מאמר שיטה

פרוטוקול לפירוק תאים בודדים, ריצוף RNA ובידוד תאי מיואפיתל ופיברובלסטים מבלוטות הלמתי והרוק המזדקנות

DOI:

10.3791/70441

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית להפרדת בלוטות דמעות עכבר מזדקנות להשגת תאים בודדים ברי-קיימא לריצוף RNA תא יחיד. עיכול אנזימטי רציף וטיפול עדין משמרים על שלמות התא, ומניבים תליות איכותיות המתאימות לבידוד ספציפי לסוג תא ולניתוח טרנסקריפטומי של שינויים הקשורים להזדקנות באוכלוסיות בלוטות דמעות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזדקנות בלוטת הדמעות (LG) קשורה להפחתת הפרשת דמעות ודלקת כרונית, התורמת למחלות עיניים יבשות. שינויים ב-LG הקשורים לגיל כוללים חדירת תאי חיסון, נזק לתאי, הצטברות שומנים בתאי אקינריים, הצטברות מטריצה חוץ-תאית והרחבת צינור העיניים. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מספק גישה עוצמתית להטרוגניות תאית ושינויים בתעתוק במהלך ההזדקנות; עם זאת, יצירת תללים חד-תאיים ברי קיימא מרקמת LG מבוגרת היא מאתגרת טכנית בשל הגברת הפיברוזיס, שבריריות תאית והצטברות שומן. מחקר זה מציג פרוטוקול אופטימלי וניתן לשחזור להפרדה יעילה של LGs עכבריים מזדקנים ולבידוד סוגי תאים מרובים, המתאים לניתוח scRNA-seq במורד הזרם. חשוב לציין שפרוטוקול זה ישים גם לבלוטות דמעות צעירות, לחמית ורקמות אקסוקריניות נוספות. תהליך העבודה עושה שימוש באסטרטגיית דיסוציאציה אנזימטית מדורגת באמצעות קולגנאז IV, דיספאז II ו-DNase I לעיכול הרקמה הראשוני, ואחריו אקוטאז לפירוק אשכולות תאים שנותרו וטיפול סופי ב-DNase I להשגת השעיה חד-תאית נקייה. כדי למזער נזק לתאים, כל כלי הפלסטיק מצופים מראש באלבמין סרום פרות של PBS, ועיבוד רקמות מתבצע בתנאי טמפרטורה וערבוב מבוקרים. ניתוק תאי דם אדומים וסינון רציף דרך מספר מסננות משפרים עוד יותר את טוהר התא. בידוד ספציפי לסוג התא מושג באמצעות קווי עכבר מדווחים בשילוב עם מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). באמצעות עכברי Acta2GFP ו-PdgfraEGFP, הצלחנו לבודד בהצלחה תאי מיואפיתל ופיברובלסטים, בהתאמה, לאחר צביעת חיסון בנוגדן EpCAM. FACS אפשר את הפרדת אוכלוסיית המיואפיתל של EpCAM⁺/αSMA⁺, בעוד שתאי EGFP⁺ מעכבריPdgfra EGFPייצגו את אוכלוסיית הפיברובלסטים. פרוטוקול זה מניב תלים חד-תאיים איכותיים ובריאים מ-LG מבוגרים וניתן להתאים בקלות לרקמות אקסוקריניות פיברוטיות או מזדקנות אחרות הדורשות דיסוציאציה עדינה ובידוד תאים ממוקד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בלוטת הדמעות (LG) היא בלוטת טובולואצינרית אקסוקרינית האחראית להפרשת שכבת המים של שכבת הדמעה. לאורך החיים, פני הקרנית והבלוטת ה-LG חשופים לזיהומים חיידקיים וויראליים, מה שעלול להוביל להפרעה מערכתית בתאי האפיתל, להזרמת תגובות דלקתיות כרוניות, לחדירת תאי חיסון ל-LG ולחוסר רגנרציה. הזדקנות מלווה בעלייה בשכיחות מחלות דלקתיות כרוניות1. מבין אלה, מחלת יובש בעיניים (DED) היא אחת מעשרת הגורמים השכיחים ביותר לפגיעה בראייה ברחבי העולם והיא תורמת מרכזית לירידה בעצמאות, בניידות ובתפקוד היומיומי באוכלוסייה המבוגרים2. סיבה עיקרית ל-DED היא תפקוד לקוי של LG3.

עם הגיל, העכבר וה-LG האנושיים עוברים שינויים מבניים ותפקודיים בולטים, כולל אטרופיה של תאי אקינרי, הרחבת תאי חיסון, חדירת תאי חיסון, פיברוזיס והצטברות שומנים 4,5,6,7. שינויים ניווניים אלו מלווים גם בדלקת כרונית של ה-LG ופיברוזיס רקמתי 3,5,8,9. למרות הקשר הברור בין הזדקנות לפתולוגיה של LG, המנגנונים המולקולריים והתאים המניעים שינויים אלו עדיין אינם מובנים היטב.

ריצוף RNA חד-תאי מאפשר פרופילינג מקיף של אוכלוסיות תאים ושינויים בתעתוק במהלך גיל10. גישה זו מאפשרת זיהוי בלתי מוטה של סוגי תאים ומצבים שונים בתוך בלוטת הדמעות, וחושפת כיצד ההזדקנות משנה את פרופילי ביטוי הגנים, חדירת תאי חיסון ואינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימיות.

נכון להיום, קיימות שיטות שונות לפירוק רקמות, כולל שיטות דיסוציאציה מכנית11 ופרוטוקולים הכוללים עיכול אנזימטי חם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אנזימים כמו קולגנאז, דיספאז או טריפסין12. אסטרטגיות שונות של דיסוציאציה תוארו למגוון רחב של רקמות, כולל כבד, ריאות, כליות, לב וסוגי גידוליםמרובים 13,14,15. עם זאת, הכנת תללים חד-תאיים ברי קיימא מרקמת בלוטות דמעות מזדקנות נותרת מאתגרת טכנית בשל הגברת הפיברוזיס ושבריריות התאים. כמו כן, כפי שדיווחנו בעבר, התאוששות של תאים אקינריים עדינים עלולה להיות מאתגרת, שכן שינויים הקשורים לפירוק בחדירות הממברנה עלולים להגביר את שחרור ה-RNA הסביבתי מהתאים הגדולים והמפרישים הללו, ולתרום לאות רקע במאגרי נתונים של תאים בודדים במורד הזרם16. למרות שמספר מחקרים דיווחו על אטלסים של scRNA-seq של בלוטות דמעות מזדקנות, איכות מערכי הנתונים הללו הוגבלה בשל שיטות דיסוציאציה לא אופטימליות, מה שהוביל לתפוקה נמוכה יותר של תאי אפיתל מאשר של אוכלוסיות סטרומליות. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט ואופטימלי לפירוק יעיל של LG עכבר זקן ולבידוד אוכלוסיות תאים מובחנות עבור ניתוחי scRNA-seq במורד הזרם ו-RNA-seq בכמויות גדולות (איור 1). גישה זו מספקת כלי עוצמתי לחקר המנגנונים המולקולריים שמאחורי הפרעה בבלוטות דמעות הקשורה לגיל.

הפרוטוקול מאפשר יצירת תלים חד-תאיים איכותיים ובריאים מבלוטות דמעות מזדקנות, ומספק בסיס אמין לניתוחים טרנסקריפטומיים מקיפים. הוא מאפשר זיהוי מפורט ואפיון מולקולרי של אוכלוסיות תאים מגוונות, כולל תאי מיואפיתל, פיברובלסטים, וסוגי תאים אפיתליאליים וסטרומליים נוספים העוברים שינויים הקשורים לגיל. תהליך העבודה האופטימלי שומר על שלמות התא ומפחית ארטיפקטים שעתוק הנגרמות מלחץ, ומבטיח ייצוג מדויק של מצבי תאים ב-vivo. יתרה מזאת, המתודולוגיה רלוונטית באופן רחב וניתנת להתאמה לבלוטות אקסוקריניות אחרות או רקמות פיברוטיות, שבהן ניתוק עדין של רקמות ובידוד מדויק של אוכלוסיות תאים נפרדות הם קריטיים למחקרים חד-תאיים בהמשך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדית (IACUC) במכון המחקר סקריפס (פרוטוקול מס' 08-0123; אושר ב-29 באוגוסט 2023). הטיפול בבעלי חיים במכון המחקר סקריפס מוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה, בינלאומית (AAALAC). העכברים נשמרו במחזור סטנדרטי של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, עם מזון ומים שסופקו לחופשיות. קווי עכברים טרנסגניים PdgfraEGFP ו-Acta2GFP שימשו לניסויים. המידע המפורט על קווי עכברים מסופק בסעיף "טבלת החומרים".

1. שיקולים כלליים

  1. פעלו לפי אמצעי זהירות אוניברסליים של NIH17 בעת טיפול בחומרים ביולוגיים מסוכנים ורקמות בעלי חיים. בצעו את כל עבודות בעלי החיים בהתאם לפרוטוקולי IACUC המאושרים ולרמות הבטיחות הביולוגית המוגדרות לבעלי חיים.
  2. יש לעקוב אחרי נהלי בטיחות סטנדרטיים במעבדה על ידי הימנעות מפיפיטה בפה, צמצום שימוש בגזים, שימוש בארון בטיחות ביולוגי להליכים לייצור אירוסולים, לבישת ציוד מגן מתאים, השלכת חומרים חדים במכלים עמידים לניקובים, וסימון וניקוי נכון של כל פסולת ביולוגית מסוכנת לפני ההשלכה.
  3. חטא באופן שגרתי משטחי עבודה וציוד באמצעות חומרי חיטוי מתאימים (למשל, 10% אקונומיקה).
  4. יש לבצע את כל שלבי הצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה מקוררת מראש כדי לשמור על חיוניות התא ולמזער את המתח הנגרמת מהטמפרטורה.
  5. אופטימיזציה של הגדרות ציטומטר זרימה ומיון תאים עבור תצורת המכשיר הספציפית והתאמת הפרמטרים לכל קונוגט נוגדן-פלואורופור באמצעות דגימות בקרה מתאימות. השתמש באותו ציטומטר ומכשיר מיון, עם הגדרות קבועות ואופטימליות, לאורך סדרת ניסוי כדי למזער שונות.
  6. הכינו את התמיסות הנבחרות עד יום מראש ואחסנו אותן כראוי עד השימוש. הכינו את כל התמיסות בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית.
  7. שמור על תמיסות המכילות Ca2+/Mg 2+ נפרדות ממאפים המכילים EDTA כדי למנוע כילציה במהלך שלבים אנזימטיים. כל החומרים הנדרשים להליך זה מוצגים בטבלת החומרים.

2. כלי פלסטיק

  1. בתנאים סטריליים, יש לצפות מראש את הצלחות, הצינורות והמזרקים עם 1x PBS + 1% BSA למשך שעה בטמפרטורת החדר (RT). שאופים ושמרו על הכל סטרילי עד השימוש.
  2. ציפוי מראש את קצות הפיפטה. שאפו וזרקו 1x PBS + 1% BSA שלוש פעמים עם כל קצה כדי לצפות את פני השטח הפנימיים. החזרו את הקצוות המצופים לקופסת הקצה הסטרילית ותנו להם להתייבש למשך הלילה באינקובטור סטרילי. השתמשו בקצוות המצופים מראש ביום הבא במהלך תהליך בידוד התאים.

3. פתרונות ומאגרים

  1. מלאי DNase I (5 מ"ג/מ"ל)
    1. הכינו 150 mM NaCl מהמאגר של 5M NaCl וסיננו את התמיסה בסטריל.
    2. מוסיפים 1 M CaCl₂ לתמיסת NaCl המסוננת של 150 מ"מ כדי לקבל ריכוז סופי של 5 mM CaCl₂.
    3. החזר להשעות 100 מ"ג DNase I ב-20 מ"ל של 150 מ"מ NaCl / 5 mM CaCl₂ כדי לקבל תמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל DNase I.
    4. הכינו 500 מיקרוליטר אליקווט ואחסנו אותם בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים כדי למנוע אובדן פעילות אנזימים.
  2. מדיום עיכול
    1. יום לפני הניסוי, הכינו את תערובת הבסיס הבינונית על ידי ערבוב DMEM/F12 עם 0.5% BSA וסינון.
    2. הוסף 1M HEPES ו-1M CaCl₂ למדיום הבסיס DMEM/F12 / 0.5% BSA כדי לקבל ריכוזים סופיים של 15 mM ו-3 mM, בהתאמה.
    3. הוסיפו את כל האנזימים הבאים ממש לפני השימוש: קולגנאז IV (1 מ"ג/מ"ל; 125 U/mL), דיספאז II (2.5 מ"ג/מ"ל; 1.25 U/mL), ו-DNase I (20 U/mL; 0.05 mg/mL מהמלאי של 5 mg/mL).
  3. חסימת בינוני 1 (BM1)
    1. מוסיפים 1M HEPES ו-0.5M EDTA ל-1x HBSS כדי לקבל ריכוזים סופיים של 15 mM ו-3mM, בהתאמה.
  4. חסימה בינונית 2 (BM2)
    1. הוסף FBS ו-1M HEPES ל-DMEM/F12 כדי לקבל ריכוזים סופיים של 10% ו-15 mM, בהתאמה.
  5. מדיום לטיפול ב-DNase
    1. יום לפני הניסוי, הכין את המדיום הבסיסי על ידי ערבוב 1x HBSS עם 0.5% BSA וסינון.
    2. הוסף 1M HEPES, 1M CaCl₂ ו-1M MgCl₂ למדיום הבסיס 1x HBSS / 0.5% BSA כדי לקבל ריכוזים סופיים של 10 mM, 1.5 mM ו-2 mM, בהתאמה.
    3. ממש לפני השימוש, הוסיפו DNase I (200 U/mL; 0.5 mg/mL מהמאגר של 5 mg/mL) לתערובת המוכנה.
  6. חסימה בינונית 3 (BM3)
    1. השתמש באותו מדיום בסיס מסונן 1x HBSS / 0.5% BSA והוסיף 1M HEPES ו-0.5M EDTA כדי לקבל ריכוזים סופיים של 10 mM ו-1 mM, בהתאמה.
  7. חסימה בינונית 4 (BM4)
    1. השתמש באותו מדיום בסיס מסונן 1x HBSS / 0.5% BSA והוסיף 1M HEPES כדי לקבל ריכוזים סופיים של 10 מ"מ.
  8. בופר FACS
    1. יום לפני הניסוי, הכן את המדיום הבסיסי על ידי ערבוב 1x DPBS עם 0.5% BSA וסינון.
    2. מוסיפים 1M HEPES ו-0.5M EDTA ל-1x DPBS / 0.5% BSA כדי לקבל ריכוזים סופיים של 25 mM ו-1 mM, בהתאמה.
  9. מדיום ל-scRNAseq (MSC)
    1. יום לפני הניסוי, הכן את המדיום על ידי ערבוב 1x DPBS עם 0.4% BSA וסינון.

4. איסוף רקמות ומיקרודיסקציה (~ 40 - 50 דקות)

  1. הרדימו את העכבר באיזופלוראן והמתינו באמצעות פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות IACUC המוסדיות.
  2. השתמשו במלקחיים ומספריים עדינים כדי לחתוך את העור שבין העין לאוזן ומשיכו בעדינות כדי לחשוף את בלוטת הדמעות.
  3. כדי לבודד את הבלוטה, הרימו אותה מעט באמצעות מלקחיים עם קצה עמום והפרדו בזהירות את רקמת החיבור הסובבת על ידי גירוי עדין בתנועה מעגלית. גבולות בלוטת הדמעות נראים בבירור, מה שמאפשר הפרדה קלה מרקמות סמוכות, כולל בלוטת הפרוטיד.
  4. העבר את בלוטת הדמעות (כל בלוטה שוקלת כ-10-25 מ"ג, תלוי במשקל, מין וגיל) לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה 2 מ"ל של 1x PBS קר על קרח. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הסר את השומן שנותר וקלף בזהירות את קפסולת הרקמה המחברת באמצעות שני מלקחיים.
  5. אשר את סימון התאים על ידי בדיקת קטע רקמה קטן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה ואימות הדיווח הצפוי או אות הפלואורסצנטי לפני המשך לעיכול אנזימטי.
  6. הניחו צלחת פטרי סטרילית בקוטר 35 מ"מ על קרח והוסיפו 800-1000 מיקרוליטר של PBS קר 1x (נפח מותאם לגודל בלוטה) למרכז הצלחת. העבר בלוטת דמעות אחת ל-1x PBS.
  7. בעזרת שני סכינים סטריליים, טחנו דק את הבלוטה לחתיכות קטנות עד שתגיע למרקם רך דמוי משחה. ודאו ששברי הרקמה נשארים טבולים ב-PBS לאורך כל תהליך הטחינה, אך אל תאפשר להם לרחף בחופשיות על הצלחת.
  8. לאסוף שברי רקמה בצד אחד של הצלחת, לשאוף שאריית PBS, ולשטוף קטעים עם 1 מ"ל של PBS קר טרי.
  9. העבר שברי רקמה שנשטפו לפלטת 6 בארות המכילה 2 מ"ל לכל באר של מדיום עיכול מחומם מראש. השאירו את הצלחת על קרח עד שכל הדגימות עובדות.

5. עיכול אנזימטי ראשון (~1.5 - 2 שעות)

  1. דגרו את הצלחת באמבט מים רועדים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 60 סל"ד למשך 30 דקות.
  2. חצו בעדינות את הרקמה 15 פעמים באמצעות קצה רחב של 1 מ"ל, ואז החזירו את הפלטה לאמבט המים המרעיד בטמפרטורה של 37°C, 60 סל"ד למשך 30 דקות נוספות.
  3. פנו בעדינות את הדגימה 10 פעמים באמצעות קצה רגיל של 1 מ"ל, ואז החזירו את הפלטה לאמבטיית המים הנערת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 60 סל"ד למשך 30 דקות נוספות.
  4. בעדינות פרצו את הדגימה 10 פעמים והעבירו את תליית התא לצינורות מיקרוצנטריפוגה של דולפין בקוטר 2 מ"ל.
  5. הוסיפו 1 מ"ל BM1 קר לכל באר בצלחת כדי לאסוף את מדיום העיכול שנותר המכיל תאים שאריתיים. הנח את הצלחת על קרח עד לשלב הבא.
    הערה: אם עדיין נצפים אשכולות תאים גדולים או קטעי רקמה בשלב זה, האריך כל שלב דגירה ב-10-20 דקות נוספות. אל תעלה על מספר המעברים המוצדק (מקסימום 10-15 מעברים עדינים), שכן לחץ מכני נוסף יפגע בחיוניות התא.

6. הפסקת פעילות אנזימטית ושטיפות ראשוניות (~ 15 דקות)

  1. צנטריפוגה את הצינורות המכילים את המתלה של התא בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. השליכו את הסופרנאנט. העבירו את ה-BM1 מכל באר של הלוח הראשוני (המכיל תאים שאריתיים) לצינור המתאים ותלויים בעדינות את כדורי התא.
  3. שטוף כל באר עם 600 מיקרוליטר BM1 קר נוסף ומשלב את השטיפה עם הצינור המתאים כדי לאסוף את כל התאים שנותרו.
  4. תלה בעדינות את מתלה התא, צנטריפוגה שוב ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, וזרקו את הסופרנטנט.

7. טיפול באקוטאז ו-DNase (~ 30 - 35 דקות)

  1. הוסיפו 1 מ"ל אקווטאז לכדורי התאים ותשאו בעדינות. דגרו את הצינור רק 5-10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-60 סל"ד.
    הערה: מניחים את הצינור על צידו במהלך הדגירה כדי למנוע מהתאים להתייצב ולהיצמד לתחתית.
  2. לשלב בעדינות 10 פעמים עם קצה פיפטה של 1 מ"ל.
  3. הוסף 1 מ"ל BM2 קר כדי לסיים את התגובה האנזימטית על ידי דילול האקוטאז.
  4. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וזרוק את הסופרנטנט.
  5. החזירו את התאים למדיום לטיפול ב-DNase, וממלאים את הצינור עד למעלה.
  6. דגר במשך 10 דקות ב-RT, והשעתי בעדינות פעם אחת אחרי 5 דקות.
  7. בינתיים, הרטיב מראש מסננת תאים בנפח 70 מיקרון עם 1 מ"ל BM3 מונחת מעל צינור קוני של 15 מ"ל.
  8. העבר את מתלי התא למסננת.
  9. שטוף את צינור האיסוף המקורי עם 1 מ"ל BM3 והעבר את השטיפה לאותו מסננת.
  10. שטוף את המסננת עם עוד 5 מ"ל BM3.

8. ספירת תאים ובדיקת כדאיות

  1. קחו 10 מיקרוליטר מהמתלה המסונן ב-BM3 וערבבו עם 10 מיקרוליטר של Trypan Blue. קבעו את ריכוז התאים והכדאיות באמצעות החרגת Trypan Blue וכימות באמצעות ספירה ידנית או מונה תאים אוטומטי (למשל, Countess 3 Automated Cell Counter). המשך רק אם הקיימות עומדת בסף הנדרש ליישומים במורד הזרם (בדרך כלל ≥70-80%).
    הערה: קחו בחשבון את הנפח הכולל ~7-9 מ"ל שנמצא כעת בצינור של 15 מ"ל בעת חישוב התפוקה.
  2. המשיכו לפי היישום במורד הזרם. ל-scRNA-seq, המשיכו לסעיף 9. למיון תאים מבוסס ציטומטריית זרימה, המשיכו לסעיף 10.
    הערה: זרימת העבודה של scRNA-seq כוללת ניתוק תאי דם אדומים והסרת תאים מתים מגנטיים להפחתת פסולת ו-RNA סביבתי ושיפור איכות הנתונים. עם זאת, צעדים אלו עלולים להטות את הייצוג של סוגי התאים על ידי השפעה מועדפת על אוכלוסיות אפיתליות עדינות או נדירות, כולל תאים אקינריים. למיון מבוסס ציטומטריית זרימה, צעדים אלו הושמטו כדי למקסם את ההתאוששות ולשמר אפיטופים על פני שטח התא. לכן, בחירת זרימת העבודה צריכה להיות מונחית על ידי מטרות ניסיוניות, תוך מתן עדיפות לאיכות הנתונים עבור scRNA-seq או שחזור תאים וכדאיות למיון ויישומים במורד הזרם.

9. הכנת תאים ל-scRNA-seq (~ 1 - 1.5 שעה)

  1. הכינו תמיסת תאי דם תפוחת 1x על ידי שיקום תמיסה של 10x עם מים של milliQ.
  2. צנטריפוגה את צינור ה-15 מ"ל המכיל את מתלה התא ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וזרוק את הסופרנטנט.
  3. החזיר את כדור התא ל-5 מ"ל בופר תאי דם (RBC) 1x ודגר במשך 5 דקות ב-RT.
  4. צנטריפוגה שוב ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס וזרקו את הסופרנטנט.
  5. החזירו את כדור התא ל-2 מ"ל BM4 קר.
  6. קחו 10 מיקרוליטר של תליית התא המסוננת ב-BM4 וערבבו עם 10 מיקרו-ליטר של Trypan Blue כדי להעריך את ריכוז התא וחיוניותו.
  7. הרטיב מראש את מסננת MACS 30 מיקרון עם 1 מ"ל 1x HBSS ומסנן את מתלי התא דרך המסננת לצינור של 15 מ"ל.
  8. שטוף את צינור האיסוף הקודם ב-2 מ"ל של BM4 קר והעבר את השטיפה דרך אותו מסננת לצינור של 15 מ"ל.
  9. שטוף את המסננת עם 10 מ"ל BM4 קר נוסף.
  10. צנטריפוגה את צינור ה-15 מ"ל ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והסירו לחלוטין את הסופרנטנט.
  11. תלה בעדינות את הכדור ב-100 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי MACS ודגור ל-15 דקות ב-RT.
  12. בינתיים, הכינו 1x Binding Buffer (BB) מקיט הסרת תאים מתים באמצעות מים סטריליים עם זיקוק כפול.
  13. שטוף עמודת MS של MACS עם 500 מיקרוליטר 1x BB כדי לאזן את העמוד.
  14. הוסיפו 400 מיקרוליטר BB לדגימה, החזירו את התאים עם מיקרו-חרוזים ומרחו את כל הנפח על עמודת המיקרוסופט המאוזנת. אספו את הזרימה לצינור של 15 מ"ל.
  15. שטפו את העמודה ארבע פעמים עם 500 מיקרוליטר BB כל אחת, ואספו את כל חלקי הזרימה.
  16. צנטריפוגה את הזרימה שנאספה ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאנט.
  17. החזירו את התאים לתוך 400 מיקרו-ליטר של בופר MSC והעבירו את המתלה לצינור של 1.5 מ"ל.
  18. שטוף את השפופרת הקודמת עם בופר MSC של 700 מיקרולטר ואגד את השטיפה עם הדגימה.
  19. צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
  20. החזירו את כדור התא לבופר MSC באמצעות קצה רחב-קוטר עד לנפח סופי של כ-1.5 מ"ל.
  21. צנטריפוגה שוב ב-400 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס וזרקו את הסופרנאנט.
  22. השאירו ~100 מיקרוליטר סופרנאנט, החזירו בעדינות את הכדור, וספרו שוב את התאים על ידי ערבוב 6 מיקרוליטר תאים עם 6 מיקרוליטר Trypan Blue.
  23. כוון את הנפח הסופי עם בופר MSC כדי להגיע ל-700-1200 תאים/מיקרוליטר ולספור תאים לאישור ריכוז התאים.
  24. להבטיח שקיימות התאים לאחר ניתוק תאי דם אדומים והסרת תאים מתים ≥ 70% (בדרך כלל 70-95%) לפני הטעינה לעיבוד כרום פי 10 (תמיסת כרום יחיד 3' V3).
  25. יש ליישם קריטריוני בקרת איכות בסיסיים של scRNA: nUMI > 500, nGene > 200, ושבר גנטי מיטוכונדריאלי <15%. השתמש בסף מיטוכונדריאלי מותר (15%) לשימור אוכלוסיות אפיתל עם פעילות מטבולית גבוהה יותר. כלול רק תאים העומדים בכל קריטריוני QC בניתוחים במורד הזרם.
    הערה: ספי בקרת האיכות הללו מייצגים ערכי דוגמה שמקורם במאגרי הנתונים שלנו (איור משלים 1) ודווחו בפרסום הקודםשלנו 18.

10. הכנת תאים למיון תאים מבוסס ציטומטריה זרימה (~ 1 - 1.5 שעה)

  1. לצורך בידוד מבוסס ציטומטריית זרימה של MECs ופיברובלסטים, השתמשו בקווי עכברים Pdgfra EGFP ו-Acta2GFP, בהתאמה, כדי לאפשר זיהוי מדויק של כל אוכלוסייה.
  2. צנטריפוגה את צינור ה-15 מ"ל עם מתלה תא ב-400 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס וזרוק את הסופרנטנט.
  3. החזירו את כדור התא לבופר קר של FACS לריכוז סופי של 5 x 10⁵ עד 2 x 10,6 תאים ל-100 מיקרוליטר.
  4. הכינו את הבקרות הנדרשות לפיצוי FACS: שליטה שלילית - תאים לא מוצבעים מעכבר מסוג פראי, בקרת פלואורסצנציה רקע - תאים לא מוצבעים מעכברי Acta2GFP ו-PdgfraEGFP , בקרת צביעה בודדת - תאים מעכבר מסוג בר שנצבעו בנפרד עם כל נוגדן בשימוש בניסוי.
    הערה: לכל דגימת ביקורת, יש להשתמש לפחות בתא אחד × 10⁵ שתלויים מחדש בתוך 100 מיקרוליטר של בופר FACS.
  5. הוסיפו FcBlock (1:100) ודגרו 5 דקות על הקרח.
  6. הוסף נוגדן מונוקלונלי CD326 (EpCAM)-APC (1:100) או נוגדן מונוקלונלי CD140a (PDGFRα) (1:100). דגירה במשך 45 דקות על קרח, מוגן מאור.
  7. החזירו בעדינות את התאים כל 15 דקות במהלך דגירה של נוגדנים.
  8. מלא כל צינור עד למעלה עם בופר FACS קר וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  9. הכינו פתרון עבודה של FxCycle (1:1000) במאגר FACS.
  10. השעתי דגימות ב-1 מ"ל ובקר ב-500 מיקרוליטר של בופר FACS קר עם FxCycle.
  11. העבר את כל הדגימות לצינורות FACS ושמור אותן על קרח, מוגנות מאור.
  12. המשיכו מיד לליבת ציטומטריית הזרימה למיון. אספו תאים ממוינים לתוך FACS, מדיום תרבית, בופר ליזיס או RNAlater, בהתאם ליישומים בהמשך.
    הערה: הגדרות המכשיר (למשל, גודל הנחיה ולחץ) וקצבי האירועים תלויים בתצורת הממיין ובאוכלוסיית התאים היעד; לכן, מומלץ לבצע פילוי ראשוני כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים לכל ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרדה של בלוטות אקסוקריניות מזדקנות היא אתגר בשל הצטברות ליפידים והצטברות נרחבת של ECM. בלוטות מבוגרות מציגות חדירה לימפוציטית בולטת והרחבה בולטת של הצינורות עם חומר תוך-לומינלי, המשקפת את השינויים המבניים והדלקתיים שמסבכים את התנתקות הרקמות. בלוטת הדמעות היא איבר אקסוקריני המורכב משלושה סוגי תאי אפיתל עיקריים: תאים אצינריים, דוקטליים ומיואפיתליאליים. תאי אקינר מייצרים את הרכיבים המימיים והחלבונים של שכבת הדמעות השומרים על הידרציה בקרנית ומספקים פונקציות אנטימיקרוביאליות וריפוי פצעים. בב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אופטימיזציה והערכנו פרוטוקול משופר משמעותית לייצור תליות חד-תאיות מרקמות אקסוקריניות, תוך התמקדות בבלוטת הדמעות. באמצעות גישה זו, יצרנו תליות חד-תאיות נקיות ואיכותיות הן מ-LG ותיק והן מ-LG צעיר, המתאימים לריצוף תאים בודדים וליישומים נוספים במורד הזרם.

למרות זמינותם של פרוטוקולי דיסוציאציה של רקמות רבים, היה צורך לשנות ולייעל אותם כדי לשחזר ביעילות את אוכלוסיות התאים הפגיעות ביותר במהלך הבידוד. עקב השבריריות של אוכלוסיות תאים ספציפיות, יחד עם נוכחות סימול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות, המכון הלאומי לעיניים (NEI), ארה"ב, מענקים 5R01EY026202, R01EY035333; מענקי המכון הלאומי למחקר שיניים וקרניופציאליים (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756, ומענק המכון הלאומי לסרטן (NCI) 5R01CA271500.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרי
BSA סיגמא-אלדריץ'A4919
CaCl2 (1  פתרון M)ביוויז'ןB1010-100
קולגנאז IVסיגמא-אלדריץ'C5138
ערכת הסרת תאים מתיםMiltenyi biotec130-090-101
ערכת הסרת תאים מתיםMiltenyi biotec130-090-101
Dispase IIרושC756V28
DNase Iסיגמא-אלדריץ'DN25-100MG
DPBS גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק14190-144
סרום בקר עוברי, IgG נמוך במיוחדגיבקו# 16250078
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)קורנינג (תרמו פישר סיינטיפיק)21-022-CV
HEPES (1  פתרון M)סיגמא-אלדריץ'H0887
תמיסת איזופלוראןקוברטוס# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 ומיקרו; m)Miltenyi biotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 ומיקרו; m)Miltenyi biotec130-110-916
בינוני/F12 (DMEM/F12)מיליפורDF-042-B
MgCl2 1Mסיגמא-אלדריץ'M1028-100ML
עמודות MSMiltenyi biotec130-042-201
NaCl (מניית 5M)Invitrogen & Trade;AM9759
טבליות מלח עם בופר פוספט (PBS)סיגמא-אלדריץ'P8920-500ML
תמיסת פירוק תאי דם אדומים (10&)Miltenyi biotec130-094-183
StemPro Accutase גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיקA1110501
Trypan Blue Solution, 0.4%גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק15250061
EDTA טהור במיוחד (0.5M, pH 8.0)Invitrogen15575020
<חזקים>נוגדנים
CD140a (PDGFRA) נוגדן מונוקלונלי (APA5), APC-eFluor ו-trade; 780, Rat / IgG2a, קאפהמדעי הביולוגיה האלקטרוניים47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (חוסם FC CD16/CD32)BD Biosciences 553141; RRID:AB_394656
FxCycle&Trade; סגול כתםתרמו פישר סיינטיפיקF10347
נוגדן מונוקלונלי עכברוש CD326 (EpCAM)-APC (G8.8), עכברוש IgG2a, קאפהמדעי הביולוגיה האלקטרוניים17-579182; RRID:AB_2716944
<חזקים>עכברים
Acta2GFP  מתנה נדיבה מד"ר איבו קלאייזיץ'PMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/Jהמעבדה של ג'קסוןRRID:IMSR_JAX:007669
<חזק>ציוד
Invitrogen & Trade;   רוזנת ומסחר; 3 מונה תאים אוטומטיפישר סיינטיפיקA49862; RRID:SCR_026963

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guo, J., et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).
  2. Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).
  3. Donthineni, P. R., et al. Aqueous-deficient dry eye disease: Preferred practice pattern guidelines on clinical approach, diagnosis, and management. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1332-1347 (2023).
  4. Yuksel, S., et al. Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).
  5. Galletti, J. G., et al. Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands. Clin Immunol. 248, 109251(2023).
  6. Delcroix, V., et al. Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).
  7. Mauduit, O., et al. Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation. Front Immunol. 13, 1011125(2022).
  8. Prasad, D., et al. Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).
  9. Scholand, K. K., et al. Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands. Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).
  10. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  12. Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing. Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).
  13. Duong, A., et al. A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress. Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).
  14. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  15. Ikeuchi, T., et al. Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications. J Immunol Methods. 525, 113605(2024).
  16. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  17. Kahwaji, N. Universal Precautions. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).
  18. Delcroix, V., et al. The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice. Cells. 12 (10), 1435(2023).
  19. Mauduit, O., et al. A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands. Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).
  20. Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J Vis Exp. (148), e59602(2019).
  21. Montanari, M., et al. Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  22. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).
  23. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).
  26. Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

מאמרים קשורים