אימות אינטגרציה ובביטוי אקראי של טרנסג'נים בטפילי איימריה

Summary

כאן אנו מציגים שיטה סטנדרטית לאימות האינטגרציה והביטוי של גנים זרים בפרזיטים טרנסגניים של איימריה . על ידי שילוב ניתוחים גנומיים וניתוחים ברמת חלבון, תהליך עבודה זה מאשר הכנסת גנים יציבה וביטוי. גישה זו מסייעת בפיתוח איימריה טרנסגנית למחקר וליישומי חיסונים.

Abstract

אימות טפילי Eimeria טרנסגניים חיוני לאישור אינטגרציה גנומית יציבה וביטוי גנים חיצוניים. פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה מקיף לאימות הכנסת גנים וביטוי חלבונים ב-Eimeria tenella. ההליך מתחיל במיצוי DNA גנומי מביציות ספורוליטיות, ולאחר מכן הגברה באמצעות PCR לאימות ראשוני של נוכחות מקטע המטרה. כדי לאשר עוד יותר את האינטגרציה הגנומית, מתבצע ריצוף מחדש של הגנום כולו לזיהוי אתרי החדרה ולהעריך את יציבות המבנה המשולב בגנום הטפיל. ביטוי החלבון נבדק לאחר מכן על ידי בלטינג מערבי של ליזאטים המוכנים מספורוזואיטים מטוהרים, מה שמאפשר זיהוי החלבון הרקומביננטי היעד. בנוסף, המיקום התוך-תאי מוצגת באמצעות בדיקת איממונופלואורסצנציה עקיפה (IFA) באמצעות תאי מארח נגועים. יחד, בדיקות אלו מספקות מסגרת איתנה וניתנת לשחזור לאימות קווי Eimeria טרנסגניים. תהליך עבודה זה מאפשר אישור אמין של אינטגרציה גנומית וביטוי חלבונים, ובכך תומך ביישומים בהמשך במניפולציה גנטית, גנומיקה פונקציונלית ופיתוח חיסונים המיועדים לפרזיטים של איימריה .

Introduction

קוקסידיוזיס, הנגרמת על ידי מיני איימריה, מייצגת אחת מהמחלות הטפיליות המשמעותיות ביותר מבחינה כלכלית בעופות, מה שמוביל לירידה בעלייה במשקל, המרת מזון לקויה והפסדים כספיים עולמיים המוערכים במיליארדי דולרים מדי שנה ^1,2,3. מניפולציה גנטית של טפילי איימריה הפכה לכלי עוצמתי הן למחקר יסודי והן לפיתוח חיסונים ^4,5,6. טרנספקציה יציבה מאפשרת אינטגרציה וביטוי של גנים חיצוניים, כגון מדווחי פלואורסצנט או אנטיגנים מגנים, ומאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של התפתחות הטפילים והערכה ממוקדת של מועמדי החיסון ^7,8,9.

פרסום קודם של דואן ואחרים סיפק פרוטוקול סטנדרטי לנוקלאופקציה והתפשטות ב-in vivo של איימריה טרנסגנית, וקבע שיטה יעילה ליצירה והעשרת קווי טפילים רקומביננטיים¹⁰. עם זאת, כיום אין תהליך עבודה מאוחד לאישור אינטגרציה גנומית יציבה וביטוי פונקציונלי של גנים טרנסג'נדרים. אימות כזה קריטי להבטחת אותנטיות, יציבות ושחזוריות של קווים טרנסגניים המשמשים למחקרים ביולוגיים במורד הזרם או ליישומי חיסונים.

מאמר זה מציג פרוטוקול שלם, שלב אחר שלב, לאימות אינטגרציה והבעה של גנים טרנסגניים ב-Eimeria tenella, באמצעות קו E. tenella טרנסגני המבטא את אנטיגן וירוס מחלת הבורסה הזיהומי (IBDV) VP2 (Et-VP2) כמודל¹¹. הפלסמיד הביטוי p5′AMic2linkerVP2m3′A, הנושא את גן VP2 ודיווח mCherry, הועבר ל-E. tenella sporozoites בר (Et-WT). ביציות זוהרות אדומות בודדו באמצעות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) ועברו באופן סדרתי בתרנגולות ללא קוקסידיה. תהליך זה מדגים פרוצדורות לחילוץ DNA גנומי, ניתוח אינטגרציה ראשוני מבוסס PCR, ריצוף מחדש של הגנום המלא לזיהוי אתרי הכנסה, ווסטרן בלוטינג לאימות ביטוי חלבונים, ובדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה (IFA) להצגת מיקום תוך-תאי של החלבון הרקומביננטי. יחד, שיטות אלו מספקות מסגרת שחזורית ומקיפה לאישור האותנטיות של קווי איימריה טרנסגניים, ומאפשרת שימוש אמין במחקר גנומיקה פונקציונלית ובפיתוח חיסונים.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שכללו תרנגולות אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של סין (מספר אישור: CAU20160628-2). כל הליכי החקלאות והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של אוניברסיטת סין החקלאית ועמדו בעקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי הכולל בעלי חיים. תרנגולות White Leghorn זכרים בני שבעה ימים ללא פתוגנים ספציפיים (SPF) שימשו במחקר זה. הציפורים טופלו בתנאי גידול סטנדרטיים עם גישה חופשית למזון ומים לאורך כל תקופת הניסוי. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. חילוץ DNA גנומי מביציות ספורוליטיות של מיני Eimeria

1. העבר 1 מ"ל של תליית בוץ (≥1 × 10⁷/מ"ל) לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. הוסיפו נפח שווה של חרוזי זכוכית בגודל 1 מ"מ המתאימים לכדור האוציסט. הפר את האוציסטים באמצעות הומוגניזר רקמות על ידי הקצבת חרוזים חזקה ב-60 הרץ למשך 5 דקות עד שדפנות האוציסט נשברות לחלוטין והתכולה משתחררת.
2. אסוף את התערובת (למעט חרוזי הזכוכית) לצינור וצנטריפוגה חדשים בעוצמה של 12,000 x גרם למשך דקה. השליכו את הסופרנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר בופר CTAB ו-40 מיקרוליטר פרוטנאז K, ודגרו את התערובת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. הוסיפו 500 מיקרוליטר פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (25:24:1), מערבולת ל-10 שניות, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות. העבר את השלב המימי העליון לצינור חדש.
   הערה: סגרו היטב והשליכו את הצינור המכיל את השכבה האורגנית כדי למנוע זיהום בסביבה. (אופציונלי) אם זיהום החלבון נשאר גבוה, יש לחזור על שלב 1.3 1–2 פעמים נוספות.
4. הוסף 500 מיקרוליטר כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (24:1), מערבולת ל-10 שניות, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות. העבר את הפאזה המימית לצינור חדש והוסיף נפח שווה של איזופרופנול. מערבבים על ידי היפוך עד שמופיעים משקעי DNA.
   הערה: משקעים בטמפרטורה של −20°C למשך ≥שעה או לילה משפרים את התפוקה.
5. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x גרם למשך 10 דקות כדי לפנות DNA לכדורים. שטוף את הכדור עם 70% אתנול, צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות, וזרוק את הסופרנטנט. הסר בזהירות נוזל שנותר באמצעות משאבת ואקום וייבש את הכדור בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס.
6. המיס את כדור ה-DNA היבש בזיכרון ddH₂O או TE המכיל RNase. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך ≥1 שעה או ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה כדי להסיר שאריית RNA. אחסן את ה-DNA המטוהר בטמפרטורה של −20°C.
   הערה: לשימור ארוך טווח, כדורי DNA לא מומסים יכולים להיאחסן ישירות בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס או −80 מעלות צלזיוס. הערכת שלמות וריכוז ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לפני יישומים במורד הזרם.

2. אימות PCR לנוכחות מבנה Et-VP2 בגנום הטפיל

1. זוגות פריימרים מתכננים (טבלה 1) לאימות אינטגרציה גנומית של מבנה Et-VP2.
   הערה: רצפי פריימר עוצבו באמצעות Primer-BLAST, עם פרמטרים טיפוסיים של אורך פריימר של 18–24 bp, טמפרטורת התכה של כ-55–60 מעלות צלזיוס, ומינימום היווצרות מבנה משני. הספציפיות של כל זוג פריימר נבדקה עוד מול הגנום של Eimeria tenella כדי למנוע הגברה לא ספציפית.
2. הכינו תערובת תגובה בנפח 50 מיקרוליטר המכילה 25 מיקרוליטר של 2× Taq Master Mix, 21 מיקרוליטר ddH₂O, 1 מיקרוליטר של פריימרים קדמיים ואחוריים, ו-2 מיקרוליטר תבנית DNA.
3. לבצע הגברה באמצעות תנאי מחזור תרמי הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס לדקה אחת; ואחריה הארכה אחרונה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: ודא שכל החומרים מעורבבים היטב לפני מחזור תרמי. השתמש בתבניות DNA שהוכנו לאחרונה כדי להשיג יעילות הגברה מיטבית.

3. ריקוונסינג מחדש של קו הטפיל הטרנסגני (Et-VP2)

1. דוגמה להגשה ובניית ספרייה
   1. יש להגיש תליית בוץ של 1 מ"ל (≥1 × 10⁷/מ"ל) לספק שירותי ריצוף מסחרי לניתוח ריצוף מהדור הבא.
   2. לאחר הערכת איכות ה-DNA הגנומי, יש לפצל את ה-DNA באמצעות הפרעה מכנית באמצעות אולטרסאונד. לטהר את ה-DNA המקוטע, לבצע תיקון קצה, להוסיף בסיס אדנין (A) לקצוות 3′, ולחבר מתאמי ריצוף.
   3. בחר קטעי DNA בגודל הרצוי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וביצוע הגברה של PCR לבניית ספריית הריצוף.
   4. לעבור בדיקת איכות על הספרייה שנבנה. בצע רצף זוגות על פלטפורמת Illumina NovaSeq באמצעות אורך קריאה של 150 bp. שמרו על עומק ריצוף של 100× כדי להבטיח דיוק נתונים, תוך יצירת לפחות 6GB של נתונים גולמיים עם ציון איכות מינימלי של Q20 >90%.
      הערה: יש לטפל בכל הריאגנטים ודגימות ה-DNA באמצעות טכניקות אספטיות למניעת זיהום. ודאו שפרמטרי הריצוף עומדים במדדי העומק והאיכות הנדרשים לפני המשך לניתוח נתונים.
2. ניתוח נתונים
   1. סנן את נתוני הריצוף הגולמיים באמצעות תוכנת Fastp (גרסה 0.23.2) בהתאם לקריטריונים^{הבאים 12}:
      1. הסר את רצפי המתאמים.
      2. הגדר את סף האיכות הנמוכה ל-Q20 והסר קריאות שבהן בסיסים באיכות נמוכה מהווים יותר מ-30% מאורך הקריאה הכולל.
      3. הסר קריאות קצרות מ-50 בסיסים.
   2. יישר את הקריאות המבוקרות באיכות לגנום הייחוס של E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) באמצעות תוכנת Bowtie2 (v2.4.5)¹³. האקראיות של נתוני הריצוף מהדור הבא מוערכת על פי עומק הכיסוי ואחידות.
   3. ודא שקריאות הריצוף מיושרות לרצף הווקטורי הטרנסגני. הסר את הקריאות שאינן ממפות את אזור ה-T-DNA כדי לקבל קריאות כימריות, שבהן קצה אחד ממפה ל-T-DNA והקצה השני לגנום הייחוס של E. tenella .
   4. בהתבסס על רצפי הקריאות הכימריות, יש לבצע יישור באמצעות ToxoDB (גרסה 64) כדי לקבוע את המיקום הספציפי של אתרי החדרת T-DNA פוטנציאליים. ניתוח עומק ריצוף בין אזורים הומולוגיים בין הווקטור לגנום איימריה (כלומר, אזורי הרגולציה 5′ ו-3′) באמצעות תוכנת Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. זהה אתרי אינטגרציה פוטנציאליים של הפלסמיד הטרנסגני בגנום E. tenella ואמת אותם באמצעות PCR באמצעות מערכת התגובה המתוארת בשלב 2.1.
      הערה: ודאו שימוש עקבי בגרסאות תוכנה והגדרות פרמטרים לאורך כל הניתוח כדי לשמור על דיוק הנתונים ושחזוריות.

4. בלוטינג מערבי של חלבוני Eimeria טרנסגניים

1. אסוף מתלה PBS המכיל לפחות 5 × 10⁶ ספורוזואיטים בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-2500 x g למשך 5 דקות. החזירו את הכדור לבופר RIPA של 100 מיקרו-ליטר ודגרו על הקרח למשך שעה. הוסף 20 מיקרוליטר של בופר טעינת חלבון 6× וחמם את התערובת בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
2. הכינו ג'לים של SDS-PAGE באמצעות פלטת זכוכית בקוטר 1.5 מ"מ. כוון את ריכוז האקרילאמיד בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון המטרה. במהלך הפולימריזציה, שכבו את ג'ל ההפרדה במים מזוקקים כדי להבטיח משטח אחיד לפני הוספת ג'ל הערימה.
3. צנטריפוגה את הליזאט בעוצמה של 10,000 x g למשך 5 דקות וטעין 40 מיקרוליטר של סופרנטנט לכל נתיב דגימה. טעין 10 מיקרוליטר של סמן חלבון לנתיב נפרד, ומלא כל נתיבים שנותרו ב-40 מיקרוליטר של בופר טעינה 1× כבקרה.
4. בצע אלקטרופורזה ב-1× בופר ריצה ב-70 וולט למשך 20 דקות, ואחריו 120 וולט ל-60–90 דקות, עד שהחזית של הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
5. הוצא את הג'ל לפי גודל החלבון הצפוי. הפעל מראש ממברנת PVDF במתנול למשך דקה אחת והרכיב את סנדוויץ' ההעברה בסדר הבא: ספוג, נייר סינון, ג'ל (צד הקתודה), ממברנת PVDF, נייר סינון, ספוג. הסר בועות אוויר, והעבר חלבונים ב-70 וולט ל-3 שעות בבופר העברה.
6. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST (5 דקות כל אחת) וחסמו עם חלב דל שומן 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר או ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטוף את הממברנה פעמיים עם PBST כדי להסיר את תמיסת החסימה שנותרה.
7. דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים המדוללים בבופר נוגדנים: אנטי-פלאג פוליקלונלי לעכבר (1:2000) ואנטי-GAPDH מונוקלונלי לעכבר (1:2000). דגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר או ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. אסוף את תמיסת הנוגדנים ושוטף את הממברנה חמש פעמים עם PBST (5 דקות כל אחת).
8. דגרו את הממברנה עם IgG אנטי-עכבר מנוגד לעזים עם HRP (1:2000) למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטוף את הממברנה חמש פעמים עם PBST (5 דקות כל אחת).
9. הכינו סובסטרט ECL על ידי ערבוב נפחים שווים של תמיסה A ו-B. הנחת הסובסטרט באופן שווה על הממברנה וזיהוי אותות חלבונים באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה.
   הערה: בצע את כל השלבים הכוללים דגימות חלבון על קרח אלא אם צוין אחרת. לטפל במצעים של מתנול ו-ECL עם מכסה אדים תוך כדי לבישת כפפות ומשקפי מגן.

5. בדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה תוך-תאית (IFA) של איימריה טרנסגנית

1. טיהור ספורוזואיטים באמצעות עמודת כרומטוגרפיה
   1. חבר את עמוד הכרומטוגרפיה למשאבה פריסטלטית וכוון את קצב הזרימה ל-50–60 הרץ. שטוף את העמודה במים מזוקקים ותמיסת גליצין.
   2. הוסף תמיסת תאית DE-52 לעמוד תוך הוספת תמיסת גליצין ברציפות עד שכבת התאית מגיעה לגובה של כ-1 ס"מ.
   3. הטעינו ספורוזואיטים שטוהרו בשיטת פרקול אל העמודה. שמרו על קצב זרימה של 30–40 הרץ באמצעות תמיסת גליסין ואסופו את הזרימה בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
   4. עקוב אחרי ה-eluate על ידי הנחת טיפות על מחסנית זכוכית לתצפית מיקרוסקופית. כאשר לא מתגלים ספורוזואיטים, עצור את המשאבה. צנטריפוגה את השבר שנאסף בעוצמה של 2,500 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט, והחזירו את הכדור ל-PBS.
      הערה: בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. השליכו פסולת גליצין ופרקול בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
2. זיהום ספורוזואיט בתאי HFF
   1. זרעים 1 ×^{10 6} ספורוזואיטים ללוחות של 24 בארות המכילות שכבות מונו-שכבות של תאי HFF. הוסף פניצילין-סטרפטומיצין לריכוז סופי של 1× (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין), ערבב בעדינות, ודוגר בטמפרטורה של 37°C במשך 4–6 שעות כדי לאפשר חדירה. הסר את המדיום, שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS, וזרוק את הסופרנטנט.
   2. הסר בזהירות את כיסויי הזכוכית מהבארות באמצעות מלקחיים סטריליים והעבר אותם ללוח חדש עם 24 בארות. מקבע את הדגימות ב-1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות, שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS, וזרוק את הסופרנאנט.
   3. לחדור את התאים עם 1 מ"ל של 0.25% Triton X-100 למשך 30 דקות. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS וזרוק את הסופרנטנט.
   4. חסום את הדגימות עם 1 מ"ל של 3% BSA למשך 30 דקות. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS וזרוק את הסופרנטנט.
   5. נוגדן אנטי-דגל מונוקלונלי מדולל בעכבר (1:200) ב-3% BSA. הניחו טיפות של הנוגדן המדולל על שכבת האטימה והפכו את הכיסוי (צד התא כלפי מטה) על הטיפות. דגרו את הכיסוי בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. שטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS (5 דקות כל אחת).
   6. מדלל אנטי-עכבר לעזים בצורת FITC IgG (1:200) ו-Hoechst 33258 (1:100) ב-3% BSA. הנח טיפות של תערובת הצביעה על שכבת איטום והפך את הכיסוי על הטיפות. דגרו בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ואז שטפו חמש פעמים עם 1 מ"ל PBS (5 דקות כל אחד).
   7. התקן את הכיסוי על ידי הנחת מדיום הרכבה של 5 מיקרוליטר נגד פייד על סלייד זכוכית. הפוך את ה-coverslip (צד התא כלפי מטה) אל הטיפה, תוך הימנעות מבועות אוויר, ואטום את הקצוות. אחסן את המחסניות המותקנות בתא לח בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
      הערה: לטפל בפרפורמלדהיד וב-Triton X-100 במכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות והגנה על עיניים. נוסחאות תגובות המשמשות בתהליך זה מפורטות בטבלה 2.

Results

ניתוח PCR גנומי אישר את נוכחות השבר המטרה בטפילים הטרנסגניים, בעוד שלא זוהו רצועות מקבלות בביקורת מסוג פראי (איור 1A). ריצוף מחדש של הגנום המלא הראה עוד יותר כי הפלסמיד הלינארי משולב באופן יציב בגנום הטפיל, ואתר האינטגרציה החזוי אומת על ידי הגברת PCR באזור החיבור (איור 1B).

ביטוי החלבון אומת על ידי Western blotting, שחשף רצועה מובחנת התואמת למשקל המולקולרי הצפוי של חלבון המיזוג בזן הטרנסגני. לא נצפה א...

Discussion

פרוטוקול זה יוצר תהליך עבודה מקיף לאימות אינטגרציה גנומית, ביטוי חלבונים ומיקום תוך-תאי של גנים אקסוגניים ב-E. tenella הטרנסגנית. במקום להסתמך על מבחן יחיד, הגישה משלבת ראיות גנומיות ורמות חלבון, ומבטיחה שהחדרת הגן הטרנסגני מאושרת מבנית ומבוטא פונקציונלית.

מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה משפיעים רבות על אימות מוצלח של קווים טרנסגניים. עלולות להיווצר בעיות טכניות אם צעדים אלו אינם מותאמים בקפידה. DNA גנומי איכותי שמופק מחומר טפיל מטוהר חיוני להגברה אמי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מדיום הרכבה נגד פייד	MCE	HYK1042	מדיום התקנה פלואורסצנטי למניעת הלבנת פוטואורסצנטיות
BSA (3%)	ביוטיים	ST023	בופר חסימה ודילול נוגדנים עבור IFA; חסימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות
כלורופורם: איזואמיל אלכוהול (24:1)	סיגמא	C0549	תגובת להסרת פנול שארית במהלך חילוץ DNA גנומי
תרנגולות ללא קוקסידיה	בוהרינגר-אינגלהיים	SPF	משמש למעבר והגברה של זנים טרנסגניים; אושר על ידי ועדת האתיקה (מספר אישור: CAU20160628-2)
CTAB (ברומיד סטילטרימתיאלמוניום)	מרק KGaA	H5882	רכיב בבופר חילוץ DNA גנומי; נוסחה: 3 גרם CTAB + 12.27 גרם NaCl + 15 מ״ל 1 מול/ליטר Tris-HCl + 6 מ״ל 0.5 מולי/ליטר EDTA, מותאם לנפח סופי של 150 מ״ל עם ddH2O
תאית DE-52	סולרביולוגיה	C8350	מדיום כרומטוגרפיה להחלפת יונים לטיהור ספורוזואיט; טופל ברצף ב-NaOH, HCl ומים מזוקקים, ואז מאוזן עם תמיסת גליצין
מצע ECL (תמיסה A + תמיסה B)	תרמופישר	32106	מגיב גילוי כימילומינסצנטי; ערבב נפחים שווים של תמיסה A ו-B לפני השימוש
FITC-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG	סיגמא	AP124F	נוגדן משני פלואורסצנטי ל-IFA, יחס דילול 1:200
חרוזי זכוכית	סיגמא	Z250473-1PAK
תמיסת גליצין	סיגמא	67419	בופר איזון והסרה לעמודות כרומטוגרפיה; נוסחה: 0.75 גרם גליצין + 7.9 גרם NaCl מומס במים מזוקקים של 500 מ"ל, pH מותאם ל-7.4-7.6, אוטוקלב
Hoechst 33258	סיגמא	94403	תגובת צביעה גרעינית, יחס דילול 1:100; משמש ללוקליזציה של IFA
IgG אנטי-עכבר נגד עכבר עם HRP-Conjugated	סיגמא	12-349	נוגדן משני ל-Western blotting, יחס דילול 1:2000
פלטפורמת ריצוף Illumina NovaSeq	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (שנגחאי, סין)		פלטפורמת ריצוף מהדור הבא; רצף בקצה הזוגי (אורך קריאה של 150 bp), עומק ריצוף פי 100;, יצירת ≥ נתוני גולם של 6 GB (Q20>90%)
צנטריפוגה במהירות נמוכה	צנטריפוגה ביילי מתקופת בייג'ינג	DT5-2
נוגדן נגד דגל מונוקלונלי עכבר	סיגמא	F1804	נוגדן ראשוני, יחס דילול 1:200; משמש לזיהוי IFA של חלבון מיזוג עם תג דגל
נוגדן אנטי-GAPDH מונוקלונלי לעכבר	סיגמא	G8795	נוגדן ראשוני, יחס דילול 1:2000; משמש כבקרת טעינה ל-Western bloting
חלב דל שומן (5%)	ביוטיים	P0216	בופר חסימה ל-Western Blutting; בלוק בטמפרטורת החדר למשך שעה או 4 מעלות (4 מעלות); לילה C
פאראפורמלדהיד (4%)	מרק KGaA	30525	תמיסת קיבוע תאים; קבוע בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות
PBS	סולרביולוגיה	P1010
פניצילין-סטרפטומיצין (100 פעמים;)	ייסן	60162ES76	אנטיביוטיקה לתרבית תאים; מעכב זיהום מיקרוביאלי
פרקול (קת DG גרדיאנט	GE Healthcare	17-0891-09
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25:24:1)	מרק KGaA	77617	תגובת להסרת חלבונים במהלך חילוץ DNA גנומי
בופר טעינת חלבון (6×)	ביוטיים	P0015F	בופר טעינה באלקטרופורזה של חלבון; נוסחה: 100 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% גליצרול, 6 M אוריאה; מיקס עם 50 & mu; L 2 M DTT ו-50 & mu; L 5% ברומופנול כחול לפני השימוש
פרוטאנאז K	מרק KGaA	39450-01-6	200 מ"ג מומסים ב-10 מ"ל ddH2O, המשמש לעיכול חלבונים במהלך חילוץ DNA גנומי
ממברנת PVDF	תרמופישר	88518	ממברנת העברת חלבון; מופעל עם מתנול למשך דקה לפני השימוש
RIPA Lysis Buffer	ייסן	20101	בופר ליזיס להפקת חלבון ספורוזואיט
RNase A	מרק KGaA	9001-99-4	25 מ"ג מומס ב-2.5 מ"ל 0.01 מול/ליטר NaAc, מחומם ב-100 מעלות מעלות (100 מעלות לדרגות); C ל-10-15 דקות, ה-pH הותאם ל-7.4 עם 1 מול לליטר Tris-HCl; משמש להסרת RNA מדגימות DNA
חומרים ג'ל SDS-PAGE (אקרילאמיד, ביס-אקרילאמיד, טריס, SDS, APS, TEMED)	ביוגרפיה	101	חומרים להכנת ג'ל SDS-PAGE; ריכוז האקרילאמיד מותאם בהתאם למשקל המולקולרי של חלבון המטרה
נתרן טאורודאוקסיכולאט הידראט	סיגמא	T0875
פתרון)
טק מאסטר מיקס (2×)	ואזימה	P112-01/02/03	תערובת קדם-הגברת PCR המכילה Taq פולימראז, dNTPs ועוד.
טריטון X-100 (0.25%)	מרק KGaA	9036	תמיסת חדירות תאים; דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות
טריפסין	סולרביולוגיה	T8150
מערבל מערבולת	בייג'ינג צפון טז-ביוטק	HQ-60-II
תרמוסטט אמבטיית מים	גרנט אינסטרומנטס (קיימברידג')	120,GM0815010