הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מערכת תרביות דו-ממדית ותלת-ממדית חדשנית ללא סרום, הכוללת שתי מולקולות קטנות לגידול תאי אפיתל של בלוטות הדקה בעכברים

257 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70438

⸱

10 בפברואר 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

במאמר זה

סיכום

מערכת תרביות חדשנית ללא סרום המשתמשת בשילוב מולקולות קטנות 2C (Y27632 ו-SB431542) הוכנסה להרחבת תאי האפיתל של בלוטות הדמעות (LGECs) ביעילות בתרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, ומאפשרת שליטה מדויקת בהתרבות ובהתמיינותם.

תקציר

תפקוד לקוי של בלוטות הדם (LG) הוא גורם מרכזי למחלות עיניים יבשות חסרות מים, וטיפולים מבוססי תאים והנדסת רקמות מראים פוטנציאל משמעותי למצב זה. עם זאת, הזמינות המוגבלת של מספיק תאי זרע שגודלו בתנאים ללא סרום פגעה ביישום נרחב שלהם. במחקר זה פיתחנו מערכת תרבית חדשה ללא סרום תוך שימוש בשתי מולקולות קטנות, Y27632 ו-SB431542 (2C), להרחבת תאי האפיתל של LG (LGECs) ביעילות. בתרבית ראשונית דו-ממדית של LGECs, LGs בודדו מעכברים בני 6-8 שבועות ועוכולו אנזימטית באמצעות Dispase II ו-Collagenase A. תליית התאים שנוצרה נזרעה לכלי תרבית בצפיפות של 7,500 תאים/סמ"ר וגודלה ב-2C למשך 12-14 ימים. כאשר המפגש התאים הגיע ל-80-90%, החלה תת-תרבית ביחס של 1:2. לתרבית תלת-ממדית, 10,000 LGECs P1 הושמו מחדש ב-10 מיקרוליטר של 2C ו-10 מיקרוליטר ג'ל מטריצה, ואז זרעו במרכז פלטת 24 בארות. לאחר תקופת התגבשות של 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נוספו 600 מיקרוליטר של 2 מעלות צלזיוס להמשך הגידול. לצורך הבחנה, הספרואידים התלת-ממדיים גודלו עם 2C למשך 7 ימים, לאחר מכן הסרת 2C והמשך תרבית למשך 7 ימים נוספים. LGECs שגודלו עם 2C הציגו התרבות גבוהה, עם ביטוי מוגבר של סמני הגבעול וההתרבות (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0.0011, 0.0002, 0.0012, 0.0003, 0.0014, בהתאמה]), ושמרו על מורפולוגיה ויכולת התרבות גם לאחר עשרה מעברים. יתרה מזאת, בתנאים תלת-ממדיים, LGECs יצרו ספרואידים בעלי מאפייני גזע/אב קדמון, שהתבדלו עוד יותר למבנים מיקרו-בלוטותיים המכילים מספר סוגי תאי LG (AQP5, K19, α-SMA חיובי) ותפקודי הפרשה בוגרים לאחר הסרת 2C. גישה זו צפויה לספק מקור יציב לתאי זרע להנדסת רקמות ולהציע מודל חדש במבחנה לחקר פיזיולוגיית LG.

מבוא

בלוטת הדמעות (LG) חיונית ליצירת שכבת המים של שכבת הדמע, שהיא חיונית לשמירה על הומאוסטזיס פני העיניים1. תפקוד לקוי של ה-LG, הנגרם מפציעה או דלקת, מוביל למחלת יובש בעין (ADDE) חסרת מים (ADDE). מצב זה עלול להוביל לדלקת חמורה על פני העיניים, מחלת קרנית כרונית, ובמקרים חמורים לאובדן ראייה קבוע2. הטיפולים הנוכחיים ל-ADDE מנהלים בעיקר את התסמינים, מבלי לטפל בתפקוד הבלוטות הבסיסי, שמגביל את יעילותם לטווח הארוך1. פיתוח טיפולים ממוקדים לתפקוד לקוי של LG מציב מספר אתגרים, כולל היעדר מודלים פשוטים וארוכי טווח במבחנה, שמגבילים את הבנת הפתופיזיולוגיה של LG ומעכבים את פיתוח טיפולים יעילים. בעוד שהשתלת תאים הראתה פוטנציאל בקידום התחדשות LG, יכולת ההתרחבות המוגבלת של תאים במבחנה ומורכבות מערכות התרבית הקיימות מציבות מכשולים משמעותיים ליישום קליני 1,3. לכן, הקמת מערכת תרבית פשוטה וארוכת טווח ל-LGs בוגרים היא חיונית לקידום הבנת הפיזיולוגיה והפתולוגיה של LG, וכן לספק מקור אמין לתאי גזע/אב LG לתיקון והתחדשות פציעות LG.

מערכות תרביות חוץ-גופיות קיימות עבור LG השיגו התקדמות משמעותית, אך עדיין מתמודדות עם מגבלות בולטות. רבות מהשיטות הללו מסתמכות על מדיום מוסיפים סרום, מה שמוביל למספר בעיות כמו שונות בין אצווה, רכיבים לא מוגדרים, וסיכון לזיהום בפיברובלסטים או בתאי מזנכימיה 4,5,6,7,8. יתרה מזאת, מערכות מבוססות סרום אינן מתאימות לחקר המנגנונים הפתוגניים של מחלות LG ומהוות אתגרים לטיפולי השתלת תאים בשל סיכוני דחייה חיסוניים פוטנציאליים9. בתגובה למגבלות אלו, פותחו מספר שיטות ללא סרום לגידול תאי אפיתל LG (LGECs) הן מעכברים והן מבני אדם. לדוגמה, Ueda ואחרים השתמשו בהצלחה בשיטה ללא סרום לגידול LGECs מעכברים שזה עתה נולדו10. עם זאת, שיטה זו הוגבלה בשל חוסר היכולת להעביר את התאים דרך תת-תרביות והצורך במספר רב של בלוטות ניאונטליות כדי לקבל מספיק LGECs. באופן דומה, קוביאשי ואחרים פיתחו מערכת תרבית ללא סרום עם רעלן כולרה, אך נתקלו בקשיים בשמירה על המורפולוגיה התאית במהלך הקטעה-11. ההתקדמות האחרונה כוללת את פיתוח מערכת תרבית תלת-ממדית לתאי גזע LG בעכברים ועל מערכת תרביות האורגנית של באנייר-הלאואט ואח' עבור עכברים ובני אדם 12,13,14,15. עם זאת, מערכות אלו מסתמכות על נוסחאות מדיה מורכבות עם מולקולות קטנות מרובות, גורמי גדילה ותוספים, מה שמסבך את תהליך התרבית ומגביל את ההרחבה. אתגרים אלו מדגישים את הצורך במערכת תרביות פשוטה ויעילה ללא סרום, שיכולה להקל על הרחבה יעילה של LGECs, תוך שמירה על תכונות רב-תרבותיות וגזע/אב קדמון ליישומים טיפוליים ומחקרים נוספים.

בשנים האחרונות, ההתפתחות המהירה של תכנות כימי מתווך מולקולות קטנות הציגה אסטרטגיות חדשות לשמירה והרחבת תאים בוגרים ראשוניים במבחנה16. על ידי ויסות מסלולי איתות תוך-תאי, אינטראקציות בין תא למטריקס, והיצמדות התא, מולקולות קטנות משפרות משמעותית את התרבות התא ופלסטיות, משפרות את יעילות התפשטות התא ושליטה בגורל17. בשל הייצור המבוקר, האימונוגניות הנמוכה והאינטגרציה הלא-גנומית, מולקולות קטנות אידיאליות לבניית מערכות חוץ גופיות להרחבת תאי אפיתל בוגרים16. שילובים של מולקולות קטנות שונות הוכחו כיעילים בשמירה יעילה על התרחבות חוץ גופית של סוגי תאים ראשוניים שונים, כולל תאי גזע אפיתל של עור, קרנית ולחמית 18,19,20. לכן, פיתוח אסטרטגיה מבוססת מולקולות קטנות להרחבת LGECs מראה פוטנציאל ליישומים עתידיים הן במחקר והן בסביבות טיפוליות.

מערכת תרבית פשוטה ויעילה ללא סרום פותחה בפרוטוקול זה, תוך שימוש בשתי מולקולות קטנות, Y27632 ו-SB431542 (2C), לתמיכה בהרחבת LGECs. על ידי שילוב היתרונות של שתי המולקולות הללו, הוקמה מערכת נטולת סרום הן לתרביות דו-ממדיות והן לתלת-ממד. LGECs שגודלו עם 2C הראו יכולת רבייה גבוהה ותכונות תאי גזע/אב, תוך שמירה על מורפולוגיית תאי אפיתל טיפוסית לאחר לפחות 10 מעברים במבחנה. בתרבית התלת-ממדית, LGECs לא רק שמרו על תכונות תאי גזע/אב אלא גם הראו יכולת להתמיין למבנים מפרשים לאחר הסרת 2C, ויצרו מבנים מיקרו-בלוטותיים עם פונקציה הפרשה. מערכת ללא סרום זו מתאימה למודלים מבחנתיים של פיזיולוגיה ופתולוגיה של LG, ומספקת גם מקור משמעותי לתאים להנדסת רקמות LG ויישומים רגנרטיביים. עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי מספק רק חקירה ראשונית של תרבות תלת-ממדית. תרבות תלת-ממד לטווח ארוך היא מעבר להיקף המחקר הזה בשלב זה. חשוב לציין ששיטה זו מיועדת במיוחד ל-LGEC של עכברים בוגרים וייתכן שלא תהיה רלוונטית למינים אחרים ללא אופטימיזציה נוספת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות האגודה למחקר בראייה ואופטלמולוגיה (ARVO) וועדת האתיקה הניסיונית של בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ילין ואוניברסיטת שיאמן.

הערה: כל הליכי תרבית התאים בוצעו בארון בטיחות ביולוגית מחוטא ב-UV בחדר הניתוח של התא.

1. התרבות הראשונית של LGECs

  1. בידוד רקמת LG
    1. הורד את עכברי C57BL/6J (בני 6-8 שבועות) הרדימו על ידי פריקת צוואר הרחם וחיטאו את אזור האוזן (סביב ה-LG) עם 75% אתנול כדי למנוע זיהום.
    2. בצע חתך מהקנתוס החיצוני אל העור מתחת לאוזן כדי לחשוף את ה-LG. באמצעות מלקחיים ומספריים חלקים סטריליים, הפריד בזהירות את ה-LG מהרקמה הסובבת (בלוטות הפרוטיד ורקמת החיבור) תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי לקבל את ה-LG.
    3. הניחו את ה-LG במדיום איסוף רקמות מקורר מראש (DMEM עם 10% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין) בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, תוך שמירה על הרקמה על קרח כדי למזער את ההתפרקות.
  2. הכנת רקמות
    1. העבר את ה-LGs למדיום איסוף רקמות קרות חדש בצלחת בגודל 3.5 ס"מ.
    2. הסר את שארית הפרווה של העכברים, ואז קילף את קפסולת הרקמה המחברת שמקיפה את ה-LGs. בודד את רקמת הבלוטות באמצעות מלקחיים חלקים להסרת רקמת החיבור בין הלובולות.
      הערה: ודאו שהקפסולה שעל פני השטח של ה-LG והרקמה המחברת בין הלובולות מוסרות היטב כדי לחשוף את התעלות שבין הלובולות, מה שיקל על חדירת תמיסת העיכול בתהליך העיכול הבא.
    3. העבר את הרקמה למדיום איסוף חדש ושטוף במשך 5-10 דקות כדי למנוע זיהום.
  3. עיכול אנזימטי
    1. הניחו את ה-LG בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל תמיסת עיכול (מדיום ללא סרום עם 2 מ"ג/מ"ל דיספאזה II ו-2 מ"ג/מ"ל קולגנאז A). (טבלה משלימה 1).
      הערה: נדרש 1 מ"ל תמיסת עיכול ל-4 LGs.
    2. נתח דק את רקמת ה-LG באמצעות מיקרוסיסורים לחתיכות קטנות (כ-0.5-1 מ"מ מעוקב) בתוך הצינור.
    3. דגרו את צינור המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 2.5-3 שעות. כל 30-60 דקות, ערבבו בעדינות את הרקמה בתמיסת העיכול כדי להבטיח עיכול אנזימטי יסודי.
  4. בידוד וקציר של LGECs
    1. נער את צינור המיקרוצנטריפוגה מספר פעמים לאחר סיום זמן העיכול. פיפט את תמיסת העיכול מספר פעמים כדי לשבור את הרקמה לתאים בודדים או לגושים קטנים של תאים. התבונן תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את התקדמות העיכול.
      הערה: כאשר לא נותרו חלקיקים נראים לעין בתמיסת העיכול ומספר רב של תאים בודדים, וכן אגרגטים תאים דמויי תעלות, נצפים תחת המיקרוסקופ, עצרו את תהליך העיכול.
    2. צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 300 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואז זרקו את מדיום העיכול.
    3. החזירו את כדור התא ל-1 מ"ל DPBS סטרילי וצנטריפוגה שוב ב-1000 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את שאר האנזימים בעיכול.
    4. חזור על שלב 1.4.3, הסר את הסופרנאנט, והחזיר את כדור התא ל-500 מיקרוליטר של חומר חופשי מסרום.
  5. זריעת LGECs וגידול ראשוני
    1. הכינו את מדיום התרבית של LGEC על ידי הוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-2C (10 מיקרומום Y27632 ו-10 מיקרומום SB431542). (טבלה משלימה 1)
    2. זרע את התאים ללוחות תרבית סטנדרטיים לא מטופלים של 24 בארות בצפיפות של 7.5 x 10³ תאים לסמ"ר באמצעות מדיום 2C ללא סרום.
    3. לאחר הזרעה, טפחו בעדינות על קצוות צלחת התרבית כדי להבטיח חלוקה אחידה של התאים. הניחו את הפלטה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
    4. שנה את מדיום התרבות בפעם הראשונה 72 שעות אחרי הזרעה. לאחר מכן, החלף את המדיום כל 2-3 ימים.
      הערה: הימנעו מהפרעה לתרבות במהלך 72 השעות הראשונות. לשינוי מדיום ראשון, אל תשטוף את התאים עם DPBS. פשוט הסר את המדיום הישן והוסיף מדיום טרי.

2. תת-תרבות של LGECs

הערה: תת-תרבית כאשר מפגש התאים מגיע ל-80-90%, דבר שמתרחש בדרך כלל כ-14 ימים לאחר התרבית הראשונית.

  1. הסר את מדיום התרבית ושוטף בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS סטרילי.
  2. הוסיפו 250 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 10-15 דקות. כאשר החיבורים ההדוקים מתנתקים והתאים מעגלים כלפי מעלה, הוסף נפח שווה של תמיסת מעכב טריפסין מוגדרת כדי לסיים את העיכול.
    הערה: אם נצפים תאים שטוחים וגדולים עם דבק במהלך התרבית הראשונית, יש לטפל בתרבית עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות כדי להסיר את התאים ההטרוגניים הללו. לאחר מכן, טפלו שוב בתרבית עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות נוספות לעיכול נוסף ולקבל אוכלוסייה טהורה יותר של LGECs למעבר הבא.
  3. מערבבים את מתלי התא על ידי פיפטינג עם פיפטה של 1 מ"ל, ואז העבירו לצינור צנטריפוגה ובצנטריפוגה של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של 1000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את הסופרנטנט.
  4. שטוף את התאים שוב עם DPBS סטרילי וצנטריפוגה כדי לאסוף את ה-LGECs.
  5. החזירו את ה-LGECs לתרבות 2C וזרעו ביחס של 1:2 לתת-תרבית. ערבבו בעדינות את התאים על ידי ניעור צלחת התרבית ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
    הערה: תת-גידול ביחס של 1:2 אומר שכאשר המפגש של התאים מגיע ל-80-90%, ה-LGECs מתעכלים מלוח באר אחד ומפוזרים באופן שווה לשתי לוחות באר חדשים.
  6. החלף את המדיום ביום השלישי לאחר הזריעה, ואז החלף את המדיום כל 2-3 ימים, תלוי במצב התא.
  7. התבוננו במורפולוגיית התאים מדי יום תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך ותיעדו עם תמונות.

3. תרבות תלת-ממדית (תלת-ממדית) של LGECs

הערה: ניסוי התרביות התלת-ממדית משתמש ב-LGEC מסוג P1. כאשר ה-LGEC של P1 מגיעים למפגש של 80-90% לאחר 7 ימי תרבית עם 2C, הם משמשים לתרבות תלת-ממדית.

  1. שלבי הכנה
    1. העבר ג'ל מטריצה (טבלה משלימה 1) ממקפיא בטמפרטורה של -20°C למקרר בטמפרטורה של 4°C להפשרה במהלך הלילה.
    2. הניחו את קצות הפיפטה הנדרשים במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20°C כדי להבטיח קירור מוקדם תקין.
    3. חמם מראש את צלחת התרביות בת 24 הבארות על ידי הנחתה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 במשך שעתיים לפני תחילת התרבית התלת-ממדית.
    4. הכינו מקרר והניחו בה כמה צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לקירור מוקדם. חטא את תיבת המקרר בארון בטיחות ביולוגית לפני השימוש.
  2. תרבות תלת-ממדית של LGECs
    1. השגת LGECs P1, כפי שמתואר בשלבים 2.1 עד 2.4.
    2. החזירו את כדור התא למרחק תרבית של 2C ומכוונים את צפיפות התא ל-1 × 10⁴ תאים ל-10 מיקרוליטר.
    3. קחו את ג'ל המטריצה המופשר מהמקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואת קצות הפיפטה המקוררים מראש מהמקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס, והניחו אותם בתיבת הקרח בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
    4. הסר את צלחת התרבית המחוממת מראש עם 24 בארות מהאינקובטור והנח אותה בארון הבטיחות הביולוגית.
    5. הוסיפו נפח מתאים של מתליית התא, מעורבבים עם ג'ל מטריצה ביחס של 1:1, באמצעות קצות פיפטה מקוררים מראש. ערבבו בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד.
    6. פיפט 20 מיקרוליטר של התערובת מהשלב 3.2.5 בזהירות למרכז כל באר של לוח 24 בארות מחומם מראש.
    7. הפוך את הפלטה ודגר אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל המטריצה להתקשות.
    8. לאחר שהג'ל המטריצי התקשה, הוסף 600 מיקרוליטר של מדיום תרבית 2C לכל באר.
    9. דגרו את צלחת הגידול באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 למשך 14 ימים. החלף את המדיום ביום השלישי אחרי הזריעה וכל 2-3 ימים לאחר מכן, תלוי במצב התא.
    10. התבוננו ביצירת כדורים תלת-ממדיים מדי יום תחת מיקרוסקופ קונטרסט פאזה הפוך וצילמו תמונות לתיעוד.
  3. הבחנה בין ספרואידים תלת-ממדיים של LGEC
    1. ספרואידים תלת-ממדיים של LGEC כפי שמתואר בשלב 3.2.
    2. לאחר 7 ימים של תרבית, הסר את מדיום התרבית 2C ושוטף בעדינות את התאים פעמיים עם DPBS כדי להסיר את שאריות 2C. היזהר לא להפריע לג'ל המטריקס.
    3. הוסף מדיום ללא סרום ללא 2C (Null) והמשך תרבית למשך 7 ימים נוספים ליצירת התמיינות.
    4. החלף את המדיום כל 2-3 ימים במהלך תקופת התרבות.
    5. התבוננו בשינויים המורפולוגיים של הספרואידים התלת-ממדיים המושרים מדי יום תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך וצילמו תמונות לתיעוד.

4. הטמעה וחתך קפוא של ספרואידים תלת-ממדיים של LGEC מופרדים

הערה: התמיינות של ספרואידים תלת-ממדיים מתבצעת כפי שמתואר בסעיף 3.3. לאחר 7 ימים של התמיינות, יש לבצע את השלבים הבאים להטמעת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) ולהקפאת הספרואידים התלת-ממדיים המופרזים.

  1. שאפו את מדיום התרבות לאורך קצוות הבאר. שטוף בעדינות את הספרואידים המובחנים שלוש פעמים עם DPBS סטרילי.
  2. הוסיפו 1 מ״ל של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) לבאר בארון בטיחות ביולוגית או מכסה אדים וקבע את הספרואידים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  3. שטפו את הספרואידים בעדינות שלוש פעמים עם DPBS סטרילי, כל שטיפה נמשכת 10 דקות, כדי להסיר את הקיבוע.
  4. השתמשו במרית כדי לגרד בזהירות את מבנה הג'ל התלת-ממדי בצורת מטריצת ספרואיד, בצורת כיפה ולהעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 5 מ"ל המכיל תמיסת סוכרוז של 20%.
  5. דגרו את הצינור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמבנה הכיפה מתיישב בתחתית הצינור.
  6. הסר את מבנה הכיפה מתמיסת הסוכרוז, הסר בזהירות כל שאריות סוכרוז, והטמיע אותו בתרכובת OCT. הקפיאו בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
  7. לפני הצביעה, יש להכין חתכים בעובי 10 מיקרון באמצעות מיקרוטום קפוא.

5. זיהוי פונקציית הפרשה של כדורי LGEC תלת-ממדיים מופרדים

  1. איסוף דגימות
    1. השרה התמיינות של ספרואידים תלת-ממדיים כפי שמתואר בסעיף 3.3.
    2. לאחר 7 ימים של התמיינות, הסר את מדיום התרבית ושוטף את הספרואידים התלת-ממדיים שלוש פעמים עם DPBS.
    3. הוסף 500 מיקרוליטר מדיום ללא סרום ללא 2 מעלות צלזיוס ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך שעתיים.
    4. אסוף את מדיום התרבית והעבר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל כדגימת בסיס למדידת ריכוז לקטופרין (LTF) לפני גירוי פילוקרפין.
    5. שטוף את הספרואידים התלת-ממדיים בעדינות שלוש פעמים עם DPBS סטרילי.
    6. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום ללא סרום המכיל 1 מיקרוגרם/מ"ל פילוקרפין, ודוגר את הספרואידים התלת-ממדיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 24 שעות.
    7. לאחר הדגירה, לאסוף את מדיום התרבית לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (למדידת ריכוז LTF לאחר גירוי פילוקרפין).
    8. צנטריפוגה אספה דגימות תרבית בטמפרטורה של 4°C ו-1000 × גרם למשך 20 דקות. אספו את הסופרנטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 80°C לשימוש מאוחר יותר.
  2. דילול דגימה
    1. הוצאו את הדגימות מהמקפיא בטמפרטורה של מינוס 80°C ותנו להן להפשיר לחלוטין בטמפרטורת החדר.
    2. קחו 5 מיקרוליטר מהדגימה ומדללים אותה עם 495 מיקרוליטר של בופר דילול דגימה מקיט בדיקת אימונוסורבנט (ELISA) המקושרת לאנזימים להכנת דילול פי 100.
  3. הכנת ריאגנט
    1. הביאו את כל החומרים של ערכת ELISA לטמפרטורת החדר 20 דקות לפני השימוש.
    2. הכינו את בופר השטיפה: חישבו את הכמות הנדרשת לפי מספר הדגימות, ודיללו את בופר השטיפה המרוכז במים מזוקקים (1:24).
    3. הכינו את הפתרון הסטנדרטי:
      1. צנטריפוגה את התקן הליופילי ב-10,000 × גרם למשך דקה אחת. הוסיפו 1 מ"ל של מדלל רפרנס ומדלל דגימה, נותנים לזה לעמוד 10 דקות, והפכו בעדינות כמה פעמים.
      2. לאחר שהוא מתמוסס לגמרי, מערבבים היטב עם פיפטה. שיקום זה מניב תמיסה עובדת של 2000 pg/mL.
    4. בצע דילול סדרתי לפי הוראות הערכה כדי להכין את גרדיאנט הריכוז הסטנדרטי הבא: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 0 pg/mL.
    5. הכינו את פתרון נוגדני הזיהוי הביוטינילטיטי:
      1. חשב את הנפח הנדרש לבדיקה (50 מיקרוליטר/באר). צנטריפוגה את נוגדן הגילוי הביוטינילטי המרוכז ב-800 × גרם למשך דקה, ואז מדלל את נוגדן הזיהוי הביוטינילטי המרוכז ב-50× לתמיסה עובדת 1× באמצעות מדלל נוגדן ביוטינילאט.
      2. הכינו את התמיסה ממש לפני השימוש, והפכו מעט יותר מהכמות המחושבת, בדרך כלל מוסיפים 100-200 מיקרוליטר יותר מהנדרש.
    6. הכינו את תמיסת העבודה הקונוגטיבית של פרוקסידאז חזרת (HRP):
      1. חשב את הנפח הנדרש לניסוי (50 מיקרוליטר/באר). צנטריפוגה את ה-HRP המרוכז ב-800 × גרם למשך דקה, ואז מדללים אותו לריכוז עבודה פי 1 באמצעות מדלל קוניגט HRP.
      2. הכינו את התמיסה ממש לפני השימוש, והפכו מעט יותר מהכמות המחושבת, בדרך כלל מוסיפים 100-200 מיקרוליטר יותר מהנדרש.
  4. הליך בדיקת ELISA
    1. קבע את הבארות עבור התקן המדולל, הריק, והדגימות, עם 3 שכפולים לכל אחד. הוסיפו 25 מיקרוליטר מהתמיסה העובדת הסטנדרטית, תמיסת דגימה ריקה או מדוללת לבארות המתאימות. כסו את הפלטה עם האטם שנמצא בערכה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
      הערה: יש להוסיף תמיסות לתחתית הבאר של צלחת המיקרו ELISA. הימנע מלגעת בקיר הפנימי ולגרום לקצף ככל האפשר.
    2. שחרר את הנוזל מהבארות בלי לשטוף אותו. מיד הוסיפו 50 מיקרו-ליטר של תמיסת נוגדנים לזיהוי ביוטינילציה לכל באר. כסו את הצלחת באטימה חדשה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
    3. פנו את הנוזל מהבארות והוסיפו 350 מיקרוליטר של בופר שטיפה מוכן לכל באר. להשרות דקה, ואז לשאוב או לשאוב את הנוזל מכל באר ולייבש אותו עם נייר סופג נקי. חזור על שלב הכביסה הזה 3 פעמים.
      הערה: אל תאפשר לבארות להתייבש במהלך תהליך הכביסה.
    4. הוסף 50 מיקרו-ליטר מתמיסת ה-HRP העובדת המוכנה לכל באר. כסו את הצלחת באטימה חדשה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. פנו את הנוזל מהבארות וחזרו על תהליך השטיפה חמש פעמים עם בופר כביסה כפי שמתואר בשלב 5.4.3.
    6. הוסף 50 מיקרוליטר של תגובת תת-קרקעית לכל באר. כסו את הפלטה באטימה חדשה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 דקות.
    7. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לסיים את התגובה. ודאו שהתמיסה העצירה מתווספת באותו סדר כמו תמיסת המצע.
    8. קבעו מיד את הצפיפות האופטית (OD value) של כל באר ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.

6. בידוד RNA

  1. איסוף דגימות
    1. לרקמת LG
      1. בודד את רקמת ה-LG החוצה-אורביטלית מעכברים בוגרים כפי שמתואר בסעיף 1.1.2-1.1.2.
      2. טבלו את רקמת LG המבודדת הטרייה ב-PBS כדי לשטוף כל דם.
      3. נמרח את הלחות השטחית של ה-LG בנייר סינון והנח את הרקמה בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תגובת חילוץ RNA (טבלה משלימה 1), תוך שמירה על הצינור על קרח.
        הערה: בצע שלבי טחינה לפני חילוץ ה-RNA כדי להבטיח פירוק מלא של הרקמה.
      4. הוסיפו שני חרוזי טחינה נקיים מפלדה לצינור המיקרוצנטריפוגה, ואז הניחו את הצינור במטחנת טמפרטורה נמוכה ומקוררת מראש.
      5. הגדר את פרמטרי המטחנה: תדר 70 הרץ, זמן טחינה 45 שניות, זמן השהיה 15 שניות, וחזור על זה 10 מחזורים. הדק את ידית המכסה של המטחנה והתחל לטחון.
      6. הנח את הצינור על קרח או אחסן אותו בטמפרטורה של -80°C לצורך הפקת RNA לאחר סיום תהליך הטחינה.
    2. עבור LGECs
      1. הסר את מדיום התרבית ושוטף את התאים שלוש פעמים עם DPBS סטרילי כאשר ה-LGECs מגיעים ל-80-90% מפגש ביניהם.
      2. הוסף 600 מיקרוליטר של תגובת חילוץ RNA לכל באר (לפלטת 24 בארות) ודגר בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
      3. השתמשו בפיפטה בנפח 1 מ"ל כדי לבצע פיפטות חוזרות של תמיסת תגובת חילוץ ה-RNA בכל באר כדי להבטיח פירוק תא מלא.
      4. העבר את התמיסה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      5. הנח את הצינור על קרח או אחסן אותו בטמפרטורה של -80°C לצורך הפקת RNA הבאה.
    3. לספרואידים תלת-ממדיים של LGEC
      1. אסוף ספרואידים תלת-ממדיים LGEC לא מובחנים ומובחנים שגודלו במשך 14 ימים כפי שמתואר בשלבים 3.2-3.3. הוסף 1 מ"ל תמיסת עיכול (מדיום ללא סרום המכיל 1 מ"ג/מ"ל Dispase II) לכל באר, כדי להבטיח שמבנה הג'ל התלת-ממדי בצורת מטריצת ג'ל מכוסה במלואו. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך 30 דקות.
      2. העבר את תמיסת העיכול המכילה את הספרואידים התלת-ממדיים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. צנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 3 דקות כדי לאסוף את כדור הספרואיד.
      3. שטוף את הכדור עם 1 מ"ל DPBS וצנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 3 דקות כדי לאסוף את הכדור שוב.
      4. הוסיפו 600 מיקרוליטר של תגובת חילוץ RNA (לכל 20 מיקרוליטר ג'ל מטריצה) ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
      5. ערבבו היטב באמצעות פיפטה של 1 מ"ל כדי להבטיח פירוק מלא של הספרואידים התלת-ממדיים.
      6. הנח את הצינור על קרח או אחסן אותו בטמפרטורה של -80°C לצורך הפקת RNA הבאה.
  2. חילוץ RNA
    הערה: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות, מסכה) ולבצע את כל ההליכים הכוללים כלורופורם ואיזופרופנול בתוך מכסה אדים. סילוק זרמי פסולת כימית במיכלים מסוכנים המסומנים ליצירת פסולת מסוכנת, בהתאם לפרוטוקולי טיפול מוסדי.
    1. הוסף כלורופורם (חמישית נפח של תגובת חילוץ RNA) לצינור הצנטריפוגה המכיל את דגימת ה-RNA בתגובת חילוץ RNA (מהשלב 6.1).
      הערה: בצע את ההליך במכסה אדים.
    2. ערבבו היטב באמצעות מערבולת ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עד להפרדת פאזה.
    3. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לאחר הצנטריפוגה, הנוזל יתפצל לשלוש שכבות, כאשר ה-RNA נמצא בשלב המימי השקוף העליון ביותר.
    4. הכינו צינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל ללא RNase והוסיפו איזופרופנול (חצי מנפח תגובת חילוץ ה-RNA) במכסה אדים.
    5. פיפט את השלב המימי השקוף העליון ביותר (חצי מנפח מגיב חילוץ ה-RNA) בזהירות אל תוך הצינור החדש ללא RNase.
      הערה: היזהר להימנע מזיהום השכבה האמצעית בעת פיפטינג.
    6. הפוך את הצינור מספר פעמים לערבוב ודגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. ואז שוב צנטריפוגה ב-14,000 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 500 מיקרוליטר של 75% אתנול כדי לשטוף את הכדור על ידי הפיכת הצינור. צנטריפוגה שוב ב-14,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    8. חזור על שלב 6.2.7. השליכו את הסופרנטנט ובצעו צנטריפוגה מהירה להסרת נוזל שנותר.
    9. מניחים את הצינור על קרח במכסה האדים, פתחו את המכסה, ותנו לו להתייבש באוויר במשך 10-20 דקות עד שהכדור הלבן הופך לחצי שקוף.
    10. הוסף 20 מיקרול מים ללא RNase כדי להמיס את הכדור. למדוד ריכוז וטוהר RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: אם ריכוז ה-RNA גבוה מדי, יש לדלל בכמות מתאימה של מים ללא RNase.
    11. מניחים את תמיסת ה-RNA על קרח או אחסנו אותה בטמפרטורה של -80°C לתהליך השעתוק ההפוך הבא.

7. RT-PCR כמותי (qRT-PCR)

  1. תעתיק הפוך
    1. הוסיפו את הרכיבים הבאים ברצף לצינור התגובה של ה-PCR לפי הוראות היצרן: 800 ng של RNA כולל (מחשב את הנפח לפי ריכוזו), 4 מיקרוליטר של 5x All-in-One SuperMix ל-q-PCR, 1 מיקרוליטר של מסיר gDNA, ומים ללא RNase כדי להביא את הנפח הכולל ל-20 מיקרוליטר.
    2. מערבבים בעדינות את הרכיבים. כוון את מכשיר ה-PCR לתנאים הבאים: 55 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות, 80 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז 12 מעלות לתקופה בלתי מוגבלת.
    3. אחסן את ה-cDNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או שמור אותו על הקרח לתהליך qRT-PCR לאחר סיום תגובת השעתוק ההפוכה.
  2. qRT-PCR
    1. הכינו את פתרון הפרה-מיקס qRT-PCR למיקוד בגנים שונים כך: 5 מיקרוליטר של 2x גרין qPCR SuperMix, 0.2 מיקרוליטר פריימר קדמי (10 מיקרומון), 0.2 מיקרוליטר פריימר הפוך (10 מיקרומון), ו-3.6 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. מערבבים בעדינות ומניחים על קרח.
    2. הוסף 9 מיקרו-ליטר של ערבוב הקדם qRT-PCR (שהוכן בשלב 7.2.1) ו-1 מיקרוליטר cDNA (שהוכן בשלב 7.1) לצינורות qRT-PCR לפי עיצוב הניסוי.
    3. צנטריפוגה את הצינורות ב-1000 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    4. הכניסו את הצינורות למכונת PCR כמותית פלואורסצנטית לצורך גילוי.
      הערה: השתמשו בשיטה בת שלושה שלבים עם התוכנית הבאה בהתאם להוראות יצרן התגובה: 94 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, 94 מעלות צלזיוס ל-5 שניות, 60 מעלות צלזיוס ל-15 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-10 שניות. תתחיל לחזור משלב 2 במשך 40-45 מחזורים.
    5. בצע ניתוח כמותי בשיטת CT השוואתית (2-ΔΔCt).
      הערה: יש לחזור על כל מערך נתונים לפחות שלוש פעמים עצמאיות כדי להבטיח את אמינות התוצאות.

8. צביעת אימונופלואורסצנציה

הערה: צביעת אימונופלואורסצנציה מתבצעת על LGECs המגודלים בלוחות של 24 בארות עם קצב מפגש של 70-80% או על חתכים קפואים של מבני LGEC תלת-ממדיים מופרדים.

  1. עבור LGECs
    1. הסר את מדיום התרבית מהבארות ושטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
    2. הוסיפו 500 מיקרוליטר של 4% PFA לכל באר בארון בטיחות ביולוגית או במכסה אדים ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לתקן את התאים.
    3. שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, כל שטיפה נמשכת 5 דקות.
    4. הוסיפו 500 מיקרוליטר של 0.2% טריטון X-100 לכיסוי התאים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לחדור את ממברנת התא.
    5. שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, כל שטיפה נמשכת 10 דקות.
    6. הסר את ה-PBS והשתמש בסמן אימונוהיסטוכימיה כדי לצייר מעגל סביב כל באר בלוח עם 24 בארים. הוסף 50 מיקרוליטר של 2% BSA לכל באר כדי לכסות את התאים. דגור בטמפרטורת החדר במשך שעה לחסימה.
    7. הסירו את ה-BSA והוסיפו 50 מיקרוליטר מנוגדן ראשוני מדולל (טבלה משלימה 1) כדי לכסות את ה-LGECs. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות.
    8. הסר את הנוגדן הראשי וחזור על שלב 8.1.5.
    9. הוסף 50 מיקרוליטר של נוגדן משני פלואורסצנטי לכל באר כדי לכסות את ה-LGECs. דגרו בטמפרטורת החדר בחושך במשך שעה.
    10. חזור על שלב 8.1.5, תוך הימנעות מחשיפה לאור.
    11. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) כדי לכסות את ה-LGECs וצפו בצבוע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. לספרואידים תלת-ממדיים של LGEC
    1. הכינו את החלקים הקפואים של LGEC תלת-ממדיים כפי שמתואר בשלב 4. בצע את צביעת האימונופלואורסצנציה כפי שמפורט בשלבים 8.1.2-8.1.11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקמת מערכת גידול LGECs ללא סרום באמצעות 2C
בפרוטוקול זה, המטרה הייתה להקים מערכת תרביות פשוטה ויעילה יותר להרחבת LGECs של העכברים הראשיים. לאחר בדיקות נרחבות, פותח בהצלחה שילוב 2C ללא סרום, המורכב כולו מ-Y27632 ו-SB431542, שאפשר התרחבות ארוכת טווח במבחנה של LGECs. לאחר עיכול אנזימי מעורבב, LGECs ראשוניים החלו להידבק וליצור שיבוטי תאים מרובים לאחר 3 ימים של תרבית עם 2C (הנתונים לא מוצגים). שלושת הימים הראשונים הם תקופה קריטית לתרבות ה-LGEC; יש להימנע מהפרעה בת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כפי שמתואר בהקדמה, פותחו בשנים האחרונות מספר מערכות תרבית ללא סרום לתאי LG 10,11,12,13. עם זאת, לרבות מהשיטות הללו יש מגבלות, כולל רבייה לקויה של תאים ואי-יכולת להשיג התרחבות רחבת היקף במבחנה 10,11. יתרה מזאת, מערכות תרביות ללא סרום עדכניות לתאי גזע ואורגנידים של LG הסתמכו על נוסחאות מורכבות הכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82471048, 82271045); תוכנית המדע והטכנולוגיה של שנזן (JCYJ20240813145510014); הפרויקט המיוחד לכישרונות מחקר בריאות של מחוז ג'ילין (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); ופרויקט תוכנית פיתוח המדע והטכנולוגיה של מחוז ג'ילין (YDZJ202601ZYTS389).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
 -20° C מקרר בטמפרטורות אולטרה-נמוכותהייר
 -80° C מקרר בטמפרטורות אולטרה-נמוכותהייר
0.25% Trypsin-EDTAגיבקו25200056
צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מ"לקירגןKG2211ללא RNASE
צלחת תרבית תאים בגודל 35 מ"מLABSELECT12111
4 & דרגה מקרר Cהייר
4% פאראפורמלדהיד (PFA)סרוויסביוG1101
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)ייסן708939ES03חנות ב--20 & דרגה; C, המקור ב-1 מ"ג/מ"ל, 500x, מדולל ל-1x עם 1x PBS
צינור צנטריפוגה 5 מ"ל  ACMECAC17457
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל  LABSELECTCT-002-50-SS
נוגדן אנטי-אלפא לשריר חלק אקטין ארנבאבקאםab5694מדלל עם בופר דילול הנוגדנים ב-1:100;
נוגדן ארנב נגד AQP5  ABclonalA9927מדלל עם בופר דילול הנוגדנים ב-1:100;
נוגדן אנטי-ציטוקרטין 14 לארנבאבקאםab181595מדלל עם בופר דילול נוגדנים ב-1:200 
אנטי-ציטוקרטין 19  נוגדן ארנבאבקאםab52625מדלל עם בופר דילול נוגדנים ב-1:400 
נוגדן נגד ארנב Anti-Ki67אבקאםab16667מדלל עם בופר דילול נוגדנים ב-1:200 
ארון בטיחות ביולוגיתסטרילגארד
אלבומין סרום בקר (BSA) ייסן36101ES60חנות ב-4° C
עכברים C57BL/6Jמרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת שיאמן
לוח תרבית תאיםLABSELECT1131224 בארות
חממת תאיםאפנדורף
צנטריפוגהאפנדורף
כלורופורםהושי10006818אזהרה, ביצוע פעולות במכסה אדים
CO2  חממת טמפרטורה קבועהאפנדורף
קולגנאז Aרוש10103586001חנות ב--20 & דרגה; C, המלאי ב-200 מ"ג/מ"ל, 100 פעמים
תמיסת מעכב טריפסין מוגדרת (DTI)גיבקוR007100
ערכת DermaLife K Keratinocyte Medium Complete (מדיום ללא סרום) קו חייםLL-0007חנות ב-4 & deg; C
די-הנקסביושארפBL559A משמש לדילול Dispase II
דימתילסולפוקסיד (DMSO)סיגמאD4540משמש לדילול Y27632 ו-SB431542
Dispase IIסיגמאD4693חנות ב--20 & דרגה; C, המלאי ב-200 מ"ג/מ"ל, 100 פעמים
DMEM בסיסי (1X)גיבקוC11995500BT
נוגדן משני מסוג חמור אנטי-ארנב IgG (H+L) בעל ספיגת צולב גבוהה, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206מדלל עם בופר דילול נוגדנים ב-1:300
תמיסת מלח עם בופר פוספט של דולבקו (DPBS)סרוויסביוG4200
אתנול אבסולוטיהושי10009218אזהרה, השתמש להכנת דילול אתנול נוסף 
מיקרוטום קפואלייקה
מטחנה מהירה בטמפרטורות נמוכותסרוויסביו
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוךלייקה
מיקרוסקופ הפוךאולימפוס
איזופרופנול הושי80109270
מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר FV3000אולימפוס
צנטריפוגה במהירות גבוהה בטמפרטורות נמוכותאפנדורף
ערכת בדיקת אימונוסורבנט (ELISA) עם קשר אנזימי LTF;ElabscienceE-MSEL-M0047חנות ב--20 & דרגה; C
ג'ל מטריצה (Matrigel)82703מוגנגלעליקווט וחנות ב-20- & דרגה; C
מיקרופיפטוראפנדורף
קורא מיקרופלטתרמו פישר סיינטיפיק
מים ללא נוקלאזביושארפBL510B
תרכובת OCTScigen4586
PBS, 1× (pH7.4)סרוויסביוG4202
מגבר PCRביו-ראד
פניצילין-סטרפטומיציןביושארפBL505A
פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריציןביושארפBL142A
ערכת PerfectStart Green qPCR SuperMixטרנסג'ן ביוטכנולוגיהAQ601-01-V2חנות ב--20 & דרגה; C
PerfectStart Uni RT& ערכת qPCRטרנסג'ן ביוטכנולוגיהAUQ-01חנות ב--20 & דרגה; C
Pilocarpine אלדיןP424663חנות ב--20 & דרגה; C, 2500x
Primer AQP5  רצף:
קדימה:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
הפוך:CTTGCTCCCATCCCAT
CC		סאנגון ביוטק
פריימר K14  רצף:
קדימה:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
הפוך: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		סאנגון ביוטק
מדריך K15  רצף:
קדימה:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
הפוך:TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		סאנגון ביוטק
פריימר K19  רצף:
קדימה:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
אחורה:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		סאנגון ביוטק
פריימר K5  רצף:
קדימה:CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
אחורה: AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		סאנגון ביוטק
Primer Ki67  רצף:
קדימה:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
אחורה: TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		סאנגון ביוטק
Primer LTF  רצף:
קדימה:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
אחורי:TTGTACTGGTCCCTCTCG
GC		סאנגון ביוטק
פריימר P63  רצף:
קדימה:ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
רוורס: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		סאנגון ביוטק
פריימר SOX10  רצף:
קדימה:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
הפוך:ACTGCCCAGCCGTAGCC		סאנגון ביוטק
פריימר &אלפא;-SMA  רצף:
קדימה:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
אחורה:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		סאנגון ביוטק
מכשיר PCR כמותי בזמן אמת עם פלואורסצנציהרוש
מבודד RNA מלא לחילוץ RNAואזימהR401-01אזהרה, ביצוע פעולות במכסה אדים
SB431542 אפקסביוA8249חנות ב--20 & דרגה; C, מקור ב-20 מילימטר, 2000x
ספקטרופוטומטר ננודרופ 1000תרמו פישר סיינטיפיקמדידת ריכוז RNA
סוקרוזהמקליןS818046להמיס עם מים מזוקקים
טריטון X-100סולרביולוגיהT8200
מערכת טיהור מים טהורה במיוחדמיליפור
בופר דילול נוגדנים אוניברסליאפיזיםPS119חנות ב-4 & deg; C
Y27632 אפקסביוB1293חנות ב--20 & דרגה; C, מקור ב-20 מילימטר, 2000x

מקורות

  1. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: the unmet challenges and promise for dry eye therapy. Ocul Surf. 25, 129-141 (2022).
  2. Chen, X., Li, S., Zhang, Y., Ye, L. Progress and prospects in the treatment of lacrimal gland dysfunction diseases: from traditional treatment methods to stem cell and organoid therapies. Stem Cells Int. 2025, 6334284(2025).
  3. Hirayama, M., Kawakita, T., Tsubota, K., Shimmura, S. Challenges and strategies for regenerating the lacrimal gland. Ocul Surf. 14 (2), 135-143 (2016).
  4. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  5. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 6 (1), 88-98 (2017).
  6. Millar, T. J., Herok, G., Koutavas, H., Martin, D. K., Anderton, P. J. Immunohistochemical and histochemical characterisation of epithelial cells of rabbit lacrimal glands in tissue sections and cell cultures. Tissue Cell. 28 (3), 301-312 (1996).
  7. Oliver, C. Isolation and maintenance of differentiated exocrine gland acinar cells in vitro. In Vitro. 16 (4), 297-305 (1980).
  8. Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (1), 145-158 (1989).
  9. Yoshida, K., et al. Serum-free medium enhances the immunosuppressive and antifibrotic abilities of mesenchymal stem cells utilized in experimental renal fibrosis. Stem Cells Transl Med. 7 (12), 893-905 (2018).
  10. Ueda, Y., et al. Purification and characterization of mouse lacrimal gland epithelial cells and reconstruction of an acinar-like structure in three-dimensional culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 1978-1987 (2009).
  11. Kobayashi, S., et al. Characterization of cultivated murine lacrimal gland epithelial cells. Mol Vis. 18, 1271-1277 (2012).
  12. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 20(2020).
  13. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232.e7 (2021).
  14. Bannier-Hélaouët, M., et al. Establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids. J Vis Exp. (192), e65040(2023).
  15. Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-dimensional, serum-free culture system for lacrimal gland stem cells. J Vis Exp. (184), e63585(2022).
  16. Wang, J., Sun, S., Deng, H. Chemical reprogramming for cell fate manipulation: methods, applications, and perspectives. Cell Stem Cell. 30 (9), 1130-1147 (2023).
  17. Rehman, A., et al. Role of small molecules as drug candidates for reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells: a comprehensive review. Comput Biol Med. 177, 108661(2024).
  18. Zhang, C., et al. Long-term in vitro expansion of epithelial stem cells enabled by pharmacological inhibition of pak1-rock-myosin II and TGF-β signaling. Cell Rep. 25 (3), 598-610.e5 (2018).
  19. An, X., et al. Novel cell culture paradigm prolongs mouse corneal epithelial cell proliferative activity in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 9, 675998(2021).
  20. Xu, L., et al. A cocktail of small molecules maintains the stemness and differentiation potential of conjunctival epithelial cells. Ocul Surf. 30, 107-118 (2023).
  21. Zeng, B., et al. Distinctive small molecules blend: promotes lacrimal gland epithelial cell proliferation in vitro and accelerates lacrimal gland injury repair in vivo. Ocul Surf. 34, 283-295 (2024).
  22. Zhou, Q., et al. inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of transforming growth factor-β signaling delays cellular senescence and preserves the function of endothelial cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 589-600 (2017).
  25. Natarajan, E., et al. A keratinocyte hypermotility/growth-arrest response involving laminin 5 and p16INK4a activated in wound healing and senescence. Am J Pathol. 168 (6), 1821-1837 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.