מאמר שיטה

מיפוי מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים במודלים של עכברים של פיברוזיס כבד

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 בפברואר 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג צינור הדמיה מקיף להמחשה ומידום מורפולוגיית תאי כוכב כבדיים ברקמת כבד שלמה. גישה זו משלבת תיוג פלואורסצנטי של פיברובלסטים באמצעות גנטיקה של עכברים, הכנת רקמה מבוססת פרפוזיה בכבד במקום , ושיטת ניקוי רקמות iDISCO מותאמת להשגת שקיפות אופטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברובלסטים תושבי רקמה הם המניעים התאיים לפיברוזיס ברקמות. בתוך הכבד, תאי הכוכב הכבדיים (HSCs), הפריציטים התושבים עם המורפולוגיה הייחודית שלהם "דמוית כוכב", מופעלים למיופיברובלסטים פיבירוקניים במהלך הפציעה ויוצרים את הצלקת הכבדית. בעוד עשרות שנים של עבודה הבהירו מסלולי איתות עיקריים העומדים בבסיס הפעלת HSC, המשמעות התפקודית של המורפולוגיה הדנדריטית הייחודית שלהם נותרה בלתי מושגת בשל מגבלות טכניות בהדמיה ובניתוח. פרוטוקול זה מציג צינור הדמיה מקיף להמחשת ומידול מורפולוגיית HSC ברקמת כבד שלמה. גישה זו משלבת תיוג פלואורסצנטי של HSCs באמצעות גנטיקה של עכברים, הכנת רקמה מבוססת פרפוזיה בכבד במקום , ושיטת ניקוי רקמות iDISCO מותאמת להשגת שקיפות אופטית בדגימות רקמה שיכולות להיות בעובי של כמה סנטימטרים. דגימות מנוקות מצולמות באמצעות פלטפורמות מיקרוסקופיה קונפוקלית אופטימליות, ומאגרי נתונים של תמונות מעובדים באמצעות תהליך ניתוח מותאם אישית לשחזור תלת-ממדי של HSCs ברזולוציה של תא יחיד. ביחד, צינור זה מאפשר מיפוי שכפול של מורפולוגיית HSC בתוך מיקרו-סביבה מורכבת של הכבד, כולל התהליכים הדנדריטיים שלהם והקשרים המרחביים לתאים שכנים. מעבר לכבד, זרימת העבודה מותאמת לפיברובלסטים באיברים אחרים, כגון הריאה, הכליה, המעי והלב, שם תאי מזנכימיה תושבים מפגינים תפקידים פיברוגניים דומים במחלות. המסגרת המוצעת, אם כן, יוצרת בסיס מתודולוגי למחקרים השוואתיים בין איברים לבחינת קשרי מבנה-תפקוד של פיברובלסטים ופגיעות טיפולית במחלות פיברוטיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברוזיס, או הצלקות הפתולוגיות של רקמה, היא הנתיב הנפוץ האחרון כמעט לכל מחלות האיברים הכרוניות ותורמת לכ-40% מהתמותהבמדינות מתועשות. בכבד, הפיברוזיס נובעת מפגיעות כרוניות כגון הפטיטיס ויראלית, שימוש באלכוהול, או מחלת כבד סטאטוטית (MASLD) הקשורה לתפקוד מטבולי יותר ויותר, אשר כיום פוגעת ב-30-40% מהמבוגרים בארה"ב. פגיעות כרוניות לכבד והפיברוזיס המתקדם הנובע ממנה מעלים באופן דרסטי את הסיכון למחלות כבד בשלב סופי כגון שחמת כבד, כשל כבד וקרצינומה כבדית2. 3,4,5.

תאי כוכב כבדיים (HSCs) הם מרכזיים להומאוסטזיס ולפיברוגנזה של הכבד. בכבד בריא, HSCs קיימים במצב שקט של אוגרי ויטמין A ותורמים להומאוסטזיס של הפטוציטים, ובסך הכל לכל הכבד. דבר זה מודגם בבירור במחקרי דלדול HSC, שבהם הסרת כמעט כל HSCs בכבד בריא מפחיתה את מסת הכבד ומגבילה מאוד את התחדשות הכבד 7,8. עם הפציעה, HSCs מופעלים לתאים דמויי מיופיברובלסטים שמתרבים, נודדים לאזורים פגועים, ומייצרים מטריצה חוץ-תאית (ECM) מופרזת, ויוצרים צלקות פיברוטיות. HSCs מופעלים בכבד פיברוטי הם גם מקור לפיברובלסטים הקשורים לסרטן וממלאים תפקידים מקדמים גידול בקרצינומה כבדית 9,10,11,12. HSCs שקטים מחזיקים במורפולוגיה ייחודית דמוית נוירונים עם גופי תאים קטנים שממנו מתפשטות הקרנות לטווח ארוך. HSCs משתנים לצורת מיופיברובלסט שטוחה ודמוית יריעה, כאשר הם מופעלים בפיברוזיס13. בעוד שעשורים של מחקר הבהירו את מסלולי האיתות השולטים בייצור ECM על ידי HSCs, המשמעות התפקודית של המורפולוגיה הנוירונית הייחודית שלהם, האופן שבו היא מוסדרת, האם היא יכולה להקל על אינטראקציות בנישת HSC, ולתרום לפיברגניות ומחלות HSC נותרה חמקמקה14,15.

השיטות הנוכחיות להמחשת המורפולוגיה של HSCs מוגבלות לתמונות דו-ממדיות (2D) של תאים שנתרמו במבחנה או חתכי רקמה ב-vivo , ולעיתים נדירות מצליחות ללכוד את כל מורפולוגיית ה-HSC כאשר הקרנות משתרעות על פני מספר אורכי גוף תאים בכל הכיוונים. יתרה מזאת, הסמן הנפוץ ביותר ב-HSC, דסמין, אינו יכול ללכוד במלואו את המורפולוגיה הייחודית של ה-HSCs בצביעה אימונופלואורסצנטית, שכן דסמין הוא חלבון שלד תא שמסמן רק סיבים ביניים בתוךHSCs 16. אתגרים מתודולוגיים אלו הקשו עד כה על היכולת ללכוד במלואו את מורפולוגיית HSC ואת האינטראקציות התאיות ביניהם באופן תלת-ממדי (תלת-ממדי) בהקשר הטבעי שלהם ברזולוציה של תא יחיד. כתוצאה מכך, שאלות יסודיות בנוגע לאופן שבו מורפולוגיית HSC קשורה למצבם הפונקציונלי ולאינטראקציות עם סוגי תאים שכנים נותרו בלתי פתורות.

מאמר זה מציג צינור הדמיה וניתוח חדשני ומקיף להמחשה ומודל מורפולוגיית HSC ברקמת כבד שלמה. שיטה זו משלבת מספר חידושים מרכזיים: (1) תיוג פלואורסצנטי של HSCs באמצעות מודלים גנטיים של עכברים מדווחים, (2) פרפוזיה ומיקום כבד מותאמים במקום לשמירה על ארכיטקטורת רקמה ויחסים תאיים שלמים, (3) פרוטוקול ניקוי רקמות מבוסס iDISCO מותאם להשגת שקיפות אופטית17, (4) מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה ללכידת תמונות רקמות עמוקות, ו-(5) תהליך חישובי מותאם אישית לשחזור תמונה תלת-ממדי וכמותי ניתוח של HSCs בודדים. הפרוטוקול מטיל מגבלות מסוימות על גודל הרקמה והמחויבות לזמן שיש לקחת בחשבון. יחד, פרוטוקול זה מספק מסגרת איתנה וניתנת לשחזור ללכידת המבנה התלת-ממדי המורכב של HSCs ולמיפוי הקשרים המרחביים שלהם עם תאי כלי דם, חיסון ופרנכימיים סמוכים. האסטרטגיות והצינורות המוצגים כאן עבור הכבד ניתנים להתאמה בקלות לאיברים אחרים כמו 17,18,19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בעכברים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה איקהן במוסד הר סיני. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. יצירת עכברים עם HSCs המסומנים כ-tdTomato (TdT)

  1. הקים מגדלי Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (זן #00791420 של מעבדות ג'קסון וזן משאבי עכבר מוטנטים ומרכזי מחקר (MMRRC) #06959521-JAX, בהתאמה).
    הערה: צפו לחול אחרי 3 שבועות. השתמש בנקבות LratCre לרבייה, שכן זוהה ביטוי מסוים של Cre בקו הנבט הזכרי.
  2. לאסוף זנבות ושגר גנוטיפ F1 כדי לזהות Tg(Lrat:Cre); עכברי Tg(LSL-TdT) שמבטאים באופן סלקטיבי את הפלואורופור TdTomato בתאי כוכב כבדיים.

2. פרפוזיה וקיבוע כבד במקום

  1. הכנה לפני הניתוח
    1. הכינו תערובת קטמין/זילזין להרדמה בעכברים על ידי ערבוב של 2 מ"ל קטמין, 1 מ"ל קסילאזין ו-7 מ"ל מים.
      הערה: קטמין הוא חומר מבוקר ודורש רישוי ורגולציה מתאימים לשימוש במעבדה.
    2. הכינו את תמיסת הפרפוזיה של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) במי מלח מפוזרים של 1x פוספט (PBS).
    3. הגדר את המשאבה הפריסטלטית על ידי מתן זרימת 1x PBS דרך הצינור וקבע את קצב הזרימה על 2 מ"ל לדקה.
      הערה: ודא שאין בועת אוויר בצינור.
  2. שקלו את העכבר כדי לקבוע את כמות תערובת הקטמין/זילזין להזריקה.
  3. הזריק תערובת קטמין/קסילאזין תוך-פריטונית לעכבר.
    הערה: הזרקו 200 מיקרוליטר מהתערובת לכל 20 גרם משקל עכבר.
  4. הניחו את העכבר במיכל עם מכסה והמתינו כ-20 דקות עד שהעכבר יהיה מרדים לחלוטין.
    הערה: לחץ את אצבע העכבר כדי לבדוק אם אין רפלקס. ודא שהעכבר עדיין חי כאשר ההזרמת מתחילה.
  5. העבר את העכבר מהמיכל הזכוכיתי לפלטפורמת הניתוח במצב שכיבה.
    אזהרה: PFA הוא רעיל ובלתי יציב; לכן, יש לבצע את הליך הפרפוזיה בתוך מכסה כימי. לאסוף ולהיפטר מזרם ה-PFA בצורה נכונה בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית.
  6. צבוט את כפות הרגל של העכבר עם מלקחיים כדי לוודא שהעכבר לא חווה תנועות רפלקס/עוויתות.
  7. דקור 4 כפות ידיים עם מחטים כדי לפתוח את בטנו של העכבר.
  8. רסס את הבטן ב-70% אתנול כדי להרטיב את הפרווה.
  9. השתמשו במלקחיים כדי להרים את העור במרכז הבטן, ליישר עם הרגליים האחוריות, ולהתחיל לחתוך את העור (בשתי השכבות) כדי לחשוף את הבטן.
  10. השתמשו במקליות צמר גפן רטובות ב-PBS כדי להזיז מעיים ואיברים נוספים הצידה ולהרים את האונה השמאלית.
  11. חתכו בזהירות את הממברנה שמחוברת בין האונה השמאלית לאונה הזנה.
  12. השתמש בתפר לקשור בבסיס העליון של האונה השמאלית.
  13. חתכו את האונה השמאלית מתחת לקשר התפר והניחו את האונה השמאלית בצד לאיסוף ועיבוד דגימות רקמה, בהתאם לצרכים ניסיוניים (כגון הקפאה ישירה בחנקן נוזלי, הטמעה בתרכובת חיתוך אופטי (OCT), או קיבוע פורמלין).
  14. השתמשו במקליות כותנה רטובות ב-PBS כדי להזיז את הכבד ולחשוף את וריד הפורטל.
  15. הכניסו בזהירות את מחט הקטטר לתוך וריד הפורטל בערך באמצע אורך הווריד הפורטלי.
    הערה: כדי לסייע בהכנסת הקטטר, הרם את גוף העכבר על ידי הנחת מלקחי מתחת לגוף כדי להבטיח משטח שטוח יותר. יישר בזהירות את מחט הקטטר במקביל ככל האפשר לווריד הפורטלי לפני ההכנסה.
  16. הסר את מחט הקטטר.
    הערה: ודאו זרימת דם חזרה דרך הקטטר כדי להעיד על הכנסה מוצלחת.
  17. הפעל את משאבת הפרפוזיה בקצב זרימה של 2 מ"ל לדקה, חבר את הצינור לקטטר, ופרפיוז בכבד ב-20 מ"ל של 1x PBS.
    הערה: ודאו שהקטטר מלא לחלוטין בדם, והצינור מלא לחלוטין בבופר הפרפוזיה, לפני החיבור כדי למנוע כניסת בועות אוויר למערכת.
  18. מהדק את העורק הריאתי מעל הכבד עם המיסטט כדי למנוע מה-1x PBS לעבור דרך הלב.
  19. חתכו את הווריד הנבוב התחתון כדי לשחרר את הצטברות הלחץ.
  20. כוון את מהירות המשאבה ל-5 מ"ל לדקה.
    הערה: יש לתת לכ-15 דקות לסיום הפרפוזיה.
  21. עצור את המשאבה כדי לשנות את המיכל ל-4% PFA.
    הערה: ודא שלא להכניס בועות אוויר לצינור על ידי עצירת המשאבה כשעדיין יש נוזל במיכל.
  22. יש לפרף את הכבד עם 25 מ"ל של 4% PFA.
  23. לאחר סיום הפרפוזיה, יש להסיר את הכבד מהאיברים הסובבים על ידי חיתוך הרקמות המקשרות.
  24. הניחו את הכבד בצינור קונוסי של 50 מ"ל, מלא ב-25 מ"ל של 4% PFA.
  25. הנח את הצינור אופקית על פלטפורמת נדנדה למשך שעה בטמפרטורת החדר ב-1.5 סל"ד, כדי להבטיח תנועת תמיסה.
  26. שטוף את הכבד 3 פעמים ב-1x PBS על פלטפורמת נדנדה על ספסל למשך 30 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר ב-1.5 סל"ד.
  27. אחסן את הכבד ב-20 מ"ל 1x PBS עם 0.02% NaN3 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: שמרו את הכבד לטווח ארוך בשלב זה, לפחות עד שנה.

3. ניקוי רקמות מבוסס iDISCO+

הערה: התיאור המקורי של פרוטוקול iDISCO+ נגיש ב-17

יום 1: דגימת התייבשות

  1. חתכו את דגימות הכבד לחתיכות בגודל של כ-0.5-1 ס"מ מעוקב.
    הערה: חתכו דגימות שונות לצורות שונות לזיהוי קל יותר במהלך שלבי ההדמיה.
  2. הכינו 20% (נפח/נפח), 40%, 60% ו-80% דילול מתנול במים בבקבוקי זכוכית נפרדים.
  3. הניחו דגימות כבד בתוך בקבוקי זכוכית עם מעל בורג (למשל, 4-7 מ"ל).
    הערה: הנח עד 6 חתיכות דגימות כבד בבקבוקון זכוכית אחד בנפח 7 מ"ל.
  4. ייבוש הדגימה באמצעות דילול מתנול בסדרתH2O, 20% (נפח/נפח), 40%, 60% ו-80% למשך שעה כל אחד בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  5. שטפו את הדגימה עם עוד 100% מתנול על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  6. קרר את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה.
  7. הכינו 66% דילול DCM במתנול בבקבוק זכוכית.
    הערה: הכינו דילול חדש בכל פעם. השתמש בצילינדרים מזכוכית להכנת התמיסה, שכן DCM יכול להמיס פלסטיק, כמו פוליסטירן.
  8. דגמו דגימות בתמיסת DCM/מתנול של 66% במהלך הלילה על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד בטמפרטורת החדר, ללא צנטריפוגה.
    הערה: היזהרו מדגימות שצפות למעלה לאחר הוספת התמיסה.

יום 2: הלבנת דגימות

  1. שטפו את הדגימה פעמיים עם 100% מתנול על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה במשך שעה בכל פעם בטמפרטורת החדר.
  2. קרר את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה.
  3. להלבין את הדגימה ב-5% H2O2 מקורר במתנול (נפח אחד של 30% H2O2 עד 5 נפחי מתנול), על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
    הערה: הכינו פתרון חדש בכל פעם.

ימים 3-5: חדירות דגימה

  1. הידרציה מחדש עם מתנול/H2סדרת O: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  2. שטפו את הדגימה פעמיים ב-PTx.2 (טבלה 1) למשך שעה כל אחד בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  3. דגרו את הדגימות בתמיסת פרמיאביליזציה (טבלה 1) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים.

ימים 5-17: תיוג חיסוני

  1. חסמו את הדגימות בתמיסת חסימה (טבלה 1) למשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: הכינו תמיסת חסימה חדשה בכל פעם בגלל חוסר היציבות של סרום החמור. אחסן את תמיסת החסימה שנותרה בטמפרטורה של 4°C עד חודש.
  2. דגרו את הדגימות בנוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PTwH (טבלה 1) עם 5% DMSO ו-3% סרום חמור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על סיבוב גלגלים במהירות 5 סל"ד, ללא צנטריפוגה במשך 4 ימים.
    הערה: התחל עם דילול נוגדנים ראשוני של 1:500.
  3. שטפו את הדגימות ב-PTwH 4-5 פעמים במשך שעה כל אחת בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
    הערה: באופן אופציונלי, להשאיר את הדגימות לשטיפה ללילה.
  4. דגרו את הדגימות בנוגדנים משניים ויודיד פרופידיום מדולל ב-PTwH עם 3% סרום חמור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על סיבוב גלגלים במהירות 5 סל"ד, ללא צנטריפוגה במשך 4 ימים.
    הערה: התחל עם דילול נוגדנים משני של 1:500. השתמש בדילול פרופידיום יודיד 1:250 מתמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד.
  5. שטפו את הדגימות ב-PTwH 4-5 פעמים במשך שעה כל אחת בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  6. השאירו את שטיפות הדגימה ב-PTwH ללילה, בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.

יום 18: ניקוי

  1. ייבשו את הדגימה באמצעות דילול מתנול בסדרתH2O, 20% (נפח/נפח), 40%, 60%, 80% למשך שעה כל אחד בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  2. שטפו את הדגימה פעמיים עם 100% מתנול בסיבוב למשך שעה בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  3. יש לדוג את הדגימה בדילול DCM של 66% (נפח/נפח) במתנול למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  4. שטוף את הדגימה פעמיים ב-100% DCM למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על סיבוב גלגלים במהירות 8 סל"ד, ללא צנטריפוגה.
  5. דגור את הדגימה ב-DBE למשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה.
  6. אחסן את הדגימות לטווח ארוך ב-DBE עד שנה ללא השפעה על אות הצביעה.

4. הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית

  1. הניחו את הדגימה שננקתה בתבנית זכוכית בגודל 35 מ"מ עם תחתית זכוכית #1.5.
  2. מלאו את הקערת באתיל סינמט כדי לטבול את הדגימה לחלוטין.
  3. הנח את הצלחת על הקונפוקל וכיוון את המיקוד כדי לזהות את המישור הטוב ביותר שמספק את האות הבהיר ביותר.
  4. רכוש תמונת אריחים במישור הבהיר ביותר כדי ללכוד שטח גדול מהדגימה, באמצעות פורמט 1024 x 1024 ומהירות 600.
    הערה: השתמש במטרה נמוכה יותר (10x או 20x) לתמונת האריחים כדי לקצר את זמן התמונה ואת גודל הקובץ.
  5. בהתבסס על תמונת האריחים, בחר אזורים מעניינים כדי לאסוף סריקת z ברזולוציה גבוהה יותר.
  6. תפסו סריקת Z דרך הרקמה שנוקו, מכסה את כל עומק הרקמה ברזולוציה הטובה ביותר של המיקרוסקופ, באמצעות פורמט 1024 x 1024 ומהירות 600.
    הערה: השתמש במטרת 40x בטבילה בשמן כדי לקבל את הרזולוציה הטובה ביותר ל-HSC.
  7. שמור קבצי תמונה בפורמט LIF וצפה בקבצים באמצעות Fiji או ImarisViewer 11.0.0.

5. ניתוח תמונות לשחזור תלת-ממדי וניתוח כמותי של HSCs בודדים

  1. המרו קבצי תמונה לפורמט IMS באמצעות ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. השתמש במודל Surface ב-Imaris 10.2.0 כדי לזהות את האובייקט בתמונות.
  3. השתמשו באסם Create כדי לבצע ניתוח על אזור תלת-ממדי נבחר שמעניין אותו, ואז החלו אותו על כל התמונה.
    הערה: השתמש בזה כדי להאיץ את תהליך הניתוח.
  4. בחר את ערוץ המקור, עוצמה מוחלטת, והסר את הסימון של כפתור החלק כדי להגדיר את סף העוצמה לכל התמונה.
  5. שנו את הסף כדי ללכוד את כל האובייקטים בתמונה.
  6. השתמש במספר הווקסלים כדי לסנן אובייקטים של פסולת.
  7. סיימו את הקוסם, לחצו על כפתור הסטטיסטיקה כדי לקבל את כל המדידות הסטטיסטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרפוזיה והקיבוע המוצלחים של כבד העכבר מיוצגים בצבע אחיד בהיר בצבע בז'-צהוב של הכבד, המשקף הסרה יעילה של הדם וחדירת הקיבוע (איור 1A,B). פרפוזיה לא נכונה גורמת לאזורים אדומים כהים או חומים של קרישי דם, שמפחיתים את הבהירות האופטית ומובילים לאות רקע גבוה באזורים אלו (איור 1C).

במהלך ניקוי הרקמות, דגימות הרקמה שומרות על מראה בהיר בצבע בז' מההזרעה ועד לדגירה משנית של נוגדנים. דגימות הרקמה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר צינור הכנת דגימות שניתן לשחזור ולהתאים המוביל להדמיה תלת-ממדית וניתוח כמותי של מורפולוגיית HSC ברקמת כבד שלמה. שילוב של סימון תאים פלואורסצנטיים גנטיים, פרפוזיה בכבד במקום , ושיטת ניקוי iDISCO+ מותאמת מאפשר הדמיה של נפחים גדולים של רקמות ברזולוציה של תא יחיד תוך שמירה על הארכיטקטורה המרחבית של מיקרו-סביבת הכבד.

שלב קריטי להצלחת שיטה זו הוא פרפוזיה יעילה של כבד. פרפוזיה לא שלמה עלולה ללכוד דם וליפידים, מה שמוביל לניקוי לקוי ולעלייה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי 1R01 DK136016-01 ו-5P30CA196521 (מענק מרכז NCI). מיקרוסקופיה ו/או ניתוח תמונות בוצעו ב-CoRE מיקרוסקופיה וביו-אימות מתקדמת בבית הספר לרפואה איקהן במאונט סיני. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מכון הסרטן של טיש בהר סיני, P30 CA196521 - מענק תמיכה במרכז הסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד RFP, ארנב, ספוג מראשרוקלנד600-401-379
צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ עם 4 תאים עם מיקרווול 20 מ"מ, זכוכית כיסוי #1.5סלביסD35C4201.5N
הזרקת AnaSed (זריקת קזילזין)אקורן, בע"מ.NDC 593990110-2020 מ"ג/מ"ל
צינורות צנטריפוגה חרוטיים: 50ml פלקון352098
מטליות כותנהמדלייןMDS202000
נעילה מעוקלת   המוסטטיםפישר סיינטיפיק16-100-117
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Cy3-conjugated (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
מספריים עדינים לפעולה 4.75" חד/קההכלי ניתוח רובוז
728501
דיבנזיל אתר (DBE), 98%סיגמא אולדריץ'108014
דיכלורומתאן (DCM),  ≥ 99.8%סיגמא אולדריץ'270997
דימתיל סולפוקסיד (DMSO), > 99.9%סיגמא אולדריץ'D8418
נוגדן משני שנספח מאוד מוצלב IgG (H+L) נגד ארנב חמורתרמופישר סיינטיפיקA31573
סרום חמורEMD מיליפורS30
אתיל סינמט, 99%סיגמא אולדריץ'112372
מספריים מיקרו-דקים דקים במיוחד; להב 24 מ"מפישר סיינטיפיקNC9232515
חולדת נוגדנים מונוקלונלית F4/80תרמופישר סיינטיפיק14-4801-82
פיג'יNIH
מלקחייםפישר סיינטיפיקNC9214139
גליציןביו-ראד1610718
מלח נתרן הפאריןכימ-אימפקס29984
תנור היברידיזציה Hybaidטריאד סיינטיפיקמקסי 14
מי חמצן, 30%סיגמא אולדריץ'31642
תוכנת Imaris 10.2.0אוקספורד אינסטרומנטס
תוכנת ImarisFileConverter 10.2.0אוקספורד אינסטרומנטס
ImarisViewer 11.0.0אוקספורד אינסטרומנטס
קטטר IVאקסל אינטרנשיונל בע"מ.EXE 26751
קטמין, הזרקת הידרוכלורידדקרהB8U4100 מ"ג/מ"ל
תוכנת LAS X 4.4.0.24861לייקה
Leica Stellaris 8 מיקרוסקופ קונפוקלילייקה
מתנול, דרגת HPLCפישרA452-2
רוטטור רב-תכליתיתעשיות מדעיות, בע"מ.דגם 151
מחטים (27G x 1/2'')BD305109
פאראפורמדהילדה, אבקה, 95%סיגמא אולדריץ'158127
משאבה פריסטלטיתגילסוןמודל מיניפולס 3
צינור משאבה פריסטלטי, MasterFlexתרמו-סיינטיפיק96400-163.1 מ"מ ID x 7.6 מטר L/S צינור סיליקון מדויק עם מי חמצן, גודל L/S 16, סיבוב צינור 1/8 אינץ'
מלח זרחן (PBS)ציטיבהSH30256.01סטרילי, pH 7.0 - 7.2, ללא סידן, מגנזיום
פרופידיום יודיד, ≥ 94.0% (HPLC)סיגמא אולדריץ'P4170
להבי רייזוראמריקן ליין66-0362
פלטפורמת נדנדהVWRדגם 200
סודיום אזיד, ≥ 99.5%סיגמא אולדריץ'S2002
תפראתיקוןJ109T
מזרק (1 מ"ל)BD309628
TritonX-100סיגמאT9284
טווין-20תרמו-סיינטיפיקJ20605-AP
בקבוקונים, מעל הברג עם פקק מלא עם ציפוי אלומיניום, מורכב מראשסיגמא אולדריץ'27470-Uכרך 7 מ"ל, בקבוקון זכוכית ענבר, O.D. & times; גובה 17 מ"מ ופעמים; 60 מ"מ, הברגה ל-15-425

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).
  2. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  3. Amini-Salehi, E., et al. Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries. Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).
  4. Ekstedt, M., et al. Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up. Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).
  5. Hagström, H., et al. Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD. J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).
  6. Geng, Y., Schwabe, R. F. Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications. Hepatology. , (2025).
  7. Trinh, V. Q. -H., et al. Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation. Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).
  8. Sugimoto, A., et al. Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3. Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).
  9. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  10. Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).
  11. Marra, F. Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation. J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).
  12. Milani, S., et al. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis. Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).
  13. Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).
  14. Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology. Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).
  15. Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells. Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).
  16. Niki, T., et al. Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers. Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  18. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  19. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).
  20. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  21. Mederacke, I., et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun. 4, 2823(2013).
  22. Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).
  23. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  24. Shrirao, A. B., et al. Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research. Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).
  25. Croce, A. C., Bottiroli, G. Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling. Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).
  26. Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy. Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים