הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד גרעין יחיד מרקמת אנדרטרקטומיה כלילית של חולי מעקף עורק כלילי

699 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70382

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

במאמר זה

סיכום

דגימות רקמת אנדארטרקטומיה כלילית עובדו לבידוד גרעינים בודדים באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה אופטימלי. שלמות הגרעינים המבודדים אושרה באמצעות שלוש גישות משלימות: צביעת טריפאן כחולה להערכת שלמות הממברנה, מיקרוסקופיה קונפוקלית מבוססת DAPI לאישור מורפולוגיה גרעינית, וציטומטריית זרימה לכמת תפוקת וטוהר גרעיניים.

תקציר

טרשת עורקים היא מצב דלקתי כרוני ומתקדם, המאופיין בהצטברות רובד בדפנות העורקים. במהלך התקדמות היווצרות הפלאק, נגעים מסוימים הופכים לבלתי יציבים, הנקראים פלאקים בסיכון גבוה, ויש להם פוטנציאל לגרום לאוטם שריר הלב (MI). רובד טרשת עורקים מורכב מתאי שריר חלק, תאי אנדותל, תאי חיסון, תאי שומן ותאים נמקיים, שכל אחד מהם עלול לגרום לקרע פלאק. חשוב לחקור הטרוגניות תאית בתוך פלאקים אטרוסקלרוטיים כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שמאחורי אי-יציבות הפלאק. אנו מציגים פרוטוקול שניתן לשחזר בקלות לבידוד ואימות גרעינים מרקמת אנדארטרקטומיה כלילית אנושית, שהושגה ממטופלים שעברו ניתוח מעקף עורק כלילי (CABG). כל הרקמות נשמרות על קרח רטוב במדיום מכון רוזוול פארק לזכר (RPMI) כדי לשמור על שלמות התאים לפני הקציר. דגימות הרקמה טחונים דק ואז מופרעות בעדינות באמצעות עלי מיקרו בבופר לליזיס כדי לעבור תאים ולשחרר גרעינים. הגרעינים המבודדים מוערכים לאחר מכן לשלמות ולתפוקה באמצעות מבחן ההחרגה הכחול של טרייפן במיקרוסקופ הפוך מורכב. צביעת DAPI מאפשרת הדמיית גרעינים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וציטומטריית זרימה מספקת כימות מבוסס פלואורסצנציה להערכת תפוקת בידוד גרעיני ולאימות האוכלוסייה הגרעינית. בניגוד לשיטות הבידוד המסורתיות באמצעות דיסוציאציה חד-תאית, בידוד גרעיני מפחית לחץ תאי ושומר על הסביבה הטרנסקריפטומית הטבעית, ובכך מונע שינויים בביטוי הגנים. ההכנה הגרעינית האיכותית המתקבלת בשיטה זו תואמת ליישומים במורד הזרם כגון ריצוף RNA בגרעין יחיד (snRNA-seq).

מבוא

מחלת לב וכלי דם אטרוסקלרוטית (ASCVD) היא הגורם המוביל בעולם למוות ולנכות, ולמרות התקדמות טיפולית משמעותית, נטלה נותר ללאפחות. טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית בדופן העורק, המונעת על ידי אינטראקציות מורכבות ודינמיות בין אוכלוסיות תאים מגוונות שמתכננות יחד את ההתקדמות השקטה ממחלה תת-קלינית מוקדמת לאירועים קרדיווסקולריים (CV) שמשנים חיים2.

בעורקים בינוניים וגדולים, הצטברות משקעי כולסטרול בתוך המאקרופאגים היא סימן היכר של טרשת עורקים3. רובד הטרשת מורכב מחומצות שומן, כולסטרול, תאים דלקתיים, סידן, פיברין, תאי שריר חלק, תאי אנדותל ושאריות תאיות בתוך תת-האנדותל. פלאקים אטרוסקלרוטיים מסווגים לשני סוגים: בסיכון נמוך ובסיכון גבוה. פלאקים בסיכון גבוה מזוהים לפי נטייתם לעורר אירוע קרדיווסקולרי נוסף, בדרך כלל באמצעות מנגנונים כמו סחף או קרע של פלאק.

מאפייני פלאקים בסיכון גבוה כוללים ליבות שומן גדולות, מספר תאים דלקתיים, פחות תאי שריר חלק, כיסוי סיבי דק, מיקרוקלציפציה, דימום תוך-פלאקי, כלי דם נאו, וליבה נקרוטית6. זיהוי פלאקים בסיכון גבוה מתבצע קלינית באמצעות שיטות דימות לא פולשניות ופולשניות, כלומר, טומוגרפיה כלילית ממוחשבת (CCTA) וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT), בהתאמה 7,8. למרות התקדמות רבה בדימות לב וכלי דם, עדיין קשה לחזות את קרע הפלאק הטרשת העורקים שגורם לאוטם שריר הלב (MI), והוא לא תמיד שימושיבהקשרים קליניים.

למרות עשרות שנים של מחקר, עדיין חסרים לנו סמנים ביוקולטיביים אמינים שיכולים לזהות במיוחד פנוטיפים של פלאקים בסיכון גבוה, מה שמשאיר פער קריטי בניהול הקליני של טרשת עורקים. דבר זה מדגיש את הצורך באסטרטגיות מולקולריות שיכולות לאפיין את הפלאקים הללו ברמה ביולוגית בסיסיתיותר 7,10. בהקשר זה, סמנים מבוססי RNA זכו לתשומת לב רבה, שכן הם יכולים ללכוד את הפעילות השעתוקית המורכבת המתרחשת בתוך מיקרו-סביבת הפלאק11. פיתוחים אחרונים בריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) הוכיחו את עצמם כעוצמתיים במיוחד, והציעו פתרון חסר תקדים לפרופיל תאים בודדים בתוך פלאקים אטרוסקלרוטיים ולחשוף אוכלוסיות תאים מובחנות, דפוסי ביטוי גנים ונתיבים מולקולריים שמאחורי פגיעות הפלאק12,13. למרות התפתחויות אלו, קיים מעט ידע על תהליכי הוויסות האישי, האינטראקציות והחשיבות התפקודית של סוגי התאים השונים המעורבים בהתפתחות טרשת עורקים14.

כאשר העומס הטרשת העורקים חמור ומפוזר, החזרת כלי דם כירורגית הופכת לאסטרטגיית הטיפול הסופית. אנדארטרקטומיה כלילית (CE) היא תוספת ניתוחית לניתוח השתלת מעקפים בעורק כלילי (CABG) שבה רובד טרשת עורקים מוסר באופן מכני מעורקים כליליים חולים במפוזרות, כדי לאפשר השתלת מעקפים ולהשיג ריקולריזציה מלאה של שריר הלב15,16. פלאקים אטרוסקלרוטיים ודגימות אנדארטרקטומיה מאתגרים במיוחד לעבודה משום שהם מכילים שפע של רקמות נקרוטיות, משקעים של שומן, פיברין והסתיידויות. כאשר רקמות אלו מפורקות לניתוח, הן מייצרות פסולת משמעותית שחוסמת מסננים ומערכות מיקרופלואידיות, מה שמקשה מאוד על בידוד תאים בודדים ברי קיימא17,18. למעשה, מחקר אחד על רובד התרדמה מצא שתאים חיים מהווים פחות מ-1% מכלל החלקיקים לאחר עיבוד רקמות; השאר היו פשוט שברי לוחית18.

להחמרת האתגר הזה, פלאקים אטרוסקלרוטיים קיימים במצב של לחץ מטבולי וחמצוני כרוני, שבו תאים העוברים אפופטוזיס, הזדקנות ותהליכים ניווניים אחרים הופכים את ממברנות התאים לשבריריים יותר ורגישים להפרעה, מה שמקשה מאוד על בידוד תאים בודדים ברי קיימא 18,19,20. העיכול המכני והאנזימטי הנדרש להכנת דגימות ל-scRNA-seq לעיתים פוגע בתאים שכבר היו פגועים, מה שמפחית עוד יותר את החיוניות ומוביל לקצב לכידת תאים נמוך. תהליך זה גם נוטה לאבד באופן סלקטיבי אוכלוסיות תאים שבירות או נדירות, מה שיוצר הטיה משמעותית הן לנתוני הטרנסקריפטומיה והן לסוגי התאים המוצגים בתוצאות הסופיות. בעיה זו מתבהרת אף יותר בפלאקים מסוידים או חולים מאוד, שם תנאי העיבוד הקשים הנדרשים לפירוק הרקמה גורמים לנזק נוסף לחיוניות התאים 18,21,22.

לעומת זאת, הגרעין נשאר שלם מבחינה מבנית גם בתנאים קשים אלו23. הסיבה העיקרית לכך היא מעטפת גרעינית, שכבה כפולה של שומנים מחוזקת על ידי למינים גרעיניים (Lamin A/C ו-Lamin B), המספקת קשיחות מכנית ועמידות ללחצים האוסמוטיים, האנזימטיים והפיזיים שמפריעים בקלות לממברנת הפלזמה24,25. הלמינה הגרעינית גם שומרת על מורפולוגיית הגרעין גם כאשר הציטופלזמה הסובבת נפגעת קשות26. דבר זה הופך את ריצוף ה-RNA בגרעין יחיד (snRNA-seq) לחלופה מעשית ואמינה יותר לריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) לפרופיל רקמות אטרוסקלרוטיות27. על ידי לכידת מידע שעתוק מגרעינים שלמים במקום תאים שלמים, snRNA-seq עוקף את המגבלות הנובעות מחיוניות תאים ירודה ותכולת פסולת גבוהה, ומאפשר פרופיל טרנסקריפטומי מדויק ומקיף יותר של מיקרוסביבת הפלאק18.

לכן, במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול בידוד גרעינים אופטימלי שפותח במיוחד לרקמת אנדארטרקטומיה כלילית, הכולל ליזיס מבוסס אבקה לא-יונית ומשך ליזיס מותאם אמפירית בהתאם למידת ההסתיידות ברקמות, כדי לספק גרעינים איכותיים עם שלמות מבנית ו-RNA משומרת המתאימים לניתוח snRNA-seq במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר הנוכחי בוצע באישור ובהתאם להנחיות ועדת האתיקה האנושית של מכון U. N. Mehta לקרדיולוגיה ומרכז מחקר (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) ואוניברסיטת הביוטכנולוגיה של גוג'ראט (GBU_IHEC/2023/006). התקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים לפני איסוף הדגימה. המטופלים שעברו ניתוח מעקף עורקים כליליים עם אנדארטרקטומיה כלילית נבחרו למחקר הנוכחי. לאחר ההסרה הכירורגית, רקמת האנדארטרקטומיה הונחה מיד במדיום RPMI ללא סרום, נשמרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והועברה למעבדה בתוך כ-12 שעות בקרוביאל. ראו את טבלת החומרים לפרטים על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול הבא.

1. בידוד גרעינים

הערה: בצע את כל השלבים על הקרח והשתמש בחומרים סטריליים. הכינו את כל הבופרים טריים.

  1. שטפו את הרקמה פעם או פעמיים עם מדיום RPMI ללא סרום כדי להסיר כתמי דם ושברים. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי סטרילית ותועדו את המשקל.
  2. באמצעות להב ניתוחי (מס' 10), חתוך את הרקמה לחתיכות קטנות בגודל ∼1 מ"מ 3 .
  3. הכינו בופר פירוק של 1 מ"ל על ידי שילוב של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 10 מ"מ NaCl, 3 מ"מ MgCl2 (באמצעות תמיסות מלאי של 1 מ' לכל רכיב), 0.1% (v/v) נוניידט P-40 במים ללא נוקלאז. מוסיפים את הרכיבים בסדר הבא: מים ללא נוקלאז תחילה, אחר כך Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ ו-NP-40 אחרונים, כדי למנוע קצף.
    הערה: יש להכין את מאגר הליזיס טרי ביום השימוש ולשמור אותו קרר על קרח בכל עת. אל תקפא.
  4. הוסיפו בופר ליזיס מקורר של 1 מ"ל לרקמה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 5 מ"ל.
  5. ליסס את הרקמה על קרח באמצעות עלי מיקרו על ידי הפעלת כוח עדין ועקבי וסיבוב המיקרו-עלי לסירוגין בכיוון השעון ונגד כיוון השעון. המשך את הליזיס כ-30 דקות, כדי לוודא שהדגימה תישאר קרה לאורך כל הדרך.
    הערה: ליז את הרקמה עד שהיא הופכת לעכורה. השתמש בקצה של 1000 מיקרוליטר כדי לערבב בעדינות על ידי פיפטינג.
  6. סננו את התמיסה באמצעות מסננת בגודל נקבובית של 100 מיקרון לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל להסרת פסולת וחתיכות רקמה.
    הערה: הסינון צריך להיראות פחות עכור עם פסולת נראית לעין שנשארת על המסננת.
  7. צנטריפוגה את הגרעינים בעוצמה של 500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.
    הערה: כדור גלוי נראה אמור להיווצר בתחתית הצינור.
  8. הסר את הסופרנטנט באמצעות קצה פיפטה רגיל מבלי להפריע לכדור.
  9. הכינו בופר שטיפת גרעינים ותלייה מחדש על ידי שילוב אלבומין סרום בקר (BSA) של 1% (באמצעות 10% תמיסת המלאי), מעכב RNase של 0.2 U/μL (בתמיסת מלאי של 20 U/μL) במי מלח בופר פוספט של 1X של Dulbecco (DPBS). הוסף את הרכיבים בסדר הבא: DPBS תחילה, אחר כך BSA, ולבסוף מעכב RNase.
    הערה: יש להכין את הבופר טרי ביום השימוש ולשמור עליו קר על קרח בכל עת. אל תקפא.
  10. החזיר את הכדור לשטוף גרעינים ובופר תלייה מחדש. קרר את הבופר על קרח לפני השימוש.
  11. הערכו את יעילות הליזה ואת הקיימות של התא על ידי צביעה ב-5 מיקרוליטר טרייפן כחול וספירה בהמוסיטומטר.
    הערה: אם תאים קיימים עדיין קיימים, יש צנטריפוגה בעוצמה של 500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ואז לחזור על החלקים 3-10.
  12. סיננו את התמיסה באמצעות מסננת בגודל נקבוביות של 30 מיקרון לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל להסרת פסולת וגושים.
  13. צנטריפוגה את הגרעינים בעוצמה של 500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.
  14. הסר את הסופרנטנט באמצעות קצה פיפטה רגיל, ואז החזיר את הכדור לתלות ב-1 מ"ל של שטיפת גרעינים ובופן תלייה מחדש.

2. אפיון גרעינים מבודדים

  1. צביעת כחול טרייפן להערכת שלמות הגרעינים.
    1. קחו 15 מיקרוליטר של תליית גרעין מבודדת בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    2. הוסיפו 5 מיקרול צבע כחול טרייפן (0.4% w/v) וערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג.
    3. דגרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי לאפשר צביעה נכונה.
    4. טעין 10 מיקרוליטר מהתערובת המוצבעת על ההמוציטומטר.
    5. התבונן תחת מיקרוסקופ הפוך מורכב כדי לבדוק את המורפולוגיה ולספור את מספר הגרעינים.
  2. ניתוח ציטומטריית זרימה של השעיית גרעין יחיד
    1. קח 1 מ"ל של מתלה גרעינים מבודד וצנטריפוגה את מתליית הגרעינים ב-500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור דלי מתנדנד.
    2. הסר את הסופרנטנט באמצעות קצה פיפטה רגיל והחזיר את הכדור ל-200 מיקרוליטר FACS בופר (1X PBS ו-1% BSA).
    3. חלק 200 מיקרוליטר גרעינים תלויים לשני אליקוטים: שמור על 100 מיקרוליטר כבקרה לא מוכתמת והשתמש ב-100 מיקרוליטר כדגימה מוצבעת.
    4. הוסיפו 1 מיקרוליטר 4', 6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) (1 מ"ג/מ"ל) לדגימה המוצבעת כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורת החדר בחושך במשך 5 דקות לפני ניתוח ציטומטרי זרימה.
    5. בציטומטר הזרימה ששימש למחקר זה, יש להשתמש בלייזר הסגול ב-405 ננומטר, ולזהות באמצעות 448/45 ננומטר. הריץ תחילה את דגימת הבקרה הלא מוכתמת וקבל מינימום של 10,000 אירועים מתוך כלל האוכלוסייה.
    6. הגדר את המתח ל-183 וולט לפיזור קדמי (FSC), 300 וולט לפיזור צד (SSC), ו-400 וולט ל-V450 (לייזר DAPI). קבע את הסף ל-10,000 עבור FSC.
      הערה: כל הגדרות המתח והגבר של הכלי קבועות בין דגימות לשמירה על עקביות.
    7. שרטט את שטח הפיזור הקדמי (FSC-A) לעומת גובה הפיזור הקדמי (FSC-H) כדי להבדיל בין סינגלטים לבין דאבלטים ואגרגטים. שרטט שער סביב אירועים שמציגים יחס ליניארי כדי לשמור רק על גרעיני סינגלט.
    8. יצר גרף דו-משתני של FSC-A מול שטח פיזור צד (SSC-A). יש להחיל שער רחב הכולל את כל אוכלוסיית הפיזור, שכן גרעינים מבודדים בדרך כלל מציגים פרופיל פיזור הטרוגני ללא תת-אוכלוסיות מובחנות.
    9. צור גרף צפיפות דו-ממדית (צבע מדומה) של SSC-A לעומת סגול בגודל 450 ננומטר (V450-A). השתמש בבקרה ללא כתם כדי להגדיר פלואורסצנציה ברקע ולהנחות מיקום מדויק של השער. זהה ושער את האוכלוסייה הייחודית של DAPI⁺ המתאימה לגרעינים שלמים.
      הערה: מכיוון שמשתמשים בפלואורוכמות בודדת (DAPI), אין צורך בפיצוי פלואורסנציה.
  3. הדמיית גרעינים מבודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. קחו 50 מיקרוליטר של השענת גרעינים והוסיפו 1 מיקרוליטר DAPI (1 מ"ג/מ"ל) לדגימה המוצבעת כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל, ערבבו בעדינות, ודוגרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך לפני הדמיה קונפוקלית.
    2. התקן 5 מיקרו ליטר של מתלים גרעיניים מוצבעים על מגלש זכוכית נקייה וכסו אותו בכיסוי כיסוי.
      הערה: הימנעו מקיבוע כדי לשמור על המורפולוגיה הגרעינית.
    3. הדמיינו את הגרעינים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. פתח את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי ותתבונן תחילה בשדה בהיר פי 10, ואז עבור לשדה בהיר פי 40.
    4. לצלם תמונות קונפוקליות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד בגלאי ספקטרלי ואובייקטים PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). עוררו DAPI באמצעות לייזר 405 ננומטר ואספו פליטה בין 429-474 ננומטר.
    5. פרמטרי ההדמיה היו כדלקמן:
      1. מצב גלאי: רב-ערוץ (GaAsP)
      2. סורק: גלבנו חד-כיווני
      3. מצב סריקה: להקה
      4. ממוצע קווים: 2X
      5. רזולוציה: 1024 × 1024 פיקסלים
      6. זמן השהייה: 2.0 מיקרושניות
      7. גודל חור סיכה: 47.7 מיקרון
      8. עוצמת לייזר: 0.1-9.3% (תלוי בעוצמת השדה)
      9. רווח גלאי: 37.8-45.9%
      10. זום: 1.0X
      11. כיול: 0.43-0.58 מיקרומטר/פיקסל
    6. רכוש את כל התמונות באמצעות מצלמת ה-AX עם מצב שיח צולב מינימלי בתצורות אופטיות זהות, ומערכת המיקוד המושלמת (PFS) צריכה להיות פעילה במהלך ההדמיה לשמירה על יציבות מישור z.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רקמת אנדארטרקטומיה כלילית אנושית נאספה ממטופלים שעברו ניתוח CABG. הרקמה נשקלה ועובדה לבידוד גרעינים, וגרעינים מבודדים נוספים אושרו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1).

הערכת Trypan Blue של איכות בידוד הגרעינים
הרקמה שנשמרה במדיום RPMI נשקלה, והיא נמדדה 247.8 מ"ג. הרקמה טוחנה ואז הומוגנית בבופר ליזיס באמצעות מיקרופסטל לבידוד גרעיני (איור 2A-C). לאחר בידוד גרעיני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תהליך עבודה אופטימלי לבידוד גרעינים מרקמת אנדארטרקטומיה כלילית אנושי מתואר בפרוטוקול הנוכחי. פרוטוקול הבידוד הגרעיני המתואר כאן תוכנן במיוחד כדי להתגבר על המגבלות הקריטיות של השגת תאים בריאים ושלמים מרובדים טרשת עורקים כליליים מתקדמים. בניגוד לגישות scan-seq קונבנציונליות המתבססות על עיכול אנזימטי קשה ודיסוציאציה מכנית21,30, הפרוטוקול האופטימלי שלנו עושה שימוש בהומוגניזציה מכנית עדינה בבופר ליזיס שאינו יוני המכיל חומר ניקוי (Noni...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) ובשיתוף פעולה עם מכון U. N. Mehta לקרדיולוגיה ומרכז מחקר, אחמדאבאד. חושי ג'אני מודה לוועדת המענקים האוניברסיטאיים (UGC) ולמועצת המחקר המדעי והתעשייתי (CSIR), ממשלת הודו, על הענקת ההסמכה המשותפת של CSIR-UGC NET (מספר הפניה NTA: 241620143543).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 & mu; מסננת MMiltenyi Biotech 130-098-463
30 & mu; מסננת MMiltenyi Biotech 130-098-458
אלבומין סרום בקרHiMediaTC546-25G
צנטריפוגהMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
מיקרוסקופ מורכבניקוןNA מיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
מיקרוסקופ קונפוקלי  ניקוןNAמיקרוסקופ קונפוקלי הפוך Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
כיסויי כיסויHiMediaBG011C
בקבוקון CRYOCHIL דגימת פיה רחבהטארסונים883191
DAPIסיגמאD9542-5MG
DPBSגיבקו (תרמופישר)10010-023
צינור צנטריפוגה (15 מ"ל)טארסונים546021
ציטומטר זרימה BD ביוסיינסס663029BD FACSLyric (מכשיר 3L12C CEIVD)
המוציטומטראקסיביוCCB 100
צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)טארסונים500010C
צינור מיקרוצנטריפוגה (5 מ"ל)טארסונים500050
MgCl2סיגמאM1028-100ML
עלי מיקרוטארסונים160020
NaClסיגמאS9888-500G
NP-40HiMediaMB143-100ML
מים נטולי נוקלאזגיבקו (תרמופישר)W4502-1L
מעכב RNaseסיגמא333540201
RPMI 1640גיבקו (תרמופישר)11875093
Slide ריביירה72910135
טריס-HClסיגמאT2194-100ML
כחול טרייפן סיגמא302643-25G

מקורות

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Trypan BlueDAPIRNA
בידוד גרעין יחיד מרקמת אנדרטרקטומיה כלילית של חולי מעקף עורק כלילי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.