Sard, N. M., et al. Comparison of fish detections using environmental DNA metabarcoding and traditional gears. Environ DNA. 1 (4), 368-384 (2019).
  19. Sigsgaard, E. E., et al. Population-level inferences from environmental DNA-Current status and future perspectives. Evol Appl. 13 (2), 245-262 (2020).
  20. Afonso, L., et al. Environmental DNA as a complementary tool for biodiversity monitoring. PLoS ONE. 19 (10), e0300992(2024).
  21. Silliman, K., et al. Evaluating prey availability for the Rice's whale based on environmental DNA. Ecol Evol. 16 (1), e72789(2026).
  22. Boyse, E., et al. Environmental DNA reveals fine-scale spatial and temporal variation of marine mammals and prey species. Environ DNA. 6 (4), e587(2024).
  23. Székely, D., Cammen, K. M., Olsen, M. T. Using environmental DNA to study marine mammals in the North Atlantic. NAMMCO Sci Publ. 12, (2021).
  24. Alter, S. E., et al. Using environmental DNA to detect whales and dolphins in the New York Bight. Front Conserv Sci. 3, 820377(2022).
  25. Parsons, K. M., et al. Environmental DNA for monitoring marine mammals: Challenges and opportunities. Front Mar Sci. 9, 987774(2022).
  26. Couton, M., Viard, F., Altermatt, F. Opportunities and inherent limits of using environmental DNA for population genetics. Environ DNA. 5 (5), 1048-1064 (2023).
  27. Leerhøi, F., et al. Exploring the potential of extreme citizen science with Danish high school students using environmental DNA for marine monitoring. Front Mar Sci. 11, 1347298(2024).
  28. Tøttrup, A. P., et al. Citizens in the lab: Performance and validation of eDNA results. Citiz Sci Theory Pract. 6 (1), (2021).
  29. Kelly, R., et al. Citizen science and marine conservation: A global review. Philos Trans R Soc B. 375 (1814), 20190461(2020).
  30. Church, E. K., et al. From citizen science experiences to stewardship action. Mar Policy. 173, 106537(2025).
  31. Barbaccia, E., et al. Combining citizen science, environmental DNA, and whale watching. Ocean Coast Manag. 269, 107827(2025).
  32. Barbaccia, E., et al. Willingness to engage in marine conservation through eDNA-informed citizen science. Sci Rep. 15 (1), 41983(2025).
  33. Broadhurst, H. A., et al. Citizen scientists' motivation to participate in environmental DNA (eDNA) surveys. Citiz Sci Theory Pract. 10 (1), (2025).
  34. O'Connor, S., et al. Whale Watching Worldwide. , Int Fund Anim Welfare. Yarmouth, MA. (2009).
  35. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  36. Foote, A. D., et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PLoS ONE. 7 (8), e41781(2012).
  37. Baker, C. S., et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales. Front Mar Sci. 5, 342201(2018).
  38. Takahashi, M., et al. Aquatic environmental DNA: A review. Sci Total Environ. 873, 162322(2023).
  39. Govindarajan, A. F., et al. Improved biodiversity detection using a large-volume environmental DNA sampler. Deep Sea Res Part I. 189, 103871(2022).
  40. Bessey, C., et al. Maximizing fish detection with environmental DNA metabarcoding. Environ DNA. 2 (4), 493-504 (2020).
  41. Robinson, C. V., et al. DNA from dives: Species detection of humpback whales from flukeprint environmental DNA. Environ DNA. 6 (2), e524(2024).
  42. Rodriguez, L. K., et al. Enhancing environmental DNA sampling efficiency for cetacean detection. Environ DNA. 7 (3), e70103(2025).
  43. Jackman, J. M., et al. Performance of eDNA filtration methods in a hyper-tidal estuary. Environ DNA. 7 (5), e70206(2025).
  44. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Sci Rep. 8, 4682(2018).
  45. Liu, Q., et al. Optimization of pore size and filter material for better enrichment of environmental DNA. Front Environ Sci. 12, 1422269(2024).
  46. Li, J., et al. Effect of filtration method on environmental DNA capture efficiency. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  47. Robinson, C. V., et al. Temporal dynamics of flukeprint environmental DNA detection. Environ DNA. 7 (3), e70132(2025).
  48. Székely, D., et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales. Environ DNA. 3 (1), 248-260 (2021).
  49. Bruce, K., et al. A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Adv Books. 1, e68634(2021).
  50. Pogner, C. -E., et al. Airborne DNA: State of the art. Sci Total Environ. 957, 177439(2024).
  51. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for environmental DNA detection. Methods Ecol Evol. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  52. Combining environmental DNA sampling, whale watching and citizen science. , eWHALE Project. accessed (2025).
  53. Klotz, L., et al. Annual and monthly fluctuations in humpback whale presence. J Cetacean Res Manag. 16, 9-16 (2017).
  54. Peres dos Santos, R., et al. First humpback whale re-sighting. Polar Biol. 45 (3), 523-527 (2022).
  55. Thalinger, B., et al. Validation scale for environmental DNA assays. Environ DNA. 3 (4), 823-836 (2021).
  56. Hall, T. A. BioEdit. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95-98 (1999).
  57. Benoit, N. P., et al. Using qPCR of environmental DNA to estimate salmon biomass. Environ DNA. 5 (4), 683-696 (2023).
  58. Skovhus, T. L., et al. Real-time quantitative PCR for marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 70 (4), 2373-2382 (2004).
  59. Godhe, A., et al. Quantification of diatom and dinoflagellate biomasses. Appl Environ Microbiol. 74 (23), 7174-7182 (2008).
  60. Baudry, T., et al. Influence of distance and seasonality in eDNA detection. Environ DNA. 5 (4), 733-749 (2023).
  61. Hunter, M. E., et al. Detection limits of PCR assays. Mol Ecol Resour. 17 (2), 221-229 (2017).
  62. Lee, J., et al. Species-specific eDNA assay for Ascidiella aspersa. Ecol Evol. 15 (11), e72453(2025).
  63. National Center for Biotechnology Information. BLAST. , accessed (2025).
  64. R Foundation. R. , (2023).
  65. susannat, eDNA sampling protocol: Smith-Root citizen scientist sampler. , protocols.io. (2024).
  66. Thomas, A., et al. Self-preserving eDNA filter. Methods Ecol Evol. 10, 1137-1145 (2019).
  67. Thalinger, B., et al. eDNA shedding of freshwater fish. Front Ecol Evol. 9, 623718(2021).
  68. Hymus, C. [PhD Thesis]. , Murdoch Univ. (2016).
  69. Rodriguez, L. K., Thalinger, B. DNA extraction - Qiagen BioSprint® 96 Workstation using the Biosprint 96 tissue protocol UIBK eWHALE. , protocols.io. (2024).
  70. Valsecchi, E., et al. Universal primers for marine mammals. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  71. Rota, A., Valsecchi, E. Floating Lab SOP. J Vis Exp. 222, e67366(2025).
  72. Robinson, C. V., et al. Limited cetacean detection by low-volume eDNA. Environ DNA. 5 (6), 1641-1651 (2023).
  73. Pinfield, R., et al. False-negative detections in killer whale presence. Environ DNA. 1 (4), 316-328 (2019).
  74. Strickler, K. M., et al. eDNA degradation. Biol Conserv. 183, 85-92 (2015).
  75. Rishan, S. T., et al. Applications of eDNA metabarcoding. Environ Adv. 12, 100370(2023).
  76. Schrader, C., et al. PCR inhibitors. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  77. Thomsen, P. F., et al. Detection of marine fish fauna. PLoS ONE. 7 (8), e41732(2012).
  78. Guri, G., et al. Detection sensitivity of qPCR and ddPCR. Ecol Evol. 14 (12), e70678(2024).
  79. Andruszkiewicz, E. A., et al. Persistence of marine fish eDNA. PLoS ONE. 12 (9), e0185043(2017).
  80. Venegas, V., Halberg, M. C. mtDNA copy number. Methods Mol Biol. 837, 327-335 (2012).
  81. Naue, J., et al. mtDNA copy number variation. Mitochondrion. 74, 101823(2024).
  82. Andreu, A. L., et al. mtDNA copy number. Mitochondrion. 9 (4), 242-246 (2009).
  83. Langlois, V. S., et al. Robust qPCR-based eDNA assays. Environ DNA. 3 (3), 519-527 (2021).
  84. Barnes, M. A., Turner, C. R. Ecology of environmental DNA. Conserv Genet. 17, 1-17 (2016).
  85. Mathieu, C., et al. Variability in eDNA data. Front Ecol Evol. 8, 466868(2020).
  86. Wilson, C. C., et al. Synthetic controls for eDNA. Methods Ecol Evol. 7 (1), 23-29 (2016).
  87. Lux, M. W., et al. Reproducibility in synthetic biology. Synth Biol. 8 (1), ysad014(2023).
  88. Sepulveda, A. J., et al. Contamination in eDNA studies. Front Ecol Evol. 8, 609973(2020).
  89. Minamoto, T., et al. An illustrated manual for environmental DNA research. Environ DNA. 3 (1), 8-13 (2021).
  90. Barnes, M. A., et al. Environmental conditions influence eDNA persistence. Environ Sci Technol. 48 (3), 1819-1827 (2014).
  91. Oka, S. I., et al. Gravity filtration of eDNA. MethodsX. 9, 101838(2022).
  92. Berran, M. S., et al. eDNA sampling strategies. Hydrobiologia. 852, 3485-3501 (2025).
  93. Esri. ArcGIS Survey123. , (2025).
  94. Ralson, M. J., et al. Translating eDNA into conservation action. Conserv Sci Pract. 7 (2), e70000(2025).
  95. Dela Cruz-Modino, R., Cosentino, M. Whale-watching industry value. Sustainability. 14 (20), 13471(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

eDNAFlukeprintPCRDNA
דגימת DNA סביבתית מכלי שיט לצפייה בלווייתנים למעקב אחר יונקים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.