מאמר שיטה

שיטה כירורגית ליצירת מודל עכברי של אוסטיאוארתריטיס בברך באמצעות הליך הולת' מותאם

146 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70379

⸱

15 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הכירורגיים המעודכנים של מודל הולת' המותאם, ומספק שיטה סטנדרטית וניתנת לשחזור לגרימת אוסטאוארתריטיס ניסיוני.

תקציר

אוסטיאוארתריטיס בברך (KOA) היא מחלת מפרקים ניוונית כרונית המאופיינת בניוון סחוס מפרקי, עיצוב מחדש של עצם תת-כונדרלית, היווצרות אוסטאופיטים וסינוביטיס, שהוא הסוג הנפוץ ביותר של אוסטאוארתריטיס.

פרוטוקול זה מציג שיטה כירורגית ליצירת מודל עכברי של אוסטיאוארתריטיס בברך באמצעות הליך הולת' מותאם. בהשוואה למודלים כירורגיים המושרים בהזרקה או קונבנציונליים כגון חוסר יציבות במניסקוס המדיאלי (DMM) וחתך הרצועה הצולבת הקדמית (ACLT), מודל הולת' המותאם גורם להתחלת מחלה מוקדמת יותר ודלקת מפרקים חמורה יותר. על ידי חתך הרצועה המדיאלית הצדדית, המניסקוס המדיאלי והרצועה הצולבת הקדמית, שיטה זו מפריעה ליישור המכני של מפרק הברך, ובכך מקדמת את התקדמות ה-OA. מודל זה מתאים במיוחד ללימוד פתולוגיה חריפה של דלקת מפרקים אוטוניים ולהערכת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. כדי להעריך את חומרת דלקת המפרקים, השתמשנו באולטרסאונד של בעלי חיים קטנים בשילוב עם שחזור תלת-ממדי (תלת-ממדי) של חלל המפרק כדי לכמת את נפחו ולהעריך את הצטברות הנוזל הסינוביאלי. בנוסף, בוצע צביעת safranin-O/ירוק מהיר של חתכים היסטולוגיים עבור דירוג האגודה הבינלאומית למחקר אוסטיאוארתריטיס (OARSI) להערכת הרס סחוס.

מבוא

אוסטיאוארתריטיס בברך (OA) היא מחלת מפרקים כרונית וניוונית נפוצה, המתאפיינת קלינית בכאב, נוקשות, טווח תנועה מוגבל וחולשת שרירים סביב הברך. השכיחות שלו גבוהה יותר בקרב נשים מאשר אצל גברים. אם לא נשלטת כראוי כראוי, OA עלולה להוביל לאובדן הדרגתי של היכולת הפיזית, הפרעות שינה, עייפות כרונית ולבסוף לנכות. ככל שאוכלוסיות העולם מזדקנות, שכיחות דלקת מפרקים מפרקים בערכים ממשיכה לעלות, מה שמציב אתגר משמעותי למערכות הבריאות והכלכלותברחבי העולם.

פתופיזיולוגית, אובדן הסחוס מייצג את המאפיין המרכזי של OA, מלווה בפגיעה מבנית ותפקודית בכל הרקמות המפרק וסביב המפרקים. כדי להבהיר את מנגנוני המחלה ולהעריך התערבויות טיפוליות, פותחו מגוון מודלים בעלי חיים שמסכמים היבטים מרכזיים של OA אנושי. מבין אלה, מודלים מונעים בניתוח משמשים לעיתים קרובות. כגון חוסר יציבות של המניסקוס המדיאלי (DMM)3 וכריתת הרצועה הצולבת הקדמית (ACLT)4, משבשים את מבנה המפרקים התקין, מה שמוביל לניוון הסחוס ולשינויים דמויי OA. לחילופין, מודלים כימיים מסתמכים על הזרקה תוך-מפרקית של סוכנים שמפריעים את המטריצה החוץ-תאית (למשל, קולגנאז או מונוסודיום יודואצטט), מה שמוביל למוות מהיר של כונדרוציטים ולשחקת סחוס 5,6. בעוד שמודלים של הזרקה בדרך כלל משיגים פתולוגיה סופית תוך שבועות, מודלים כירורגיים דורשים בדרך כלל זמן ארוך יותר.

מבין הטכניקות הכירורגיות הזמינות, בחרנו ושיפרנו את מודל הולת' בשל הופעת OA7 המואצת שלו. על ידי שילוב חתך של הרצועות הצולבות הקדמיות והרוציאטיות האחוריות עם כריתת רצועות צדדיות מדיאליות וכריתת מניסקטומיה מדיאלית מלאה, מודל זה גורם באופן אמין לנזק חמור ומתקדם לסחוס ולשינויים בעצם תת-כונדרלית. מסגרת הזמן הקצרה לכשל מבני במפרקים הופכת את מודל הולת' המותאם למתאים במיוחד למחקרי OA חריפה או תת-חריפה, ואנו מציעים שהפרוטוקול האופטימלי שלנו מציע פלטפורמה מעשית וניתנת לשחזור לחקירות פרה-קליניות עתידיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית. עכברים זכרים C57BL/6 בגילאי 6-8 שבועות ושוקלים כ-20 גרם נרכשו מספקים מסחריים (ראו טבלת חומרים) (מספר אישור אתיקה: PZSHUTCM2312210005).

1. טיפול טרום-ניתוחי

  1. אפשר לעכברים להסתגל לפחות שבוע לפני הניתוח.
  2. חטא את כל כלי הניתוח לפני הניתוח וחטא את סביבת הניתוח.
  3. הפעל את מכונת ההרדמה בגז, ומניח את העכבר בתא השראה למשך 5 דקות עם 2-3% איזופלורן כדי להתחיל הרדמה כללית.
    הערה: ודאו שקצב זרימת החמצן נשמר בין 0.5 ניולטון לדקה ל-1 ניולטון לדקה.
  4. לאחר ההרדמה, העבר את העכבר לפלטפורמת הניתוח ושמור על ההרדמה באמצעות 1-1.5% איזופלוראן באמצעות מסכת הרדמה עד לסיום הניתוח (איזופלורן 1-1.5%).
  5. מקם את העכבר בשכיבה כשהמפרקים פונים כלפי מעלה, כדי להבטיח יציבות וגישה נכונה לאתר הניתוח.
  6. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת היעדר רפלקסים, ואז מרח קרם הסרת שיער כדי להסיר לחלוטין את השיער סביב מפרק הברך.
  7. הסירו בזהירות את הקרם השארי באמצעות גזה או מטליות כותנה, ואז חיטו תחילה את העור החשוף עם 75% אתנול, ולאחר מכן טינקטורת יוד כדי להבטיח תנאים אספטיים.

2. הליך כירורגי (איור 1)

  1. הארכי את הגפה האחורית של העכבר והחלו אחיזה כדי להדק את העור. בצע חתך אורכי של 0.5-1 ס"מ לאורך הצד המדיאלי של מפרק הברך הימנית באמצעות להב ניתוחי סטרילי.
    הערה: כל ההליכים הכירורגיים המתוארים להלן בוצעו תחת מיקרוסקופ כירורגי.
  2. למשוך את העור ולבצע ניתוח קהה של הפאשיה הבסיסית כדי לחשוף במלואו את קפסולת המפרק, ולדמיין את הרצועה הפיקה.
  3. יש לבדוק ולחתוך את הפאשיה שמעל הרצועה הצדדית המדיאלית (MCL), באמצעות מחט הזרקה דקה.
  4. חתך את ה-MCL באמצעות מיקרו-מספריים בהגדלה.
  5. הזז את הרצועה הפיקה באמצעות מחט כדי לחשוף את המרחב התוך-מפרקי ולזהות את המניסקוס המדיאלי.
  6. חתכו את הרצועה המניסקוטיביאלית המדיאלית (MMTL) באמצעות מיקרו-מספריים לאחר החיתוך, וחקרו בעדינות את הרקמה עם מחט כדי לאשר ניתוק מלא וניידות של המניסקוס.
  7. זהה וחתך את הרצועה הצולבת הקדמית (ACL), תוך שמירה על מניעת נזק לרצועה הצולבת האחורית (PCL) או למניסקוס הלטרלי. בדרך כלל זה יוביל לסימן מגירה קדמית חיובי לאחר הניתוח, מה שמאשר חוסר יציבות במפרקים.
    הערה: מבחן מגירה: לפני סגירת הפצע, הירך יוצבה ביד אחת בעוד שהקרסול הוחזק ביד השנייה, תוך שמירה על השוקה והירך בניצב. היסט יחסי של הקדמה-אחורית בין הטיביה לעצם הירך הוחל ידנית; תנועה תרגומית נראית הצביעה על סימן מגירה חיובי, המאשר הפרעה ברצועה הצולבת.
  8. כדי לגרום לאוסטיאוארתריטיס חמורה יותר, יש לבצע חיתוך סימולטני של הרצועה הצולבת הקדמית (ACL) ושל הרצועה הצולבת האחורית (PCL) בשילוב עם כריתת מניסקטומיה מדיאלית (MMT) (כמו במודל הולת' הקלאסי).
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי וניתן לבצע אותו לפי הצורך; אם נבחר, זהו גישת המידול של מודל הולת' הקלאסי.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. סגור את החתך עם תפרי ניילון 4-0 וחטא את אתר הניתוח בטינקטורת יוד.
  2. הניחו את העכבר על כרית חימום מבוקרת טמפרטורה עד שיחזור להכרה ויראה נשימה ופעילות מוטורית תקינה. לאחר שהחלים לחלוטין וללא סימנים של מצוקה, החזירו לכלוב הבית.
  3. יש לעקוב אחרי שלמות התפר ברציפות במשך 3-5 ימים לאחר הניתוח. אם נצפה שבר בתפר, יש להרדים את העכבר שוב ולבצע תפירה מחודשת
  4. ניתן אנטיביוטיקה תוך-שרירית עד 3 ימים לאחר הניתוח כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח.
    הערה: מתן אנטיביוטיקה משמש למניעת זיהום לאחר ניתוח. הקלה לאחר הניתוח נקבעת על ידי מטרות ניסויים; במחקרי אוסטאוארתריטיס, משככי כאבים בדרך כלל נמנעים במהלך השלב האקוטי כדי למנוע הערכת יעילות טיפולית מבלבלת.
  5. עקבו מדי יום אחר אתר הניתוח לסימנים לנפיחות, הפרשה או דלקת מקומית.
  6. הורד את העכבר בנקודת הסיום של המחקר, בהתאם לפרוטוקולים מאושרים, ונתח את מפרק הברך לניתוח היסטולוגי או דימות.
    הערה: בשלב זה אימצנו את הפרוטוקול של המתת חסד לבעלי החיים הניסיוניים בהרדמה במנת יתר. הדבר הושג באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של תמיסת פנטוברביטל נתרן במינון של >100 מ"ג/ק"ג בעכברים.

4. הערכת פיתוח OA

  1. לפני המתת חסד יש להעריך נפיחות במפרק ולבצע אולטרסונוגרפיה להערכת שינויים מבניים במפרק הברך. הערך את ביצועי המוטוריקה בעכבר על ידי ביצוע בדיקת הרוטרוד.
    הערה: הרדמה איזופלורנית נדרשת לבדיקת אולטרסאונד בעכברים.
  2. לאחר המתת חסד, יש לנתח את מפרק הברך ולהסיר בזהירות את השריר והפאשיה שמסביב תוך שמירה על השוקה, הפיבולה והירך.
    תקן את המפרקים ודקלציפיק אותם בתמיסת 10% אתילנדיאמינטטטראצטית (EDTA) למשך לפחות 30 יום, תוך החלפת התמיסה פעמיים בשבוע כדי להבטיח דה-קלציפיקציה מלאה.
  3. הטמיעו את מפרקי הברך המפוצרים בפרפין והכינו חתכים סגיטליים בעובי של 4 מיקרומטר8.
  4. התחל לאסוף חתכים ברגע שהמניסקוס נראה בבירור. צבעו את החתכים ב-safranin O וירוק מהיר כדי להמחיש את מורפולוגיית הסחוס והעצם התת-כונדרלית. הערכה של פירוק סחוס באמצעות מערכת הניקוד OARSI9 .
  5. הליך צביעת Safranin O-Fast Green (ערכת מסחרית בשימוש, ראו טבלת חומרים)
    1. דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש
      1. לפרק חלקים בקסילן למשך 3 דקות, לחזור על זה 3 פעמים.
      2. הידרציה מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת (100%, 90%, 80%) כדי להסיר שאריות קסילן, 2 דקות כל אחת.
        הערה: יש להשתמש בסדרת אתנול בסדר יורד של ריכוז.
      3. שטוף במים מזוקקים דקה אחת ומסנן לזמן קצר.
    2. צביעת המטוקסילין הברזל של וייגרט
      1. מרחים את תמיסת העבודה של וייגרט על חלקים, צבעו במשך 5 דקות.
      2. שטוף במים מזוקקים דקה אחת ומסנן לזמן קצר.
    3. התמיינות חומצה
      1. מרחים את תמיסת המבדילה החומצית על חתכים למשך 15 שניות.
      2. שטפו במים במשך 10 דקות ומסננים מים עודפים.
        הערה: זמן ההבחנה הוא קריטי – התמיינות ממושכת מונעת צביעה ירוקה מהירה, בעוד שהבחנה לא מספקת גורמת לצביעה ירוקה עמוקה ומהירה עם קליטה לקויה של ספרנין
    4. צביעה ירוקה מהירה
      1. מרח תמיסה ירוקה מהירה על החלקים למשך 5 דקות, רוקן לזמן קצר.
      2. מרח תמיסה חומצית חלשה להסרת כתם ירוק מהיר שנותר למשך 15 שניות, ורוקן לזמן קצר.
    5. כתמי סאפרנין
      1. מרחי תמיסת O ספרנין על החלקים למשך 4.5 דקות.
      2. העבר במהירות חתכים ל-90% אתנול כדי להסיר עודפי ספרן O, 2-3 שניות.
        הערה: שלב זה עשוי להיות מורחב בהתאם לעוצמת צביעת הספרנין.
    6. התייבשות ופינוי
      1. ייבשו חלקים באתנול 100% למשך דקה.
      2. לנקות חתכים בקסילן להתייבשות מלאה, 2 דקות, לחזור על זה 3 פעמים.
        הערה: אין לערבב את הקסילן בשלב זה עם זה שבסעיף 4.5.1; זיהום צולב עלול לפגוע באיכות החתך.
    7. התקנה עם בלסם נייטרלי
      1. הניחו חלקים במכסה אדים כדי לאפשר לעודפי הקסילן להתאדוי.
      2. הסר חתכים, מרח כמות מתאימה של בלסם ניטרלי על הדגימה, וכסה בזהירות עם כיסוי כיסוי.
      3. בדקו חלקים תחת מיקרוסקופ קל לאיתור בועות אוויר והסירו בזהירות כל בועות אוויר.
      4. אחסן חלקים בקופסת סלייד והניח בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להבטיח ייבוש מלא של הבלסם הנייטרלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סריקות אורך של מפרק הברך בוצעו באמצעות מערכת מיקרו-אולטרסאונד8 עם שלב סריקה של 4 מ"מ ורזולוציה צירית של 0.04 מ"מ. ביום השביעי לאחר הניתוח, השחזור התלת-ממדי חשף עלייה ניכרת בנפח חלל המפרקים בקבוצת הדגם בהשוואה לקבוצת השמה (איור 2A,B). בדיקת עייפות רוטארוד10,11 אישרה ממצא זה, והראו ירידה משמעותית בסיבולת הריצה בקבוצת המודל באותו זמן (איור 2C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהשוואה לשיטות מודל ניתוח אחרות, כמו חוסר יציבות של המניסקוס המדיאלי (DMM) וכריתת הרצועה הצולבת הקדמית (ACLT), מודל הולת' המותאם גורם לאוסטיאוארתריטיס באמצעות פגיעה משולבת ברצועות ומניסקוס. ההפרעה המבנית הספציפית קובעת שינויים בביומכניקת המפרקים במישורים שונים. ACLT4 פוגע ביציבות הסיבובית (סיבוב פנימי וחיצוני) ומפחית את היציבות הקדמית האחורית, מה שמוביל לסימני מגירה חיוביים. DMM3 משבש את הרצועה המניסקוטיבית המדיאלית (MMTL), מערער את יציבות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי תוכנית הפעולה לחדשנות במדע וטכנולוגיה בשנגחאי (23YF1447900 ל-CJM), תוכנית צ'נגואנג של קרן פיתוח החינוך של שנגחאי וועדת החינוך העירונית של שנחאי (23CGA53 ל-CJM), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U24A6013 עד XH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק הזרקה של 1 מ"ל//מפרט טכני: 30 G וזמן; 0.13 מ"מ
מערכת הדמיה תלת-ממדית של אולטרסאונד Vevo 3100אופטיקהVevo 2100מערכת דימות אולטרסאונד בתדר גבוה המשולבת עם תוכנת Vevo LAB לניתוח נתונים.
תפר ניילון 4-0//
75% אתנולשנחאי טיטאן סיינטיפיק בע"מ.G73537O
עכברים זכרים C57BL/6J (גיל 6-8 שבועות)מעבדת חיות שנגחאי ג'יסג'י בע"מ./
קרם הסרת שיערVeetהחלקה: C021123001
טינקטורת יוד//
איזופלוראןRWD R650-IE
מלקחיים מיקרו-מלקחייםRWD F12013-10
מספריים מיקרוRWD S11035-08
ערכות צבע Safranin O ו-Fast Green Paint שעברו שינויסולרביולוגיהG1371
מחזיק מחטRWD F21001-12
להבי ניתוח (10#)RWD S31010-01
מיקרוסקופ כירורגיאולימפוסSZ61

מקורות

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Safranin O
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים