ויזואליזציה וניתוח כמותי של הפעלת PARP1/PARP2 המושרת על ידי גנוטוקסין בתאים באמצעות מדווח מבוסס חלבון פיוז'ן פלואורסצנטי

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטה לוויזואליזציה מבוססת תאים, לוקאליזציה תת-תאית וניתוח כמותי של מוקדים מועשרים בפולי(ADP-ריבוז) (PAR) בתאי יונקים קבועים. מבחן זה מאפשר לכימות אתרים של הפעלת PARP הנגרמת מנזק DNA, כולל זה הקשור לתיקון כריתת בסיס או תיקון שבירה חד-גדילית, בגרעינים של תאים שנחשפו לגנוטוקסין.

תקציר

פולי(ADP-ריבוז) (PAR) הוא פולימר של ADP-ריבוז שמסונתז על ידי ארבעה חברים ממשפחת האנזימים ADP-ריבוז פולימראז—PARP1, PARP2, PARP5a ו-PARP5b. עם זאת, רק PARP1 ו-PARP2 מסנתזים PAR בתגובה לשבירות DNA. PAR מוגדר כשינוי חלבון לאחר תרגום, אך הוכח גם כקיומו כשינוי DNA או RNA. רמות ה-PAR מווסתות עוד יותר על ידי PARG, גליקוהידרולז PAR אשר יחד עם PARP1 ו-PARP2 מווסת את רמת התאים של PAR הנגרמת מנזק DNA. הסינתזה הדינמית וההתדרדרות של PAR הן קריטיות לתפקידו הרגולטורי בתיקון DNA ולתגובה לנזק ה-DNA, אשר בתורו משפיע על ארגון מחדש של הכרומטין, שכפול, שעתוק ומוות תאים. הפעלת PARP1/PARP2 והצטברות PAR נחשבים לאתרים של תיקון כריתת בסיס מתמשך או תיקון שבירת DNA חד-גדילי; עם זאת, מפעילים רבים של PARP1/PARP2 קשורים גם ללחץ שכפול ותהליכים מטבוליים אחרים של DNA. לאחר היווצרותן, שרשראות PAR מקלות על גיוס גורמי תיקון DNA ותגובה לנזק DNA (DDR) לאתרים של נזק DNA או פגיעה גנומית דרך תחומי הקישור PAR (PBDs). עשרה PBDs שונים מזהים אזורים שונים במולקולת PAR, כולל מוטיב הקשירה של PAR, אצבע אבץ קושרת PAR, דומיין WWE ומקרודומיין, בין יתר PBDs. כדי להקל על ניתוח תאי של דינמיקת PAR, השתמשנו ב-PBDs הממוזגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) כדי לאופטימיזציה של כימות תאי של מוקדי PAR. אנו מתארים בדיקה המשתמשת בקטע של RNF146 המקודד את תחום PBD/WWE, המקושר ל-EGFP, כדי להמחיש ולכמת את הצטברות PAR באתרים של פגיעה גנומית וב-BER או SSBR מתמשך. אנו מתארים שלבים ניסיוניים, כולל ייצור חלקיקי לנטי-ויראליים, העברת קו התאים היעד, טיפול בתאי יונקים לגרימת נזק גנטי DNA, רכישת מיקרוגרפים פלואורסצנטיים קונפוקליים, וכימות חצי-אוטומטי של הנתונים.

מבוא

פרוטוקול זה מתאר את מבחן LivePAR, המאפשר ויזואליזציה וניתוח כמותי של פוליאפור(ADP-ריבוז) (PAR) באתרי פגיעה גנומית, בעיקר הקשורים לתיקון כריתת בסיס (BER) או תיקון שבירה חד-גדילית (SSBR), בתאים יונקים ^1,2,3. BER הוא מסלול חיוני לתיקון DNA שמסיר בסיסים פגומים או מותאמים מ-DNA (לסקירות על BER ופארילציה, ראו 4,5,6,7). BER מתחיל בגליקוזילאז DNA שמזהה ומסיר את הבסיסים^{המעודכנים 4}, ומשאירים אתר אפוריני/אפירימידיני (AP), לדוגמה, גליקוזילאז מתיל פורין (MPG), שמפרק את הבסיסים המתילטים ^8,9, או 8-אוקסוגואונין גליקוזילאז (OGG1), שמבצע כריתת 8-oxoG ^9,10. אתרי AP נחתכים לאחר מכן על ידי אנדונוקלאז AP 1 (APE1)^11,12,13, ויוצרים חתך בעמוד השדרה של ה-DNA. פולימראז, כלומר DNA פולימראז β (Polβ)^14,15, תופר וממלא את הפער באמצעות החוט הלא פגוע כתבנית, ולבסוף, ליגות DNA אוטמות את החוט המתוקן^16,17, לדוגמה, DNA ligase I או DNA ligase III.

שחקני מפתח ב-BER ו-SSBR הם פוליאטראזים 1 ו-2 (PARP1/PARP2)18,19,20, אנזימים שמזהים במהירות שבירות גדילי DNA במהלך BER או SSBR. לאחר זיהוי שברים אלו, PARP1/PARP2 מזרז את הוספת פולימרים ADP-ריבוז לעצמה ולחלבונים אחרים — תהליך הנקרא PARylation (לסקירה⁶) — על ידי הידרוליזה של NAD⁺. זה יוצר פיגום חלבוני דינמי (PAR) שמגייס גורמי תיקון DNA נוספים לאתר הנזק, ומגביר את הדיוק של תיקון ה-DNA. כדי לנהל את ה-PAR הדינמי הזה, מספר חלבונים תורמים להידרוליזה ולהסרת שרשראות PAR, כולל ADP-ריבוז-קולט הידרולאז 3 (ARH3), ADP-ריבוז גליקוזיל הידרולאז 1 (TARG1), הידרולאז מונו-ADP-ריבוזיל 1/2 (MacroD1/2), ופולי(ADP-ריבוז) גליקוהידרולאז (PARG)6,21,22,23,24,25,26 . עם זאת, PARG אחראית בעיקר לתהליך זה^21,27 ומשחקת תפקיד מרכזי בתגובה לנזק DNA (DDR)^28,29.

לכן, PARG קשור באופן קריטי לפונקציה של PARP1 ו-PARP2. בעוד ש-PARP1 ו-PARP2 יוצרים את פולימרי PAR, PARG פועל כאנזים "ניקוי", הידרוליזה של פולימרים אלו והופך למעשה את PARylation^30,31. תהליך זה חיוני להשלמת BER ו-SSBR ולאפשרות למחזור PARP1/PARP2 כדי להגיב לנזק DNA חדש. כתוצאה מכך, PARP1, PARP2, PARylation ו-PARG פועלים בתיאום, ומבטיחים תיקון DNA יעיל והפיך באמצעות BER ו-SSBR ^4,6.

היקף הפארילציה יכול להיות מושפע מגורמים שונים ומשחק תפקיד חיוני בתגובת הנזק הכוללת^{ל-DNA 32}. גורמים אלה כוללים חשיפה לגנוטוקסינים שמוסיפים תוספות לבסיסי DNA, כגון N-מתיל-N'-ניטרו-ניטרו-ניטרוזוגואנידין (MNNG), מתיל מתאנסולפונאט (MMS), מי חמצן (H₂O₂), או טרט-בוטיל הידרופרוקסיד (tBuOOH). יתרה מזאת, היקף ה-PARylation יכול להיות מושפע ממולקולות המווסתות את תהליך ה-PARylation, כגון דיהידרוניקוטינמידיד ריבוזיד (NRH), קדם ל-NAD⁺, שמגביר את הפעלת PARP על ידי העלאת רמות NAD⁺, או FK866, מעכב של NAMPT, שיכול להוריד את רמות NAD⁺ ולווסת לרעה את פעילות PARP³. לבסוף, מוטציות גנטיות או עיכוב מולקולות קטנות של אנזימים כמו PARP1/PARP2, PARG או חלבוני תיקון DNA אחרים (למשל, פגמים ב-BER או גורמי רקומבינציה הומולוגיים כמו BRCA1/BRCA2) יכולים לשנות את הפעלת PARP 33,34,35,36.

מבחן LivePAR עושה שימוש בשבר של חלבון אצבע הטבעת 146 (RNF146) שמקודד דומיין WWE (חומצות אמינו 100–182), המקושר לחלבון פלואורסצנציה ירוק משופר (EGFP)³. תחום WWE הוא דומיין כדורי הנקרא על שם השאריות השמורות טריפטופן (W) וגלוטמט (E) באתר הקישור שלו³⁷. דומיינים של WWE נקשרים לאיזו-ADP-ריבוז, היחידה המבנית הפנימית הקטנה ביותר בשרשראות PAR^38,39. RNF146 הוא ליגז יוביקוויטין E3 שמזהה איזו-ADP-ריבוז^38,40 ומדווח כי הוא מכוון לחלבונים המעורבים ב-BER (XRCC1, DNA ליגאז III ו-PARP1) לפירוק פרוטאזום⁴¹. קישור דומיין זה ל-EGFP מאפשר ויזואליזציה וזיהוי של אתרי פארילציה המושרים על ידי גנטוקסין בתאי יונקים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את יצירת קווי תאים יציבים המבטאים את מדווח LivePAR (איור 1A), את השראת נזק DNA להפעלת PARP1/PARP2, את ייצור PAR, ואת רכישת וניתוח נתוני מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקלית (איור 1).

הפלסמיד pMD2.g(VSVG) מספק את גליקופרוטאין המעטפת הוויראלית (VSVG), שמרחיב את טווח התאים שהווירוס יכול להדביק בהשוואה לחלבון מעטפת הלנטי-וירוס הטבעי. הפלסמיד pRSV-REV מספק את חלבון האלמנט הרגולטורי (REV), שהוא טרנסאקטיבטור חיוני הנקשר ל-RNA הוויראלי ומפעיל את השעתוק של הגנים הוויראליים; הוא חיוני לשכפול יעיל של וירוסים. הפלסמיד pMDLg/pRRE מספק מספר רכיבי אריזה פנימיים מרכזיים, ביניהם gag, שמקודד את חלבוני המטריצה (MA), קפסיד (CA) ונוקלאוקפסיד (NC), pol, שמקודד את האנזימים הנדרשים לשכפול ושילוב וירוס בגנום של תא המארח, ואלמנט רגולטורי RNA (RRE), שהוא יסוד RNA שמגביר את יעילות תרגום ה-RNA הוויראלי ואריזת RNA גנומיה. הפלסמיד pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (איור 1A) מכיל cDNA המקודד לחלבון הפלואורסצנציה הירוק המשופר (EGFP) המאוחד לקצה C של דומיין WWE של RNF146 (חומצות אמינו 100–182), תחום חלבון שנקשר לשרשראות פולי(ADP-ריבוז), והוקטור גם מקודד קסטה עמידות להיגרומיצין. הווירוס מבודד מהסופרנטנט של תרבית התאים וניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -80°C או להשתמש בו מיד להעברה (איור 1B).

פרוטוקול

1. ייצור לנטיווירוס

הערה: פרוטוקול זה עושה שימוש במערכת אריזה לנטיויראלית דור שלישי^42,43 ליצירת תאים המבטאים מדווח PAR מקודד גנטית. חלקיקי לנטיויראליים מיוצרים בתאי 293FT באמצעות מערכת ארבעה פלסמידים הכוללת רכיבי מעטפה, רגולציה ואריזה, יחד עם מבנה pLV-EF1A-LivePAR-Hygro המקודד דומיין WWE עם תגית EGFP של RNF146, הקושר שרשראות פולי(ADP-ריבוז). הווירוס המתקבל משמש ליצירת קווי תאים יציבים לצורך ויזואליזציה וכימות של הצטברות PAR.

1. תרבית תאי 293FT במעבר נמוך ב-DMEM המכילים 10% FBS ו-1% Pen/Strep באטמוספירה לחה בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2. ודא שתאי ה-293FT לא היו בתרבות יותר מ-3 שבועות.
   הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי בתאי 293 רגל שמספריהם נעים בין 3 ל-10. תאי 293FT עברו טרנספורמציה והפכו לנצח על ידי אנטיגן ה-T הגדול SV40. לתאים אלו יש יעילות טרנספקציה גבוהה, שהיא חיונית לייצור חלבונים רקומביננטיים ולמחקרי ביטוי גנים. הם מגיבים היטב הן לטרנספקציה מבוססת שומנים והן לשיטות המעבר הוויראלי.
2. לוח 1.7 × 10⁵ תאים בגודל 293FT על צלחת תרבית רקמה בגודל 60 מ"מ בנפח סופי של 5.5 מ"ל מדיום תרבית ביום הראשון. החזיר תאים לאינקובטור ל-24 שעות.
3. ביום השני (יום ההעברה), הוסף 375 מיקרוליטר של מדיום DMEM ללא FBS ועט וללא סטרפטוקוק לצינור מיקרוצנטריפוגציה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיקרו-ליטר של תגובת טרנספקציה מבוססת שומן, 4 מיקרוגרם של פלסמיד pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 מיקרוגרם של פלסמיד pMD2.g(VSVG), 2 מיקרוגרם של פלסמיד pRSV-REV, ו-2 מיקרוגרם של פלסמיד pMDLg/pRRE. הקישו בעדינות את צינור המיקרוצנטריפוגה כדי לערבב את המדיה, תגובת הטרנספקציה ו-DNA הפלסמיד (הימנעו ממערבולת). דגרו למשך 15–30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר יצירת קומפלקס DNA/תגובת טרנספקציה.
4. הוסיפו את תערובת הפלסמיד/המגיב לטרנספקציה לצלחת של 60 מ"מ עם תאי 293FT שיש להעבר מבלי להסיר את המדיום, בדרופ. החזיר את התאים לאינקובטור למשך 48 שעות.
   הערה: תקופה זו מאפשרת ייצור ושחרור חלקיקי הלנטיויראל לתוך מדיום הגידול.
5. ביום הרביעי, אספו את מדיום התרבית מתאי 293FT שעברו טרנספקט כדי לבודד את חלקיקי הלנטיווירוס. לסנן דרך מסנן סטרילי של 0.45 מיקרון כדי להפריד פסולת תא מהחלקיקים הלנטיוויראליים.
6. קבעו את מדד הלנטי-וירוס עם חומרים זמינים (אופציונלי).
   הערה: שיטה זו מניבה בדרך כלל 10⁵ עד^{10 6} יחידות זיהומיות למ"ל (IFU/mL), מה שמקביל לריבוי זיהום משוער (MOI) של ~5 כאשר הוא מתואר בשלב ההעברה למטה.
7. אליקווט את המדיה המכילה חלקיקי הלנטי-וירוס לארבעה קריוביאלים סטריליים (1.0 מ"ל לצינור) ומאוחסנים בטמפרטורה של -80°C.

2. טרנסדוקציה

הערה: סעיף זה מתאר את פרוטוקול הטרנסדוקציה של הלנטיוויראל המשמש להחדרת גן טרנסג'נדרי לקווי תאים (איור 1B). הוא היה יעיל באופן עקבי במעבדה^שלנו 1,3,33,37,44,45.

1. תרבית קו תאים מועדף (מספר מעבר נמוך) במדיה מתאימה באטמוספירה לחה בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2.
   הערה: התחל עם מעבר מוקדם של סוג התא הנדרש. יש להפשיר ולהוציא בקבוקון תאים חדש לפחות פעם אחת לפני הזרעה להעברה.
2. ביום הראשון, זרע 1 × 10⁵–1.5 × 10⁵ תאים בכל באר, על כל באר של צלחת עם 6 בארות בתוך 2 מ"ל של מדיום גידול. תחזיר את התאים לאינקובטור ל-24 שעות.
3. ביום השני (יום ההעברה), ודא שהתאים בין 20% ל-40% מתאחדים. הוסף 1 מ"ל וירוס, 1 מ"ל מדיום גידול ו-2 מיקרוליטר פוליברן (2 מ"ג/מ"ל) לצינור קוני של 15 מ"ל וערבב בעדינות באמצעות היפוך (הימנע מערבולת).
   הערה: פוליברן משמש במהלך טרנסדוקציה לנטיווירוס כדי למנוע דחייה אלקטרוסטטית בין חלקיקי הווירוס לממברנת התא. מכיוון שפוליברן טעון חיובית, הוא מתקשר עם הגליקופרוטאין הוויראליים השליליים, ומנטרל את המטען שלהם. יתרה מזאת, פוליברן נקשר לגליקוזאמינוגליקנים במדיום תרבית התאים, ומונע את האינטראקציה שלהם עם הווירוס. פוליברן, לכן, משפר משמעותית את יעילות ההעברה.
4. הסר את מדיום הגידול מלוח עם 6 בארות והוסף את תערובת הווירוס/מדיה/פוליברן לכל באר. הניחו את התאים עם תערובת ההעברה באינקובטור המכיל אטמוספירה לחה בטמפרטורה של 32 ^מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 16–18 שעות.
   הערה: דגירה של תאים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס במהלך הלילה במהלך הטרנסדוקציה לנטיויראלית היא פרקטיקה נפוצה, אם כי לא חיונית, שמגבירה משמעותית את יעילות הזיהום הוויראלי. הורדת הטמפרטורה מאטה את חילוף החומרים התאי, ובכך מפחיתה את ההגנות התאיות ומגבירה את הרגישות לזיהומים ויראליים.
5. ביום השלישי, החלף את המדיה של התאים המועברים לווירוס במדיה טרייה והעבר אותם לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. דגרו במשך 48 שעות.
   הערה: יומיים אלו מספיקים לתאים לייצר את הגן הטרנסג'ני RNF146(100–182)-EGFP ולהפוך לעמידים להיגרומיצין.
6. כדי לפתח את קווי התאים היציבים הפוליקלונליים המתקבלים המבטאים את הגן הטרנסג'ני RNF146(100–182)-EGFP, יש להתחיל לאחר יומיים של דגירה בבחירת היגרומיצין כפי שמצוין בשלב 2.5.
   1. חלופה נוספת היא להרחיב את אוכלוסיית התאים המומרת בהיעדר היגרומיצין ולהשתמש בניתוח PAR במהלך 10–14 הימים הבאים (טרנסדוקציה חולפת), כפי שתואר קודם¹.
7. העבר את התאים ללוח בגודל 100 מ"מ לאחר שהם גדלים בנוכחות היגרומיצין ומתרחב ככל שצריך.
8. הכינו מלאי קריו של התאים המומרת לשימוש עתידי.
9. אימות הביטוי של הגן הטרנסג'י RNF146(100–182)-EGFP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שמתואר בסעיף 3. הגן הטרנסג'י RNF146(100–182)-EGFP יתבטא בכל רחבי התא.
10. אימות הביטוי של הגן הטרנסג'ני RNF146(100–182)-EGFP על ידי אימונובלוטינג, כפי שמתואר במקום אחר ^1,37.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מפרט את הכנת כיסויי כיסוי, זריעה של התאים המבטאים את LivePAR, חשיפה לטיפולים (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi ו/או NRH), והכנת תאים קבועים על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה קונפוקלית וניתוח מוקדי PAR (איור 1C). הוא גם מתאר את השימוש בתוכנת ImageJ ובמאקרו מותאם אישית לכימות חצי-אוטומטי של מוקדי PAR. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקירת השפעת גורמים שונים (למשל, מולקולות קטנות, השמצות חלבון BER) על פארילציה התלויה בנזק DNA, והוא יושם בהצלחה במעבדה שלנו^34,37.

1. הכנת ה-coverslip
   1. להשרות 20 × 20 מ"מ בכיסוי ל-20 דקות ב-Dithyl Ether במיכל זכוכית בתוך מכסה אדים.
      הערה: השתמש במכסה אדים בעת עבודה עם אתר דיאתיל בגלל דליקו וסיכונים פוטנציאליים.
   2. הסר את האתר דיאתיל ושוטף את הכיסוי בריכוזים מופחתים של אתנול [100%, 70%, 50%, ואז 0% (ddH₂O)].
   3. הוציאו את המים והשרו את הכיסוי למשך 20 דקות ב-1 N HCl עם ערבוב עדין.
   4. הסר את ה-HCl ושטוף את הכיסויים 3 פעמים עם ddH₂0.
   5. אחסן את הכיסוי ב-70% אתנול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. ציפוי תאים
   1. הניחו שני כיסויי כיסוי סטריליים בקוטר 20 × 20 מ"מ בצלחת תרבית תאים בגודל 60 מ"מ זה לצד זה. הכן כמה מנות שנדרשות לניסוי. ודאו שכל האתנול התאדה לפני הוספת תאים לצלחת המכילה את הכיסוי. שטוף שאריות אתנול על ידי הוספת PBS סטרילי לצלחת למשך 10–15 דקות; הסר את PBS לפני הזריעת התאים.
   2. 200,000 תאים המבטאים LivePAR לכל צלחת תרביות תאים. אפשרו לתאים 24–36 שעות להיצמד לכיסויי הכיסוי, להכין את המדיום ולהתחיל לגדול (לשכפל).
3. השראה של מוקדי PAR
   1. חשפו את התאים המבטאים את LivePAR ל-100 מיקרומום NRH, 10 מיקרומו PARGi, ו-10 מיקרומום MNNG או 40 מיקרומו tBuOOH. בנוסף, כדי לבדוק היווצרות PAR התלויה ב-PARP1/PARP2, יש לעכב את PARP1/PARP2 על ידי הוספת 10 מיקרומולים PARPi. הוסיפו תרכובות ישירות למדיה המכילה את התאים על הכיסוי וסובבו בעדינות את המדיה בכלי התרבית כדי להפיץ את התרכובות. דגרו את הצלחות בגודל 60 מ"מ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60–90 דקות.
      הערה: NRH משמש להבטיח שרמות מספקות של NAD⁺ תאי זמינות לפרלציה אופטימלית בתיווך PARP1/PARP2 ^33,46,47. PARGi משמש למניעת פירוק שרשראות PAR שמסונתזות על ידי PARP1/PARP2 על ידי PARG. MNNG או tBuOOH משמש לגרימת שינויים בבסיס ה-DNA להפעלת BER, מה שמוביל להפעלת PARP1/PARP2. PARPi משמש לאישור שהאות (פוקוסים) נובע מהפעלת PARP1/PARP2.
4. קיבוע תאים והתקנת כיסויי הכיסוי
   1. הסר את המדיום ושטוף עם PBS.
      הערה: שטיפה פעם או פעמיים עם PBS חשובה, שכן המדיום המשמש לתרבות תאים מכיל ריכוז גבוה של חלבוני סרום כביסה עם PBS גם מסירה כל שאריות MNNG או tBuOOH שעדיין במדיה.
   2. קידומת בפורמלדהיד 4% ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף תאים 3 פעמים עם PBS.
   3. תקן על ידי הוספת 3 מ"ל מתנול קר (-20 ^°C): אצטון (7:3) לתאים. הנח את הכלים בטמפרטורה של -20 ^°C למשך 9 דקות.
   4. הסר מתנול: אצטון. שטוף 3 פעמים עם PBS.
   5. פיפטה 15 מיקרוליטר של מדיום נגד דהייה המכיל DAPI על שקופיות הזכוכית. התקן בעדינות את הכיסוי על המקום שבו המדיום מתקין כשהתאים פונים פנימה, כדי למזער בועות.
   6. מרכז, אבטח ואטום את צידי הכיסוי לזכוכית על ידי מריחת כמות קטנה של אמייל ציפורניים שקוף על צידי הכיסוי. הניחו את הסליידס בחושך כדי לתת לאמייל הציפורניים להתייבש (~10 דקות). אחסן את הסליידס בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לצילום.
5. תאי הדמיה
   1. צילם את כל השקופיות לפחות פי 10 בהגדלה של 63×, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. זיהוי מוקדי PAR באמצעות לייזר 488 ננומטר וצביעת גרעינית (DAPI) באמצעות לייזר 405 ננומטר (לדוגמה, ראו איור 2).
6. ניתוח דימויים קונפוקליים
   1. צור קובץ טקסט המכיל את הטקסט הבא וקרא לו "LivePAR_Macro". מאקרו זה מקל על הכימות ה"אוטומטי" של מוקדי PAR בגרעינים של התאים המבטאים את LivePAR:
      מאקרו "צביעת DAPI חיובית [1]" {
      tit=getTitle();
      run("כפול...", "title=DAPI duplicate");
      selectWindow("DAPI")
      run ("8-bit");
      run("ערוצים מפוצלים")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run ("טשטוש גאוסיאני...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("ברירת מחדל");
      run ("Make Binary");
      run("Invert")
      run ("מילוי חורים")
      run ("קו ניקוז")
      run("ניתוח חלקיקים...", "size=50.00-Infinity circularity=0.00-1.00 show=מתווים מוסיפים החריג כולל in_situ");
      שינוי שם("DAPI_"+ציד);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode (true);
      run ("8-bit");
      t=getTitle();
      run("Duplicate...", "title=GB1 duplicate");
      run ("כפול...", "title=GB20 duplicate");
      selectWindow("GB20")
      run("טשטוש גאוסיאני...", "radius=20 stack");
      selectWindow("GB1");
      run("טשטוש גאוסיאני...", "radius=1 stack");
      imageCalculator("חסר יצירת מחסן", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      close();
      selectWindow("GB20");
      close();
      selectWindow("תוצאה של GB1");
      שינוי שם ("Blank_GB1-GB20_"+t);
      title = getTitle();
      run("ערוצים מפוצלים")
      selectWindow("C1-"+title);
      close();
      selectWindow("C2-"+title);
      setThreshold(90,255) //הערך 90 ניתן לשנות כדי להתחשב בשונות ניסויית
      run("ניתוח חלקיקים...", "גודל=0.00-200 מעגליות=0.00-1.00 show=מסכות מסכמות");
      קרוב ("C2-"+כותרת);
      selectWindow("מסכת C2-"+title);
      קרוב ();
      setBatchMode (false);
      }
   2. הורד והתקן את ImageJ על המחשב (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. פתח את ImageJ והתקן את המאקרו (קובץ טקסט: LivePAR_Macro) על ידי לחיצה על Plugins | מאקרו | התקן.
   4. פתח את כל קבצי הקונפוקל ב-ImageJ ושמור אותם כקבצי *.tif כדי לשמור על הקבצים המקוריים.
   5. פתח מסמך גיליון אלקטרוני ושמור אותו כ-[date]_[Cell Line]_Foci ניתוח.
   6. נתח קובץ *.tif אחד בכל פעם. לחץ 1 כדי למצוא את הגרעינים; כאשר נפתח חלון בשם ROI Manager , בחר את כל הערכים בחלון ולחץ על Add כדי לשכב את אזור הגרעינים מעל התמונה המקורית. מחק גרעינים שזוהו לא נכון. צייר את הגרעין באמצעות כלי הבחירה החופשית ולחץ על 2 כדי לכמת את מוקדי PAR.
      הערה: אל תכלול גרעינים שאינם נמצאים במלואם בתוך המסגרת.
   7. בחר כל גרעין במנהל ה-ROI אחד אחד ולחץ על 2. יופיע ספירה שמציינת את מספר המוקדים בתוך הגרעין שנבחרו. לאחר שהמוקדים בכל הגרעינים של הקובץ נמדדו, העתיקו והדבקו את המידע למסמך הגיליון הפתוח.
   8. חזור על שלבים 3.6.6 ו-3.6.7 עם כל קבצי *.tif.
   9. צייר את מוקדי PAR לכל גרעין בתוכנה המועדפת (למשל, ראו איור 3).

תוצאות

תאים המבטאים את גלאי LivePAR יכולים להיווצר על ידי ייצור לנטיווירוס המקודד את חלבון המיזוג RNF146(100-182)-EGFP (איור 1A). ניתן להעריך תאים לאחר ביטוי חולף עד שבועיים לאחר ההעברה או כקווי תאים יציבים לאחר בחירה בהיגרומיצין (איור 1B)¹. לאחר טיפול בגנטוקסין, ניתן לראות מוקדי PAR שנגרמו מנזק DNA בתוך הגרעין, ולאחר התיקון, ניתן לצלם באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית (איור 1C

דיון

מבחן LivePAR פותח לזיהוי אתרים של נזק גנטי גרעיני ל-DNA שבהם PARP1/PARP2 מסנתז באופן פעיל שרשראות PAR. לשם כך, קטע של RNF146 המקודד את תחום WWE (חומצות אמינו 100–182) התמזג עם EGFP ^1,2,3,37. גשושי PAR נוספים שתיארנו מקודדים EGFP המאוחים לשאריות חומצות אמינו 1 עד 166 של DTX4, שאריות חומצות אמינו 22 עד 112 של PARP11, וחומצות אמינו 1–178 של DTX2, שכל אחת מהן מקודד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזקים>מגבים, כימיקלים ופפטידים
0.45 ומיקרו; m מסנני Durapore steriflip	סיגמא-אלדריץ'	Cat# SE1M003M00
כיסויי מיקרוסקופ בגודל 20 על 20 מ"מ	תרמו פישר סיינטיפיק	קט# 22-170-371
אצטון	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# A18-1
צלחות תרבית תאים, 100 מ"מ	VWR	קטגור# 25382-166
צלחות תרבית תאים, 60 מ"מ	פישר סיינטיפיק	Cat# 430166
לוחות תרבית תאים, 6 בארות	VWR	קטגוריה# 62406-161
קריוביאלים, 2 מ"ל	VWR	קטגוריה# 89499-722
אתר דיאתיל	תרמו פישר סיינטיפיק	קטגור# 60-29-7
דימתיל סולפוקסיד	תרמו פישר סיינטיפיק	קט# BP231-1
פילטרים סטריליים חד-פעמיים, 0.45 ומיקרו; m	סיגמא-אלדריץ'	Cat# SE1M003M00
DMEM	קורנינג	Cat#15-017-CV
אתנול, 200 proof	דיקון לאבס	קט# 2701
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית	תרמו פישר סיינטיפיק	קט# 12-544-4
סרום בקר עוברי מושבת חום	אטלנטה ביולוגיקס	קט# S11150
חומצה הידרוכלורית	תרמו פישר סיינטיפיק	קטגוריה# A144-212
היגרומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# 10687010
מגבוני קים גדולים	קימברלי-קלארק	Cat#34256
ערכת לנטי-X GoStix Plus	טקארה	קט# 631280
מתנול	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# A452SK-4
MNNG	מולפורט	Cat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-דיהידרוקסי-5-(הידרוקסימיתיל) טטרהידהידרופורן-2-yl]-4H-פירידין-3-קרבוקסמיד)	מארי מיגו או  נוכימיה סיינס בע"מ
מעכב PARG (PDD00017273)	סיגמא-אלדריץ'	Cat# SML1781
מעכב PARPi (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Cat# HY-10129
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו	קטלוג# 15140-122
פוליברן	סיגמא-אלדריץ'	Cat# TR-1003-G
tBuOOH	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# 180345000
TransIT-x2 (מגיב טרנספקציה)	מירוס	Cat# MIR-6006
טריטון-X100	VWR	Cat# 0694
טריפסין-אדטה	תרמו פישר סיינטיפיק	קט# 25200-056
מדיום הרכבה נגד דעיכה Vectashield (H-1000)	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# NC1695563
<חזק>קווי תאים
293-FT	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# R70007
(נגזר מתאי כליה עובריים אנושיים שעברו שינוי עם האנטיגן הגדול של SV40)	תרמו פישר סיינטיפיק	Cat# R70007
LN428	מתנה נדיבה מ	לא זמין
(קו תאי גידול גליובלסטומה אנושי)	ד"ר איאן פולאק (אוניברסיטת פיטסבורג)	לא זמין
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(תאי אפיתל של פיגמנט רשתית שהונצחו על ידי hTERT)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Cat# HTB-96
(קו תאים של אוסטאוסרקומה אנושית)	ATCC	Cat# HTB-96
DNA רקומביננטי
pMDLg/pRRE	מלאי מעבדה#253	אדג'ין, קט# 12251
pRSV-Rev	מלאי מעבדה# 254	אדג'ין, קט# 12253
pMD2.G	מלאי מעבדה#252	אדג'ין, קט# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR הוא דומיין WWE של RNF146, שאריות חומצות אמינו 100-182, מאוחים ל-EGFP; מכיל קלטת עמידות להיגרומיצין)	מלאי מעבדה# 1727	Addgene, Cat# 176063
תוכנה ואלגוריתמים
Adobe Illustrator (להכנת דמויות)	אדובי סיסטמס	גרסה 2024
פריזמת GraphPad	GraphPad	גרסה 10.5.0  (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html