מאמר שיטה

בידוד יעיל של תאי גזע ושומנים שמקורם בשומן מרקמת שומן חזיר

DOI:

10.3791/70464

⸱

26 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Swine and Poultry Breeding Industry, College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, 2Faculty of Pharmacy, Paris Cité University, 3Chengdu DosSense Biotech Co., LTD, 4TCM Prevention and Treatment of Metabolic and Chronic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Pig Production, Chongqing Academy of Animal Science, 6College of Animal Science and Technology, Southwest University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטה סטנדרטית לבידוד יעיל של תאי גזע ומגדלי שומן שמקורם בשומן, המאופיינת בהפחתה של >90% בזמן העיבוד, חיוניות תאית גבוהה ותאימות רחבה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) הפכו לתאי זרע אידיאליים ברפואה רגנרטיבית בזכות מקורותיהם הרבים, קציר מינימלי פולשני, פוטנציאל התמיינות רב-שושלתית ותכונות אימונומודולטוריות. היישומים שלהם כוללים תיקון רקמות, מידול מחלות וטיפול תאי; עם זאת, בידוד יעיל של ADSCs בעלי חיוניות גבוהה נותר קריטי לקידום מחקר ותרגום קליני. שיטות בידוד קונבנציונליות, כגון עיכול אנזימטי בשילוב עם דיסוציאציה מכנית באמצעות פיפטינג, מוגבלות על ידי זמני עיבוד ארוכים (1–3 שעות), עמידות תאים ירודה (לעיתים <70%), ושונות משמעותית בין אצווה, מה שפוגע בניסויים במורד הזרם.

כאן נציג את מערכת SoniConvert (מערכת הפרדה מכנית מבוססת גלים), המשלבת גל מכני ועיכול אנזימטי כדי להתמודד עם אתגרים אלו. המערכת משלבת יחידת בקרה מבוססת מיקרופרוססור שמווסתת דיסוציאציה מכנית המתווכת על ידי גלים באמצעות משוב דיגיטלי, יחד עם תגובת רפייה ייעודית לרקמה המותאמת לרקמת שומן (דגירה של 5–15 דקות). גישה זו מאפשרת המרה מהירה של רקמה לתלייה חד-תאית, כאשר ניתוק מכני מתבצע תוך 3–9 שניות.

למערכת יש שלושה יתרונות: (1) עיבוד מהיר במיוחד, כאשר תהליך הבידוד הליבה—מעיכול אנזימטי ועד הפרדה ראשונית בין חלקי התא—הושלם בכ-30 דקות (>90% הפחתה בהשוואה לשיטות המסורתיות); (2) שימור חיוניות גבוה, כאשר צביעת כחול טרייפן המאשרת את חיוניות התא של 80–95%, העולה על פרוטוקולים מסורתיים; ו-(3) תאימות רחבה, שכן ההתלשות החד-תאית המתקבלות עומדות בדרישות לתרבות תא ראשונית, ציטומטריית זרימה, בדיקות ציטוטוקסיות ובניית אורגנואיד שומן. על ידי הפחתת זמן העיבוד, שיפור שלמות התאים והגבלת השונות הזו, מערכת זו מספקת פלטפורמה מעשית למחקר הקשור לשומן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs), תת-קבוצה קריטית של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) המבודדים מרקמת שומן, מציגים פוטנציאל טיפולי משמעותי בשל נגישותם, קציר מינימלי פולשני, יכולת רבייה חזקה, פוטנציאל התמיינות רב-שושלתית, ותכונות פאראקריניות ואימונומודולטוריות חזקות 1,2,3,4 . תכונות אלו מיקמו את ADSCs כמועמדים מבטיחים לרפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות ואימונותרפיה. עם זאת, התועלת התרגומית של ADSCs תלויה ביכולת לבודד אוכלוסיות טהירות ובלתי שלמות פונקציונלית—תהליך שנותר מאתגר מבחינה טכנית. הביולוגיה הייחודית של רקמת השומן מציבה שני מכשולים עיקריים: (1) תכולת השומנים הגבוהה של השומנים הופכת אותם לנטייה לקרע במהלך עיבוד מכני, משחררת ליפידים חופשיים שמזהמים את חלק הווסקולרי הסטרומלי (SVF) ופוגעים בחיוניות התאים ומניבים 5,6; ו-(2) המורכבות המבנית של הרקמה, הכוללת פאציה, תאי אנדותל, תאי חיסון ורכיבי דם7, מסבכת את ההפרדה של תאים שמקורם בשומן. מגבלות אלו מדגישות את הצורך הדחוף בשיטה יעילה, מהירה ושומרת חיוניות לבידוד ADSCs ושומנים איכותיים, שהם קריטיים לא פחות ליישומים בהמשך כמו מידול מחלות מטבוליות וטיפולים מבוססי תאים.

קיימות כיום מספר שיטות מבוססות לבידוד תאים שמקורם בשומן, כולל עיכול אנזימטי, תרבית צמחייה והפרדה מכנית 8,9,10. עיכול אנזימטי, הגישה הפופולרית ביותר, משתמש בקולגנאז לפירוק רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM), ומשחרר תאי גזע עטופים. שיטה זו כוללת בדרך כלל טחינת רקמות, עיכול קולגנאז (37°C, 1–2 שעות), בידוד SVF באמצעות צנטריפוגה, וטיהור תרביות דבק. בעוד שיעיל לפירוק ECM, העיכול האנזימטי סובל מחסרונות בולטים: זמן עיבוד ממושך (3–4 שעות בסך הכל), הסתמכות על נפחי דגימות גדולים, וסיכונים לציטוטוקסיות אנזימטית או שונות בין אצווה מקולגנזות שמקורן בבעלי חיים — כולם מונעים תרגום קליני. תרבית אקספלנט, המנצלת נדידת תאי גזע ממקטעי רקמה, מניבה תאים עם שמר-חיוניות אך סובלת מתפוקה נמוכה והתאוששות תאים מאוחרת (7–10 ימים). דיסוציאציה מכנית, שתלויה בהפרעות פיזיות (למשל, תנודה, גזירה), מקצרת את זמן העיבוד אך לעיתים פוגעת בשלמות התא, מה שמוביל להפחתת החיוניות ולאוכלוסיות לא טהורות. ביחד, שיטות אלו אינן מצליחות ליישב בין יעילות, טוהר וכדאיות—קריטריונים קריטיים לבידוד תאים בדרגה קלינית. לכן, אנו מציעים שיטה חדשה לבידוד תאים שמקורם בשומן (שדיפוציטים ו-ADSCs) המשלבת עיכול אנזימטי עם דיסוציאציה מכנית מתווכת גל11. גישה זו משיגה שני התקדמויות מרכזיות: (1) יעילות זמן: על ידי שילוב קוקטיילים של אנזימים מותאמים מראש, ללא בעלי חיים, עם גלים מכניים בתדר נמוך, זמן העיבוד הכולל מתקצר מ-3–4 שעות ל~30 דקות (איור 1); (2) שימור חיוניות: פיזור מכני עדין ממזער קרע ושחרור שומנים של הדיפוציטים. חשוב לציין כי מסגרת הזמן של 30 דקות מתייחסת לזרימת הבידוד המרכזית (עיכול, ניתוק מכני, סינון וצנטריפוגה ראשונית) לקבלת חלקי שומן ו-SVF גסים; שלבי טיהור אופציונליים במורד הזרם, כגון פירוק תאי דם אדומים (RBC), דורשים זמן טיפול נוסף.

שיטת בידוד תאי השומן המותאמת שלנו מדגימה פוטנציאל משמעותי ליישום במגוון תחומים מחקריים וקליניים. במחקר יסודי, התאים בעלי היכולת הגבוהה שהתקבלו מציגים ביצועים יוצאי דופן במחקרי התמיינות אדיפוגנית ואוסטאוגנית, ומספקים מקור תאים אמין ליישומי הנדסת רקמות. ברפואה תרגומית, מחקרים קליניים הראו את הפוטנציאל הטיפולי של ADSCs בטיפול במצבים כמו אוסטיאוארתריטיס12, מחלות לב וכלי דם13, טרשת נפוצה14, ומחלת מעי דלקתית (IBD)/מחלת קרוהן15. ה-ADSCs המבודדים במהירות משמשים כאבני בניין אידיאליות לבניית אורגנואידים של רקמת השומן וליישום יישומי טיפול תאי, ומקדמים משמעותית את מחקר סקר התרופות ומודלים של מחלות. יתרה מזאת, תליות חד-תאיות איכותיות מתאימות לריצוף RNA חד-תאלי. לסיכום, גישה משולבת זו יוצרת פלטפורמה טכנולוגית חזקה לרקמת שומן, התומכת הן במחקר בסיסי והן בתרגום קליני ברפואה רגנרטיבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל מחקרי בעלי החיים נערכו בהתאם לתקנות לניהול עניינים הנוגעים לבעלי חיים ניסיוניים (משרד המדע והטכנולוגיה, סין, עודכנו במרץ 2017), ואושרו על ידי ועדת האתיקה והרווחה של בעלי החיים של אוניברסיטת סצ'ואן החקלאית (מספר אישור: 20230089). פרוטוקול זה דורש שימוש במערכת SoniConvert, מכשיר מסחרי לניתוק רקמות בסיוע גלים מכני (להלן מערכת הדיסוציאציה המכנית). הפרוטוקול מותאם לרקמת שומן חזירית, וההסתמכות שלו על ציוד מיוחד זה היא מגבלה מרכזית.

1. איסוף והכנת רקמת השומן

  1. חיטוי והסרת שיער לפני ניתוח
    1. הורד את החזיר באמצעות מנת יתר תוך-ורידית של פנטוברביטל נתרן (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאשר את המוות לפני איסוף רקמות.
    2. יש להניח גזה סטרילית טבולה ביודופור 2% לחיטוי ספירלי של גב החזיר, המשתרע עד 15 ס"מ מהקו האמצע. אפשר להתייבש למשך 30 שניות.
    3. השתמשו בסכין גילוח סטרילית כדי לגלח את השיער מאזור בגודל 16 ס"מ × 8 ס"מ. ודאו שכל השיער מוסר מאזור הניתוח.
    4. נגב את הגב פעמיים עם 75% אתנול עם גזה סטרילית.
  2. איסוף רקמות שומן
    1. עשה חתך רוחבי של 20 ס"מ לאורך קו האמצע הגבי עם סכין סטרילית.
    2. הרם את קצה החתך עם מלקחיים סטריליים. נתח לאורך המישור הטבעי בין רקמת השומן לדרמיס כדי לקבל שכבה עליונה מלאה של יריעת רקמת שומן תת-עורית (ULB) בעובי של כ-2–3 מ"מ.
    3. שטפו את ה-ULB פעם אחת במלח סטרילי קרח והניחו אותו בצלחת תרבית סטרילית (איור 2).

figure-protocol-1
איור 2: איסוף ULB של חזיר לבידוד תאים. (א) איור של מבנה רקמת השומן של גב חזיר; (ב) אתר החיתוך של במה מיניפיג; (ג) הצגת רקמת השומן האחורית, שומן תת-עורי בגב חזיר מכיל שתי שכבות: השכבה העליונה (ULB) והשכבה הפנימית (ILB); (ד) ULB שנאסף. קיצור: ULB = השכבה העליונה של הגב; ILB = שכבה פנימית של הגב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

נקודת הפסקה: רקמת השומן שנאספה יכולה להישמר בתמיסת מלח קרירה או בתמיסת D-Hanks בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לתקופה קצרה לפני ניתוח נוסף.
הערה: המטרה היא לגבות את ה-ULB. הימנעו מהכללת השכבה התחתונה של רקמת השומן התת-עורית האחורית (ILB) במהלך הדיסקציה.

  1. כריתת רקמת שומן וניקוי
    1. הוסיפו 10 מ"ל של D-Hanks Buffer קרח לכל 1.8 גרם רקמה לצלחת וודאו שהרקמה טבולה לחלוטין.
    2. זיהוי וכריתת כל כלי הדם הנראים מהרקמה באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים. הסר כל רקמת חיבור ורכיבים פיברוטיים. השליכו את החומרים שנכרתו למיכלים מסוכנים לביולוגיה.
      הערה: יש להיזהר מאוד בעת טיפול בכלים חדים; תמיד חתכו מהגוף והשליכו את הלהבים והמספריים המשומשים במיכלים חדים מיד לאחר השימוש.
    3. שטוף את הרקמה בתוך בופר D-Hanks כדי להסיר שאריות דם ופסולת.
      הערה: לדגימות עם המטומה מופרזת, החליפו את הבופר פי 1–3 לפי הצורך כדי להשיג בהירות ויזואלית. שמרו על כל שלבי הניתוח על הקרח כדי לשמור על חיוניות הרקמה.
  2. דיסוציאציה מכנית של רקמת השומן
    1. העבר 1.8 גרם מחלקי הרקמה השטופים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 800 מיקרוליטר של בופר פירוק רקמות מסוג A (A-buffer) לצינור.
    2. באמצעות מספריים עיניים סטריליים, טחנו את הרקמה בצינור לחתיכות קטנות בגודל של כ-1–2 מ"מ 3 אינץ'.
      הערה: אם נצפתה דליפה משמעותית של השומנים במהלך או לאחר הטחינה, שטפו שוב את הרקמה ב-1 מ"ל של תמיסת D-Hanks מקוררת מראש לפני הממשיכים לעיכול אנזימטי להסרת שומנים משומנים שבורים. שלב זה שומר על שלמות הדיפוציטים לניתוח במורד הזרם.

2. בידוד תאים והומוגניזציה

  1. עיבוד אנזימטי
    1. הוסיפו 200 מיקרוליטר של חומר פירוק רקמות מסוג A (תמיסת סוג A) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. סובבו ונערו בעדינות את הצינור ביד 3 פעמים כדי לערבב את התכולה ולוודא שחלקי השומן טבולים לחלוטין בתמיסת הדיסוציאציה.
    2. תוודא שהפקק סגור היטב. הניחו את הצינור באמבט מתכת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ודוגרו במשך 5–10 דקות.
      הערה: יש לעקוב אחרי התמיסה עד שהיא הופכת עכורה ושברי הרקמה נראים מעוכלים חלקית. תמיסת A-Type מכילה קולגנאז ופרוטאז ניטרלי. לבש כפפות ניטריל, מעיל מעבדה ומשקפי מגן בעת הטיפול. להימנע ממגע עור; אם יש חשיפה, שטוף מיד במים רבים למשך 15 דקות. A-Buffer לא ייזרק לאחר הוספת פתרון מסוג A.
  2. דיסוציאציה מכנית בסיוע אולטרסוני
    1. העבר את שברי רקמת השומן המעוצלים חלקית יחד עם הבופר הסובב מצינור המיקרוצנטריפוגה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל המיועד למערכת הדיסוציאציה המכנית.
    2. הרץ את התוכנית המוקדמת לרקמת שומן במערכת הדיסוציאציה המכנית לביצוע דיסוציאציה מכנית באמצעות גל סינוסואידלי בתדר 200 הרץ.

3. סינון להשגת תלייה חד-תאית

  1. סינון וצנטריפוגה
    1. אספו את תליית התא והעבירו אותה דרך מסננת תאים בקוטר 200 מיקרון לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מ"ל כדי להסיר פסולת גדולה וגושי רקמה לא מעוכלים.
    2. הוסף 5 מ"ל של תמיסת D-Hanks מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) למסננת. שטוף את המסננת עם תמיסת D-Hanks פעמיים כדי למקסם את תפוקת התאים.
    3. צנטריפוגה את מתלה התא המסונן בטמפרטורה של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      נקודת הפסקה: לאחר הצנטריפוגה, ניתן לעבד מיד את תליית התא או להשאיר על הקרח לזמן קצר לפני הפרדת השכבות.
    4. איסוף אדיפוציטים: לאיסוף האדיפוציטים, לשאוב ולהשליך את שכבת השומנים הסופרנטנטית באמצעות פיפט פסטור סטרילי, תוך השארת 1 מ"ל של בופר להגנה על שכבת הדיפוציטים. אסוף את השכבה השנייה לניתוח במורד הזרם של השומנים. הימנע מהפרעה לשכבה השלישית והרביעית.
    5. איסוף SVF (שבר וסקולרי סטרומלי): לאחר הסרת השכבות העליונות, יש להחזיר בעדינות את הכדור התחתון המכיל את שבר הווסקולר סטרומלי (SVF) ב-1 מ"ל של D-Hanks/PBS. החזירו את כדור התא בעדינות ל-1 מ"ל D-Hanks/PBS כדי להגיע לריכוז תאים של 2–5 ×-106 תאים/מ"ל.
      הערה: באופן אידיאלי, ניתן לראות ארבע שכבות לאחר הצנטריפוגה: שכבת השומנים בחלק העליון; השכבה השנייה המכילה שומרים; השלישית היא שכבת הבופר ההידרופילית; והשכבה התחתונה היא SVF, המכילה תאי גזע (איור 1).
  2. פירוק תאי דם אדומים
    1. הערה: אם כדור התא מציג צבע אדום משמעותי, המצביע על זיהום תאי דם, בצע ליזיס תאי דם אדומים.
      החזירו את כדור התא ל-1–3 מ"ל של בופר ליזיס תאי דם אדומים (RBC) באמצעות פיפטה P1000 עם קצוות רחבי קינה. דגרו על קרח במשך 15 דקות עם ערבוב מדי פעם.
    2. קירור מראש את כל התמיסות ורוטורי הצנטריפוגות עד 4 מעלות צלזיוס כדי למזער פעילות מטבולית במהלך העיבוד.
    3. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
    4. שטוף את התאים שוב על ידי השעיית הכדור ב-5 מ"ל של תמיסת D-Hanks מקוררת מראש וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
  3. השעיה סופית
    1. החזירו את הגלולה הסופית של התא ב-D-Hanks/PBS ליישומים במורד הזרם.

4. יישומים וניתוח במורד הזרם

  1. הערכת עמידות תאי SVF ותפוקת תאים
    1. הכינו את מתלה תא SVF שמתקבל בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. תשאיר את המתלה על הקרח עד השימוש.
    2. מערבבים 10 מיקרוליטר מתלה תא SVF עם 10 מיקרוליטר של תמיסת Trypan Blue של 0.4% בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 0.5 מ"ל. הפיפט בעדינות למעלה ולמטה 3 פעמים כדי להבטיח ערבוב אחיד.
      הערה: הריכוז הסופי של Trypan Blue בתערובת הוא 0.2%. הימנע מהחדרת בועות אוויר במהלך הערבוב, שכן הן עלולות להפריע לספירה אוטומטית של תאים.
      העבר 10 מיקרוליטר מתערובת התאים הצבועה למחסנית ספירה המתאימה למונה התאים האוטומטי. ודא שהדגימה ממלאת את התא לחלוטין ללא הצפה.
    3. הכנס את שקופית הספירה למונה התאים. בחר את סוג הבדיקה Trypan Blue והתאם את טווח הריכוז של התאים במידת הצורך.
    4. לחץ על כפתור הספירה כדי להפעיל ספירה אוטומטית של סלולרים. המכשיר יצלם תמונות של תא הספירה ויבחין אוטומטית בין תאים חיים לתאים מתים.
    5. רשמו את אחוז העמידות של התאים וספרו את סך כל התאים הקיימים המוצגים על מסך המכשיר. בצע שלוש מדידות עצמאיות לכל דגימה וחשב את החיוניות הממוצעת ואת תפוקת התאים לגרם רקמת שומן.
      הערה: נקה את שקופית הספירה ואת פתח הטעינה של המכשיר עם 70% אתנול לאחר כל שימוש כדי למנוע זיהום צולב בין הדגימות.
  2. תצפית על מורפולוגיית השומניות
    1. צבע את הדיפוציטים המבודדים ב-5 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst לגרעינים ו-1 מיקרומום BODIPY לליפידים ב-D-Hanks/PBS למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      נקודת הפסקה: לאחר הצביעה, יש לצלם דגימות במהירות; אם יש צורך, ניתן להגן עליהם מאור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לזמן קצר לפני מיקרוסקופיה.
    2. השתמשו במערכת זכוכית עם כיסוי שקופיות ידידותית לשומנים בעצמכם להכנת שקופית כדי למנוע דחיסת התאים.
    3. התבוננו בגרעינים (צבועים ב-Hoechst) ובטיפות השומן (צבועות ב-BODIPY) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
      הערה: בשל גודלם הגדול (20–300 מיקרון) ותכולת הליפידים הגבוהה, שדיפוציטים שבירים, נוטים לצוף ולהצטבר לשכבות מרובות, מה שהופך את שיטות ההרכבה המסורתיות לבלתי מתאימות לתצפית מיקרוסקופית ברורה (איור 3A). כדי להתמודד עם זה, פותחה מערכת הרכבה ביתית ידידותית לדיפוציטים באמצעות מחסניות וכיסוי סטנדרטיים (איור 3B).
  3. טיהור רכיבי כלי דם סטרומליים ותצפית מורפולוגית על ADSCs
    1. זרע את ה-SVF המבודד זה עתה בבקבוק תרבית תאים T25 המכיל 5 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
    2. אחרי 48 שעות, שטפו בעדינות את הבקבוקון פעמיים עם PBS מחומם מראש כדי להסיר תאים לא דביקים לזה. הוסף מדיום תרבית טרי והמשך את הדגירה.
    3. החליפו את מדיום התרבית כל 2–3 ימים. מעקב אחרי מורפולוגיית התאים והמפגש שלהם תחת מיקרוסקופ הפוך.
    4. כאשר התאים מגיעים ל-80–90% מפגש (בדרך כלל לאחר 7–10 ימים), נתק את התאים באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA למשך 3–5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לנטרל עם מדיום תרבית ולאסוף את תליית התא.
    5. בצע צביעת Trypan Blue כדי לזהות את חיוניות התא לפני זיהוי ומיון FACS.
    6. התבוננו במורפולוגיה של ה-ADSCs המטוהרים תחת מיקרוסקופ אופטי.
    7. מסננים את תליית התא שנאספה דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרון כדי להסיר את האגרגטים שנותרו. החזירו את התאים ב-PBS המכילים 2% FBS לצורך ניתוח FACS.
    8. צבעו את התאים בנוגדנים פלואורוכרום נגד CD73, CD90, CD11b ו-CD45 למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.
    9. שטוף את התאים פעמיים עם בופר צביעה והשלים מחדש ב-PBS המכיל 2% FBS.
    10. בצע ניתוח ציטומטרי זרימה באמצעות פיה של 70 מיקרון בעוצמה של 20 psi וקצב זרימה מתחת ל-3.0.
    11. יש להוציא פסולת תא על ידי גייטינג לאוכלוסייה הראשית באמצעות פרמטרים של שטח פיזור קדמי (FSC-A) ואזור פיזור צד (SSC-A).
    12. הסר דאבלטים באמצעות שער FSC-A לעומת FSC-H ובחר את אוכלוסיית הסינגלטים הרלוונטית לניתוח במורד הזרם.
    13. לנתח תאים סגורים על בסיס ביטוי סימני פני השטח. השתמשו ב-CD73 ו-CD90 כסמנים חיוביים וב-CD11b ו-CD45 כסמנים שליליים לאימות הפנוטיפ של ADSC.
    14. התבונן במורפולוגיה של ה-ADSCs המועשרים והמוגברים תחת מיקרוסקופ אופטי. מורפולוגיה אופיינית בצורת ציר דמוית פיברובלסטים מצביעה על העשרה מוצלחת של ADSC.
  4. התמיינות אדיפוגנית ב-ADSC
    1. זרע את הדור השלישי של ADSCs בצפיפות של 1 × 104 תאים/סנטימטררבוע. כאשר המפגש של התאים מגיע לכ-90%, התחילו השראה אדיפוגנית.
    2. הכינו את מדיום ההשראה האדיפוגני באמצעות מדיום Eagle's Modified (DMEM) של Dulbecco עתיר גלוקוז, המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), 0.5 mM 3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין (IBMX), 1 מיקרומום דקסמתזון, 10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין ו-1 מיקרומום רוזיגליטזון.
    3. לאחר 3 ימים של אינדוקציה, החלף את המדיום לתחזוקה והחלף את התמיסה כל יומיים.
    4. לאחר 14 ימי השראה, צבעו את התאים בשמן אדום O וצפו בטיפות השומן תחת מיקרוסקופ הפוך.
  5. התמיינות אוסטאוגנית ב-ADSC
    1. כאשר מפגש התאים מגיע ל-80–90%, יש להתחיל באינדוקציה אוסטאוגנית. הרכיבו את מדיום ההשראה האוסטאוגנית עם DMEM גבוה שמכיל 10% FBS, 10 mM β-גליסרופוספט, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית, 10 מיקרומום קלציטריול ו-1 מיקרומום דקסמתאזון.
    2. החלפת המדיום כל 2–3 ימים והמשיכה בתהליך ההשראה למשך כ-14 ימים.
    3. צבעו את התאים ב-2% Alizarin Red S (pH 5.2) וצפו בהם תחת מיקרוסקופ הפוך.
  6. בניית וזיהוי אורגנואיד
    1. הכינו תלייה חד-תאית של ADSCs במדיום תרבית מלא ומכוונים את ריכוז התאים ל-2 ×10 4 תאים/20 מיקרוליטר.
    2. הפוך את המכסה של צלחת תרבית בקוטר 100 מ"מ ושפך טיפות של 20 מיקרו-ליטר של תליית התא על פני הפנים של המכסה.
    3. הוסיפו PBS סטרילי לתחתית הצלחת לשמירה על לחות, כסו את המכסה בזהירות, ודוגרו את טיפות התלייה בתנאי תרבית סטנדרטיים.
    4. התבוננו בטיפות מדי יום ואפשרו לתאים להצטבר וליצור ספרואידים למשך 6 ימים.
    5. אספו את הספרואידים בעדינות באמצעות פיפטה והעבירו אותם למטריחל מקורר מראש על קרח.
    6. הטמיעו את הספרואידים ב-Matrigel וצלחו את התערובת לצלחות תרבית לפני הדגירה בתנאי תרבית סטנדרטיים.
    7. החלף את המדיום באופן קבוע ועקוב אחרי צמיחת האורגנידים עד הימים 18–28, אז המבנים הופכים לקומפקטיים ובשילים.
    8. מקבע את האורגנידים עם 4% פאראפורמלדהיד, חדיר אותם עם 0.1% טריטון X-100, וחסום קישור לא ספציפי עם 5% BSA.
    9. דגרו את הדגימות בנוגדנים ראשוניים נגד CD73, CD90, CD11b ו-CD45, ואז דגרו אותן עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים מתאימים.
    10. צבעו את האורגנידים ב-Hoechst ו-BODIPY כדי להמחיש גרעינים וטיפות שומן, בהתאמה, וצפו בדגימות המוצבעות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
      הערה: לבצע מיון תאים וכל המניפולציות הכוללות תרביות פתוחות, כולל זריעה, האכלה והכנת צביעה, בתנאים אספטיים קפדניים בארון בטיחות ביולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: איור סכמטי של תהליך בידוד התאים שמקורו בשומן. התרשים מציג את השיטה המסורתית ואת השיטה הנוכחית כזרימות עבודה להמחשה. שלושה שלבים עיקריים מעורבים בבידוד תאים שמקורם בשומן: הראשון הוא טיפול מוקדם; השני הוא פירוק רקמת השומן לשחרור התאים; והאחרון הוא הפרדת התאים באמצעות סינון וצנטריפוגה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מציג גישה משולבת חדשה לבידוד תאים שמקורם בשומן (בעיקר שומנים ו-ADSCs) המתמודדת עם מגבלות קריטיות של שיטות קונבנציונליות. על ידי שילוב רפיון אנזימטי ספציפי לרקמה עם דיסוציאציה מכנית מדויקת של גלים, מערכת זו משיגה מהירות (זמן עיבוד כולל ~30 דקות), חיוניות גבוהה (80–95%) ובידוד תאים שניתן לשחזר.

עיכול אנזימטי קונבנציונלי, אף שהוא נפוץ מאוד, נשען על דגירה ממושכת של קולגנאז (1–3 שעות) ופיפטינג מכני קשה, מה שמוביל לשחרור שומנים מקריעים של שומנים שהתפוצצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר זייי ג'או וג'יאיינג יו קשורים לחברת צ'נגדו דוסנס ביוטכנולוגיה בע"מ, שמייצרת את מערכת SoniConvert (SC-L1W) ואת ערכת ניתוק רקמות השומן (TM008) המשמשת בפרוטוקול זה. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Li M: 32421005 ו-32225046, Lu L: 32472857); פרויקטי המדע והטכנולוגיה של אזור שיזאנג האוטונומי של סין (XZ202501ZY0147 ל-M.L.); הקרן הסינית למדעי הפוסט-דוקטורט (Lu L: 2024M763881); המימון המיוחד לפוסט-דוקטורט בצ'ונגצ'ינג (Lu L: 2023CQBSHTB3098); תוכנית ההכשרה הלאומית/המחוזית לתואר ראשון בחדשנות ויזמות (Lu L: 202510626001); ופרויקט המרכזי למדע וטכנולוגיה חקלאית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת דיסוציאציה של רקמות מסוג AדוקסנסTM001מכיל סוג של חומר פירוק רקמות (תמיסת סוג A) וסוג A של בופר פירוק רקמות (A-buffer).
ערכת מדיום התמיינות אדיפוגניתאוריסלGUXMD-90031משמש להבדלה אדיפוגנית, כולל מדיום Eagle's Modified (לא שונה) ואמצעי תחזוקה של Dulbecco עם רמות רמות גלוקוז גבוהות
אליזרין רד SאוריסלA5533ALIR-10001צביעת מינרליזציה לצורך התמיינות אוסטאוגנית (pH 5.2)
חומצה אסקורביתסיגמא-אלדריץ'A4544חומצה L-אסקורבית, תרבית תאים שנבדקה, לצורך השראה אוסטאוגנית
מיניפיגים של באמהצ'נגדו דוסי לניסויים בע"מזכרים בני שנה, בעלי חיים בדרגת SPF, המוחזקים תחת נהלי חיסון, טיפול נגד תולעים וניקוי סטנדרטיים.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863
04.html
מונה תאים אוטומטי Bio-Rad TC20מעבדות ביו-ראד1450011מונה תאים אוטומטי להערכת כדאיות ותפוקה
בודיפיתרמו פישר סיינטיפיקD3922כתם שומן ניטרלי
BSA (5%)סיגמא-אלדריץ'A9418אלבומין סרום בקר, אבקה ליופילית, לחסימה
קלציטריולסיגמא-אלדריץ'C97561α,25-דיהידרוקסיויטמין D3, לאינדוקציה אוסטאוגנית
מסננת תא (70 ו-mu; m)קורנינג352350פלקון 70 & mu; מסננת תא M, סטרילית, להכנת דגימה ב-FACS
מסננת תאים (200 & mu; m)pluriSelect43-50200-03pluriStrainer, רשת PET, מתאימה לצינורות של 50 מ"ל, סטרילית 
צינור צנטריפוגה (50 מ"ל)קורנינג352098פלקון 50 מ"ל צינור חרוטי בהיר מאוד, סטרילי, פוליפרופילן
שקופית ספירה (עבור Bio-Rad TC20)מעבדות ביו-ראד1450011שקופית ספירה דו-תאית למונה תאים אוטומטי של TC20  
מנה תרבותית (100 מ"מ)קורנינג430167צלחת פוליסטירן סטרילית, ליצירת אורגנואיד טיפות תלויים
דקסמתזוןסיגמא-אלדריץ'D4902≥ 98%, לאינדוקציה אדיפוגנית ואוסטאוגנית
תמיסת מלח מאוזנת D-Hanks או PBSגיבקו10010015מקורר מראש ל-4 ו-°ג; C, pH 7.4.
DMEMגיבקו11965084זה משמש לגידול SVF מבודד טרי
DNase IביוטייםD7073אופציונלי, מומלץ אם נשמרים גושים.
אתנולסיגמא-אלדריץ'45983675% לחיטוי משטח.
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקוA4736201מערכת טט מאושרת, מקור אמריקאי, סטרילי  
ציטומטר זרימהBD ביוסיינססBD FACSCanto II3 לייזרים (405 ננומטר, 488 ננומטר, 633 ננומטר), 8 ערוצי פלואורסצנציה, לניתוח סימני משטח (CD73, CD90, CD11b, CD45), עומדים ב-70 figure-materials-1 מ' של פיה ב-20 psi
מיקרוסקופ פלואורסצנציהאולימפוסמודל הפוך או זקוף המסוגל למערכות סינון FITC ו-DAPI.
נוגדנים משניים פלואורסצנטייםתרמו פישר סיינטיפיקA-11001 (נגד עכברים), A-11008 (נגד ארנב)אלקסה פלואור מצומדת, לאימונופלואורסצנציה
נוגדנים פלואורוכרום מצומדים (CD73, CD90, CD11b, CD45)BD ביוסיינסס561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)לניתוח ציטומטרי זרימה של פנוטיפ ADSC
הוכסטתרמו פישר סיינטיפיקH3570צבע גרעיני להערכת תאים חיים/מתים.
IBMXסיגמא-אלדריץ'I5879≥ 99% (HPLC), עבור מדיום אינדוקציה אדיפוגני
סליין סטרילי קרחבקסטר2F7124הזרקת כלוריד נתרן 0.9%, ייחודית, לשטיפת רקמות
אינסוליןסיגמא-אלדריץ'I9278רקומביננט, מבוטא בשמרים, לאינדוקציה אדיפוגנית
יודופורסיגמא-אלדריץ'25104תמיסת חיטוי 2%.
מטריג'לקורנינג354230גורם גדילה מופחת, פנול חופשי מאדום, להטמעת ספרואידים 
מטאל באת'סרוויסביוSMB-Hמשמש לדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
שמן אדום OאוריסלOILR-10001צביעת שומנים להבחנה בין שומנים
מיקרוסקופ אופטיאולימפוסמיקרוסקופ בהיר סטנדרטי עם 10x– 40x יעדים.
ערכת מדיום התמיינות אוסטאוגניתאוריסלGUXMD-90021משמש להתמיינות אוסטאוגנית, כולל מדיום איגל המותאם של דולבקו (לא משודרג) ואמצעי תחזוקה
פיפטת P1000 עם קצוות רחבי קדחבקמן קולטרB01113קצות רחבי קדח Biomek P1000 Span-8, סטרילי
פאראפורמלדהיד (4%)תרמו פישר סיינטיפיקJ61899תמיסה מימית, לקיבוע אורגנואידים 
פיפטת פסטורקורנינג7095S-5Cסטרילי, חד פעמי.
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו1507006310,000 U/mL פניצילין, 10,000 & mu; g/mL סטרפטומיצין, סטרילי 
פנטוברביטל נתרןHikma Pharmaceuticals USA Inc.24201-010-20הזרקה, להמתת חסד (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף, תוך ורידי). ANDA 203619 
נוגדנים ראשוניים (CD73, CD90, CD11b, CD45)BD ביוסיינסס561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)לצביעת חיסון אורגנואידית
בופר ליזיס תאי דם אדומים (RBC)סולרביולוגיהR1010אם נדרש ליישומים במורד הזרם.
צנטריפוגה מקוררתאפנדורף5702Rמשמש לשלבים של צנטריפוגציה ב-4 מעלות צלזיוס.
רוזיגליטאזוןקיימן כימיקל71740≥ 98%, PPAR&GAMMA; אגוניסט לאינדוקציה אדיפוגנית
מכולת שארפסבקטון דיקינסון305270מיכל עמיד לדקירות ללהבים ומספריים משומשים
מערכת ההכנה למתלים חד-תאיים SoniConvertדוקסנסSC-L1Wמשמש להתנתקות מכנית של רקמות.
בופר צביעה (בופר צביעת ציטומטריית זרימה)eBioscience (תרמו פישר סיינטיפיק)00-4222-57200 מ"ל, מוכן לשימוש, מכיל FBS ו-0.09% נתרן אזיד כחומר משמר, לדילול נוגדנים ותאי, צביעת פני שטח ושטיפה בציטומטריית זרימה;
צינור אפנדורף סטרילי בנפח 1.5 מ"לאפנדורף30121.517צינור מיקרו-צנטריפוגה Safe-Lock, סטרילי, לטחינת רקמות
מנה של תרבות סטריליתקורנינג430167צלחת תרבית סטרילית בגודל 100 מ"מ על 20 מ"מ, לאיסוף רקמות
מלקחיים סטרילייםסקלאר96-1719מלקחי אגודל סטריליים, משוננים, לטיפול ברקמות 
גזה סטריליתתאגיד דוקאל7060033רפידות גזה סטריליות, לחיטוי וניגוב
מספריים עיניים סטרילייםסקלאר10023-580מספריים קפיציים בסגנון ואנאס, לטחינת רקמה ל-1-2 מ"מ ומעלה; חלקים
סכין גילוח סטרילית3M9681סכין הכנה כירורגית, להסרת שיער מאזור הניתוח
סכין סטריליתאינטגרה מילטקס4-415סכין סטרילית חד-פעמית, לביצוע חתך
מספריים כירורגיים סטרילייםסקלאר10022-580מספריים סטריליים של קשתית Merit, לניתוח כלי דם ורקמות חיבור  
בקבוק תרבית תאים T25קורנינג430639בקבוק תרבית תאים Falcon T25, מכסה מאוורר, סטרילי
טריטון X-100 (0.1%)סיגמא-אלדריץ'T8787דרגת מעבדה, לחדירות ו-nbsp;
טרייפן בלוגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק15250061תמיסה של 0.4% לספירת כחיות תאים.
טריפסין-EDTA (0.25%)גיבקו252000560.25% טריפסין, 1 mM EDTA, לניתוק ADSCs
β-גליסרופוספטסיגמא-אלדריץ'G9422מלח דיסודיום פנטהידרט, לאינדוקציה אוסטאוגנית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, Y., et al. An update on adipose-derived stem cells for regenerative medicine: where challenge meets opportunity. Adv Sci. 10 (20), 1-27 (2023).
  2. Wang, L., et al. A review of adipose-derived mesenchymal stem cells’ impacts and challenges: metabolic regulation, tumor modulation, immunomodulation, regenerative medicine and genetic engineering therapies. Front Endocrinol. 16, 1606847(2025).
  3. Suchanecka, M., et al. Adipose derived stem cells – sources, differentiation capacity and a new target for reconstructive and regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036(2025).
  4. Su, H., et al. Bridging the gap: clinical translation of adipose-derived stem cells - a scoping review of clinical trials. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 288(2025).
  5. Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. (156), e60485(2020).
  6. Attané, C., Estève, D., Moutahir, M., Reina, N., Muller, C. A protocol for human bone marrow adipocyte isolation and purification. STAR Protoc. 2 (3), 100629(2021).
  7. Emont, M. P., Rosen, E. D. Exploring the heterogeneity of white adipose tissue in mouse and man. Curr Opin Genet Dev. 80, 102045(2023).
  8. Uguten, M., et al. Comparing mechanical and enzymatic isolation procedures to isolate adipose-derived stromal vascular fraction: a systematic review. Wound Repair Regen. 32 (6), 1008-1021 (2024).
  9. Villanueva-Carmona, T., Cedó, L., Núñez-Roa, C., Maymó-Masip, E., Vendrell, J., et al. Protocol for the in vitro isolation and culture of mature adipocytes and white adipose tissue explants from humans and mice. STAR Protoc. 4 (4), 102693(2023).
  10. Cohen, M., et al. Adipose tissue explant culture using PDMS flow chambers: an alternative to static explant culture. Adipocyte. 14 (1), (2025).
  11. Liu, Y., Zhao, H., Yu, J., et al. A novel laboratory-based strategy for single adipocyte and adipose-derived stem cells extraction for transplantation: an experimental research. Aesthet Plast Surg. 49, 367-379 (2025).
  12. Tangkanjanavelukul, P., et al. Cartilage regeneration potential in early osteoarthritis of the knee: a prospective, randomized, open, and blinded endpoint study comparing adipose-derived mesenchymal stem cell (ADSC) therapy versus hyaluronic acid. Int J Mol Sci. 26 (17), 8476(2025).
  13. Qayyum, A. A., et al. Effect of allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal stromal cell treatment in chronic ischaemic heart failure with reduced ejection fraction – the SCIENCE trial. Eur J Heart Fail. 25 (4), 576-587 (2023).
  14. Arab, F. L., et al. Safety and feasibility of intravenous fresh adipose-derived mesenchymal stem cells in secondary progressive multiple sclerosis: phase I/IIa clinical results. Stem Cell Res Ther. 17, 120(2026).
  15. Sheykhhasan, M., et al. Therapeutic potential and mechanistic insights into adipose-derived stem cells and mesenchymal stem cell-derived exosomes in patients with Crohn’s disease-associated fistulas: challenges and future perspectives. Stem Cell Res Ther. 16, 664(2025).
  16. Dufau, J., et al. In vitro and ex vivo models of adipocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C822-C841 (2021).
  17. Ghazal, S. K., et al. Adipose tissue-derived stem cells: a comparative review on isolation, culture, and differentiation methods. Cell Tissue Bank. , 1-16 (2021).
  18. Zhu, R., et al. Isolation methods, proliferation, and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells from different fat depots in bovines. Mol Cell Biochem. , (2023).
  19. Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of adipose tissue nuclei for single-cell genomic applications. J Vis Exp. (160), e61230(2020).
  20. Basatvat, S., Bach, F. C., Barcellona, M. N., et al. Harmonization and standardization of nucleus pulposus cell extraction and culture methods. JOR Spine. 6 (1), e1238(2023).
  21. Escudero, M., et al. Scalable generation of pre-vascularized and functional human beige adipose organoids. Adv Sci. 2301499, 1-20 (2023).
  22. Mandl, M., et al. An organoid model derived from human adipose stem/progenitor cells to study adipose tissue physiology. Adipocyte. 11 (1), 164-174 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Adipose Derived Stem CellsAdipocyte IsolationPorcine Adipose TissueMechanical DissociationEnzymatic DigestionStromal Vascular FractionCell ViabilitySingle Cell SuspensionFluorescence MicroscopyAutomated Cell Counter

מאמרים קשורים