מאמר שיטה

PCR חופף חד-שלבי לסינתזה מהירה של תבניות DNA RNA עם מדריך יחיד עבור מערכת CRISPR

193 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

במאמר זה

סיכום

שיטת PCR חופפת חד-שלבית המשתמשת בארבעה פריימרים מאפשרת יצירת תבניות DNA מהירה ובעלות נמוכה לשעתוק sgRNA במבחנה . יחס פריימר אופטימלי (50:5:1:50) מייצר sgRNA איכותיים בתוך 5 שעות, כאשר אימות פונקציונלי מודגם באמצעות בדיקות מבחנה ופעילות עריכה בתאי HEK293T.

תקציר

מערכת CRISPR–Cas חוללה מהפכה בעריכת הגנום; עם זאת, שיטות קונבנציונליות ליצירת RNA מדריך יחיד (sgRNA) כוללות לעיתים שלבי שיבוט גוזלים זמן או ערכות סינתזה מסחריות יקרות. מוצגת אסטרטגיית PCR אופטימלית חד-שלבית חופפת לסינתזה מהירה וחסכונית של תבניות DNA לשעתוק sgRNA במבחנה . באמצעות ארבעה פריימרים חופפים חלקית המכסים את פרומוטר T7, רצף המדריך הספציפי למטרה ופיגום sgRNA, מורכבים תבניות באורך מלא בתגובת PCR אחת ללא שיבוט. אופטימיזציה ניסויית שיטתית קבעה יחס פריימר אופטימלי (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), תוך מזעור תוצרי לוואי לא ספציפיים תוך מיקסום תפוקת המוצר באורך מלא, כפי שאושר על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. גישה זו הורחבה בהצלחה ליצירת תבניות ל-sgRNA של Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9), והדגימה יישום חוצה מערכות מעבר ל-Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). למרות שסינתזה כימית ישירה של sgRNA מציעה יתרונות כמו טוהר גבוה, שינויים כימיים לשיפור היציבות והפחתת השפעות מחוץ למטרה, היא נותרת יקרה מאוד ליישומים בעלי תפוקה גבוהה או מסכים בקנה מידה גדול שדורשים מספר רב של sgRNA. בדיקות חיתוך חוץ-גופית הראו כי RNA מנחה שנוצר בשיטה זו משיג יעילות עריכה הדומה לאלו שמתקבלות באמצעות שיבוט מבוסס פלסמידים קונבנציונלי. יתרה מזאת, קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאינים שהורכבו עם sgRNA אלו ומועברים לתאי HEK293T באמצעות אלקטרופורציה הביאו להיווצרות אינדל ניתנת לזיהוי בלוקוס היעד, מה שמאשר את הפונקציונליות ב-vivo. ניתוח עלויות מצביע על כך ששיטה זו מפחיתה משמעותית את עלויות הכנת התבניות בהשוואה לערכות סינתזה מסחריות, תוך קיצור זמן התגובה מימים לשעות, ובכך מספקת גישה נגישה וניתנת להרחבה למעבדות העוסקות במחקר גנטי.

מבוא

מערכת CRISPR–Cas, שמקורה במנגנון חיסוני אדפטיבי בחיידקים וארכאאוטים, חוללה מהפכה בהנדסה גנטית בכך שאפשרה עריכה מדויקת של גנום בין אורגניזמים מגוונים 1,2. רכיב מרכזי הוא ה-RNA המדריך היחיד (sgRNA), RNA כימרי שמכוון את נוקלאזי Cas ללוקסים גנומיים ספציפיים; העיצוב המודולרי שלו מאפשר ריטרג'ינג באמצעות שינוי רצף פרוטוספייסר של כ-20 נוקלאוטידים3. מעבר ל-SpCas9, נוקלאזים נוספים של Cas עם תכונות מובחנות אומצו באופן נרחב. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) קטן יותר, מקל על הפצת וירוס אדנו-קשור (AAV) ובכך מרחיב את אפשרויות ההפצה4. כל מערכת דורשת ארכיטקטורות RNA מונחות ספציפיות, מה שהופך את שיטת הסינתזה הרב-תכליתית למבוקשת מאוד3.

שיטות מסורתיות ליצירת RNA מדריך פונקציונלי כוללות שיבוט מבוסס פלסמיד, ערכות סינתזת sgRNA מסחריות, או סינתזה מסחרית ישירה של sgRNA 5,6. שיבוט מבוסס פלסמיד דורש מספר שלבים עתירי עבודה — עיכול הגבלה, קשירה, טרנספורמציה וסינון מושבות — בדרך כלל אורך מעל 48 שעות 2,4,6. ערכות sgRNA מסחריות, למרות שמציעות זרימת עבודה יעילה (<5 שעות), נשארות יקרות מאוד ליישומים בעלי תפוקה גבוהה, בדרך כלל בעלות של 35–45$ לתגובה. סינתזה כימית ישירה של sgRNA מציעה יתרונות כמו טוהר גבוה, שינויים כימיים לשיפור היציבות, והפחתת השפעות מחוץ למטרה7; עם זאת, הוא יקר מאוד (בדרך כלל 200–280 דולר ל-sgRNA) עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה או מסכים בקנה מידה גדול הדורשים מאות sgRNA.

לעומת זאת, שיטת ה-PCR החופפת החד-שלבית המתוארת כאן משלימה את סינתזת התבנית בפחות מ-5 שעות באמצעות פריימרים סטנדרטיים בעלות של כ-5–8 דולר ל-sgRNA, מה שמייצג הפחתה משמעותית הן בזמן והן בעלות החומר. יתרה מזאת, sgRNA המיוצרים בשיטה זו משיגים יעילות עריכה דומה לזו שנוצרת על ידי שיבוט מבוסס פלזמידים, כפי שמאושר על ידי בדיקות חיתוך במבחנה . השוואה בין גישות אלו מוצגת באיור 1.

PCR הרחבת חפיפה (OE-PCR) מספק אסטרטגיה מהירה ובלתי תלויה בליגז להרכבת קטעי DNA8. גישה זו הותאמה לסינתזת תבנית sgRNA באמצעות פריימרים חופפים. בתגובה חד-שלבית המשתמשת בארבעה פריימרים חופפים חלקית, מתרחש קישור תחרותי: הפריימרים החיצוניים (AF1 ו-Tracr-R) מגדירים את גבולות ההגברה, בעוד שהפריימרים הפנימיים (AF2 ו-AF3) צריכים להיות מדוללים כדי להבטיח התרחבות מסודרת משני הקצוות למרכז. למרות המסגרת התיאורטית הזו, פרמטר קריטי המשפיע על יעילות ההרכבה — יחס הפריימר האופטימלי — לא נחקר באופן שיטתי. יתרה מזאת, היישום הרחב יותר של שיטות OE-PCR כאלה במערכות CRISPR שונות עדיין לא נחקר.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, תוכנן מחקר לאופטימיזציה ולאמת שיטת PCR חופפת חד-שלבית לסינתזת תבנית sgRNA. יחס הפריימר האופטימלי נקבע באמצעות עיצוב ניסויי מובנה, כאשר אלקטרופורזה בג'ל אגרוז שימשה לזיהוי תנאים שמניבים מוצר יחיד בגודל נכון. לאחר האופטימיזציה, הוערכה הרב-גוניות של השיטה בשתי מערכות CRISPR נפוצות (SpCas9 ו-saCas9), עם הגברה מוצלחת של שתי התבניות. אימות פונקציונלי באמצעות בדיקות חיתוך חוץ-גופית הראה כי sgRNAs שנוצרו בשיטה זו משיגים יעילות דומה לאלו שהושגו באמצעות שיבוט מבוסס פלסמיד.

להערכת פונקציונליות נוספת בהקשר תאי, SgRNA של SpCas9 קומפלקס עם חלבון Cas9 ליצירת קומפלקסים ריבונוקלאופרוטאינים (RNP) והועבר לתאי HEK293T באמצעות אלקטרופורציה. עריכת הגנום בלוקוס אנדוגני הוערכה באמצעות מבחן T7 Endonuclease I (T7EI), עם דפוסי חיתוך על ג'לים של אגרוז המעידים על היווצרות אינדל ניתנת לזיהוי ב-vivo. ביחד, ממצאים אלו מראים ששיטה זו מייצרת באופן אמין תבניות sgRNA איכותיות ופונקציונליות. הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך המפורט תוך שימוש ב-SpCas9 כדוגמה מייצגת, עם תבניות פריימר שסופקו להתאמה לנוקלאזים Cas אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בקו התאים HEK293T הזמין מסחרית (ATCC CRL-3216) בוצע בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בית החולים הראשון של העם בעיר צ'נג'ואו, אוניברסיטת דרום סין, לשימוש בקווי תאים שמקורם בבני אדם. התגובות, התוכנה והציוד בהם השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

1. עיצוב רצפי מטרה של sgRNA

  1. זהה את האזור הגנומי היעד באמצעות כלים מקוונים מוכרים (למשל, CRISPRscan, CHOPCHOP או Broad Institute CRISPick)3.
  2. גש לשרת האינטרנט של CHOP ב-https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. הזן את מידע הגן היעד ובחר את מערכת CRISPR/Cas המתאימה (למשל, EGFR עבור CRISPR/Cas9) (איור 2A).
  4. סקור את טבלת הפלט, הכוללת דירוג, רצף יעד, מיקום גנומי, גדיל, תכולת GC (אחוז), השלמה עצמית, אתרים חזויים מחוץ למטרה (MM0, MM1, MM2, MM3), וציון יעילות (איור 2B).
  5. בחרו רצף RNA מדריך עם יעילות גבוהה במטרה ופעילות נמוכה חזויה מחוץ למטרה הרצויה.
  6. רשמו את רצף המטרה הסופי של sgRNA לעיצוב פריימר (למשל, רצף יעד EGFR: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (איור 2B).

2. סינתזה והכנת ארבעה פריימרים חופפים

  1. תכנן ארבעה פריימרים של אוליגונוקלאוטידים (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) עם אזורים חופפים כך (איור 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [המשך מטרה] GTTTTAGAGCTAGAAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    הערה: החלף את [target seq] בפריימר AF1 ברצף שהושג בשלב 1.6.
  2. סינתז פריימרים בקנה מידה של 25 ננומול עם טיהור דה-סולט סטנדרטי.
  3. החזירו פריימרים מיובשים במים ללא נוקלאז לריכוז מלאי של 100 מיקרומון. צנטריפוגה ב-5000 × גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר.

3. אופטימיזציה של ריכוזי פריימר ו-PCR חופף חד-שלבי לסינתזת תבנית sgRNA

  1. הכינו תערובות פריימר בריכוזי AF2 ו-AF3 משתנים לפי טבלה 1. שמרו על AF1 ו-Tracr-R ב-10 מיקרומטר.
  2. הכינו תגובות PCR בצינורות נטולי נוקלאז בנפח 0.2 מ"ל לפי טבלה 2. השתמשו בפולימראז DNA באיכות גבוהה.
  3. ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג חמש פעמים. אל תבצעו מערבולת. צנטריפוגה ב-5000 × גרם למשך דקה.
  4. הרץ PCR בהתאם לתנאי המחזור המתוארים בטבלה 3.

4. אלקטרופורזה והשבת תבניות DNA

  1. הכינו ג'ל אגרוז 2% על ידי המסה של 2 גרם אגרוז ב-100 מ"ל של בופר 1× TAE. מקררים ל-50–60 מעלות צלזיוס, מוסיפים צבע של 5 מיקרו-ליטר חומצה גרעין, ויצקו את הג'ל.
  2. תן לג'ל להתגבש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. עומס 10 מיקרוליטר מוצר PCR מעורבב עם 2 מיקרוליטר של בופר עומס 6×. כולל סולם DNA של 100 bp.
  4. הרץ אלקטרופורזה ב-100 וולט למשך 30–40 דקות.
  5. הדמיין תחת תאורת UV. אשר שמצב 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) מייצר תחום ~120 bp יחיד (איור 4A).
  6. השתמש בריכוזי פריימר אופטימליים: AF1 10 מיקרומון, AF2 1 מיקרומון, AF3 0.2 מיקרומון, Tracr-R 10 מיקרומון.
  7. הסר את רצועת היעד באמצעות סכין סטרילי. הגבל את החשיפה ל-UV ל-≤30 שניות.
    הערה: אחסן את פרוסות הג'ל בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס עד שבוע או המשך מיד.

5. טיהור תבניות DNA

  1. טהרו DNA באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפי הוראות היצרן10.
  2. DNA אלוט במים נטולי נוקלאז של 20–30 מיקרוליטר (60 מעלות צלזיוס) מחוממים מראש.
  3. למדוד ריכוז DNA. תפוקה טיפוסית: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1.8–2.0.
    הערה: יש לאחסן DNA מטוהר בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.

6. שעתוק וחתיקה של sgRNA במבחנה

  1. הרכיבו את תגובת השעתוק באמצעות ערכת סינתזת RNA של T7 (טבלה 4). הכינו על קרח11.
    הערה: השתמשו בחומרים נטולי RNase וניקו את כל המשטחים.
  2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  3. הוסיפו 1 מיקרוליטר DNase I ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. טיהור sgRNA באמצעות ערכת ניקוי RNA12.
  5. נפילת מים ללא נוקלאז בנפח 30–50 מיקרוליטר.
  6. כמת sgRNA. תפוקה צפויה: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1.9–2.1.
    הערה: יש לאחסן את sgRNA בטמפרטורה של −80°C למשך עד שנה.

7. בדיקת חיתוך חוץ-גופית לאימות פעילות sgRNA

  1. הכינו וטיהרו את DNA המטרה. כוונו את הריכוז ל-60 ng/μL13.
  2. הרכיבו את תגובת הפיצול (טבלה 5)—קדם-אינקובציה ללא DNA ב-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כלול בקרה שלילית.
  3. הוסף 1 מיקרו-ליטר DNA למטרה.
  4. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. הוסף 4 מיקרוליטר של בופר עומס של 6× כדי לעצור את התגובה.
  6. הרץ את המוצרים על ג'ל אגרוז 2% ב-100 וולט למשך 30–40 דקות.
  7. לדמיין תחת אור UV. לאשר חיתוך (למשל, 617 bp → 414 bp + 203 bp) (איור 4C).

8. אימות תאי של עריכת Cas9 מונחית sgRNA

  1. הכינו את קומפלקס הריבונוקלאופרוטאין (RNP) על ידי ערבוב חלבון Cas9 ו-sgRNA ביחס מולרי של 1:2. שלבו 10 מיקרו-ליטר Cas9 (4 mg/mL), 280 מיקרו-ליטר sgRNA (60 ng/μL) ו-200 מיקרו-ליטר DMEM. דגרו במשך 15 דקות.
  2. תרב HEK293T תאים ל-~80% קונגונלנציה. קציר והתאים ל-3 × 106 תאים לכל דגימה.
  3. משלבים את קומפלקס ה-RNP עם התאים ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. העבר לקובט אלקטרופורציה בקוטר 2 מ"מ. אלקטרופורט ב-115 וולט, 4 מילישניות, פולס אחד (575 וולט לס"מ). הוסף מיד 10 מ"ל מדיום שלם והעבר ללוח עם 6 בארות.
  5. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 48 שעות.
  6. להפיק DNA גנומי מתאים מטופלים ובקרים. למדוד ריכוז.
    הערה: יש לאחסן DNA בטמפרטורה של −20°C עד 6 חודשים.
  7. הגבר את מוקד היעד באמצעות PCR (טבלה 6 וטבלה 7).
    הערה: גודל המוצר הצפוי: 617 נקודות בסיס ל-EGFR.
  8. בדוק את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 2%. טהר את הרצועה הנכונה וכמת את ה-DNA.
  9. בצע יצירת הטרודופלקס (טבלה 8 וטבלה 9).
  10. הוסיפו 1 מיקרוליטר T7 אנדונוקלאז I ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מכבים בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  11. הוסף בופר טעינה ומריץ על ג'ל אגרוז 2%.
  12. הדמיין תחת אור UV. אשר היווצרות אינדל (617 bp → 414 bp + 203 bp) (איור 4D).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יישום מוצלח של פרוטוקול PCR חד-שלבי חופף יוצר רצועת DNA חדה, חדה, בגודל הצפוי, כאשר ניתוח באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז.

יחסי פריימר תת-אופטימליים, במיוחד אלו עם ריכוזים מופרזים של פריימרים פנימיים (AF2 ו-AF3), גורמים לרצועות נוספות הגדולות מהמכפל הצפוי, מה שמעיד על הגברה לא ספציפית או יצירת פריימר-דימר, יחד עם רצועות חלשות המתאימים לביניים של הרכבה לא שלמה (איור 4A, תנאים 1, 4, 7 ו-10). תנאים תת-אופטימליים אלו משמשים כבקרות שליל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מתואר פרוטוקול יעיל וחסכוני לסינתזה של תבניות DNA של sgRNA באמצעות אסטרטגיית PCR חופפת חד-שלבית. שיטה זו מבטלת את הצורך בבניית פלסמידים ושכפול, ומקיצרת את זמן הכנת התבנית ממספר ימים לכ-5 שעות. היבט מרכזי בגישה זו הוא אופטימיזציה שיטתית של יחס הפריימר, שנקבע כ-50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R), התואם לריכוזי עבודה של 10 מיקרומ', 1 מיקרומ', 0.2 מיקרומום ו-10 מיקרומ', בהתאמה. יחס זה ממזער תוצרי לוואי לא ספציפיים וממקסם את התפוקה של מוצר באורך מלא, ותומך ביישומי שעתוק במבחנה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מחקר הבריאות של ועדת הבריאות של מחוז חונאן (מספר מענק W20243264), קרן המדע הטבעי של מחוז חונאן (מספר מענק 2023JJ50368), פרויקט המחקר המרכזי של משרד החינוך של מחוז חונאן (מספר מענק 24A0607), ופרויקט הצוות החדשני של בית החולים העממי הראשון של צ'נג'ואו (מענק מספר CX202103).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 bp DNA LadderTIANGENMD109סמן גודל DNA לאלקטרופורזה
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849Mחומר זירוז PCR
50 bp DNA LadderTIANGENMD108סמן גודל DNA לקטעים קטנים
6DNA loading bufferTIANGEN1109565חיץ העמסת דגימה לאלקטרופורזה
ערכת מיצוי DNA מג'ל אגרוזTIANGENDP219טיהור DNA מג'ל אגרוז
אגרוז I Thermo Scientific 17850הכנת ג'ל אגרוז
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicכלי עיצוב sgRNA
צנטריפוגהHENGNUO2-16Rצנטריפוגה של דגימה
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023Aתוסף לתרבית תאים
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682חומרים להכנת חיץ TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/כלי עיצוב sgRNA
חממת CO2Thermo Scientific51032874דגירת תרבית תאים של יונקים
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/כלי עיצוב sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500תרכובת תרבית תאים
dsDNaseThermo Scientific EN0771הסרת תבנית DNA לאחר תעתוק
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830אלקטרופורציה של תאים
EDTA Na2BioSharpBS108חומרים להכנת חיץ TAE
אמבט מים תרמוסטטי חשמליSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8דגירה עם בקרת טמפרטורה
מכשיר אלקטרופורזה TrophoresisLIUYIDYCP-31BNאלקטרופורזה בג'ל אגרוז
מערכת ניתוח והדמיית ג'לShanghHai JiaPengZF-258ויזואליזציה והדמיה של ג'ל
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5נוקלאז Cas9 לעריכת גנום
ערכת מיצוי DNA גנומיTIANGENYDP304בידוד DNA גנומי
ערכת סינתזת RNA HiScribe T7 High YieldNEBE2040Sתעתוק in vitro של sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834זירוז PCR
ספקטרופוטומטר NanoDrop 2000cThermo Scientific 2000cכימות חומצות גרעין
צבע חומצת גרעין (למשל, GeneRed)TIANGENRT211ויזואליזציה של DNA בג'ל אגרוז
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578זירוז PCR עם נאמנות גבוהה
פריימרים (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptאוליגונוקלאוטידים להרכבת תבנית sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083חומרים להכנת חיץ TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01טיהור RNA

מקורות

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAIn Vitro Transcription

מאמרים קשורים