מאמר שיטה

נתיחה מוחית ומעיים באוכלוסיות דגי שטח ודגי מערות של Astyanax mexicanus

710 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70412

⸱

24 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפירוק וחילוץ רכיבים שלמים של מוח ומעיים של מורפוטיפים מותאמים למשטח ולמערות של Astyanax mexicanus. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש ביישומים במורד הזרם, כולל טרנסקריפטומיקה, מטבולומיקה וניתוח מיקרוביוטה במעי.

תקציר

דגי טלאוסט משמשים למענה על מגוון רחב של שאלות מחקר, החל מפיתוח ועד גנטיקה ומדעי המוח, ובשנים האחרונות להבנת המורכבות של ציר המעי-מוח, ואפילו בהקשר רחב יותר, ציר המעי-מוח-כבד. הטטרה המקסיקנית, Astyanax mexicanus, משמשת יותר ויותר במסגרות אבולוציה השוואתיות והתפתחותיות בשל זמינותם של מורפוטיפים מובחנים מבחינה מורפולוגית ופיזיולוגית, כולל דגים על פני הנהרות ודגי מערות עיוורים מותאמים למערות. הסתגלות לבתי גידול במערות קשורה לשינויים בתכונות מורפולוגיות, תכונות התנהגותיות ומגוון מיקרוביוטות במעי, שנמצאות גם בתנאי מעבדה. דבר זה פתח את האפשרות לשאול שאלות על האינטראקציות בין המיקרוביום, פעילות מטבולית, הסתגלות עצבית ותפוקות התנהגותיות מורכבות. כעת ניתן לטפל באינטראקציות אלו באמצעות מחקרי מיפוי מוח מלא עם ריצוף מוח נקי ומיקרוביוטה במעי, כדי לזהות מגוון חיידקים הקשור לפנוטיפים מותאמים למשטחים ולמערות. עם זאת, רוב המחקרים הללו ירוויחו מאיברים ורקמות שלמים שלמים, מפורקים ומשומרים בזהירות, המאפשרים עיבוד לאחר מכן ביישומים במורד הזרם. פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לפירוק מוח ומעי, שבה כל האיברים המוחיים והבטניים מוסרים ומבודדים הן עבור מורפוטיפים של דגי שטח והן עבור דגי מערה.

מבוא

מודלים של בעלי חיים, כולל דגים בעלי חוליות, הם כלים קריטיים למידול תופעות ביולוגיות ופתולוגיות מורכבות במערכות פשוטות ונגישות יחסית. לדוגמה, דג הזברה, דניו ריריו, הוא אחד המודלים הנפוצים ביותר לדגים טלאוסט, עם שפע שיטות המיושמות לחקר התפתחותו, גנטיקה, פיזיולוגיה והתנהגותו, עם השפעה משמעותית במדעי הביו-רפואה והנוירו-התנהגות 1,2,3,4,5,6,7,8 . יתרון עצום בשימוש בדגי זברה כיום הוא זמינותן של מספר שיטות לחקר היסטולוגיה ופתולוגיה של איברים ורקמות בקווי מוטנטים של אובדן תפקוד, שלגביהם קיימים פרוטוקולי דיסקציה שלב אחר שלב 3,9,10.

עם זאת, מספר מודלים נוספים של דגי טלאוסט נמצאים בעלייה, המתאימים לשאול סוגים אחרים של שאלות, כולל אלו בתחומי הביולוגיה האבולוציונית 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס ההזדקנות 2,22, טוקסיקולוגיה23,24, ואחרים25,26. דוגמה לכך היא דג הטטרה המקסיקני, Astyanax mexicanus, דג טלאוסט שמקורו בצפון-מזרח מקסיקו, עם אוכלוסיות אבות של דגי שטח החיים בנהרות ולמעלה מ-30 אוכלוסיות של דגי מערה עיוורים החיים במערות (איור 1)12.

דגי המערות אימצו מערך תכונות מורפולוגיות, כולל אובדן עיניים12,27, אובדן פיגמנטציה28, התרחבות מערכות החישה 17,29,30, והגברת אגירת השומן 12,31, שאפשרו להם לשרוד בבתי גידול עוינים של מערות. דגים אלו גם אימצו מערך תכונות התנהגותיות, כולל ירידה בשינה19,20, חרדה32, להקות33, ואגרסיביות13,18,19,20,29,34,35,36,37, בהשוואה לדגי השטח הקדומים שלהם. הסתגלות רוב התכונות הללו ככל הנראה נבעה משילוב של שונות גנטית ולחצים סביבתיים 35,36,28, הכוללים הבדלים בבית הגידול בין הנהרות למערות. מודל שימושי יותר ויותר לשאול שאלות על השפעת השונות הגנטית על התאמת תכונות מורפולוגיות והתנהגותיות 16,18,19,20,35,38,39 ובשנים האחרונות על מגוון המיקרוביוטות במעי 14,15, שאלות שעשויות לדרוש איסוף איברים כמו המוח, המעיים, הכבד ואחרים, יש צורך בפרוטוקול סטנדרטי לפירוק אנטומיה גסה שעשוי לשמש את הקהילה הרחבה. בעוד שכריתת מוח שלמה וניתוח איברים ב-A. mexicanus כבר בוצעו בעבר, חסר שיטה מקיפה ומקיפה שמאפשרת להבין כיצד לבצע ניתוחים מסוג זה בצורה חסכונית בזמן, דבר קריטי לפרויקטים רבים, כולל כאלה שדורשים איסוף דגימות למטבולומיקה40, מטגנומיקה41, או הדמיית איברים שלמים16,38. המטרה שלנו היא להסיר את מחסום פתרון הבעיות בגישה לאיברים במודל זה לעיבוד לאחר מכן, ולאפשר למשתמשים בקהילה להתמקד בצורה חלקה במחקר שלהם.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שלב אחר שלב לפירוק מוח ומערכת העיכול בדגים בוגרים על פני השטח ודגי מערות פאצ'ון ממין Astyanax mexicanus. שיטה זו ניתנת להתאמה למגוון פרוטוקולים בהמשך, כולל אלו הקשורים למיקרוביום המעי, מטבולומיקת רקמות ופינוי מוח להדמיה מוחית שלמה במיקרוסקופ יריעת אור. טכניקה זו גם ניתנת להתאמה ליישום סימולטני על אותו דגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מתבצע בהתאם לפרוטוקולים המאושרים על ידי IACUC 2024-0004 ו-A790125 במרכז למדעי המולקולות ובקמפוס המדעים הרפואיים של אוניברסיטת פוארטו ריקו.

1. הכנה טרום-ניתוח

  1. אם משתמשים בצלחת סילגארד פטרי (SP) לניתוח, ודאו שהם מוכנים מראש לפני ההליך, תוך התחשבות בכך שזה עשוי לקחת כמה ימים להתייצב.
  2. להכנת צלחת SP, השתמשו ב-Sylgard 184 וב-Elastomer 184 ביחס של 10:1. מערבבים 200 גרם של בסיס סילגארד 184 עם 20 גרם אלסטומר בכוס חד פעמית. שופכים לתוך צלחות פטרי לעומק של כשליש עד חצי עומק. טפח על הצלחת כדי להסיר בועות וכיסוי. ודא שהכלים מלאים ונשארים על משטח ישר. תן להתייבש לפחות לשבועאחד ו-42.
    הערה: אם אוספים דגימות לריצוף 16s rRNA או מטגנומיקה, הימנעו משימוש בצלחות SP. במקום זאת, השתמשו בלוחות פטרי חד-פעמיים ומעוטרים בטכניקת אספטיקה מתחת למכסה זרימה למינרי. אם עוקבים אחרי טכניקה אספטית, מומלץ לנקות את מכסה הזרימה הלמינרי עם 70% אתנול, עם חומר ניקוי חיידקים, ורצוי לחשוף את המכסה למנורת C אולטרה-סגולה לחיידקים למשך 15 דקות. יש לעשות זאת לפני הכנסת חומרים/כלים מחוטאים ואוטוקלוויים בתוך מכסה הזרימה הלמינרי.
  3. התקן מיקרוסקופ נתיחה עם מגבות נייר משני הצדדים. הקצה צד אחד לאחסון פסולת (למשל, רקמת איברים עודפת) והצד השני להנחת כלי חיתוך סטריליים. חתוך חתיכות קטנות של נייר מגבת כדי לנקות כלים בין הניתוחים.
  4. הכינו 1 PBS ושמרו אותו בתערובת קרח קרה וזמין למקרה שיהיה צורך לניקוי אזורים או דגימות לשיפור הראות. בהתאם לפרוטוקול, בחר לא להשתמש ב-1PBS.
    הערה: מומלץ לא להשתמש בו, למשל, בעת איסוף דגימות לריצוף מטגנומי43. אם משתמשים ב-1PBS בגישה מסוג זה, מומלץ לאסוף דגימת 1PBS לצורך ריצוף כדי לסרוק זיהום אפשרי.
  5. הניחו את ה-SP (או צלחת פטרי חד-פעמית ומעוקרת) מתחת למיקרוסקופ וודאו שכל הכלים זמינים (ערכת ניתוח, צינורות מיקרוצנטריפוגה לאיסוף רקמות על קרח וכו').
  6. הנח 1 PBS וצינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים בדלי קרח סמוך. יש לי טפטפת פלסטיק ביד ל-1 PBS.
  7. תקים תחנת המתת חסד לדגים קרוב. הכינו אמבט קרח על ידי הנחת תערובת קרח באקווריום עם רשת פלסטיק בפנים, ואז מלאו אותו במי מערכת דגים (מהמערכת הביתית או מהאקווריום הביתי).
    הערה: MS-222 עשוי לשמש גם כן, בהתאם לפרוטוקולים במורד הזרם (צרכי עיבוד פוסט-פרוטוקול לדוגמה).

2. ניתוח מוחי בדגים בוגרים על פני השטח ודגי מערות

  1. הורד דגים בתערובת קרח. ודא שאין תנועה, והדג שוקע לקרקעית, ללא תנועה אופרקולרית. הזמן תלוי בגודל. דגים גדולים יותר לוקחים יותר זמן להפסיק את התנועה האופרקולרית.
    הערה: דגים צעירים לוקחים כ-2-5 דקות להפסקת תנועה אופרקולרית (המתת חסות), בעוד שדגים בוגרים וגדולים עשויים לקחת כ-10-15 דקות. קיימים הבדלים מבוססי מורפוטיפ. חלק מאוכלוסיות דגי המערות עשויות לקחת יותר זמן מהדגים השטחיים להרדמה/המתת חסד מהדגים השטחיים. פרוטוקולי גידול וניסויים ממליצים על אימות של הליכי הרדמה והמתת חסד בין אוכלוסיות, שכן התגובות עשויות להשתנות בין מורפים לאוכלוסיות11.
  2. העבר דגים ל-SP (או צלחת פטרי חד-פעמית ומעוקרת בתוך מכסה המנוע) ועם טפטפת רחוץ עם 1x PBS קר (איור 1).
  3. נתק את הראש מהגוף על ידי חיתוך עם סכין כמדר כ-2 מ"מ מאחורי הזימים (איור 2). זה יגן על חלק מהמוח האמצעי ויאפשר מניפולציה של המוח לאחר הניתוח, מבלי לגרום נזק. הוציאו את הגופה לכיוון אזור הפסולת באמצעות מגבת נייר, ואז הניחו אותה בשקית ביוסכנה במיכל הפסולת לטיפול ביולוגי.
  4. עם מלקחיים דקים או המוסטט, אחיזה טובה בחלק האחורי של ראש הדג. באמצעות מיקרו-מספריים, חותכים את קצוות הפה לכיוון אחורי הראש והזימים (איור 3).
  5. חזור על זה בצד השני. הסר את הלסת הלסתית ואז נקה היטב את התחתית עם זוג מלקחיים דקים או דקים במיוחד.
    הערה: עקבו אחרי הקו הפנימי של הזימים.
  6. בשלב זה, המשיכו להחזיק חזק בראש הדג עם המוסטט או להצמיד אותו עם סיכת T ל-SP (אם משתמשים), בזהירות בקצה הפה.
  7. נתק את שתי העיניים באמצעות מלקחיים או מספריים עדינים במיוחד. הכנס את הקצה לקצה העין ואז מושך או חתך בעדינות את העין החוצה (איור 4).
    הערה: זה לא רלוונטי לדגי מערות (גרדת עור מאזור העין).
  8. שרטט קו סגיטלי בראש הראש שעובר בין העיניים מקדימה לאחור ומחלק את הראש לשמאל ולימין. לאחר מכן, השתמש במספריים המיקרו כדי לחתוך את הקו בצורה שטחית (איור 5).
  9. עם מלקחיים דקים, התחל בזהירות למשוך את שני צידי הראש, תוך זהירות רבה שלא לשבור את המוח שמתחת, המוטמע מתחת לרקמת החיבור. כאשר המוח נראה לעין, בעזרת קצה המלקחיים הדקים, נתק את המוח מהגולגולת (איור 6).
    1. הימנע מלרסק את המוח על ידי משיכה עם מלקחיים. במקום זאת, החזק אותו במוח האחורי או בחוט השדרה אם עדיין נשאר שריד כדי לשמור על שלמותו.
    2. אם המוח עדיין בצד אחד של הראש, השתמשו במלקחיים עדינים במיוחד כדי לנתק אותו בעדינות מגולגולת המיטה על ידי הכנסת הקצוות בעדינות מאחורי המוח והעלאה עדינה. הימנע ממשיכה כל הזמן, כי זה עלול לשבור אותה.
  10. לאחר שהמוח מוציא, נקה בעדינות עם מלקחיים דקים במיוחד, תוך הסרת שומן או רקמות סמוכות. שים בצינור מיקרוצנטריפוגה או אחסון מתאים לפרוטוקול המורד. בשלב זה, שמרו על כל המוח או אספו תת-אזורים במוח (למשל, טלנצפלון, טקטום אופטי, פקעות ריח) (איור 7).
  11. בידוד טלנצפלון: כדי להוציא את הטלנצפלון, לחץ בבסיס בין הטלנצפלון לטקטום הראייה עם מלקחיים עדינים במיוחד והפריד את הטלנצפלון משאר המוח. העבר לצינור האחסון המתאים.
  12. אם משתמשים במטאגנומיקה, איסוף דגימות בהקפאה מיידית בחנקן נוזלי ומאוחסן בטמפרטורה של -80°C. עשה זאת על ידי טבילה של צינור המיקרוצנטריפוגה בחנקן נוזלי למשך 5 שניות.

איור 1
איור 1: מורפוטיפים של Astyanax mexicanus . (א) דגי שטח. (ב) דגי מערות פאצ'ון. פס קנה מידה: 10 מ" מ אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 2
איור 2: ניתוק הראש. (א) דג פני השטח. (B) דגי מערות פאצ'ון אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: הסרת הלסת מראש דג מנותק. (א) דג פני השטח. (B) דגי מערות פאצ'ון אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 4
איור 4: הסרת העין מראש דג מנותק. בדגי מערות, ניתן לבצע גירוד של האזור כדי לדלל את הרקמה. (א) דגי שטח. (B) דגי מערות פאצ'ון אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 5
איור 5: קשת חותך את החלק העליון של ראש הדג. (א) דג פני השטח. (ב) דגי מערות פאצ'ון. פס קנה מידה: 5 מ" מ אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 6
איור 6: הפרדת החלקים הצדדיים של הראש וחשיפת המוח בתוך חלל הגולגולת. (א) דגים על פני השטח. (ב) דגי מערות פאצ'ון. (C,D) הסרת המוח מהגוגולת. פס קנה מידה: 5 מ"מ אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 7
איור 7: אנטומיית מוח אזורית של A. mexicanus . (א) דגי שטח. (ב) דגי מערות פאצ'ון. פס קנה מידה: 5 מ" מ אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

3. ניתוח מעיים בדגים בוגרים על פני השטח ודגי מערות

  1. עקבו אחרי השיטה להמתת חסד כפי שתוארה לעיל.
  2. מייבש את הדג עם מגבון ללא סיבים לפני שמניחים אותו על SP נקי ומכסה אותו ב-1 PBS קרים (או מים במערכת, תלוי ביישום בהמשך) עם הטפטפת כדי לשמור על לחות הרקמה.
  3. אבטח את הדג על ה-SP (אם אתה משתמש) עם פיני T.
    1. אם לא משתמשים ב-SP, המואסטט שמחזיק חזק קדימה מהפה בזמן ביצוע חתכים יספיק. הניחו את הסיכה קדמית בתוך ארובת העין (נכון גם לדגי מערות), כדי לוודא שהיא מגיעה ל-SP.
    2. סיכה אחורית דרך הזנב אל הלוח. ודא שהדג נשאר בשקט במהלך ההליך.
      הערה: אם מבצעים ניתוח מערכת העיכול על אותו דגימה כמו ניתוח מוח, ערפו במהירות את הראש עם סכין מנתח לפני שמתחילים את הכריתה והצמידו את הדג לפני השטח של הצלחת. עשה חתך אלכסוני קדמי מאחורי האופרקולום ששומר על החלק העליון של הראש ומתחמק מהמעי. רצוי לחלק את הראש והגוף ולתת לשני מנתחים מנוסים לעבוד על כל אחד ליעילות בזמן. הסיכה הקדמית יכולה להיות ממוקמת בחלק הקדמי העליון של הגוף לאחר כריתת הראש, בעוד שהסיכה האחורית נשארת באותו מיקום (איור 8).
  4. באמצעות מיקרו-מספריים, חתכו את העור והשריר שמתחת לאורך קו האמצע הגחוני מהסנפיר/פי הטבעת לכיוון האופרקולום (הכיסוי הקשה מעל הזימים) בקו חצי-עגול העוקב אחרי הקימור התחתון של הדג (איור 9).
  5. הסר את האופרקולום ואת סנפיר החזה עם מספריים מיקרו-מלקחיים ועדינים.
    הערה: שלב זה מסייע להסרת העור ליעילה יותר, אך הוא עלול להאט את הדיסקציה ולדלג עליו בהתאם לצרכים.
  6. חתכו את העור והשריר התחתון כלפי מעלה מהסנפיר האנאלי ואז חתכו קדמית לכיוון הזימים, תוך הארכת החתך הוונטרלי לפי הצורך (איור 10). זה בסופו של דבר יוצר חלון.
  7. פתח את החתך בעזרת מלקחיים עדינים כדי לחשוף את חלל הגוף. השתמשו במלקחיים עדינים כדי לאחוז בעור והרימו אותו בעדינות כדי להסיר (איור 11).
  8. חתכו את החיבורים הקדמיים והאחוריים של המעי והוציאו בזהירות את כל האיברים הפנימיים - הסרו את מערכת העיכול מהגוף והניחו אותה על אזור נקי של ה-SP (או צלחת פטרי חד-פעמית ומעוטאת) (איור 12 ואיור 13).
  9. ראשית, הפרדו את הכבד משאר איברי הבטן בעזרת המלקחיים העדינים ביותר. אם מבודדים את הכבד, שימו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה או השתמשו בשיטת אחסון מתאימה בהתאם לפרוטוקול או לצורך בהמשך. מתוח בזהירות את המעי וזהה את חלקי הקיבה והמעי/האחורי (איור 14).
  10. נתק את הקיבה מהמעי/האחורי.
  11. החזקו את הקצוות הקדמיים והאחוריים של המעי/המעי האחורי עם מלקחיים עדינים ומותחים בעדינות כדי להאריך אותו לאורך הכולל.
  12. אסוף רקמות בצינור מיקרוצנטריפוגה ואחסן אותן כראוי.
  13. אם משתמשים במטאגנומיקה, איסוף דגימות בהקפאה מיידית בחנקן נוזלי ומאוחסן בטמפרטורה של -80°C. זה נעשה על ידי טבילה של צינור המיקרוצנטריפוגה בחנקן נוזלי למשך 5 שניות.

איור 8
איור 8: מיקום סיכות לכריתת מערכת העיכול. (א) דגי שטח. (B) דגי מערות פאצ'ון אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 9
איור 9: החתך מתחת לפריסקציה. (א) דגי שטח. (B) דגי מערות פאצ'ון אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 10
איור 10: הסרת האופרקולום ויצירת חלון. (א) דגי שטח. (B) דגי מערות פאצ'ון אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 11
איור 11: הסרת עור ושריר צדדיים שטחיים. (א) דגים על פני השטח. (B) דגי מערות פאצ'ון אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 12
איור 12: איברים במקום בחלל גוף הדג הבוגר לאחר הסרת שריר ועור. (א) נקבות דגי שטח עם חלל בטן חשוף וביצים הוסרו כדי לחשוף איברים. (ב) דג שטח זכר עם חלל בטן ואיברים חשופים. (ג) נקבות דגי מערות פאצ'ון עם חלל בטן חשוף וביצים שהוסרו לחשיפת איברים. (ד) זכר דגי מערות פאצ'ון עם חלל בטן ואיברים. חצים שחורים מצביעים על האזור שבו נמצאת חבילת מערכת העיכול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 13
איור 13: חבילת מערכת העיכול שהוסרה מחלל גוף הדג. (א) דגים על פני השטח. (ב) דגי מערות פאצ'ון. פס קנה מידה: 10 מ" מ אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 14
איור 14: איברים מבודדים במערכת העיכול של דגי שטח ודגי מערות. (א) דגי שטח. (ב) דגי מערות פאצ'ון. פס קנה מידה: 10 מ" מ אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בהתאם לפרוטוקול זה, הופקו תכולת המוח והמעיים, ונלקחו מדידות של אורך המעי המלא, הטלנצפלון והטקטום האופטי והושוו בין מורפוטיפים של דגי שטח ודגי מערות פאצ'ון (איור 15). השתמשנו במבחני t של וולש במדגם עצמאי להשוואות סטטיסטיות, עם גודל מדגם של n = 6 דגי שטח ו-n = 6 דגי מערות פאצ'ון. לדגים על פני השטח היו מממדי טקטום אופטי גדולים משמעותית מדגי מערות פאצ'ון, בהתאם לפרוטוקולי רישום מוח שפורסמוקודם לכן 16,38, עם אורך גדול יותר בדגים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הרלוונטיות הגוברת של A. mexicanus כמודל מחקר במספר תחומים, החל מאבולוציה ועד מדעי המוח הביו-רפואיים ומיקרוביולוגיה, דורשת שיטת ניתוח ואיסוף איברים סטנדרטית. בעוד שמבנים מבודדים נחקרו ותועדו בעבר, כולל הטקטום האופטי16,38, הלבהבוגר 11 ואחרים 11,44, חסרה הנחיה שיטתית לאפשר תוצאות שחזוריות מאיברים שנחתכו ביעילות בדגים על פני השטח ודגי מערות של מין זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים. כל ההליכים פועלים לפי הפרוטוקול המאושר על ידי IACUC 2024-0004.

תודות

עבודה זו ממומנת על ידי מענק NIH 5R16EY037336-02, מענק RCMI U54 MD007600, ומענק NIH 1P20GM156713-01 (מרכז COBRE פוארטו ריקו למדעי המיקרוביום).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אקווריום רבייה לדגי זברה בנפח 1.0 ליטרטקניפלסטhttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tankלהכין את תערובת הקרח להמתת חסד. המיכל מלא למחצה בקרח ואז המיכל הפנימי המחורר מונח עליו. לאחר מכן הוא מתמלא במים עד למעלה.
מחבת קרח פוליאוריתן 4 ליטרUSA Scientificפריט #2328-7242
שקיות פסולת ביו-מסוכנותפישרברנד14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS מרוכז נוזלי 10x, דרגת ביולוגיה מולקולרית, סטרילימיליפורסיגמא65074L
מיקרוסקופ ניתוח אולימפוס SZ51אולימפוס  OLSZ51NPS-LED/R
מלקחיים לניתוח רקמותפישרברנד08-953G
סיכות ניתוח, חבילת 100כלים למדעי ביתhttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
מלקחיים, עדין, קצוות חדים ועדינים במיוחד MOPECAB132
מלקחיים, רקמה, קצה עדין ועדיןMOPECAB047
המוסטט, 12.5 ס"מ, ישרכלי הדיוק העולמייםhttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
מלקחי צורפים, דומון מס' 5מיליפורסיגמאhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
קימווייפס EX-Lקימברלי-קלארק34155
חנקן נוזליסופק על ידי מוסד
Noyes Micro Scissors, 12 ס"מכלי הדיוק העולמיים500228
מגבות ניירסופק על ידי מוסד
צלחות פטרי עם מכסה שקוף, 95 מ"מ, 15 מ"מ, עגולפישרברנדFB0875714G
סכין מדרין, #22, חבילת 10כלים מדעיים ביתייםhttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
ידית סכין #4סורטקסhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
מספריים, ניתוח קשתיתMOPECAA146
מספריים, סופר-דק מיקרוMOPECAA152
פיפטות העברה חד-פעמיות סטנדרטיותתרמו-סיינטיפיק13-711-9D
מיקרוצנטריפוגה אפנדורף סטרילית 1.5 ומיקרו; צינורות Lאפנדורף05-402-25
סילגארד 184מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים24236-10
תרמו-פלאסקLab-Line Instruments Inc.2119
מספריים עדינים במיוחדNEWMED InstrumentsNM-DI-206023
מים מתאימים לאלקטרופורזה, PCRסיגמא-אלדריץ'W4502-1L

מקורות

  1. Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds. J Vis Exp. (139), e58366(2018).
  2. Örling, J., Kosonen, K., Villman, J., Reichard, M., Paatero, I. Impaired fin regeneration and angiogenesis in aged zebrafish and turquoise killifish. Biol Open. 12 (4), bio059622(2023).
  3. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Dev Methods Protoc. 1082, 197-214 (2014).
  4. Barbosa, A., et al. Western Blotting Assay for egr-1 Immediate Early Gene in Brain Tissue of Zebrafish Applied to Neuroethological Study. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  5. Corradi, L., Zaupa, M., Sawamiphak, S., Filosa, A. Using perk immunostaining to quantify neuronal activity induced by stress in zebrafish larvae. STAR Protoc. 3 (4), 101731(2022).
  6. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  7. Leigh, S. C., Nguyen-Phuc, B. -Q., German, D. P. The effects of protein and fiber content on gut structure and function in zebrafish (danio rerio). J Comp Physiol B. 188 (2), 237-253 (2018).
  8. Sassen, W. A., et al. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Dev Biol. 430 (1), 18-31 (2017).
  9. Jie, J., et al. Adult zebrafish intestine dissection: a technique to analyze compound absorption. J Vis Exp. (10), e20199(2023).
  10. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), e1717(2010).
  11. Baumann, D. P., Ingalls, A. Mexican Tetra (astyanax mexicanus): Biology, Husbandry, and Experimental Protocols. Laboratory Fish in Biomedical Research. , Academic Press. (2022).
  12. Gross, J. B., Meyer, B., Perkins, M. The rise of Astyanax cavefish. Dev Dyn. 244 (9), 1031-1038 (2015).
  13. Carlson, B. M., Gross, J. B. Characterization and comparison of activity profiles exhibited by the cave and surface morphotypes of the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 208, 114-129 (2018).
  14. Riddle, M., et al. Evolution of the Mexican cavefish gut microbiome. Curr Biol. 23, 01307(2023).
  15. Riddle, M. R., et al. Host evolution shapes gut microbiome composition in Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11192(2024).
  16. Jaggard, J. B., et al. Cavefish brain atlases reveal functional and anatomical convergence across independently evolved populations. Sci Adv. 6 (38), eaba3126(2020).
  17. Rodríguez-Morales, R. Sensing in the dark: constructive evolution of the lateral line system in blind populations of Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11286(2024).
  18. Rodriguez-Morales, R., et al. Convergence on reduced aggression through shared behavioral traits in multiple populations of Astyanax mexicanus. BMC Ecol Evol. 22 (1), 116(2022).
  19. Duboué, E. R., Borowsky, R. L., Keene, A. C. β-adrenergic signaling regulates evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Brain Behav Evol. 80 (4), 233-243 (2012).
  20. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biol. 13, 15(2015).
  21. Forberg, J. Temperature effects on the development of the axial skeleton and body shape in Astyanax mexicanus (teleostei: characidae) [Master's Thesis]. , College of Science and Health Theses and Dissertations. https://via.library.depaul.edu/csh_etd/514 (2022).
  22. Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
  23. Blackwell, B. R., et al. Effects of metformin and its metabolite guanylurea on fathead minnow (Pimephales promelas) reproduction. Environ Toxicol Chem. 41 (11), 2708-2720 (2022).
  24. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquat Toxicol. 78 (1), 91-102 (2006).
  25. Butler, J. M., Whitlow, S. M., Roberts, D. A., Maruska, K. P. Neural and behavioural correlates of repeated social defeat. Sci Rep. 8 (1), 6818(2018).
  26. Norton, W. H. J., Gutiérrez, H. C. The three-spined stickleback as a model for behavioural neuroscience. PLoS ONE. 14 (3), e0213320(2019).
  27. Espinasa, L., Jeffery, W. R. Conservation of retinal circadian rhythms during cavefish eye degeneration. Evol Dev. 8 (1), (2006).
  28. Jeffery, W., Ma, L., Parkhurst, A., Bilandzija, H. Pigment Regression and Albinism in Astyanax Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press, Elsevier. (2015).
  29. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). J Exp Biol. 217 (Pt 6), 886-895 (2014).
  30. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line-dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Dev Biol. 441 (2), 328-337 (2018).
  31. Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Dev Biol. 441 (2), 297-304 (2018).
  32. Chin, J. S. R., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Dev Biol. 441 (2), 319-327 (2018).
  33. Kowalko, J. E., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Curr Biol. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  34. Espinasa, L., et al. Divergent evolutionary pathways for aggression and territoriality in Astyanax cavefish. Subterr Biol. 43, 169-183 (2022).
  35. Kowalko, J. Utilizing the blind cavefish Astyanax mexicanus to understand the genetic basis of behavioral evolution. J Exp Biol. 223 (Suppl_1), jeb208835(2020).
  36. Sekulovski, B., Miller, N. Mechanisms of social behaviour in the anti-social blind cavefish (Astyanax mexicanus). Proc Biol Sci. 292 (2043), 20250052(2025).
  37. Chin, J. S. R., et al. Analysis of stress responses in Astyanax larvae reveals heterogeneity among different populations. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 334 (7-8), 486-496 (2020).
  38. Kozol, R. A., et al. A brain-wide analysis maps structural evolution to distinct anatomical module. eLife. 12, e80777(2023).
  39. Ra, K., et al. Evolution of a central dopamine circuit underlies adaptation of light-evoked sensorimotor response in the blind cavefish, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2024).
  40. Medley, J. K., et al. The metabolome of Mexican cavefish shows a convergent signature highlighting sugar, antioxidant, and ageing-related metabolites. eLife. 11, e74539(2022).
  41. Yen, S., Johnson, J. S. Metagenomics: a path to understanding the gut microbiome. Mamm Genome. 32 (4), 282-296 (2021).
  42. Marder, E. Marder lab website - Sylgard dishes. , https://sites.google.com/brandeis.edu/marder-lab/experimental-resources/sylgard-dishes (2026).
  43. Hallmaier-Wacker, L. K., Lueert, S., Roos, C., Knauf, S. The impact of storage buffer, DNA extraction method, and polymerase on microbial analysis. Sci Rep. 8, 6292(2018).
  44. Riddle, M. R., et al. Evolution of gastrointestinal tract morphology and plasticity in cave-adapted Mexican tetra, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2020).
  45. Garduño-Sánchez, M., et al. Phylogeographic relationships and morphological evolution between cave and surface Astyanax mexicanus populations (de Filippi 1853) (actinopterygii, characidae). Mol Ecol. 32 (20), 5626-5644 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים