דגימות רקמת אנדארטרקטומיה כלילית עובדו לבידוד גרעינים בודדים באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה אופטימלי. שלמות הגרעינים המבודדים אושרה באמצעות שלוש גישות משלימות: צביעת טריפאן כחולה להערכת שלמות הממברנה, מיקרוסקופיה קונפוקלית מבוססת DAPI לאישור מורפולוגיה גרעינית, וציטומטריית זרימה לכמת תפוקת וטוהר גרעיניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד גרעין יחיד מרקמת אנדרטרקטומיה כלילית של חולי מעקף עורק כלילי
במאמר זה
סיכום
תקציר
טרשת עורקים היא מצב דלקתי כרוני ומתקדם, המאופיין בהצטברות רובד בדפנות העורקים. במהלך התקדמות היווצרות הפלאק, נגעים מסוימים הופכים לבלתי יציבים, הנקראים פלאקים בסיכון גבוה, ויש להם פוטנציאל לגרום לאוטם שריר הלב (MI). רובד טרשת עורקים מורכב מתאי שריר חלק, תאי אנדותל, תאי חיסון, תאי שומן ותאים נמקיים, שכל אחד מהם עלול לגרום לקרע פלאק. חשוב לחקור הטרוגניות תאית בתוך פלאקים אטרוסקלרוטיים כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שמאחורי אי-יציבות הפלאק. אנו מציגים פרוטוקול שניתן לשחזר בקלות לבידוד ואימות גרעינים מרקמת אנדארטרקטומיה כלילית אנושית, שהושגה ממטופלים שעברו ניתוח מעקף עורק כלילי (CABG). כל הרקמות נשמרות על קרח רטוב במדיום מכון רוזוול פארק לזכר (RPMI) כדי לשמור על שלמות התאים לפני הקציר. דגימות הרקמה טחונים דק ואז מופרעות בעדינות באמצעות עלי מיקרו בבופר לליזיס כדי לעבור תאים ולשחרר גרעינים. הגרעינים המבודדים מוערכים לאחר מכן לשלמות ולתפוקה באמצעות מבחן ההחרגה הכחול של טרייפן במיקרוסקופ הפוך מורכב. צביעת DAPI מאפשרת הדמיית גרעינים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וציטומטריית זרימה מספקת כימות מבוסס פלואורסצנציה להערכת תפוקת בידוד גרעיני ולאימות האוכלוסייה הגרעינית. בניגוד לשיטות הבידוד המסורתיות באמצעות דיסוציאציה חד-תאית, בידוד גרעיני מפחית לחץ תאי ושומר על הסביבה הטרנסקריפטומית הטבעית, ובכך מונע שינויים בביטוי הגנים. ההכנה הגרעינית האיכותית המתקבלת בשיטה זו תואמת ליישומים במורד הזרם כגון ריצוף RNA בגרעין יחיד (snRNA-seq).
מבוא
מחלת לב וכלי דם אטרוסקלרוטית (ASCVD) היא הגורם המוביל בעולם למוות ולנכות, ולמרות התקדמות טיפולית משמעותית, נטלה נותר ללאפחות. טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית בדופן העורק, המונעת על ידי אינטראקציות מורכבות ודינמיות בין אוכלוסיות תאים מגוונות שמתכננות יחד את ההתקדמות השקטה ממחלה תת-קלינית מוקדמת לאירועים קרדיווסקולריים (CV) שמשנים חיים2.
בעורקים בינוניים וגדולים, הצטברות משקעי כולסטרול בתוך המאקרופאגים היא סימן היכר של טרשת עורקים3. רובד הטרשת מורכב מחומצות שומן, כולסטרול, תאים דלקתיים, סידן, פיברין, תאי שריר חלק, תאי אנדותל ושאריות תא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר הנוכחי בוצע באישור ובהתאם להנחיות ועדת האתיקה האנושית של מכון U. N. Mehta לקרדיולוגיה ומרכז מחקר (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) ואוניברסיטת הביוטכנולוגיה של גוג'ראט (GBU_IHEC/2023/006). התקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים לפני איסוף הדגימה. המטופלים שעברו ניתוח מעקף עורקים כליליים עם אנדארטרקטומיה כלילית נבחרו למחקר הנוכחי. לאחר ההסרה הכירורגית, רקמת האנדארטרקטומיה הונחה מיד במדיום RPMI ללא סרום, נשמרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והועברה למעבדה בתוך כ-12 שעות בקרוביאל. ראו את טבלת החומרים לפרטים על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול הבא.
1. בידוד גרעינים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רקמת אנדארטרקטומיה כלילית אנושית נאספה ממטופלים שעברו ניתוח CABG. הרקמה נשקלה ועובדה לבידוד גרעינים, וגרעינים מבודדים נוספים אושרו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1).
הערכת Trypan Blue של איכות בידוד הגרעינים
הרקמה שנשמרה במדיום RPMI נשקלה, והיא נמדדה 247.8 מ"ג. הרקמה טוחנה ואז הומוגנית בבופר ליזיס באמצעות מיקרופסטל לבידוד גרעיני (איור 2A-C). לאחר בידוד גרעיני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תהליך עבודה אופטימלי לבידוד גרעינים מרקמת אנדארטרקטומיה כלילית אנושי מתואר בפרוטוקול הנוכחי. פרוטוקול הבידוד הגרעיני המתואר כאן תוכנן במיוחד כדי להתגבר על המגבלות הקריטיות של השגת תאים בריאים ושלמים מרובדים טרשת עורקים כליליים מתקדמים. בניגוד לגישות scan-seq קונבנציונליות המתבססות על עיכול אנזימטי קשה ודיסוציאציה מכנית21,30, הפרוטוקול האופטימלי שלנו עושה שימוש בהומוגניזציה מכנית עדינה בבופר ליזיס שאינו יוני המכיל חומר ניקוי (Noni.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) ובשיתוף פעולה עם מכון U. N. Mehta לקרדיולוגיה ומרכז מחקר, אחמדאבאד. חושי ג'אני מודה לוועדת המענקים האוניברסיטאיים (UGC) ולמועצת המחקר המדעי והתעשייתי (CSIR), ממשלת הודו, על הענקת ההסמכה המשותפת של CSIR-UGC NET (מספר הפניה NTA: 241620143543).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 100 & mu; מסננת M | Miltenyi Biotech | 130-098-463 | |
| 30 & mu; מסננת M | Miltenyi Biotech | 130-098-458 | |
| אלבומין סרום בקר | HiMedia | TC546-25G | |
| צנטריפוגה | MPW | NA | https://mpw.pl/en/offer/mpw-352r |
| מיקרוסקופ מורכב | ניקון | NA | מיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2) |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | ניקון | NA | מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series) |
| כיסויי כיסוי | HiMedia | BG011C | |
| בקבוקון CRYOCHIL דגימת פיה רחבה | טארסונים | 883191 | |
| DAPI | סיגמא | D9542-5MG | |
| DPBS | גיבקו (תרמופישר) | 10010-023 | |
| צינור צנטריפוגה (15 מ"ל) | טארסונים | 546021 | |
| ציטומטר זרימה | BD ביוסיינסס | 663029 | BD FACSLyric (מכשיר 3L12C CEIVD) |
| המוציטומטר | אקסיביו | CCB 100 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל) | טארסונים | 500010C | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה (5 מ"ל) | טארסונים | 500050 | |
| MgCl2 | סיגמא | M1028-100ML | |
| עלי מיקרו | טארסונים | 160020 | |
| NaCl | סיגמא | S9888-500G | |
| NP-40 | HiMedia | MB143-100ML | |
| מים נטולי נוקלאז | גיבקו (תרמופישר) | W4502-1L | |
| מעכב RNase | סיגמא | 333540201 | |
| RPMI 1640 | גיבקו (תרמופישר) | 11875093 | |
| Slide | ריביירה | 72910135 | |
| טריס-HCl | סיגמא | T2194-100ML | |
| כחול טרייפן | סיגמא | 302643-25G |
מקורות
- Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
- de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. He....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
