הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ריצוף RNA חד-תאי של רקמת ריאה במודל עכברוש של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה

435 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70491

⸱

7 באפריל 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי לניתוח ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) של רקמת ריאה במודל עכברוש של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). הוא מפרט את השלבים מהקמת מודל מושרה על ידי LPS ועד לניתוח ביואינפורמטי, מזהה 21 אשכולות תאים ו-6 תת-אוכלוסיות של מקרופאג'ים, ומדגיש מסלולים דלקתיים מרכזיים המעורבים בפתוגנזה של ARDS.

תקציר

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא מחלת ריאה דלקתית חמורה עם תמותה גבוהה, המאופיינת בתגובות חיסוניות לא מוסדרות ונזק אלוואולרי, אך ההטרוגניות התאית שלה נותרה בלתי מובנת לחלוטין. רצף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מציע רזולוציה חסרת תקדים לניתוח מנגנונים ספציפיים לסוג תא, אך יישומו ב-ARDS מוגבל בשל שונות טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי לניתוח scRNA-seq של רקמת ריאה במודל ARDS של חולדות שנגרמו על ידי LPS (LPS). שיטה זו כוללת פירוק רקמתי אופטימלי, בקרת איכות קפדנית, הסרת דאבלטים, תיקון אפקט באצווה, וצינורות ביואינפורמטיים מקיפים לאשכולות, הערות וניתוח ביטויים דיפרנציאליים. הגישה שלנו מזהה באופן אמין 21 אוכלוסיות תאים מובחנות וחושפת שש תת-אוכלוסיות של מקרופאג'ים/מונוציטים עם חתימות שעתוק ייחודיות ב-ARDS. ניתוח ביטוי גנים שונה והעשרה תפקודית ספציפית לתת-אשכולות זיהו עוד גנים ונתיבים מרכזיים העומדים בבסיס פתוגנזה של ARDS. תהליך העבודה הניתן לשחזור זה מאפשר אפיון מעמיק של גיוון תאי, מסלולים דלקתיים ויעדים טיפוליים מועמדים, ומספק בסיס איתן למחקרים מכניים ותרגומיים ב-ARDS.

מבוא

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא מחלת נשימה חריפה המאופיינת בדלקת ריאה מפוזרת ובבצקת ריאתית לא קרדיוגנית, המתבטאת בעיקר בהיפוקסמיה מתקדמת וכשל נשימתי 1,2. המנגנונים הפתולוגיים של ARDS כוללים מפלים דלקתיים לא מאורגנים, הפרעה במחסום אלוואולרי-קפילרי, והפעלה ואינטראקציות לא תקינות של סוגי תאי חיסוןמרובים 3,4. במהלך התקדמות ה-ARDS, תאי החיסון ברקמת הריאה מניעים מפלים דלקתיים באמצעות הפרשת מתווכים דלקתיים ומווסת תגובות חיסוניות, ובכך משבשים את אנדותליום הריאה, מפעילים את מפל הקרישה החיצוני ומחמירים את פגיעת הריאה 5,6,7. עם זאת, ההבנה הנוכחית של מנגנוני פתולוגיה ברמת התא ב-ARDS נותרה מוגבלת, מה שמגביל את פיתוח טיפולים פרמקולוגיים ספציפיים, בעוד שאסטרטגיות הניהול הנוכחיות מורכבות בעיקר ממודאליות שונות של תמיכה בחמצן ואוורור מכני1. אפיון מעמיק של הטרוגניות תאית ושינויים דינמיים במהלך פתוגנזה של ARDS הוא בעל חשיבות עליונה לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות ולפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות 8,9,10.

הופעת טכנולוגיית ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) הביאה פריצות דרך מהפכניות במחקר ריצוף ה-RNA, ואפשרה לנו לנתח הטרוגניות תאית ודינמיקה פונקציונלית בפתוגנזה של מחלות11,12. בהשוואה לריצוף RNA בכמויות גדולות מסורתי, טכנולוגיית scRNA-seq יכולה לזהות תת-אוכלוסיות תאים נדירות אך קריטיות, לחשוף תהליכים דינמיים של מעברים בין מצבי תא, ולגלות רשתות אינטראקציה בין-תאיות מורכבות, מידע שלעיתים מוסתר בניתוחים ברמת האוכלוסייה 13,14,15. מחקרי scRNA-seq עדכניים ב-ARDS השיגו התקדמות משמעותית, כולל זיהוי חתימות ביטוי גנים ספציפיות של מונוציטים, גילוי דפוסי קיטוב לא תקינים של מקרופאגים, והבהרת רשתות תקשורת בין-תאיות פרופיברוטיות 16,17,18,19 . ממצאים אלו לא רק מעמיקים את הבנתנו את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ARDS אלא גם מספקים תובנות חדשות על התפתחות סמנים ביולוגיים, סטרטיפיקציה של מחלות וטיפול מדויק20,21.

עם זאת, מחקר ARDS scRNA-seq הנוכחי מתמודד עם אתגרים, כולל תקנון מתודולוגי לא מספק, הבדלים משמעותיים בפרוטוקולי עיבוד דגימות, וצינורות ניתוח נתונים לא עקביים, המגבילים את השחזוריות של תוצאות המחקר ויישומיהן הקליניים בתרגום22,23. פרוטוקול זה מתמודד עם האתגרים הטכניים הקשורים לניתוח scRNA-seq של רקמת ריאות ARDS על ידי אופטימיזציה של הליכים לעיבוד רקמות, בקרת איכות וניתוח נתונים, ובכך מספק בסיס למחקרים מכניים ופיתוח טיפולי. הגישה הסטנדרטית מבטיחה שחזוריות בין מעבדות שונות ומקלה על מחקרים השוואתיים במחקר ARDS של הטרוגניות תאית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שנים-עשר זכרים חסרי פתוגן ספציפיים (SPF) מסוג Sprague-Dawley (SD), בגילאי 6–7 שבועות ומשקלם 220 גרם ± 10 גרם, נרכשו מ-Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (מספר רישיון בעלי חיים: SCXK (Jing) 2025-0008). העכברים אוחסנו במרכז בעלי החיים המעבדה של בית החולים דונגג'ימן, אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג, בהתאם לתקן הלאומי "דרישות בעלי חיים למעבדה לסביבה ולמתקני דיור" (GB 14925-2010, שהונפק על ידי הוועדה הטכנית לתקינה של בעלי חיים במעבדות הלאומית של סין). ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים ואתיקה של בית החולים דונגג'ימן, אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג (מספר אישור: 24-54). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הקמת מודלים ואיסוף דגימות

הערה: לפני הניסוי, יש להכניס את כל העכברים לתקופת הסתגלות של שבוע כדי למזער את ההשפעות הנגרמות מלחץ.

  1. המיס את Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) במי מלח של 0.9% כדי לקבל תמיסה של 0.4 mg/mL LPS.
  2. חלק באקראי 12 חולדות זכרים SPF של ספרג-דולי (SD) לשתי קבוצות: קבוצת ביקורת (n = 6) וקבוצת מודל ARDS (n = 6).
  3. מתן 0.9% מלח באמצעות הזרקה תוך-קנה במינון של 0.5 מ"ל/100 גרם משקל גוף לקבוצת הביקורת.
  4. מתן תמיסת LPS של 0.4 מ"ג/מ"ל באמצעות הזרקה תוך-טרכלית באותו נפח (0.5 מ"ל/100גרם) לקבוצת המודלים של ARDS, ולאחר 16 שעות הרדמה את העכברים באמצעות איזופלוראן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
  5. איסוף דם דרך האאורטה הבטנית, ואז צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 1000 × גרם, 30 דקות) לקבלת סרום.
  6. פתח את חלל החזה והוצא רקמת ריאה.
  7. לבצע שטיפה ברונכואלואולרית דרך גזע הסימפונות באמצעות מזרק כדי לקבל נוזל שטיפה ברונכואלוואולרי (BALF)24,25.
  8. קצור את האונה הריאתית הימנית ושוטף אותה עם PBS לבדיקה פתולוגית נוספת.
  9. קצור את האונה הריאתית השמאלית ושוטף אותה ב-PBS לצורך ריצוף תאים בודדים וניסויים בביולוגיה מולקולרית26,27.

2. הערכה היסטופתולוגית של רקמת הריאה

  1. טבלו את רקמת הריאה הימנית שנקטפה של חולדות ב-4% פאראפורמלדהיד לקיבוע למשך 12 שעות.
  2. לאחר הקיבוע, ייבשו את הרקמה באמצעות סדרה מדורגת של אתנול (70%, 80%, 90%, 95%, 100% ו-100%), ומאפשרים 2 שעות בכל ריכוז.
  3. טפל ברקמה המיובשת בקסילן עד שהיא הופכת לשקופה.
  4. חדרו את הרקמה השקופה עם פרפין מותך בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
  5. הניחו את בלוק הרקמה המוחדר לתוך תבנית מוטמעת, שפכו פנימה פרפין טרי, ותנו לו להתקרר ולהתגבש לבלוק פרפין.
  6. חתך את בלוק הפרפין לפרוסות בעובי 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום, צף את החלקים באמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס כדי לפזר אותם, ואז אסף אותם עם מחסניות מצופות פולי-אל-ליזין.
  7. אפו את הסליידס בתנור של 60 מעלות צלזיוס כדי להבטיח הידבקות יציבה של החלקים לסלייד.
  8. דה-פרפין של החלקים על ידי הטבילה בקסילן והידרציה מחדש דרך גרדיאנט יורד של אתנול (100%, 95%, 90%, 80% ו-70%).
  9. שטוף את החלקים עם PBS, בצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE), והתקן את הכיסוי באמצעות שרף נייטרלי.
  10. הערכו את פגיעת הריאות בחלקים סרוקים עם שקופית שלמה באמצעות מערכת ניקוד סטנדרטית המבוססת על חדירת נויטרופילים, דלקת בין-מונית, בצקת וגודש.
    הערה: כל פרמטר דורג מ-0 עד 4 בהתבסס על היקף המעורבות הפתולוגית: 0 (אף אחד); 1 (≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)28,29.

3. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים

הערה: ניתן לשמור על הדגימות בטמפרטורה של -80°C אם לא ניתן לבצע ניתוח מיד לאחר הרכישה.

  1. המיס את התקנים ואפשר להם לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, ואז לבצע דילול סדרתי לפי הוראות היצרן.
  2. הכינו את תמיסת הנוגדנים הביוטינילית, את תמיסת הפעולה הקונג'וגטית של האנזים, ואת בופר השטיפה כפי שמצוין במדריך.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר מכל דגימה או 100 מיקרוליטר של תקנים מדוללים סדרתית לבארות המצופות בנוגדנים, ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  4. שטפו את הצלחת 4 פעמים עם מכונת ניקוי צלחות, מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ביוטינילית, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. שטפו את הצלחת 4 פעמים, מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת אנזימים קונגוגטיבית, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  6. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע לבאר, דגר מפני אור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  7. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר, ערבב בעדינות, ומדד את הצפיפות האופטית (OD) ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.
  8. יצר עקומה סטנדרטית על ידי ציור ערכי ה-OD מול ריכוזים סטנדרטיים באמצעות התוכנה שתוכננה.
  9. קבעו את ריכוזי הדגימה בהתבסס על ערכי ה-OD שנמדדו והעקומה הסטנדרטית.

4. הכנת תליות חד-תאיות לצורך ריצוף

הערה: לאחר קבלת רקמת הריאה, יש להניח אותה על קרח ולעבד אותה במהירות כדי לשמור על חיוניות התאים.

  1. שטוף את רקמת הריאה 3 פעמים עם PBS מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. מוסיפים 2 מ"ל של PBS מקוררים מראש ופורקים אותם לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים סטריליים לגודל של כ-0.5 מ"מ 3 אינץ'.
  3. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להעביר את הרקמה הטחונה יחד עם PBS לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
  4. הוסף 1 מ"ל נוסף של PBS מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס לצלחת התרבית, שטוף ותלוש מחדש את שברי הרקמה שנותרו, והעבר את המתלה לאותו צינור.
  5. כוונן את הנפח ל-6.5 מ"ל עם PBS מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס, עכל קטעי רקמה בתמיסת אנזימים המכילה קולגנאז I (100 U/mL) ודיספאזה II (1 U/mL), ודגר בניעור עדין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  6. כאשר שברי הרקמה הופכים לשקופים, ואין חלקים מוצקים ברורים, סננו את הרקמה המעכלת דרך מסננות תאים בגודל 70 מיקרון ו-40 מיקרון, ואז בצנטריפוגה (4° C, 500 × גרם, 5 דקות) וזרקו את הסופרנאנט.
  7. מיד תלויות מחדש את הכדור ב-3 מ"ל של בופר ליזיס תאי דם אדומים (RBC), ערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג, ומרחים על קרח למשך 10 דקות.
  8. כאשר הסופרנטנט נראה צהוב חיוור או כמעט חסר צבע, הוסף 7 מ"ל PBS לסיום התגובה, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), והשליך את הסופרנאנט.
  9. הוסף 3 מ"ל PBS כדי להחזיר את התאים ולקבוע ריכוז וחיוניות התאים באמצעות צביעת כחול טרייפן.
    הערה: אם חיוניות התאים נמוכה מ-70%, יש לבצע הליך הסרת תאים מתים.
  10. שטפו את התאים פעמיים עם בופר שטיפה המכיל 0.04% אלבומין סרום בקר (BSA) המוכן ב-DPBS.
  11. החזירו את התאים לספירה וכווננו את הריכוז ל-1,000 תאים/מיקרוליטר לצורך טעינה וזיהוי נוספים.

5. בקרת איכות לנתוני ריצוף תא יחיד

הערה: ספריות RNA חד-תאיות הוכנו מהשעיות תא באמצעות שיטת בניית ספרייה חד-תאית מבוססת טיפות. הספריות סומנו על פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה באמצעות כימיה לריצוף מבוססת ננו-כדורי DNA. כ-21,000 תאים נטענו בכל ספרייה, במטרה לשיעור התאוששות של ~60%. הרצף יצר סך של 5.0 ×-108 קריאות לספרייה, עם עומק ממוצע של 30,000-40,000 קריאות לתא. נתוני ריצוף גולמיים עובדו באמצעות צינור ניתוח RNA חד-תאי מתאים ליצירת מטריצת ביטוי גנים לכל דגימה.

  1. בנה את ספריית Oligo באמצעות PCR ותיוג ברקוד, תוך הבטחת ריכוז >10 ng/μL וגודל שיא של 180 bp ±10 bp.
  2. הרכיבו את ספריית ה-cDNA באמצעות פיצוץ, תיקון קצה, קישור מתאם ו-PCR, תוך הבטחת ריכוז >10 ng/μL וגודל שיא של 350–550 bp.
  3. יצירת אובייקט Seurat לכל דגימה ממטריצת ביטוי הגנים באמצעות פונקציית Read10X בחבילת Seurat (v4.3.0) בתוכנת R (v4.2.0).
  4. הסרת תאים באיכות נמוכה על ידי סינון של תאים עם שיעור הגן המיטוכונדריאלי >10%) או שיעור הגן ההמוגלובין >5%.
  5. נרמל את הנתונים באמצעות שיטת "LogNormalize" עם מקדם קנה מידה של 10,000.
  6. זהה תכונות משתנות מאוד באמצעות שיטת "vst" ושמר את 2,000 הגנים המובילים לניתוח במורד הזרם.
  7. לבצע ניקוד מחזור תא באמצעות גני סמן מחזור התא המובנים של Seurat ולהחזיר את השפעות מחזור התא (G2M. Score ו-S.Score) במהלך סקיילינג נתונים.
  8. זהה והסרת דאבלטים פוטנציאליים באמצעות DoubletFinder (v2.0.3) כאשר pN = 0.25, pK = 0.09, וקצב כפול צפוי של 0.06, והוציא אותם מהמשך הטיפול.
  9. נכון אפקטי אצווה בין דגימות באמצעות חבילת Harmony (v0.1.1) עם תטא = 2 ו-max.iter.harmony = 20.
  10. הוסף עמודות מידע לשמות דגימות בודדות ופרטי קיבוץ של קבוצת המודל וקבוצת הביקורת של ARDS למטא-דאטה באובייקט Seurat.

6. הפחתת ממדיות, קיבוץ והערות סוג תא

  1. לבצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) על גנים משתנים מאוד באמצעות פונקציית RunPCA ב-Seurat.
  2. קבעו את המספר האופטימלי של הרכיבים העיקריים באמצעות ויזואליזציה של ElbowPlot.
  3. זיהוי אשכולות תאים עיקריים על ידי יישום אלגוריתם ליידן באמצעות פונקציית FindClusters של Seurat ופונקציית FindNeighbors ברזולוציה של 0.1.
  4. בצע הפחתת ממדיות UMAP באמצעות הרכיבים העיקריים שנבחרו.
  5. יש לזהות סוגי תאים על ידי זיהוי גני סמנים עם פונקציית FindAllMarkers.
  6. המחישו את ביטוי הגנים של הסמנים בין סוגי תאים באמצעות פונקציית DotPlot.
  7. הוסף עמודת מידע חדשה של תוצאות אנוטציה של תאים למטא-דאטה והמחיש אנוטציה של סוג תא באמצעות Umap.
  8. חשב את היחס של כל קבוצת ניסוי בתוך כל סוג תא מזוהה באמצעות פונקציות dplyr לספירת תאים ולחישוב אחוזים.
  9. צור גרפים של עמודות מוערמים עם ggplot2 כדי להמחיש את הרכב הקבוצות לכל סוג תא, כולל תוויות אחוזים והשוואות סטטיסטיות בין קבוצות.

7. ניתוח תת-אוכלוסייה

  1. לחלץ את תת-האוכלוסייה של תא היעד באמצעות פונקציית תת-הקבוצה וליצור אובייקט Seurat מתאים לניתוח ברמת תת-האוכלוסייה במורד הזרם.
  2. נרמול מחדש ושינוי קנה מידה של נתוני תת-האוכלוסייה תוך כדי הנחת גנים מיטוכונדריאליים, גני המוגלובין, ספירות UMI וציוני מחזור תאים.
  3. לבצע ניתוח PCA משני וליישם תיקון אצווה של Harmony במיוחד עבור תת-האוכלוסייה.
  4. בצע קיבוץ מחדש באמצעות פונקציות FindNeighbors ו-FindClusters לזיהוי תת-סוגים מובחנים בתוך תת-אוכלוסיות תאים יעד.
  5. יצירת הטמעות UMAP חדשות והמחשת אשכולות תת-אוכלוסיות עם הערות מסוג תאים, בהתאם לאותה גישה שתוארה קודם.

8. ניתוח ביטוי גנים שונה

  1. זיהוי גנים המובעים באופן שונה (DEGs) בין קבוצת מודל ARDS לקבוצת הביקורת עבור כל תת-אשכול באמצעות שיטת MAST הסטטיסטית.
  2. שלב רגרסיה משתנה סמויה לשליטה על השפעות עומק ריצוף במהלך בדיקות ביטוי דיפרנציאלי.
  3. סינון DEGs בהתבסס על ספי שינוי לוג פולד מוגדרים מראש וערכי p מותאמים באמצעות פונקציית FindMarkers.
  4. צור גרפים של הרי געש עם פונקציית ggplot לכל תת-אשכול כדי להמחיש דפוסי ביטוי גנים שונים עם תיוג מובהק.
  5. ייצא תוצאות DEG ויצר טבלאות סיכום מקיפות כדי להקל על העשרה פונקציונלית וניתוחים נוספים במורד הזרם.

9. ניתוח העשרה

  1. מפי סמלי גנים למזהי ENTREZ באמצעות הארגון. Rn.eg.db מאגר הערות לתאימות ניתוח מסלולים.
  2. משלבים DEGs מכל תת-האשכולות וסיננו גנים משמעותיים בהתבסס על ספי שינוי log fold וערכי p מותאמים (מבחן סכום דירוג Wilcoxon, logfc.threshold = 0.25, p_val < 0.05).
  3. בצע ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים (GO) באמצעות העשרת פונקציית GO עם קטגוריות תהליך ביולוגי, פונקציה מולקולרית, אונטולוגיית רכיבי תאי ושיטת תיקון בנג'מיני-הוכברג.
  4. ביצוע ניתוח העשרת מסלולים של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) באמצעות פונקציית העשירה KEGG במסד הנתונים של אורגניזמים של חולדות ויישום ספי מובהקות סטטיסטיים.
  5. יצרו גרפים נקודתיים לתוצאות העשרה של GO ו-KEGG באמצעות פונקציית dotplot, המציגים את 15 האיברים המועשרים משמעותית העליונים עם יחסי גנים וערכי p מותאמים.
  6. יצא תוצאות העשרה כקבצי CSV ושמור גרפים ויזואליזציה לפרשנות ניתוח מסלולים מקיף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

צביעת HE ברקמת ריאה של חולדה הראתה מבנים אלוואולריים ברורים עם דלקת מינימלית בביקורת, בעוד שקבוצת מודל ARDS הציגה חללים אלוואולריים מעוותים, דפנות מעובים וחדירה משמעותית לתאי דלקת, כפי שמודגם בציוני פגיעות ריאה תואמות (איור 1A–E). רמות גבוהות של IL-6, TNF-α ו-IL-1β ב-BALF ובסרום אישרו מידול מוצלח ותגובה דלקתית מערכתית (איור 2A–F). ניתוח ScRNA-seq לאחר בקרת איכות חשף 21 אשכולות תאים מובחנים, הכול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מציג גישה סטנדרטית לניתוח ריצוף RNA חד-תאי של רקמת ריאה במודל עכברוש לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). תוצאות אלו מדגימות את ההקמה המוצלחת של מודל ה-ARDS המושרה על ידי LPS, כפי שאושר על ידי בדיקה היסטופתולוגית, ציוני פגיעות ריאה גבוהים ורמות מוגברות של ציטוקינים דלקתיים ב-BALF ובסרום. ניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי חשף 21 אוכלוסיות תאים מובחנות, עם עלייה ניכרת במאקרופאג'ים/מונוציטים, נויטרופילים ותאי דנדריט ברקמות ARDS. אפיון נוסף של תת-אוכלוסיות מקרופאג'ים/מונוציטים זיהה שישה א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לתמיכה מהפרויקט האופקי של בית החולים דונגג'ימן, אוניברסיטת הרפואה הסינית בבייג'ינג (HX-DZM-202114).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.4% תמיסת טרייפן בלוגיבקו, ארה"ב15250061
4% פאראפורמלדהידסרוויסביו, סיןG1101
אלבומין סרום בקר (BSA)סנגון ביוטק, סיןA600332-0005
קולג'נאז Iייסן, סין40507ES60
CurveExpertפיתוח היימסגרסה 1.4
Dispase IIייסן, סין40104ES60
Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) סיגמא, ארה"בL6511
צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE)סולארביו, סיןG1120
רצף גנים בתפוקה גבוהה  MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
מעכב פוספטאזביוטכנולוגיה ביוטיים, סיןP1081
תמיסת בופר עם פוספטסולארביו, סיןP1020
PMSFסולארביו, סיןR0010
R software לוסנט טכנולוגיות, ארה"בv4.2.0
rat IL-1β ערכת ELISA4אביו, סיןCRE0006
ערכת RAT IL-6 ELISA4אביו, סיןCRE0005
עכברוש TNF-α ערכת ELISA4אביו, סיןCRE0003
בופר ליסיס תאי דם אדומים (RBC)סולארביו, סיןR1010
בופר פירוק תאי דם אדומיםטיאנגן ביוטק, סיןRT122-1
מים ללא RNaseאמביון, ארה"בAM9937
בופר TE, pH 8.0אמביון, ארה"בAM9858
בופר העברת טריס-גליציןסרוויסביו, סיןG2017

מקורות

  1. Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
  2. Gragossian, A., Siuba, M. T. Acute respiratory distress syndrome. Emerg Med Clin North Am. 40 (3), 459-472 (2022).
  3. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  4. Huang, Q., Le, Y., Li, S., Bian, Y. Signaling pathways and potential therapeutic targets in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Respir Res. 25 (1), 30(2024).
  5. Cutolo, M., Campitiello, R., Gotelli, E., Soldano, S. The role of M1/M2 macrophage polarization in rheumatoid arthritis synovitis. Front Immunol. 13, 867260(2022).
  6. Scozzi, D., Liao, F., Krupnick, A. S., Kreisel, D., Gelman, A. E. The role of neutrophil extracellular traps in acute lung injury. Front Immunol. 13, 953195(2022).
  7. Zheng, J., Li, Y., Kong, X., Guo, J. Exploring immune-related pathogenesis in lung injury: providing new insights into ALI/ARDS. Biomed Pharmacother. 175, 116773(2024).
  8. Qiao, Q., Liu, X., Yang, T., Cui, K., Kong, L., Yang, C., Zhang, Z. Nanomedicine for acute respiratory distress syndrome: The latest application, targeting strategy, and rational design. Acta Pharm Sin B. 11 (10), 3060-3091 (2021).
  9. Bonaventura, A., et al. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat Rev Immunol. 21 (5), 319-329 (2021).
  10. Yıldırım, F., Karaman, İ, Kaya, A. Current situation in ARDS in the light of recent studies: classification, epidemiology and pharmacotherapeutics. Tuberk Toraks. 69 (4), 535-546 (2021).
  11. Huminiecki, Ł Bulk and single-cell RNA sequencing elucidate the etiology of severe COVID-19. Int J Mol Sci. 25 (6), 3280(2024).
  12. Riemondy, K. A., et al. Single cell RNA sequencing identifies TGF-β as a key regenerative cue following LPS-induced lung injury. JCI Insight. 5 (8), e123637(2019).
  13. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  14. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. Int J Oral Sci. 13 (1), 36(2021).
  15. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  16. Zhang, F., Wei, K., Slowikowski, K. Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry. Nat Immunol. 20 (7), 928-942 (2019).
  17. Mulder, K., Patel, A. A., Kong, W. T. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaau0964(2019).
  19. Kang, Z. Y., et al. Heterogeneity of immune cells and their communications unveiled by transcriptome profiling in acute inflammatory lung injury. Front Immunol. 15, 1382449(2024).
  20. Wang, H. P., et al. Single-cell transcriptome analysis of the mouse lungs during the injury and recovery periods after lipopolysaccharide administration. Inflamm Res. 73 (12), 2087-2107 (2024).
  21. Yao, C., et al. Cell-type-specific immune dysregulation in severely ill COVID-19 patients. Cell Rep. 34 (1), 108590(2021).
  22. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  23. Su, M., et al. Data analysis guidelines for single-cell RNA-seq in biomedical studies and clinical applications. Mil Med Res. 9 (1), 68(2022).
  24. Yang, Q., et al. The interaction of macrophages and CD8 T cells in bronchoalveolar lavage fluid is associated with latent tuberculosis infection. Emerg Microbes Infect. 12 (2), 2239940(2023).
  25. Zheng, L., et al. Single-cell transcriptome sequencing reveals the immune microenvironment in bronchoalveolar lavage fluid of checkpoint inhibitor-related pneumonitis. Cancer Immunol Immunother. 74 (4), 128-145 (2025).
  26. Shi, X. Y. Single-cell transcriptomic analysis of radiation-induced lung injury in rat. Biomol Biomed. 24 (5), 1331-1349 (2024).
  27. Huang, H., et al. Single-cell RNA sequencing uncovered the involvement of an endothelial subset in neutrophil recruitment in chemically induced rat pulmonary inflammation. Int J Med Sci. 19 (4), 669-680 (2022).
  28. Kosaka, J., et al. Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats. PLoS One. 8 (5), e63606(2013).
  29. Hassan, N. H., El-Wafaey, D. I. Histopathological scoring system role in evaluation of electronic cigarette's impact on respiratory pathway in albino rat: Biochemical, histo-morphometric and ultrastructural study. Tissue Cell. 79, 101945(2022).
  30. Wang, P., et al. Single-cell suspension preparation from Nile Tilapia intestine for single-cell sequencing. J Vis Exp. (192), e64321(2023).
  31. Wang, F., et al. Integrating bulk and single-cell sequencing reveals the phenotype-associated cell subpopulations in sepsis-induced acute lung injury. Front Immunol. 13, 981784(2022).
  32. Zi, S. F., et al. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  33. Zi, S. F., Wu, X. J., Tang, Y., Liang, Y. P. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  34. Hurskainen, M., et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12 (1), 1565(2021).
  35. Zhou, X., Zhang, C., Yang, S. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733(2024).
  36. Zhao, C. Q., et al. Heterogeneity of T cells and macrophages in chlorine-induced acute lung injury in mice using single-cell RNA sequencing. Inhal Toxicol. 34 (13-14), 399-411 (2022).
  37. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  38. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  39. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  40. Dun, Y., et al. PTTG1 promotes CD34+CD45+ cells to repair the pulmonary vascular barrier via activating the VEGF-bFGF/PI3K/AKT/eNOS signaling pathway in rats with phosgene-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 162, 114654(2023).
  41. Liu, Z., Wei, J., Sun, H., Xu, L. Plumbagin ameliorates LPS-induced acute lung injury by regulating PI3K/AKT/mTOR and Keap1-Nrf2/HO-1 signalling pathways. J Cell Mol Med. 28 (13), e18386(2024).
  42. Guo, Y., Zhang, H., Lv, Z., Du, Y. Up-regulated CD38 by daphnetin alleviates lipopolysaccharide-induced lung injury via inhibiting MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway. Cell Commun Signal. 21 (1), 66(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ARDS
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.