אימות אינטגרציה ובביטוי אקראי של טרנסג'נים בטפילי איימריה

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה סטנדרטית לאימות האינטגרציה והביטוי של גנים זרים בפרזיטים טרנסגניים של איימריה . על ידי שילוב ניתוחים גנומיים וניתוחים ברמת חלבון, תהליך עבודה זה מאשר הכנסת גנים יציבה וביטוי. גישה זו מסייעת בפיתוח איימריה טרנסגנית למחקר וליישומי חיסונים.

תקציר

אימות טפילי Eimeria טרנסגניים חיוני לאישור אינטגרציה גנומית יציבה וביטוי גנים חיצוניים. פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה מקיף לאימות הכנסת גנים וביטוי חלבונים ב-Eimeria tenella. ההליך מתחיל במיצוי DNA גנומי מביציות ספורוליטיות, ולאחר מכן הגברה באמצעות PCR לאימות ראשוני של נוכחות מקטע המטרה. כדי לאשר עוד יותר את האינטגרציה הגנומית, מתבצע ריצוף מחדש של הגנום כולו לזיהוי אתרי החדרה ולהעריך את יציבות המבנה המשולב בגנום הטפיל. ביטוי החלבון נבדק לאחר מכן על ידי בלטינג מערבי של ליזאטים המוכנים מספורוזואיטים מטוהרים, מה שמאפשר זיהוי החלבון הרקומביננטי היעד. בנוסף, המיקום התוך-תאי מוצגת באמצעות בדיקת איממונופלואורסצנציה עקיפה (IFA) באמצעות תאי מארח נגועים. יחד, בדיקות אלו מספקות מסגרת איתנה וניתנת לשחזור לאימות קווי Eimeria טרנסגניים. תהליך עבודה זה מאפשר אישור אמין של אינטגרציה גנומית וביטוי חלבונים, ובכך תומך ביישומים בהמשך במניפולציה גנטית, גנומיקה פונקציונלית ופיתוח חיסונים המיועדים לפרזיטים של איימריה .

מבוא

קוקסידיוזיס, הנגרמת על ידי מיני איימריה, מייצגת אחת מהמחלות הטפיליות המשמעותיות ביותר מבחינה כלכלית בעופות, מה שמוביל לירידה בעלייה במשקל, המרת מזון לקויה והפסדים כספיים עולמיים המוערכים במיליארדי דולרים מדי שנה ^1,2,3. מניפולציה גנטית של טפילי איימריה הפכה לכלי עוצמתי הן למחקר יסודי והן לפיתוח חיסונים ^4,5,6. טרנספקציה יציבה מאפשרת אינטגרציה וביטוי של גנים חיצוניים, כגון מדווחי פלואורסצנט או אנטיגנים מגנים, ומאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של התפתחות הטפילים והערכה ממוקדת של מועמדי החיסון ^7,8,9.

פרסום קודם של דואן ואחרים סיפק פרוטוקול סטנדרטי לנוקלאופקציה והתפשטות ב-in vivo של איימריה טרנסגנית, וקבע שיטה יעילה ליצירה והעשרת קווי טפילים רקומביננטיים¹⁰. עם זאת, כיום אין תהליך עבודה מאוחד לאישור אינטגרציה גנומית יציבה וביטוי פונקציונלי של גנים טרנסג'נדרים. אימות כזה קריטי להבטחת אותנטיות, יציבות ושחזוריות של קווים טרנסגניים המשמשים למחקרים ביולוגיים במורד הזרם או ליישומי חיסונים.

מאמר זה מציג פרוטוקול שלם, שלב אחר שלב, לאימות אינטגרציה והבעה של גנים טרנסגניים ב-Eimeria tenella, באמצעות קו E. tenella טרנסגני המבטא את אנטיגן וירוס מחלת הבורסה הזיהומי (IBDV) VP2 (Et-VP2) כמודל¹¹. הפלסמיד הביטוי p5′AMic2linkerVP2m3′A, הנושא את גן VP2 ודיווח mCherry, הועבר ל-E. tenella sporozoites בר (Et-WT). ביציות זוהרות אדומות בודדו באמצעות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) ועברו באופן סדרתי בתרנגולות ללא קוקסידיה. תהליך זה מדגים פרוצדורות לחילוץ DNA גנומי, ניתוח אינטגרציה ראשוני מבוסס PCR, ריצוף מחדש של הגנום המלא לזיהוי אתרי הכנסה, ווסטרן בלוטינג לאימות ביטוי חלבונים, ובדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה (IFA) להצגת מיקום תוך-תאי של החלבון הרקומביננטי. יחד, שיטות אלו מספקות מסגרת שחזורית ומקיפה לאישור האותנטיות של קווי איימריה טרנסגניים, ומאפשרת שימוש אמין במחקר גנומיקה פונקציונלית ובפיתוח חיסונים.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים שכללו תרנגולות אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של סין (מספר אישור: CAU20160628-2). כל הליכי החקלאות והניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של אוניברסיטת סין החקלאית ועמדו בעקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי הכולל בעלי חיים. תרנגולות White Leghorn זכרים בני שבעה ימים ללא פתוגנים ספציפיים (SPF) שימשו במחקר זה. הציפורים טופלו בתנאי גידול סטנדרטיים עם גישה חופשית למזון ומים לאורך כל תקופת הניסוי. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. חילוץ DNA גנומי מביציות ספורוליטיות של מיני Eimeria

1. העבר 1 מ"ל של תליית בוץ (≥1 × 10⁷/מ"ל) לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. הוסיפו נפח שווה של חרוזי זכוכית בגודל 1 מ"מ המתאימים לכדור האוציסט. הפר את האוציסטים באמצעות הומוגניזר רקמות על ידי הקצבת חרוזים חזקה ב-60 הרץ למשך 5 דקות עד שדפנות האוציסט נשברות לחלוטין והתכולה משתחררת.
2. אסוף את התערובת (למעט חרוזי הזכוכית) לצינור וצנטריפוגה חדשים בעוצמה של 12,000 x גרם למשך דקה. השליכו את הסופרנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר בופר CTAB ו-40 מיקרוליטר פרוטנאז K, ודגרו את התערובת בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. הוסיפו 500 מיקרוליטר פנול:כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (25:24:1), מערבולת ל-10 שניות, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות. העבר את השלב המימי העליון לצינור חדש.
   הערה: סגרו היטב והשליכו את הצינור המכיל את השכבה האורגנית כדי למנוע זיהום בסביבה. (אופציונלי) אם זיהום החלבון נשאר גבוה, יש לחזור על שלב 1.3 1–2 פעמים נוספות.
4. הוסף 500 מיקרוליטר כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (24:1), מערבולת ל-10 שניות, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות. העבר את הפאזה המימית לצינור חדש והוסיף נפח שווה של איזופרופנול. מערבבים על ידי היפוך עד שמופיעים משקעי DNA.
   הערה: משקעים בטמפרטורה של −20°C למשך ≥שעה או לילה משפרים את התפוקה.
5. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x גרם למשך 10 דקות כדי לפנות DNA לכדורים. שטוף את הכדור עם 70% אתנול, צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות, וזרוק את הסופרנטנט. הסר בזהירות נוזל שנותר באמצעות משאבת ואקום וייבש את הכדור בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס.
6. המיס את כדור ה-DNA היבש בזיכרון ddH₂O או TE המכיל RNase. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך ≥1 שעה או ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה כדי להסיר שאריית RNA. אחסן את ה-DNA המטוהר בטמפרטורה של −20°C.
   הערה: לשימור ארוך טווח, כדורי DNA לא מומסים יכולים להיאחסן ישירות בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס או −80 מעלות צלזיוס. הערכת שלמות וריכוז ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לפני יישומים במורד הזרם.

2. אימות PCR לנוכחות מבנה Et-VP2 בגנום הטפיל

1. זוגות פריימרים מתכננים (טבלה 1) לאימות אינטגרציה גנומית של מבנה Et-VP2.
   הערה: רצפי פריימר עוצבו באמצעות Primer-BLAST, עם פרמטרים טיפוסיים של אורך פריימר של 18–24 bp, טמפרטורת התכה של כ-55–60 מעלות צלזיוס, ומינימום היווצרות מבנה משני. הספציפיות של כל זוג פריימר נבדקה עוד מול הגנום של Eimeria tenella כדי למנוע הגברה לא ספציפית.
2. הכינו תערובת תגובה בנפח 50 מיקרוליטר המכילה 25 מיקרוליטר של 2× Taq Master Mix, 21 מיקרוליטר ddH₂O, 1 מיקרוליטר של פריימרים קדמיים ואחוריים, ו-2 מיקרוליטר תבנית DNA.
3. לבצע הגברה באמצעות תנאי מחזור תרמי הבאים: דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס לדקה אחת; ואחריה הארכה אחרונה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: ודא שכל החומרים מעורבבים היטב לפני מחזור תרמי. השתמש בתבניות DNA שהוכנו לאחרונה כדי להשיג יעילות הגברה מיטבית.

3. ריקוונסינג מחדש של קו הטפיל הטרנסגני (Et-VP2)

1. דוגמה להגשה ובניית ספרייה
   1. יש להגיש תליית בוץ של 1 מ"ל (≥1 × 10⁷/מ"ל) לספק שירותי ריצוף מסחרי לניתוח ריצוף מהדור הבא.
   2. לאחר הערכת איכות ה-DNA הגנומי, יש לפצל את ה-DNA באמצעות הפרעה מכנית באמצעות אולטרסאונד. לטהר את ה-DNA המקוטע, לבצע תיקון קצה, להוסיף בסיס אדנין (A) לקצוות 3′, ולחבר מתאמי ריצוף.
   3. בחר קטעי DNA בגודל הרצוי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וביצוע הגברה של PCR לבניית ספריית הריצוף.
   4. לעבור בדיקת איכות על הספרייה שנבנה. בצע רצף זוגות על פלטפורמת Illumina NovaSeq באמצעות אורך קריאה של 150 bp. שמרו על עומק ריצוף של 100× כדי להבטיח דיוק נתונים, תוך יצירת לפחות 6GB של נתונים גולמיים עם ציון איכות מינימלי של Q20 >90%.
      הערה: יש לטפל בכל הריאגנטים ודגימות ה-DNA באמצעות טכניקות אספטיות למניעת זיהום. ודאו שפרמטרי הריצוף עומדים במדדי העומק והאיכות הנדרשים לפני המשך לניתוח נתונים.
2. ניתוח נתונים
   1. סנן את נתוני הריצוף הגולמיים באמצעות תוכנת Fastp (גרסה 0.23.2) בהתאם לקריטריונים^{הבאים 12}:
      1. הסר את רצפי המתאמים.
      2. הגדר את סף האיכות הנמוכה ל-Q20 והסר קריאות שבהן בסיסים באיכות נמוכה מהווים יותר מ-30% מאורך הקריאה הכולל.
      3. הסר קריאות קצרות מ-50 בסיסים.
   2. יישר את הקריאות המבוקרות באיכות לגנום הייחוס של E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) באמצעות תוכנת Bowtie2 (v2.4.5)¹³. האקראיות של נתוני הריצוף מהדור הבא מוערכת על פי עומק הכיסוי ואחידות.
   3. ודא שקריאות הריצוף מיושרות לרצף הווקטורי הטרנסגני. הסר את הקריאות שאינן ממפות את אזור ה-T-DNA כדי לקבל קריאות כימריות, שבהן קצה אחד ממפה ל-T-DNA והקצה השני לגנום הייחוס של E. tenella .
   4. בהתבסס על רצפי הקריאות הכימריות, יש לבצע יישור באמצעות ToxoDB (גרסה 64) כדי לקבוע את המיקום הספציפי של אתרי החדרת T-DNA פוטנציאליים. ניתוח עומק ריצוף בין אזורים הומולוגיים בין הווקטור לגנום איימריה (כלומר, אזורי הרגולציה 5′ ו-3′) באמצעות תוכנת Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. זהה אתרי אינטגרציה פוטנציאליים של הפלסמיד הטרנסגני בגנום E. tenella ואמת אותם באמצעות PCR באמצעות מערכת התגובה המתוארת בשלב 2.1.
      הערה: ודאו שימוש עקבי בגרסאות תוכנה והגדרות פרמטרים לאורך כל הניתוח כדי לשמור על דיוק הנתונים ושחזוריות.

4. בלוטינג מערבי של חלבוני Eimeria טרנסגניים

1. אסוף מתלה PBS המכיל לפחות 5 × 10⁶ ספורוזואיטים בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-2500 x g למשך 5 דקות. החזירו את הכדור לבופר RIPA של 100 מיקרו-ליטר ודגרו על הקרח למשך שעה. הוסף 20 מיקרוליטר של בופר טעינת חלבון 6× וחמם את התערובת בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
2. הכינו ג'לים של SDS-PAGE באמצעות פלטת זכוכית בקוטר 1.5 מ"מ. כוון את ריכוז האקרילאמיד בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון המטרה. במהלך הפולימריזציה, שכבו את ג'ל ההפרדה במים מזוקקים כדי להבטיח משטח אחיד לפני הוספת ג'ל הערימה.
3. צנטריפוגה את הליזאט בעוצמה של 10,000 x g למשך 5 דקות וטעין 40 מיקרוליטר של סופרנטנט לכל נתיב דגימה. טעין 10 מיקרוליטר של סמן חלבון לנתיב נפרד, ומלא כל נתיבים שנותרו ב-40 מיקרוליטר של בופר טעינה 1× כבקרה.
4. בצע אלקטרופורזה ב-1× בופר ריצה ב-70 וולט למשך 20 דקות, ואחריו 120 וולט ל-60–90 דקות, עד שהחזית של הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
5. הוצא את הג'ל לפי גודל החלבון הצפוי. הפעל מראש ממברנת PVDF במתנול למשך דקה אחת והרכיב את סנדוויץ' ההעברה בסדר הבא: ספוג, נייר סינון, ג'ל (צד הקתודה), ממברנת PVDF, נייר סינון, ספוג. הסר בועות אוויר, והעבר חלבונים ב-70 וולט ל-3 שעות בבופר העברה.
6. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם PBST (5 דקות כל אחת) וחסמו עם חלב דל שומן 5% למשך שעה בטמפרטורת החדר או ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטוף את הממברנה פעמיים עם PBST כדי להסיר את תמיסת החסימה שנותרה.
7. דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים המדוללים בבופר נוגדנים: אנטי-פלאג פוליקלונלי לעכבר (1:2000) ואנטי-GAPDH מונוקלונלי לעכבר (1:2000). דגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר או ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין. אסוף את תמיסת הנוגדנים ושוטף את הממברנה חמש פעמים עם PBST (5 דקות כל אחת).
8. דגרו את הממברנה עם IgG אנטי-עכבר מנוגד לעזים עם HRP (1:2000) למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטוף את הממברנה חמש פעמים עם PBST (5 דקות כל אחת).
9. הכינו סובסטרט ECL על ידי ערבוב נפחים שווים של תמיסה A ו-B. הנחת הסובסטרט באופן שווה על הממברנה וזיהוי אותות חלבונים באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה.
   הערה: בצע את כל השלבים הכוללים דגימות חלבון על קרח אלא אם צוין אחרת. לטפל במצעים של מתנול ו-ECL עם מכסה אדים תוך כדי לבישת כפפות ומשקפי מגן.

5. בדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה תוך-תאית (IFA) של איימריה טרנסגנית

1. טיהור ספורוזואיטים באמצעות עמודת כרומטוגרפיה
   1. חבר את עמוד הכרומטוגרפיה למשאבה פריסטלטית וכוון את קצב הזרימה ל-50–60 הרץ. שטוף את העמודה במים מזוקקים ותמיסת גליצין.
   2. הוסף תמיסת תאית DE-52 לעמוד תוך הוספת תמיסת גליצין ברציפות עד שכבת התאית מגיעה לגובה של כ-1 ס"מ.
   3. הטעינו ספורוזואיטים שטוהרו בשיטת פרקול אל העמודה. שמרו על קצב זרימה של 30–40 הרץ באמצעות תמיסת גליסין ואסופו את הזרימה בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל.
   4. עקוב אחרי ה-eluate על ידי הנחת טיפות על מחסנית זכוכית לתצפית מיקרוסקופית. כאשר לא מתגלים ספורוזואיטים, עצור את המשאבה. צנטריפוגה את השבר שנאסף בעוצמה של 2,500 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט, והחזירו את הכדור ל-PBS.
      הערה: בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. השליכו פסולת גליצין ופרקול בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
2. זיהום ספורוזואיט בתאי HFF
   1. זרעים 1 ×^{10 6} ספורוזואיטים ללוחות של 24 בארות המכילות שכבות מונו-שכבות של תאי HFF. הוסף פניצילין-סטרפטומיצין לריכוז סופי של 1× (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין), ערבב בעדינות, ודוגר בטמפרטורה של 37°C במשך 4–6 שעות כדי לאפשר חדירה. הסר את המדיום, שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS, וזרוק את הסופרנטנט.
   2. הסר בזהירות את כיסויי הזכוכית מהבארות באמצעות מלקחיים סטריליים והעבר אותם ללוח חדש עם 24 בארות. מקבע את הדגימות ב-1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות, שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS, וזרוק את הסופרנאנט.
   3. לחדור את התאים עם 1 מ"ל של 0.25% Triton X-100 למשך 30 דקות. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS וזרוק את הסופרנטנט.
   4. חסום את הדגימות עם 1 מ"ל של 3% BSA למשך 30 דקות. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS וזרוק את הסופרנטנט.
   5. נוגדן אנטי-דגל מונוקלונלי מדולל בעכבר (1:200) ב-3% BSA. הניחו טיפות של הנוגדן המדולל על שכבת האטימה והפכו את הכיסוי (צד התא כלפי מטה) על הטיפות. דגרו את הכיסוי בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. שטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS (5 דקות כל אחת).
   6. מדלל אנטי-עכבר לעזים בצורת FITC IgG (1:200) ו-Hoechst 33258 (1:100) ב-3% BSA. הנח טיפות של תערובת הצביעה על שכבת איטום והפך את הכיסוי על הטיפות. דגרו בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ואז שטפו חמש פעמים עם 1 מ"ל PBS (5 דקות כל אחד).
   7. התקן את הכיסוי על ידי הנחת מדיום הרכבה של 5 מיקרוליטר נגד פייד על סלייד זכוכית. הפוך את ה-coverslip (צד התא כלפי מטה) אל הטיפה, תוך הימנעות מבועות אוויר, ואטום את הקצוות. אחסן את המחסניות המותקנות בתא לח בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
      הערה: לטפל בפרפורמלדהיד וב-Triton X-100 במכסה אדים כימי תוך כדי לבישת כפפות והגנה על עיניים. נוסחאות תגובות המשמשות בתהליך זה מפורטות בטבלה 2.

תוצאות

ניתוח PCR גנומי אישר את נוכחות השבר המטרה בטפילים הטרנסגניים, בעוד שלא זוהו רצועות מקבלות בביקורת מסוג פראי (איור 1A). ריצוף מחדש של הגנום המלא הראה עוד יותר כי הפלסמיד הלינארי משולב באופן יציב בגנום הטפיל, ואתר האינטגרציה החזוי אומת על ידי הגברת PCR באזור החיבור (איור 1B).

ביטוי החלבון אומת על ידי Western blotting, שחשף רצועה מובחנת התואמת למשקל המולקולרי הצפוי של חלבון המיזוג בזן הטרנסגני. לא נצפה א...

דיון

פרוטוקול זה יוצר תהליך עבודה מקיף לאימות אינטגרציה גנומית, ביטוי חלבונים ומיקום תוך-תאי של גנים אקסוגניים ב-E. tenella הטרנסגנית. במקום להסתמך על מבחן יחיד, הגישה משלבת ראיות גנומיות ורמות חלבון, ומבטיחה שהחדרת הגן הטרנסגני מאושרת מבנית ומבוטא פונקציונלית.

מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה משפיעים רבות על אימות מוצלח של קווים טרנסגניים. עלולות להיווצר בעיות טכניות אם צעדים אלו אינם מותאמים בקפידה. DNA גנומי איכותי שמופק מחומר טפיל מטוהר חיוני להגברה אמי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Antifade Mounting Medium	MCE	HYK1042	Fluorescent mounting medium to prevent photobleaching
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Blocking buffer and antibody dilution buffer for IFA; block at room temperature for 30 min
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)	Sigma	C0549	Reagent for removing residual phenol during genomic DNA extraction
Coccidia-Free Chickens	Boehringer-Ingelheim	SPF	Used for in vivo passage and amplification of transgenic strains; approved by the Ethics Committee (approval number: CAU20160628-2)
CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)	Merck KGaA	H5882	Component of genomic DNA extraction buffer; formulation: 3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA, adjusted to a final volume of 150 mL with ddH2O
DE-52 Cellulose	Solarbio	C8350	Ion exchange chromatography medium for sporozoite purification; sequentially treated with NaOH, HCl, and distilled water, then equilibrated with glycine solution
ECL Substrate (Solution A + Solution B)	thermofisher	32106	Chemiluminescent detection reagent; mix equal volumes of Solution A and B before use
FITC-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG	Sigma	AP124F	Fluorescent secondary antibody for IFA, dilution ratio 1:200
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glycine Solution	Sigma	67419	Equilibration and elution buffer for chromatography columns; formulation: 0.75 g glycine + 7.9 g NaCl dissolved in 500 mL distilled water, pH adjusted to 7.4-7.6, autoclaved
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear staining reagent, dilution ratio 1:100; used for IFA localization
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG	Sigma	12-349	Secondary antibody for Western blotting, dilution ratio 1:2000
Illumina NovaSeq Sequencing Platform	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)		Next-generation sequencing platform; paired-end sequencing (150 bp read length), sequencing depth 100×, generating ≥6 GB raw data (Q20>90%)
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
Mouse Monoclonal Anti-Flag Antibody	Sigma	F1804	Primary antibody, dilution ratio 1:200; used for IFA detection of Flag-tagged fusion protein
Mouse Monoclonal Anti-GAPDH Antibody	Sigma	G8795	Primary antibody, dilution ratio 1:2000; used as a loading control for Western blotting
Nonfat Milk (5%)	Beyotime	P0216	Blocking buffer for Western blotting; block at room temperature for 1 h or 4°C overnight
Paraformaldehyde (4%)	Merck KGaA	30525	Cell fixation solution; fix at room temperature for 30 min
PBS	Solarbio	P1010
Penicillin-Streptomycin (100×)	Yeasen	60162ES76	Antibiotic for cell culture; inhibits microbial contamination
Percoll (DG gradient stock	GE Healthcare	17-0891-09
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Reagent for protein removal during genomic DNA extraction
Protein Loading Buffer (6×)	Beyotime	P0015F	Protein electrophoresis loading buffer; formulation: 100 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% glycerol, 6 M urea; mix with 50 μL 2 M DTT and 50 μL 5% bromophenol blue before use
Proteinase K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg dissolved in 10 mL ddH2O, used for protein digestion during genomic DNA extraction
PVDF Membrane	thermofisher	88518	Protein transfer membrane; activated with methanol for 1 min before use
RIPA Lysis Buffer	Yeasen	20101	Lysis buffer for sporozoite protein extraction
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg dissolved in 2.5 mL 0.01 mol/L NaAc, heated at 100°C for 10-15 min, pH adjusted to 7.4 with 1 mol/L Tris-HCl; used for RNA removal from DNA samples
SDS-PAGE Gel Reagents (Acrylamide, Bis-acrylamide, Tris, SDS, APS, TEMED)	Bio	101	Reagents for SDS-PAGE gel preparation; acrylamide concentration adjusted according to the molecular weight of the target protein
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
solution)
Taq Master Mix (2×)	Vazyme	P112-01/02/03	PCR amplification premix containing Taq polymerase, dNTPs, etc.
Triton X-100 (0.25%)	Merck KGaA	9036	Cell permeabilization solution; incubate at room temperature for 30 min
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge)	GD120,GM0815010