מאמר שיטה

בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

DOI:

10.3791/70414

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי הלבלב של עכברוש לואיס, המאפשר הכנות בעלות תפוקה גבוהה וטוהר לשימוש ישיר בהשתלות או במחקרים במבחנה .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איי הלבלב חיוניים הן להשתלת איים קלינית והן למחקרים פרה-קליניים שמטרתם להבין את המנגנונים וההתקדמות של סוכרת. עם זאת, ההתקדמות בתחומים אלו מוגבלת לעיתים קרובות בשל זמינות איים קטנים איכותיים, שכן אסטרטגיות טיפוליות מתפתחות דורשות תכשירים גדולים, נקיים וסטנדרטיים יותר. מאמר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי בעל תפוקה גבוהה לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור איים בלבלב בעכברי לואיס באמצעות גרדיאנט צפיפות. השיטה משלבת פרפוזיה תוך-דוקטלית של הלבלב עם תערובת אנזימים מוגדרת, עיכול משותף של מספר לבלב, והפרדה מבוססת צפיפות כדי למקסם את התפוקה תוך מזעור הפיצויים וביטול הצורך באיסוף ידני שגרתי. תפוקת האיים נמדדת באמצעות שתי גישות משלימות: שיטת ספירה מסורתית מבוססת אליקווט הנפוצה בהקשרים קליניים, ושיטה חצי-אוטומטית המבוססת על הדמיה מלאה. בבידוד מייצג מ-12 לבלב, ספירה ידנית הניבה כ-3,300 שקולות איים (IEQ) ו-2,700 איים אבסולוטיים לכל לבלב (~39,600 IEQ בסך הכל), עם התפלגות גודל של 62% (50-100 מיקרון), 17% (100-150 מיקרון), 10% (150-200 מיקרון), 5% (200-250 מיקרון) ו-6% (>250 מיקרון). בהשוואה, ניתוח אוטומטי של הכנה מלאה דיווח על 16,350 IEQ כולל (1,362 IEQ/לבלב), מה שמדגיש שונות מובנית בכימות מבוסס אליקווט. ההכנות הגיעו לטוהר של 98% על ידי צביעת דיתיזון, וחיוניות האיים נשמרה ב-98% במבחנה בימים 3 ו-7 לאחר הבידוד. הערכה פונקציונלית על ידי הפרשת אינסולין מונעת גלוקוז סטטית הראתה עלייה פי 10 בשחרור האינסולין לאחר גירוי של שעה עם 16.7 מ"מ גלוקוז. בסך הכול, פרוטוקול זה מספק גישה שחזורית ויעילה ליצירת הכנות איים טהורות ופונקציונליות שלמות, שניתן להשתמש בהן מיד ללא ניקוי נוסף. האיים שומרים על תפקוד חזק בתרבות עד שבעה ימים, מה שמאפשר גמישות לבדיקות במבחנה רחבות היקף וכן למחקרים של השתלות בחיים (in vivo ).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת איי הלבלב מהווה אסטרטגיה ישימה לשיקום ייצור האינסולין האנדוגני אצל אנשים עם סוכרת סוג 1 (T1D)1. מעבר לסוכרת סוג 1, ביולוגיית האיים רלוונטית יותר ויותר לסוכרת סוג 2 (T2D), מצב המאופיין בתפקוד לקוי ואובדן מתקדמים של תאי β, וכן למטופלים שעוברים כריתת לבלב חלקית או מלאה בשל דלקת לבלב כרונית, גידולים בלבלב או פגיעה טראומטית. בהקשרים אלו, גישה לאיים איכותיים חיונית לקידום טיפולים תאיים, למידול כשל תאי β, לחקר אינטראקציות בין איים ואי לסטרומל, ולפיתוח גישות רגנרטיביות מתפתחות2. כתוצאה מכך, נהלי בידוד איים חזקים וניתנים לשחזור הם קריטיים לתמיכה הן במחקר מכני והן בפיתוח תרגומי במגוון רחב של הפרעות אנדוקריניות בלבלב.

למרות שהאיים מהווים פחות מ-2% ממסת הלבלב, הם ממלאים תפקיד משמעותי באופן לא פרופורציונלי בהומאוסטזיס הגלוקוז. הפגיעות הפנימית שלהם להיפוקסיה, עיכול יתר אנזימטי, לחץ חמצוני וגזירה מכנית הופכת אותם לרגישים במיוחד לפגיעות הקשורות לבידוד 3,4,5. אפילו סטיות עדינות בטמפרטורה, בחמצון או בטיפול ברקמות עלולות לפגוע בקישור גירוי-הפרשת תאי β או להפעיל אפופטוזיס, בשל הגנות נוגדי חמצון מוגבלות וביקוש מטבולי גבוה 6,7. כתוצאה מכך, רוב הפרוטוקולים הקונבנציונליים מדגישים שימוש מהיר במורד הזרם, בדרך כלל בתוך 24-48 שעות מהקציר בסביבות קליניות וניסויים 8,9,10,11,12. בעוד שמסגרת השימוש המיידית הזו ממזערת התדרדרות, היא מגבילה את הגמישות הניסויית, מעכבת מחקרים לאורך זמן ומסבכת את המאמצים לצבור מספיק מספרי איים לבדיקות חוץ גופיות גדולות או לניסויי השתלה ב-in vivo.

מבין מודלי המכרסמים, חולדות לואיס משמשות רבות למחקר באיים בשל הרקע הגנטי הפנימי שלהן, פרופיל חיסוני יציב ותכונות פיזיולוגיות ששכפול14. ההבדלים בתפוקת האיים, הרגישות והחוסן התלויים בעינן מתועדים היטב. דה גרוט ואחרים הראו כי איי עכברוש לואיס מציגים הפרשת אינסולין מונעת גלוקוז גבוהה יותר בהשוואה לזנים אחרים, מה שמדגיש את התאמתםלמחקרים פונקציונליים, מטבוליים והשתלות. מחקרים נוספים אישרו את אמינותם למחקר אימונולוגי ואלו/קסנוטרנסלנטציה 14,15,16. עם זאת, במעבדות שונות, שונות בתפוקת האיים, טוהרם ותפקודם נותרה מחסום משמעותי. רוב השונות הזו נובעת מאי-עקביות בתערובת אנזימים, טכניקות פרפוזיה תוך-דוקטלית, טיפול בלבלב, תזמון העיכול ואסטרטגיית טיהור17.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פיתחנו פרוטוקול שחזורי שלב אחר שלב לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי לבלב מעכברי לואיס. תהליך עבודה זה מותאם כדי למקסם את התפוקה, למזער פיצול ולשמר את הקיימות הפונקציונלית. חשוב לציין שהוא קובע מדדים ברורים, כולל שווי ערך איים (IEQ), כדאיות לאורך זמן, טוהר והפרשת אינסולין מונעת גלוקוז, המאפשרים לחוקרים להבחין באופן אמין בין בידוד מוצלח לבין בידוד תת-אופטימלי 18,19,20. על ידי שיפור התפוקה והאריכות ימים, הפרוטוקול משפר את הגמישות הניסויית ועשוי להפחית את מספר בעלי החיים התורמים הנדרשים, ובכך לתמוך בתכנון ניסויים אתי וניתן להרחבה.

בניגוד לגישות מסורתיות רבות, השיטה הנוכחית מראה כי איי עכברוש לואיס יכולים להישמר בתרבות עד 7 ימים עם שמירה על חיוניות ותפקוד, מה שמרחיב את השימושיות שלהם למחקרים מגוונים ממושכים . הפרוטוקול משלב גם אסטרטגיית עיבוד מאוחדת ויעילה, המסוגלת לטפל בעד 30 לבלבנים באצווה אחת, מה שמאפשר עיכול אחיד ולהפחית שונות בין דגימות. עם טוהר אנדוקריני שמגיע ל-98%, ההליך מבטל את הצורך בפריטה ידנית אינטנסיבית ומפחית את הסיכויים לזיהום מיקרוביאלי. בהשוואה לשיטות עיכול חד-שלבי או בכמויות גדולות שמייצרות לעיתים קרובות תכשירים לא טהורים או פגומים מכנית,תהליך עבודה עתיר זה מניב באופן אמין מספר רב של איים נקיים ואיכותיים להשתלה, המתאימים לבדיקות מבחנה , פרופיל מטבולי ומחקרי השתלות בחו"ם .

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מוסדות המתודיסטים ביוסטון (IACUC, פרוטוקול #IS00007362) ובוצעו בהתאם למדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ולחוק רווחת בעלי החיים.
הערה: החומרים והכלים המשמשים לאורך כל הפרוטוקול נמצאים בטבלת החומרים.

1. הכנה לפני הקציר ויום הבידוד

  1. הכינו את התמיסות הבאות בתנאים אספטיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית (ראו טבלה 1) ואחסנו את כל התמיסות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    תמיסת שטיפה לפניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep).
    שטיפת מדיה.
    בופר כיבוי.
    מדיה של תרבות האיים.
    קרבס בופר.
  2. חטא כלים וציוד באמצעות אוטוקלב.
    1. אריזת ניתוחים לאיסוף לבלב מהאוטוקלאב: וילונות ניתוחים, גזה, מלקחיים של רקמת שן חולדה, מלקחיים שטוחים, מלקחיים מעוקלים עדינים, מספריים לעור, מספריים מיקרו-דיסקרטיביים, שני המוסטטים קטנים והמוסטאט מעוקל אחד.
      הערה: אוטוקלב לשני חבילות ניתוח לאיסוף לבלב אם יהיו שני מפעילי ניתוח.
    2. ערכת ניתוח לניקוי לבלב לאוטוקלאב: מלקחיים עדינים מעוקלים ומספריים מיקרו-דיסקטיביים.
    3. אוטוקלב יריעת אלומיניום בגודל 30 ס"מ על 30 ס"מ.
    4. אוטוקלב 1-6 כוסות בנפח 600 מ"ל ו-1 ליטר, בהתאם למספר הלבלב שיש לעבד (ראו טבלה 2).
    5. אוטוקלאב מסננת של 500 מיקרון.
    6. אוטוקלב של שתי מחטים עמוד שדרה במשקל 14 גרם, למקרה שאחת מהן נסתמת עם רקמת לבלב לא מעוכלת.
    7. אוטוקלב צינור מזרק אחד לכל מזרק של 50 מ"ל הנדרש (ראו טבלה 3).
  3. הכינו את אמבט המים לעיכול.
    1. מלא את אמבט המים המצויד בשייקר אורביטלי במים אולטרה-טהורים באוטוקלב עד שהוא מגיע לגובה של 3/4 אינץ' מעל פני הפלטפורמה.
    2. הוסף 3 מ"ל תמיסה אנטימיקרוביאלית ושמור על המכסה סגור כדי למזער זיהום.

2. הכנות ליום הקציר והבידוד

  1. הכינו מזרקים גרדיאנטיים.
    1. הסר תמיסות שיפוע איים 1.108 גרם/סמ"ק, 1.096 גרם/סמ"ק ו-1.069 גרם/סמ"ק שהוכנו ושימשו בשלבים הבאים ובשלב 5.2 "טיהור איים" מאחסון בטמפרטורה של 4°C, ואפשרו להן להתאזן לטמפרטורת החדר (כ-1 שעה).
      הערה: נפח הגרדיאנט הנדרש ישתנה לפי מספר הלבלב שיש לעבד; עיין בטבלה 3 כדי להבטיח נפחים מספיקים של גרדיאנטים נבחרים.
    2. טענו מראש ותייגו את המזרקים בנפח 50 מ"ל עם גרדיאנטים של 1.096 גרם לסמ"ק ו-1.069 גרם לסמ"ק.
      1. ערבבו בנחישות את תמיסות גרדיאנט הצפיפות של 1.069 ו-1.096 גרם לסמ"ק.
      2. טען את הנפחים המתאימים, בהתאם לטבלה 3, למזרקים של 50 מ"ל המצוידים בצינור ניתוחי ומחט 16 G.
      3. לאחר המילוי, סגרו את המחטים לשמירת הסטריליות והניחו את המזרקים בצד לשימוש עתידי בשלב "טיהור האיים" 5.5.
    3. שמור על 1.108 גרם/ס"מ3 גרדיאנט בטמפרטורת החדר עד לשימוש מאוחר יותר.
  2. הכינו תמיסת אנזים של מדיה דיסוציאציה עובדת (WDM), טעונו למזרקים לפרפוזיה ובקבוקונים עם אוטוקלב.
    1. עבדו בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית ושמרו על כל התמיסות בקפיא.
    2. הפשרה של אליקוטים של קולגנאז, תרמליזין ו-DNase I על הקרח.
    3. מדלל תגובות אנזימיות בכוס סטרילית בנפח 1 ליטר באמצעות WDM להשגת הריכוזים הסופיים הבאים: קולגנאז 0.15 מ"ג/מ"ל, תרמוליזין 5 מיקרוגרם/מ"ל, ו-DNase I 0.1 מ"ג/מ"ל (טבלה 2).
    4. ערבב WDM בעדינות באמצעות תנועת סיבוב 10 פעמים. אין לערבב עם פיפטה; לשמור על פעילות האנזימים על ידי סיבוב עדין.
    5. אחד אחד, טענו 10 מ"ל של תמיסת האנזים WDM לכל מזרק של 10 מ"ל באמצעות מחט של 16 גרם למילוי מהיר, ואז החליפו במחט מכוסה בגודל 25 גרם על 1/2 אינץ' לזרימת הלבלב מאוחרת.
    6. עטוף מזרקים טעונים בנייר אלומיניום מאוטוקלב והניח על קרח עד השימוש.
    7. זרקו עודף WDM באופן שווה לבקבוקים סטריליים של 600 מ"ל כדי להחזיק את הלבלב שנקטף לפי טבלה 2. כסו כל בקבוק בנייר אלומיניום סטרילי ושמרו אותו על קרח (טבלה 2).
  3. הכינו את סביבת תרבית התאים.
    1. הפעל את שייקר אמבט המים המסלול, מכוון ל-130 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. להשאיר כך במהלך קציר הלבלב.
    2. הניחו את הפריטים הבאים תחת אור UV בארון הבטיחות הביולוגית למשך שעה לצורך חיטוי נוסף.
      מסננת סטרילית של 500 מיקרון.
      סטרילית בנפח 1 ליטר.
      משאבת מזרק.
    3. ודאו שדגמת תרבית התאים מכוונת ל-25 מעלות צלזיוס 5% CO2.
    4. כוון את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס, עם האצה והאטה על 9.
  4. אספו חומרים לקציר והמשיכו לחדר הניתוח.
    1. מנקה לבלב ייעודי:
      1. אספו דלי קרח גדול אחד כדי להכיל את מספר הבקבוקים הנדרש של 600 מ"ל WDM ותמיסת שטיפת הלבלב (ראו טבלה 1 וטבלה 2).
      2. אסוף צלחת פטרי סטרילית אחת לכל 6 לבלב לעיבוד.
      3. אסוף מספריים סטריליים מיקרו-דיסקרטיביים ו-2 מלקחיים קטנים ועדינים.
    2. קציר לבלב מיועד:
      1. אסוף חבילת ניתוחים לקציר סטרילי.
      2. אספו כפפות ניתוח סטריליות.
      3. אסוף מגש קרח עם מזרקי WDM טעונים מראש בנפח 10 מ"ל ואטום בנייר אלומיניום אוטוקלב.
  5. בחדר הניתוחים, הכן את תחנת כריתת הלבלב.
    1. הפעל את חיטוי חרוזי הזכוכית כדי לחטא את כלי הניתוח על ידי טבילה למשך דקה אחת בחומר החיטוי בין כל חיה. כלים עשויים להתקרר במהירות על ידי טבילה ב-PBS סטרילי של 1x.
    2. הניחו כרית סופגת מתחת לשדה הראייה של המיקרוסקופ לחיפוש דם או תמיסת אנזימי WDM דליפה.
    3. כוון את המיקרוסקופ להגדלה כוללת של 6.3 פעמים בין עדשת העין לעדשה האובייקטיבית.
    4. פתח את ערכת הניתוח ולבש כפפות ניתוח סטריליות בטכניקת אספטיה.
    5. המשך בקציר כירורגי.
  6. בחדר הניתוח, הכן את תחנת ניקוי הלבלב.
    1. שפוך מספיק תמיסת Pen-Strep כדי למלא חצי מצלחת פטרי של 100 מ"מ (כ-6 מ"ל) כדי לטבול את הלבלב המבודד ולהניח על קרח.
    2. פתח את ערכת הניתוח ולבש כפפות ניתוח סטריליות בטכניקת אספטיה.
  7. בחדר הניתוח, הכן את תא ההרדמה.
    1. הניחו מגשי מאגר בכלוב חולדות ריק, נקי וניתן לסגירה.
    2. למלא מגשים חצי מלאים באיזופלורן.
    3. הניחו את המגש המחורר מעל המאגרים כדי למנוע שפיכה בזמן שהעכברים מונחים בפנים.
    4. סגור את מכסה התא עם מכסה הכלוב.
  8. המשיכו לקצירת הלבלב.

3. קציר הלבלב

  1. הניחו חולדות אחת אחת בתא המתת החסד מעל המגש למנת יתר מהירה של איזופלוראן.
    הערה: זמן המתת החסד הנדרש לעכברוש ישתנה, במיוחד כאשר האיזופלורן מתאדה.
  2. אשר היעדר דופק ונשימה לכל עכברוש.
  3. אשר המתת חסד באמצעות שיטה משנית שאינה מפריעה לחלל הבטן (למשל, ניקור לבבי).
    הערה: שיטות המתת חסד ראשוניות אחרות מקובלות; עם זאת, עדיף מנת יתר של איזופלורן, שכן המתת חסד מהירה מצמצמת את היפוקסיית האיים.
  4. רססו 70% אתנול על פרוות הבטן של כל עכברוש כדי לסחוט ולמנוע שיער רפוי בשדה הניתוחים.
  5. הניחו את העכברוש שהושמד על הקצה מתחת למיקרוסקופ עם הראש המרוחק מהמפעיל. ודא שהחלל העליון של הבטן נמצא תחת שדה הראייה של המיקרוסקופ.

איור 1
איור 1: חשיפה כירורגית ופרפוזיה תוך-תוך-צינור של לבלב העכברוש. המחשה של השלבים המרכזיים בחשיפת הלבלב והפרפוזיה דרך הספינקטר של אודי. (א) עכברוש לואיס שהושמד עם חלל הבטן פתוח. (אה) הצבת מהדק של צינור המרה הנפוץ והווריד הכבדי. (ב) תצוגה מוגדלת של התריסריון, המראה המוסטטים המסמנים את אזור הספינקטר של אודי. (BB) מחט הפרפוזיה ממוקמת בתוך צינור הלבלב הראשי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. קציר הלבלב (תפקיד קציר הלבלב):
    1. בצע חתך בצורת "V" באמצעות מספריים בעור, החל מהסימפיזה הערווה לכיוון כל צלעות צדדיות כדי להגיע לחלל הבטן (ראו איור 1A).
    2. משוך את המעי הדק והגס לצד השמאלי של החיה באמצעות מלקחיים שטוחים לפינוי "מרחב העבודה" של חלל הבטן.
    3. פתח את התריסריון באמצעות מלקחיים שטוחים והמוסטטים מעוקלים. ודאו שצינור המרה המשותף ווריד הפורטל הכבדי נמצאים בשדה הראייה של המיקרוסקופ.
    4. למשוך את ראש הכבד ולסגור את צינור המרה המשותפת והווריד הכבדי באמצעות המוסטטים המעוקלים. מהדק 1-2 מ"מ מהכבד (ראו איור 1Aa).
      הערה: שלבים 3.6.1-3.6.4 ו-3.6.8 יכולים להתבצע באמצעות ויזואליזציה ישירה. השתמשו במיקרוסקופ בכל שאר השלבים כדי להבטיח שליטה עדינה ברקמות.
    5. בעיני המיקרוסקופ, באמצעות מלקחיים שטוחים והמוסטטים שטוחים, מפעילים בעדינות את התוכן בתריסריון כדי לנקות את הסוגר מאודי.
      הערה: ודאו שתכולת התריסריון מוזזת ממקום החדרת המחט המיועדת.
    6. בודדו את האזור סביב הסוגר של אודי על ידי הידוק עדין של התריסריון עם ההמוסטים השטוחים במרחק של כ-5 מ"מ מכל צד של הסוגר. יש להבטיח דחיסה מינימלית לשמירה על שלמות הרקמה (ראו איור 1B).
    7. באמצעות מזרק WDM סטרילי, מכניסים את המחט בזהירות דרך דופן התריסריון הדק, העבירו אותה דרך הסוגר של אודי, והתקדמו אל תעלת הלבלב הראשית לקבלת פרפוזיה (ראו איור 1Bb).
      1. ברגע שהמחט עוברת דרך הסוגר של אודי, תוך שמירה על לחץ קבוע, יש להזריס 7-10 מ"ל של WDM ללבלב בקצב של כ-500 מיקרו לשנייה עד שהלבלב מתנפח לחלוטין.
        הערה: ודאו שהשיפוע כלפי מעלה והמחט מקבילה לתעלה הלבלבלית כדי למזער טראומה. התחל להזריק מיד עם ההכנסה. זה יעזור להרחיב את הסוגר והצינור ויקל על התקדמות המחט. הלבלב נחשב לנפוח לחלוטין כאשר זנב הלבלב, הממוקם סמוך לטחול, הופך לפירוז גלוי.
    8. כריתה את הלבלב על ידי ניתוח עדין מהמבנים הסובבים אותה בסדר הבא: טחול, קיבה, מעי גס, תריסריון ומזנטריה.
      הערה: השתמש בדיסקציה קהה כדי למזער נזק לרקמות. המשיכו ברצף לשמירה על כיוון אנטומי והפחתת המתח על החיבורים הוסקולריים והדוקטליים.
      1. הסר את שני ההמוסטטים השטוחים מהשתריון.
      2. השתמשו במלקחיים השטוחים כדי להדק את רצועת הטחול (המחברת בין הלבלב והטחול) והפכו לאחיזה עדינה.
      3. באמצעות מלקחיים דקים ומעוקלים לניתוח, הניעו בזהירות והפרדו את הלבלב מהחיבורים הסמוכים לטחול.
      4. נתק את הלבלב מהקיבה על ידי הרמת רקמת הלבלב עם מלקחיים עדינים ומעוקלים ויישום אחיזה נגדית עדינה עם מלקחיים שטוחים.
      5. לאחר מכן, באמצעות המלקחיים השטוחים, יש להפעיל אחיזה חזקה כדי להוציא את המעי הגס מהלבלב.
      6. הרם את המעי הדק באמצעות המלקחיים השטוחים ונתח את המזנטריה מהלבלב באמצעות מלקחיים מעוקלים דקים.
      7. הרימו בעדינות את הלבלב המנוקב עם המלקחיים השטוחים והשתמשו במספריים דקים כדי לנתק כל חיבורים שנותרו לרקמת החיבור.
    9. מעבירים מיד את הלבלב שנכרתו לצלחת פטרי המכילה תמיסת שטיפה קרה ומיד ממשיכים לקצור את הלבלב הבא, כאשר מנקה הלבלב מתחיל בניקוי הלבלב.
  2. לנקות את הלבלב (תפקיד מנקה הלבלב):

איור 2
איור 2: ניקוי הלבלב העכברוש המנופח. הדגשה רציפה של הלבלב לפני ואחרי הסרת רקמה לא חיונית. (א) לבלב מחודר מיד לאחר הניתוח, עם רקמת שומן סמוכה, בלוטות לימפה ומבני חיבור נראים. (B) לבלב מחובר עם סימני אנטומיה מרכזיים מסומנים. (ג) לבלב נקי לאחר הסרת רקמות עודפות, המראה את המראה הסופי לפני העיכול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. השתמשו במלקחיים מעוקלים דקים ובמספריים לניתוח דק כדי לחתוך בזהירות בלוטות לימפה, רקמת שומן, מזנטריה וכלי דם גדולים מהלבלב המפוחד, אם קיימים (ראו איור 2).
  2. העבר את הלבלב הנקי לכוס סטרילית בנפח 600 מ"ל המכילה 25 מ"ל נוזל מים קר. כסו את הבקבוק בנייר אלומיניום סטרילי כדי לשמור על הניקיון בין ההעברה מחלל הניתוח לחלל תרבית התאים.
    1. החלף את תמיסת השטיפה בצלחת פטרי כל 6 לבלב כדי למנוע זיהום.
    2. תעד את הזמן שבו הלבלב הראשון מונח על הקרח. זה ישמש לתיעוד זמן האיסכמיה הקרה.
  1. לאחר שכל הלבלב נרכש ונוקה ממנו, המשך במהירות לשלב העיכול במרחב העבודה של תרבית התאים.

4. עיכול הלבלב

  1. עצרו סיבובי שייקר אורביטליים וקבעו את הכוס(ים) המכוסים, המכילים את הלבלב, למחזיקים המיועדים של אמבטיית המים.
  2. במהירות, הפעל מחדש את ה-Orbital Shaker על 130 סל"ד והתחל טיימר של 10 דקות לזמן העיכול (ראו איור 3A).
    הערה: רשום נקודה זו כסיום תקופת האיסכמיה הקרה. רשמו כל קציר של אי קטן עם זמן האיסכמיה הקרה הכולל שלו ברשומות מעבדה.
  3. ב-5 דקות, סובבו ידנית את הבקבוק בכיוון השעון, ואז נגד כיוון השעון כדי לסייע בניתוק הרקמות.
  4. ב-8 דקות, יש להוציא את תמיסת הקירור מהאחסון הקר ולהעביר אותו לארון הבטיחות הביו-סייטי לשימוש מיידי מאוחר יותר (ראו טבלה 1).
  5. ב-10 דקות, העבירו במהירות וטבעו בקבוקים בקרח כדי להאט את פעילות האנזימים (ראו איור 3B).
    הערה: מנקודה זו ואילך, יש לטפל בכל הרקמות, התאים והתמיסות על הקרח כדי לשמר אותם עד שלב 4.20 כאשר משתמשים במדרגות צפיפות בטמפרטורת החדר.
  6. העבר את החלק החיצוני של הבקבוק והמגש לארון בטיחות ביולוגית.
  7. הוסיפו בופר קירוי ביחס 1:1 לתמיסה שבכוס כדי לעצור את העיכול (כ-75-100 מ"ל לבקבוק).
  8. שאיפת והוציא את תליית הרקמה בעדינות ובחזרה באמצעות מזרק 50 מ"ל המצויד במחט עמוד שדרה 14 גרם להפרדת שברי רקמה גדולים (ראו איור 3C).
  9. העבר את המתלה לצינורות חרוטיים של 200 מ"ל.
  10. שטוף את הכוסית עם 5 מ"ל מדיום שטיפה ונקז לצינור הקוני של 200 מ"ל המכיל את העיכול האי כדי לאסוף את העיכול שנותר.
  11. הצנטריפוגה מתעכלת ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ודאו שימוש במתאמי בקבוקי צנטריפוגה וכריות מתאימים לבטיחות.
  12. נקז בזהירות את הסופרנטנט ותלה מחדש את הכדור ב-100 מ"ל של מדיום כביסה באמצעות אותה מחט עמוד שדרה של 14 גרם כמו קודם.
  13. סנן את המתלה דרך מסננת סטרילית של 500 מיקרון המונחת מעל סטרילית בנפח 600 מ"ל כדי להסיר רקמות גדולות ולא מעוכלות.
    הערה: אם הפרפוזיה והניקוי של הלבלב בוצעו בצורה מיטבית, תישאר רקמת שומן מינימלית ולא לבלב לא מופרז על המסננת.
  14. שטוף את המסננת עם 10 מ"ל של חומר כביסה כדי לשחזר רקמה כלואה.
  15. העבר את הסינון לצינורות קוניים חדשים של 200 מ"ל.
  16. צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  17. שחרר את הסופרנטנט ותשיה את הכדור במדיה שטיפה של 100 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
    הערה: יש להבטיח אובדן מינימלי של תאים על ידי הרטבת קצות הפיפטה עם בופר המכיל FBS לפני חשיפה לאיים.
  18. צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  19. שאפו בזהירות את הסופרנטנט כדי לקבל כדור יבש.
  20. כוון את טמפרטורת הצנטריפוגה ל-22 מעלות צלזיוס כהכנה להפרדת גרדיאנטים.
    הערה: ניתן להאיץ זאת על ידי הפעלת הצנטריפוגה בעוצמה של 2000 x g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, ללא דגימות.

5. טיהור האיים

  1. עיין בטבלה 3 כדי לקבוע את מספר הצינורות הקוניים של 50 מ"ל נדרש.
    הערה: עיין בטבלה 3 כדי לפזר את נפח הכדור הכולל באופן שווה, תוך הבטחה שכ-2-3 מ"ל של עיכול הכדורים מחולק לכל צינור גרדיאנט. אם נראה הפרדה חלשה של רצועת האי מאוחר יותר, יש להשתמש בצינורות גרדיאנט נוספים לשיפור רזולוציית ההפרדה.
  2. הרטיב מראש את קצה הפיפטה הסרולוגית בנפח 10 מ"ל עם תמיסת גרדיאנט צפיפות של 1.108 גרם לסמ"ק כדי למנוע מהאיים להידבק לפני השטח הפנימיים של הקצה.
  3. החזירו כל כדור רקמה ב-15 מ"ל של תמיסת גרדיאנט של 1.108 גרם לסמ"ק לכל 2 מ"ל נפח כדור באמצעות הפיפטה הסרולוגית המורטבת מראש של 10 מ"ל. למרות שנפח הכולל עולה על 10 מ"ל, רוחב הפיפטה הקטן יותר מאפשר ערבוב מבוקר יותר ופירוק יעיל של הכדורים. מערבבים בעדינות עד שהם אחידים.
  4. יש לשחרר בזהירות 15 מ"ל מתלה התא לתחתית כל צינור קוני של 50 מ"ל, תוך הימנעות ממגע עם דפנות הצינור כדי להבטיח שיפוע נקי.
  5. באמצעות מזרקים טעונים מראש, יש לשכב ברצף 10 מ"ל של 1.096 גרם לסמ"ק, ואחריהם 10 מ"ל של 1.069 גרם לסמ"ק.
  6. פזר כל גרדיאנט בקצב של 5 מ"ל לדקה באמצעות משאבת מזרק, תוך מיקום קצה מחט 16 הגרם כנגד הדופן הפנימית של הצינור כדי למנוע ערבוב גרדיאנטים.
  7. צנטריפוגה את הצינורות ב-700 × גרם למשך 15 דקות ב-22 מעלות צלזיוס, כאשר האצת הצנטריפוגה מוגדרת ל-3 והאטה מוגדרת ל-0 כדי למנוע ערבוב גרדיאנטים.
    הערה: בהתחשב בזמן ההאטה המורחב, כל מחזור הצנטריפוגה אורך כ-45 דקות. יש לעקוב מקרוב אחרי השעה, שכן יש לאסוף איים קטנים במהירות כדי למנוע ערבוב גרדיאנטים ונזק אפשרי לתאים. אם צריך, יש להכין צינורות נגד איזון לפי משקל, לא לפי נפח, כדי להתחשב בהבדלי הצפיפות. לאחר הסרת הצינורות, אפס את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס, ואת האצה והאטה ל-9 לצעדים הבאים.
  8. לאחר הצנטריפוגה, יש לזהות את שכבת האי הממוקמת בממשקים בין שכבות הגרדיאנט של 1.069-1.096 g/cm³ ו-1.096-1.108 g/cm³ (ראו איור 3D).
  9. שאופים והשליכו בזהירות כל רקמה שנאספה בשכבה העליונה באמצעות פיפטת פסטר שהורטבה מראש במדיית כביסה.
  10. הרטבו פיפטת פסטר נוספת, אספו את שכבת האי, והעבירו אותה לצינור קוני מקורר מראש בנפח 200 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום שטיפה.
  11. העלה את נפח הצינור הקוניקלי של 200 מ"ל מקורר מראש ל-200 מ"ל עם חומר כביסה.
  12. צנטריפוגה ב-600 × גרם ל-5 דקות ומשחרר את הסופרנטנט.
  13. החזירו את הכדור לתלות ב-30 מ"ל של מדיום כביסה באמצעות קצה סרולוגי של 10 מ"ל שהורטבו מראש.
  14. העבר תלייה מחדש לצינור קוני חדש בנפח 50 מ"ל באמצעות קצה סרולוגי רטוב מראש של 10 מ"ל לשיפור הכדורים באי.
  15. שטוף את אותו צינור קוני של 200 מ"ל עם 20 מ"ל מדיית שטיפה והעבר לצינור הקוני של 50 מ"ל שמכיל את האיים הקטנים.
  16. צנטריפוגה את הקונוס של 50 מ"ל עם איים ומדיית שטיפה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  17. שחרר את הסופרנטנט והחזיר את כדור האי לתלייה ב-50 מ"ל של מדיה לתרבות האיים (ראו טבלה 1).
    הערה: הסר 100 מיקרו-ליטר אליקווטים בשלב זה אם סופרים איים קטנים בשיטת הכימות הידנית.
  18. חלקו איים באופן אחיד לצלחות פטרי בגודל 100 מ"מ שלא טופלו בתרבות רקמה, תוך שימוש בצלחת אחת לכל חמישה לבלב עכברוש לואיס שעובד.
    1. חשב את נפח המדיה הכולל של האי הנדרש באמצעות הנוסחה (מספר הלבלב ÷ 5 × 10 מ"ל).
    2. החזירו את כדור האי למחצית מנפח המדיה המחושב, ואז פזרו את המתלים באופן שווה על פני מספר הלוחות שנקבע.
    3. שטוף את צינור הקונוס בקוטר 50 מ"ל המכיל איים שאריתיים עם החצי הנותר של המדיום המחושב, והפך את השטיפה על פני אותן לוחות כדי להגיע לנפח סופי של 10 מ"ל לכל צלחת (ראו איור 3E).
  19. הדגרה בלילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂. הוסיפו 3 מ"ל של חומר תרבות איים כל 24 שעות לצד כל צלחת פטרי ואז סובבו בעדינות כדי למלא מחדש את המדיום.
  20. המשך לספירת האיים (שלב 6).

איור 3
איור 3: עיכול וטיהור הלבלב של איים מבודדים. תמונות מייצגות של השלבים הסדרתיים מעיכול הלבלב המצטבר ועד טיהור האיים. (א) הלבלב המפוקם הצטבר לפני עיכול אנזימטי. (B) לבלב מפורק לאחר עיכול אנזימטי. (ג) מתלה רקמה אחיד, פוסט-מכני. (D) צינורות עם גרדיאנט צפיפות לפני הצנטריפוגציה (משמאל) ואחרי הצנטריפוגה (מימין), עם רצועת איים נראית בממשק הגרדיאנט שמסומן במעגל. (ה) תמונת ברייטפילד של האיים הקטנים ביום 0 מיד לאחר האיסוף. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. ספירת האיים

  1. איסוף כימות ידני של האיים.
    1. במהלך שלב 5.16, שלפו שלושה אליקוטים של 100 מיקרוליטר של מתלי האי באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר וקצוות רגילים של 200 מיקרוליטר.
      הערה: ודאו שהאיים תלויים באופן שווה במדיה באמצעות ערבוב פיפטות, כאשר נלקחים אליקווטים למדידה.
    2. העבר כל אליקווט לצלחת פטרי מרושת בקוטר 2 מ"מ × 2 מ"מ המכילה 1 מ"ל של 1× PBS.
    3. ספר איים קטנים תחת מיקרוסקופ הפוך, ומקטלוג אותם לפי קוטר באמצעות עדשת עינית רשתית.
      הערה: לא כל האיים הקטנים יהיו עגולים; היצמד למדידות אופקיות או אנכיות לאורך כל הספירה.
    4. חשב את המספר הכולל של 150 מיקרון שקולים לאי באמצעות טבלת המרה סטנדרטית (ראו טבלה 4).
      הערה: השווה את IEQ של כל דגימה. אם ה-IEQ של האליקוטים שונה ביותר מ-30%, יש להמשיך עם הממוצע של האליקוטים הדומים ביותר.

7. אמצעי בטיחות

  1. בצע את כל ההליכים הכירורגיים וטיפול ברקמות בתנאים אספטיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית בעת הצורך. השתמשו בציוד מגן אישי (PPE), כולל משקפי מגן, חלוקי מעבדה, כפפות ומסכות כירורגיות, במהלך הטיפול בחומרים ורקמות.
  2. בצע קצירת לבלב בתנאים סטריליים עם כלים כירורגיים מתאימים וציוד מגן אישי. לטפל באיזופלוראן ובחומרי הרדמה אחרים בהתאם להנחיות המוסד כדי למנוע חשיפה לשאיפה.
  3. השלכת רקמות בעלי חיים, חדות ופסולת ביולוגית מסוכנת בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים. לשמור על תגובות אנזימטיות וחומרים ביולוגיים על הקרח אלא אם צוין אחרת לשימור פעילות וחיוניות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות הבאות מייצגות בידוד איים טיפוסי המתבצע בשיטה המתוארת, עם עיבוד של שנים-עשר לבלב עכברוש לואיס במקביל.

התפלגות תפוקה וגודל

ספירת אליקוות ידנית והמרת IEQ

שני אליקווטים עצמאיים של 100 מיקרוליטר התקבלו מהמתלה המעורב של האי, כפי שמתואר בסעיף "ספירת האיים", שלב 6.1, ונספרו באמצעות מיכלים בקוטר (50-100 מיקרון, 100-150 מיקרון, 150-200 מיקרון, 200-250 מיקרון, 250-300 מיקרון, 250-300 מיקרון). ספירות הומרו למקבילות איים (IEQ; 150 מיקרון) באמצעות טבלאות שקילות סטנדרטיות והוסקו לנפח המתלים הכולל (ראו איור 4A). במהלך הבידוד הניסיוני (n = 12), התפוקה הייתה 3330 IEQ ללבלב עם קוטר חציוני של אי בתא 50-100 מיקרון. מקדם השונות המשוחזר הסכים ב-18.8% לכל מיכל (מקדם שונות), מה שמעיד על שונות בינונית אך צפויה בשימוש בשיטות ספירה ידניות. במהלך 14 הבידוד הקודמים של האיים, שיטה זו הניב בממוצע 1353 (SD 607) IEQ/לבלב.

כימות אוטומטי של לוח מלא

כדי להשוות את IEQ ידני, נרכשו תמונות שדה בהיר ב-D1 באמצעות מיקרוסקופ ונתפרו ליצירת קומפוזיטים של צלחת שלמה (4× אובייקטיבי; חשיפה של 1/100 שניות). גודל אוטומטי וכימות אובייקטים בוצעו באמצעות פיג'י וקידוד עם סף גודל מוגדר מראש של 50-600 מיקרון. התמונות עובדו תחילה מראש כדי להפחית את השונות ברקע ולשפר את אחידות הניגודיות. מבני האיים זוהו בהתבסס על הבדלי עוצמה ביחס לרקמה הסובבת, ויצרו מסכות אובייקט בינאריות. איים סמוכים או שנגעו בהם חלקית הופרדו כדי למנוע הערכת חסר של מספר האובייקט. עצמים מחוץ לטווח הגודל שצוין הוצאו לצורך הסרת פסולת ורקמות שאינן איים. עבור כל אובייקט שנשמר נלקחו פרמטרים מורפומטריים שכללו שטח וקוטר צירי x ו-y. האיים חולקו לפי קוטר, ו-IEQ חושב על ידי הכפלת מספר האיים בכל תא בגודל בגורם ההמרה המתאים. גודל אוטומטי הניב 98,832 אובייקטים בסך הכול, עם קוטר ממוצע של צירי x ו-y של 117 מיקרון ו-116 מיקרון, בהתאמה, וסך כולל מוערך של 16,350 IEQ, שהיו תואמים מאוד ל-IEQ ידני שנמדד ב-D0 (ספירמן r = 0.937, p = 0.0048; ראו איור 4A-C).

השלכת תא האי

תמונות של לוח שלם צולמו שעתיים לאחר הטיהור ושוב ביום הראשון (D1), תוך שימוש באותה מתודולוגיה ב"כימות אוטומטי של כל הלוח" להערכת ייצוב מוקדם של האיים ("נשירה"). מספר האובייקטים השתנה ב-0.9% וב-IEQ ב-6.11% מ-2 שעות עד D1 (ראו איור 4D). השוואה זוגית של קוטרי האיים בין D0 ל-D1 הראתה ירידה חציונית מובהקת סטטיסטית של 2 מיקרומטר (מבחן דירוג סימן של וילקוקסון, p = 0.0136, n = 2820). עם זאת, גודל השינוי הקטן ככל הנראה לא יהיה משמעותי ביולוגית או קלינית.

איור 4
איור 4: הערכה כמותית של התפלגות גודל האיים, הקורלציה והנשירה המוקדמת. סיכום גרפי של מדידות איים שהושגו באמצעות ניתוחים ידניים ואוטומטיים. (A) התפלגות גודל האי ביום 0 (D0) המבוססת על כימות ידני על פני תאי IEQ סטנדרטיים שקולים לאיים. (B) התפלגות גודל האי ביום 1 (D1) שנקבעת על ידי מדידות אוטומטיות מבוססות תמונה על פני אותם תאי IEQ סטנדרטיים. (ג) קורלציה של ספירות בין D0 ידני לכימות D1 אוטומטי בין מיכלי הגודל של IEQ. (D) גרף קופסה של התפלגות קוטרי האיים בין D0 ל-D1 למדידות אוטומטיות של אותו לוח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טוהר (תכולת אנדוקרינים לעומת אקסוקרינים)

צביעת דיתיזון (DTZ)

ב-D1, אליקו של איים קטנים (n = 451) צובע ב-DTZ למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר וצולם מיד באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (4× אובייקטיבי; חשיפה של 1/20 שניות). בפיג'י, פיקסלים ברקע הוסרו כך ששטח הפיקסלים שנותר תואם לשטח האי הכולל. אזורים אקסוקריניים שליליים ל-DTZ, שזוהו על ידי ניגודיות צבע כהה יותר, נבחרו ידנית באמצעות כלי לאסו, והאזור בכל אזור עניין נרשם אוטומטית בפיקסלים. טוהר אנדוקריני חושב כאחוז הפיקסלים החיוביים ל-DTZ ביחס לסך פיקסלי האי, מה שהניב טוהר של 98.56 ± 0.38% (איור 5A).

היתכנות וביצועים פונקציונליים

הפרשת אינסולין מונעת גלוקוז (GSIS)

בכל נקודת זמן (D1, D3, D7), נבחרו ביד 15 איים תואמים בגודל והונחו בבארות נפרדות של צלחת 24 בארות, שהוכנו בארבעים. האיים הקטנים דוגרו בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 בבופר קרבס תחת פרוטוקול גירוי גלוקוז נמוך-גבוה-נמוך: תחילה בגלוקוז נמוך (2.8 מ"מ, 60 דקות), ואחר כך בגלוקוז גבוה (16.7 מ"מ, 60 דקות, ראו טבלה 1). חלקי שפכים נאספו בסוף כל תקופת דגירה, וריכוזי האינסולין נמדדו באמצעות בדיקת ELISA של אינסולין לעכברים. מדדי הגירוי חושבו כיחס הפרשת האינסולין במצבים של גלוקוז גבוה לנמוך. מדדי הגירוי היו 9.37, 8.34 ו-6.7 בימים 1, 3 ו-7, בהתאמה, ללא הבדלים משמעותיים (איור 5B).

כתמים חיים/מתים

ב-D1, D3 ו-D7, 15 איים קטנו ונצבעו ביד בערכת הקיימות Live/Dead בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, האיים הוטמעו בתמיסת צביעת Live/Dead למשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, ואז צולמו תחת הגדרות מיקרוסקופ עקביות כדי להבטיח השוואה בין נקודות זמן (4X אובייקטיבי; חשיפה של 1/30 שניות, מסנני טקסס אדום ו-GFP). הכדאיות נמדדה באמצעות סקריפט פייתון המשתמש ב-scikit-image לסגמנטציה של איים ומדידת פלואורסצנציה. האיים זוהו על ידי שילוב ערוצי הפלואורסצנציה הירוקים והאדומים, יישום שיטת הסף של Li ליצירת מסכה בינארית, ושימוש בחלוקת אגן הניקוז להפרדת איים נוגעים. האובייקטים סוננו לפי שטח כדי למנוע פסולת ופריטים. עבור כל אי, הקיימות חושבה כאחוז הצפיפות המשולבת החיים (פיקסלים ירוקים) ביחס לצפיפות המשולבת הכוללת (ירוקים ועוד פיקסלים אדומים). התוצאות הראו עמידות של 68 ± 9% ב-D1, 98.2 ± 0.6% ב-D3, ו-100% ב-D7. דגימת ביקורת חיובית שטופלה ב-70% אתנול במשך 10 דקות הראתה 2.7 ±-7.2% כדאיות (ראו איור 5C-F).

איור 5
איור 5: הערכת טוהר האי, הקיימות ותגובה תפקודית של האיים. תמונות מייצגות וסיכומים כמותיים של מאפייני האיים המבודדים לאורך זמן. (א) תמונה מייצגת של 10× שדה בהיר של איים צבועים בדיתיזון (DTZ), המציגה איים אנדוקריניים מוצבעים באדום ורקמה אקסוקרינית לא צבועה. (B) ערכי הפרשת אינסולין מגובה גלוקוז (GSIS) של מדד גירוי גלוקוז גבוה/גלוקוז נמוך (HG/LG) לימים 1, 3 ו-7. (C-E) תמונות פלואורסצנציה חיות/מתות של איים קטנים ביום 1 (C), יום 3 (D) ויום 7 (E). (F) תמונת פלואורסצנציה חיה/מת של איים בקרה חיובית שטופלו באתנול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

(א) מדיה לשטיפה
רכיבריכוז סופיכמות (mL)
RPMI 1640-500 מ"ל
סרום בקר עוברי10%50 מ"ל
עט-סטרפטוקוק (10,000 U/mL)1%5.5 מ"ל
HEPES25 מ"מ12.5 מ"ל ממלאי 1M
L-גלוטמין2 מילימטר5 מ"ל מקת 200 מ"מ
(ב) מדיה של תרבות האיים
רכיבריכוז סופיכמות (mL או g)
RPMI 1640, ללא גלוקוז-500 מ"ל
סרום בקר עוברי10%50 מ"ל
עט-סטרפטוקוק (10,000 U/mL)1%5.5 מ"ל
HEPES20 מ"מ11 מ"ל מסטוק 1M
נתרן פירובאט1 mM5.5 מ"ל מכלל 100 מ"מ
גלוקוז5.5 מ"מ2.75 מ"ל מבסיס של 200 גרם לליטר
(ג) תמיסת שטיפה של פניצילין-סטרפטומיצין
רכיבריכוז סופיכמות (mL או g)
תמיסת מי מלח, 0.9%-500 מ"ל
פניצילין סטרפטומיצין (10,000 U/mL)2%10 מ"ל
(ד) בופר כיבוי
רכיבריכוז סופיכמות (mL או g)
HBSS-500 מ"ל
סרום בקר עוברי20%100 מ"ל
HEPES (1M)2.50%2.5 מ"ל
(ה) בופר קרבס
רכיבריכוז סופיכמות (mL או g)
dH2O-975 מ"ל
NaCl115 מ"מ6.72 גרם
NaHCO324 מ"מ2.02 גרם
KCl5 מ"מ0.3728 גרם
HEPES (1M)25 מ"מ25 מ"ל
MgCl21 mM0.0952 גרם
BSA0.10%1 גרם
CaCl22.5 מ"מ0.2775 גרם

טבלה 1: רשימת פתרונות. פרטי הרכב והכנה לכל התמיסות המשמשות לאורך פרוטוקול הבידוד והטיהור של האי. כל תת-סעיף מפרט רכיבים, ריכוזים סופיים, כרכי הכנה ומספרי קטלוג. (א) מדיית שטיפה, המשמשת לשטיפה ושטיפת רקמות במהלך העיכול והטיהור. (ב) מדיה לתרבות האיים, המשמשת לתחזוקה וקיימות של האיים לאחר בידוד. (C)תמיסת שטיפה של פניצילין-סטרפטומיצין, משמשת לעיקור ושטיפה של הלבלב שנקטף. (D) בופר הקירור, המשמש לסיום עיכול אנזימטי ולשמירה על חיוניות התא. (ה) קרבס באפר, המשמש במהלך בדיקות הפרשת אינסולין מונעת גלוקוז (GSIS).

מספר הלבלבקולגנאז (15.38 מ"ג/מ"ל)תרמליזין (1 מ"ג/מ"ל)DNAse (100 מ"ג/מ"ל)בופר עבודהבקבוקים של 600 מ"ל לשימושנפח/בקבוק
304.5 מ"ל2.25 מ"ל450 מיקרוליטר450 מ"ל525 מ"ל
243.6 מ"ל1.8 מ"ל360 מיקרוליטר360 מ"ל425 מ"ל
203 מ"ל1.5 מ"ל300 מיקרוליטר300 מ"ל325 מ"ל
162.4 מ"ל1.2 מ"ל240 מיקרוליטר240 מ"ל225 מ"ל
121.8 מ"ל0.9 מ"ל180 מיקרוליטר180 מ"ל225 מ"ל
101.5 מ"ל0.75 מ"ל150 מיקרוליטר150 מ"ל225 מ"ל
סיכום סופי.0.15 מ"ג/מ"ל5 מ"ג/מ"ל0.1 מ"ג/מ"ל

טבלה 2: תמיסת אנזימי עיכול לפי כמות הלבלב. נדרשו נפחים של קולגנאז, תרמליזין ו-DNase I להכנת מדיום דיסוציאציה עובד (WDM) עבור מספר משתנה של לבלב חולדות. הריכוזים הסופיים של כל אנזים מופיעים בתחתית הטבלה.

מספר הלבלבצינורות מספר 50 מ"לנפח/מזרקמספר 1.096 מזרקיםמספר 1.068 מזרקים
3010 צינורות50 מ"ל22
248 צינורות40 מ"ל22
206 שפופרות30 מ"ל22
164 שפופרות40 מ"ל11
124 שפופרות40 מ"ל11
102 צינורות20 מ"ל11

טבלה 3: עומס גרדיאנט לפי כמות הלבלב. מספר צינורות חרוטיים של 50 מ"ל ונפחי גרדיאנט מתאימים הנדרשים לטיהור האיים בהתבסס על מספר הלבלב המעובד.

טווח קוטר האי (מיקרומטר)מספר חלקיקי האי (AI)מקדם המרה IEQIEQ לפי טווח
50-100a* 0.167a * 0.167
101-150b* 0.648b * 0.648
151-200c* 1.685c * 1.685
201-250d* 3.500d * 3,500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10.352
> 350g* 15.833g * 15.833

טבלה 4: המרת שקילות לאיים. המרה של טווחי קוטר האיים למקבילות איים סטנדרטיות (IEQ). הטבלה מפרטת את מיכלי קוטר האיים שנצפו, מספר חלקיקי האיים לכל טווח, מקדם ההמרה המתאים של IEQ לכל טווח גודל, ותרומת IEQ לטווח.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה לבידוד וטיהור איי לבלב מעכברי לואיס. הצלחת השיטה תלויה במספר שלבים קריטיים ששומרים יחד על שלמות ותפקוד האי. בין הגורמים הללו ניתן למנות את הפרפוזיה התוך-דוקטורלית המדויקת והמלאה של הלבלב, ניקוי זהיר של הלבלב המופרז, וזמן העיכול האנזימטי המדויק. פרפוזיה עקבית לאיבר שלם חיונית להשגת התפשטות אחידה של הלבלב ולהבטחת פיזור אחיד של תערובת הקולגנאז-תרמליזין-DNase, הפועלת בהתאמה לעיכול המטריצה החוץ-תאית, לשיפור חדירת האנזימים ולהפחתת צמיגות מתווכת DNA21,22. תת-זרימה עלולה לגרום לעיכול רקמות לא מלא ואובדן חלק משמעותי מהאיים, שכן הרקמה המעכלת מסוימת מסוננת החוצה עם המסננת. באופן דומה, הסרה לא מספקת של רקמת השומן או כלי הדם לפני העיכול עלולה להכניס זיהומים לא-אנדוקריניים שמפחיתים את הטוהר. לבסוף, עיכול ממושך גורם להפרדת איים כתוצאה משבר מופרז של מטריצת חוץ-תאית, בעוד עיכול לא אופטימלי מניב רקמה לא מעוכלת עמידה לעיכול מכני באמצעות מחט עמוד שדרה. שלבים אלו מייצגים את המלכודות הטכניות השכיחות ביותר ויש לעקוב אחריהם בקפידה במהלך ההכשרה והאופטימיזציה.

למרות ששיטה זו תוכננה במיוחד עבור חולדות לואיס, סביר שניתן להתאים אותה לזנים או מינים אחרים באמצעות אופטימיזציה קלה של זמן העיכול ויחס האנזימים 23,24,25,26. חלק מהמעבדות עשויות לבחור להתאים את היחס בין קולגנאז, תרמליזין ו-DNase I במדיום הדיסוציאציה העובד (WDM) כדי למקסם את התפוקה עבור מאפייני האנזים או הרקמות הספציפיים שלהן. לשם כך, המעבדות עשויות לעקוב בקפידה אחרי מדריך שלב אחר שלב של היצרן לאופטימיזציה של אנזימים ורקמות, ובכל המקרים להימנע מהוספת רכיבים כמו 0.1 M EDTA, ציסטאין, מרקפטואתנול, מעכבי פרוטאז, סרום או אלבומין, שכן הם עלולים לעכב פעילות אנזימי קולגנאז, תרמליזין ו-DNase 127. למרות שלא פורסם זמן עבודה מוגדר לתערובת האנזימים לפני הדיסוציאציה, נתונים קודמים מראים כי שימור ממושך בקור של הלבלב משפיע לרעה על תפוקת האיים ותפקוד האיים28. אמפירית, מצאנו שבפרוטוקול שלנו, בידוד מוצלח הושגו באופן עקבי כאשר זמן האיסכמיה הקרה הכולל, המוגדר כמרווח בין הנחת הלבלב הראשון על הקרח לניקוי לבין העברתו לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נשמר מתחת ל-1.5 שעות. אופטימיזציה נוספת של פרמטר זה עשויה להיות מוצדקת בהתאם ליישום המשתמש הקצה.

למרות עמידותו, לפרוטוקול זה יש מספר מגבלות מעשיות וטכניות. ראשית, תערובת האנזימים (קולגנאז, תרמליזין ו-DNase I) וגרדיאנטים של צפיפות חיוניים לפירוק רקמות יעיל ובידוד איים, אך מטילים עלויות משמעותיות. הבחירה שלנו בשילוב האנזימים נבעה מהמאפיינים המבניים של מטריצת הטרקס החוץ-תאי של הלבלב ומהצורך לאזן בין פירוק רקמתי יעיל לשימור שלמות האי. כל רכיב אנזימטי מקדם תפקיד מובחן: קולגנאז מכוון לקולגנים פיברילריים ובסיסיים-ממברנה כדי לשחרר איים קטנים; תרמליזין, פרוטאאז ניטרלי, חותך חלבוני מטריצה לא-קולגניים ומולקולות היצמדות תאים-תאים, ומפחית את החשיפה הנדרשת לקולגנאז; ו-DNase I ממזער צמיגות הנגרמת על ידי DNA המשתחרר מתאים מפורקים 29,30,31. למרות שנוסחאות זולות יותר של אנזימי עיכול זמינות מסחרית, טוהרן משתנה ועלולה לפגוע בביצועים האנזימטיים13,23. בהינתן שקולגנאז מבודד מתרביות חיידקים, צעדי טיהור נוספים מפחיתים זיהום אנדוטוקסין אך מעלים משמעותית את העלותב-13,23.

לגבי קולגנאז, אנו ממליצים על תכשירים עם פעילות של כ-2,000 עד 4,000 יחידות וינש לבקבוק, מה שתומך בדיסוציאציה יעילה במינון מתון תוך הימנעות מעיכול ממושך. ראוי לציין כי התערובת צריכה לכלול יחס מאוזן בין קולגנאז מחלקה I למחלקה II, התואם לשבר קולגנאז II/סך הקולגנאז של כ-0.3-0.5. יחס זה מספק פעילות קולגנוליטית חזקה תוך הגבלת התדרדרות מופרזת של מטריצה חוץ-תאית לא-קולגנית. בנוסף, תערובת הקולגנאז צריכה להיות משופרת ברמת פעילות פרוטאז ניטרלית מתונה (כ-150,000-250,000 יחידות) ו-DNase, מסיבות שכבר הוזכרו.

מבחינת בקרת איכות, כל אצווה צריכה לכלול תיעוד של עומס אנדוטוקסין נמוך (≤50 חלבון EU/mg), טוהר אנזימים גבוה (≥85% על ידי HPLC), ופעילות מאומתת בין כמות, שכן טוהר והרכב האנזים משתנים מאוד בין יצרנים. לבסוף, שינויים בהרכב המגרשים עשויים להשפיע על עקביות העיכול ותפוקת האיים, מה שמחייב ביצוע אימות פנימי ספציפי למגרש. אימות כזה ניתן להשיג על ידי מעקב אחר תנאי העיכול הסטנדרטיים המתוארים בפרוטוקול זה, ולאחר מכן הערכת יעילות העיכול ומורפולוגיית האיים. אינדיקטורים לביצועי אנזימים לא אופטימליים כוללים פירוק רקמות לא שלם, איים עם גבולות לא סדירים או מחוספסים, או הצורך בגזירה מכנית מופרזת להשגת הפרדה, שבמקרה כזה עשויה להיות הכרחית טיטרציה של זמן העיכול.

שיקולים דומים חלים גם על גרדיאנטים של צפיפות. בחרנו גרדיאנט מבוסס פוליסוקרוז, קופולימר לא יוני, הידרופילי מאוד של סוכרוז-אפיכלורוהידרין, שיוצר גרדיאנטים יציבים עד 1.2 גרם למ"ל ויש לו רקורד ארוך בבידוד האיים32,33. יודיקסנול הוא חלופה מאומתת היטב, ומחקרים באיים אנושיים מראים שגרדיאנטים מבוססי יודיקסנול יכולים לשפר את התאוששות האיים תוך שמירה על חיוניות ותפקוד 34,35,36,37. עם זאת, נתוני המכרסמים אינם חד-משמעיים, כאשר חלק מהמחקרים דיווחו על תוצאות טובות יותר באמצעות יודיקסנול ואחרים הראו ביצועים ותפקוד טובים יותר עם גרדיאנטים מבוססי פוליסוכרוז32,35. חשוב לציין, מומלץ להשתמש בפתרונות גרדיאנטים מסחריים ומבוקרי איכות כדי לשפר את השחזוריות בין מעבדות. גרדיאנטים מבוססי פוליסוכרוז זמינים באופן נרחב בצפיפויות אופטימליות לבידוד איים, בעוד שגרדיאנטים של יודיקסנול בדרך כלל מוכנים על ידי דילול פנימי, מה שמוסיף שונות נוספת. מגבלה שנייה היא שקציר כירורגי דורש רמת מיומנות טכנית גבוהה, במיוחד עבור פרפוזיה תוך-דוקטלית דרך הסוגר של אודי וכריתת הלבלב המהירה. אפילו עיכובים קלים או חוסר יישור עלולים לגרום לנזק לרקמה, דליפה, פרפוזיה לא אחידה או איסכמיה חמה ממושכת, מה שעלול לפגוע בתפוקת האי ובחיוניותו. כדי להקל על מגבלה זו, הפרוטוקול כולל תיאורים פרוצדורליים מפורטים ועזרים גרפיים מקוריים עם סימני אנטומיה מקודדים בצבעים כדי להקל על ההבנה. מפעילים חדשים מעודדים להתרגל לטכניקת הפרפוזיה לפני ביצוע בידוד מלא, ומומלץ לתרגל על גופות לפני ניסיון קציר חי.

שלישית, למקסימום יעילות, פרוטוקול זה דורש עבודת צוות מתואמת. במהלך קצירת הלבלב והעיכול האנזימטי, נדרשים בדרך כלל שלושה מפעילים מיומנים: אחד המבצע ניתוח סטרילי, אחד שמנקה את הלבלב בתנאים סטריליים, ואחד שמסיר ומחסל בעלי חיים בתנאים לא סטריליים. לאחר העיכול, שלבי טיהור במורד הזרם יכולים להתבצע בדרך כלל על ידי פחות מפעילים לאחר השגת מיומנות. בעוד שתיאום זה מייצג דרישה לוגיסטית ראשונית, הוא מאפשר בידוד של איים קטנים רבים ממספר בעלי חיים בפרק זמן קצר יחסית, ומשפר את התפוקה הכוללת לעומת תהליכי עבודה פחות מתואמים. למרות שפרוטוקול זה תובעני טכנית ודורש משאבים, מגבלות אלו משותפות לכל שיטות בידוד האיים. על ידי הדגשת תנאי עיכול סטנדרטיים, אימון מובנה וביצוע מתואם, גישה עתירה זו יכולה להפחית זמן ועבודה לכל בידוד ולהניב תוצאות עקביות וניתנות לשחזור כאשר מבוצעת על ידי צוות מיומן.

בהשוואה לפרוטוקולי בידוד איים מכרסמים קונבנציונליים, שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים בתפוקה, שחזוריות ועקביות. עיכול אורגני יחיד מסורתי מסתמכים במידה רבה על פריטה ידנית ולעיתים מניבים טוהר משתנה13. לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו עושה שימוש בעיכול משותף וטיהור צפיפות עם גרדיאנט, ומפחית משמעותית את זמן ההכנה ואת השונות בין המדגימות תוך שמירה על חיוניות גבוהה של האיים ותגובה פונקציונלית גבוהה. האיים המבודדים אופיינו באופן מקיף מבחינת מורפולוגיה (צביעת דיתיזון), חיוניות (בדיקה חיה/מתה) ותפקוד (הפרשת אינסולין מונעת גלוקוז), מה שמאשר את עמידות השיטה. ביחד, תהליך עבודה סטנדרטי זה מאפשר יצירת שפע של הכנות איים נקיות ופונקציונליות המתאימים ליישומים במורד הזרם, כולל עטיפה, השתלה ומודלים מיקרופיזיולוגיים 38,39,40. חשוב לציין כי איי עכברוש לואיס שבודדו בטכניקה זו הפכו את הסוכרת במודלים פרה-קליניים, מה שמדגיש את הרלוונטיות התרגומית של גישה שחזורית וניתנת להרחבה זו41.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.G. הוא מייסד שותף ויועץ מדעי ראשי של Continuity Biosciences, LLC. A.G., J.P-M. ו-C.Y.X.C. הם ממציאי קניין רוחני המורשים על ידי Continuity Biosciences, LLC. כל שאר המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) ו-NIH NIDDK R01DK132104 (A.G.), Breakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B (AG) ו-SRA-2022-1224-S-B (A.G., N.K.), וקרן ויויאן ל. סמית'.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
21 G x 2 אינץ'. מחט BD PrecisionGlideBD305129
500 ומיקרו; מסגרת ברונזה ומסך נירוסטה 304, בקוטר 3 אינץ' ועומק 1 אינץ' (מספר מסננת 35)מקמאסטר-קאר34735K525
מזרקי אייר-טייט סטריליים, מנעול לוארפישר סיינטיפיק14-817-178
Biogel PI UltraTouch MMö אינליקה42665
מספריים בון; ישר; נקודות חדות; אורך להב 15 מ"מ; אורך כולל 3 1/2"רובוזRS-5840
בריינטרי סיינטיפיק ג'רמינטור 500 סטריל יבשפישר סיינטיפיקNC9956482
סדרת Cell-IQ 5.8 רגל מעוקב. חממת מעבדת CO2PHCBIMCO-170AICUVHL-PA
צלחת תרבות קורנינג 100 מ"מ שלא טופלה ב-TCקורנינג430591
סרום בקר עוברי קורנינג, 500 מ"ל, רגיל, נבדק בטיחות USDA (מושבת חום)קורנינג35011CV
שיפוע אי קורנינג 1.069 (צפיפות 1.069 גרם/סמינמ<סופה>3< לסופה>)קורנינג99-815-CISנדרש בקשה מיוחדת מהחברה
שיפוע האי קורנינג 1.096 (צפיפות 1.096 גרם/סמינמ<שאפ>3< לסופה>)קורנינג99-691-CISנדרש בקשה מיוחדת מהחברה
שיפוע אי קורנינג 1.108 (צפיפות 1.108 גרם/סמינ<שפירה>3< לעל-סוף>)קורנינג99-692-CISנדרש בקשה מיוחדת מהחברה
פדים תחתונים של Covidien Tendersorbפישר סיינטיפיק22-225-102
DNase דרגה II Iרוש10104159001
פלקון  צינורות צנטריפוגה חרוטיים בבהירות גבוהה בנפח 50 מ"לפישר סיינטיפיק14-432-22
נייר אלומיניום פישרברנד, גליל ברוחב סטנדרטיפישר סיינטיפיק01-213-100
פישרברנד  ספוגי גזה לא ארוגיםפישר סיינטיפיק22-028-559
כוסות זכוכית רב-פעמיות כבדות של פישרברנד בצורת צורה נמוכהפישר סיינטיפיקFB101600
מירקוסקופ פלואורסצנצי  BZ-X810קיינסBZ-X810
תמיסת גלוקוזגיבקוA2494001
מחזיק מחט מיקרו של Halseyכלי המדע המדויק12500-12
HBSS, סידן, מגנזיום, ללא פנול אדוםגיבקו14025092
HEPES (1M)גיבקו15630080
מלקחיים המוסטטיים Classic Crile באורך 5-1/2 אינץ'מקסון1231217
מלקחיים של הדסון (אוולד)רובוזRS-5238
מחט היפודרמית מונוג'קט באורך 1-1/2 אינץ' 16 גייג' קיר רגיל ללא בטיחותמקסון43481
L-גלוטמין (200 מ"מ)גיבקו25030081
Liberase T-Flex, דרגת מחקררוש5989132001
ערכת חיות/ציטוטוקסיות LIVE/DEAD, לתאים יונקיםInvitrogen  L3224
חבילת התוכנה של MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
משאבת מזרקים מתוכנתת דו-ערוצית NE-4000SyringePumpNE-4000-US
מחט, HYPOSTR DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINTמקסון408877
תרבית תאי נונק/צלחות פטריתרמו-מדעי174926
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך Olympus CKX41אולימפוסCKX41-B
PBS, pH 7.4גיבקו10010023
פניצילין' סטרפטומיצין (10,000 U/mL)גיבקו15140122
RPMI 1640גיבקו11875093
RPMI 1640, ללא גלוקוזגיבקו11879020
נתרן פירובט (100 מ"מ)גיבקו11360070
נתרן פירובט (מאגר 100 מ"מ)גיבקו11360070
סורבל ST 16Rתרמו-מדעי75004381
מחט מזרקים מנירוסטה 304מיליפור סיגמאZ117013-1EA
וילון ניתוח, חד-פעמי, 36 אינץ' X 100 יארדקובטרוס10408
מספריים כירורגיים - ToughCutכלי המדע המדויק14054-13
מלקחי תחבושת אגודל 4.5 אינץ' משוננים עדינים ברוחב קצה 1.3 מ"מרובוזRS-8120
צינור צנטריפוגה Thermo Scientific Nunc 200 מ"לתרמו-מדעי14-962-17
מתאמי וריפדות לבקבוקי צנטריפוגה Thermo Scientific Nuncתרמו-מדעי12-565-283B
TSDUB15 אמבט מים לנענוע ב-15 ליטר דבנוףפישר סיינטיפיק300610298
TX-400 רוטור דלי מתנדנד בנפח 4 x 400 מ"לתרמו-מדעי75003181
טייגון S-50-HLטייגוןAAXoooo3
ערכת ELISA לאינסולין עכברוש רגיש במיוחדכימיה קריסטלית90060

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grattoni, A., et al. Harnessing cellular therapeutics for type 1 diabetes mellitus: progress, challenges, and the road ahead. Nat Rev Endocrinol. 21 (1), 14-30 (2025).
  2. Páez-Mayorga, J., et al. Emerging strategies for β cell transplantation to treat type 1 diabetes mellitus. Cell Transplant. 31, 963689721004(2022).
  3. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets and its relevance to β-cell function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  4. Brissova, M., et al. Pancreatic islet microvasculature and blood flow. J Clin Invest. 124 (4), 1871-1883 (2014).
  5. Jiang, F. X., Morahan, G. Pancreatic islet architecture and function. Cell Death Discov. 10, 170(2024).
  6. Sato, Y., et al. Hypoxia induces β-cell apoptosis and functional suppression in isolated islets. PLoS One. 9 (12), e114868(2014).
  7. Tiedge, M., Lortz, S., Drinkgern, J., Lenzen, S. Relation between antioxidant enzyme gene expression and antioxidative defense status of insulin-producing cells. Diabetes. 46 (11), 1733-1742 (1997).
  8. Ichii, H., et al. Shipment of human islets for transplantation. Am J Transplant. 7 (4), 1010-1020 (2007).
  9. Carobbio, S., et al. Rapid GSIS kinetics in freshly isolated mouse islets. Diabetologia. 47 (9), 1652-1662 (2004).
  10. Zawalich, W. S., Zawalich, K. C., Kelley, G. G. Immediate perifusion of fresh rat and mouse islets. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (2), E444-E450 (2008).
  11. Wassmer, C. H., et al. Clinical use of freshly isolated islets transplanted within 48 h. Transplant Proc. 53 (6), 1907-1912 (2021).
  12. Tai, D. S., et al. Immediate autotransplantation of islets following total pancreatectomy. JAMA Surg. 150 (5), 472-479 (2015).
  13. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  14. Emamaullee, J. A., et al. Lewis rats in transplantation studies. Diabetes. 65 (5), 1350-1359 (2016).
  15. de Groot, M., et al. Rat islet isolation yield and function are donor strain dependent. Lab Anim. 38 (2), 200-206 (2004).
  16. Moazenchi, A. M., et al. Strain variability in islet yield and isolation. Islets. 2 (5), 283-289 (2010).
  17. Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. Isolation variability limits reproducibility in rat islet studies. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  18. Stehno-Bittel, L. The flaws and future of islet volume measurements. Cell Transplant. 27 (4), 571-578 (2018).
  19. Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets. Cell Transplant. 18 (6), 611-620 (2009).
  20. Papas, K. K., et al. Islet assessment for transplantation. Cell Transplant. 18 (6), 519-528 (2009).
  21. Dono, K., et al. Low temperature collagenase digestion for islet isolation from 48-hour cold-preserved rat pancreas. Transplantation. 57 (1), 22-26 (1994).
  22. Shapiro, A. M. J., et al. High yield of rodent islets with intraductal collagenase distension and warm incubation. Cell Transplant. 5 (6), 631-638 (1996).
  23. Corbin, K. L., Hughes, J. W., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment revisited. Biol Proced Online. 23, 10(2021).
  24. de Haan, B. J., et al. Factors influencing isolation of functional pancreatic rat islets. Pancreas. 29 (1), e15-e22 (2004).
  25. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in baboons treated with humanized anti-CD154. Diabetes. 48 (7), 1473-1481 (1999).
  26. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (14), 8132-8137 (1999).
  27. Liberase T-Flex Research Grade - Method Sheet. eLabDoc. , Roche Diagnostics GmbH. (2025).
  28. Miyazaki, Y., et al. Strategy towards tailored donor tissue-specific pancreatic islet isolation. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  29. Cross, S. E., et al. Key matrix proteins within the pancreatic islet basement membrane are differentially digested during human islet isolation. Am J Transplant. 17 (2), 451-461 (2017).
  30. O'Gorman, D., Kin, T., Pawlick, R., Imes, S., Senior, P. A., Shapiro, A. J. Clinical islet isolation outcomes with a highly purified neutral protease for pancreas dissociation. Islets. 5 (3), 111-115 (2013).
  31. Wang, W., et al. Adjustment of digestion enzyme composition improves islet isolation outcome from marginal grade human donor pancreata. Cell Tissue Bank. 8, 187-194 (2007).
  32. McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3 (4), 144-149 (2011).
  33. Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes. 37 (4), 413-420 (1988).
  34. BenchChem Technical Support Team. An in-depth technical guide to cell separation using iodixanol. BenchChem. , (2026).
  35. Dellê, H., Saito, M. H., Yoshimoto, P. M., Noronha, I. L. The use of iodixanol for the purification of rat pancreatic islets. Transplant Proc. 39 (2), 467-469 (2007).
  36. Noguchi, H., et al. Iodixanol-controlled density gradient during islet purification improves recovery rate in human islet isolation. Transplantation. 87 (11), 1629-1635 (2009).
  37. Min, T., et al. Superiority of Visipaque (iodixanol)-controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification. Transplant Proc. 42 (5), 1825-1829 (2010).
  38. Paez-Mayorga, J., et al. Neovascularized implantable cell homing encapsulation platform with tunable local immunosuppressant delivery for allogeneic cell transplantation. Biomaterials. 257, 120232(2020).
  39. Paez-Mayorga, J., et al. Implantable niche with local immunosuppression for islet allotransplantation achieves type 1 diabetes reversal in rats. Nat Commun. 13, 7951(2022).
  40. Piemonti, L., et al. Islet transplantation. Endotext. , (2022).
  41. Patel, S. N., et al. The foundation for engineering a pancreatic islet niche. Front Endocrinol. 13, 881525(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים