Method Article

יצירה וניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי של אורגנואידים של קרצינומה כבדית לאחר טיפול תרופתי

DOI:

10.3791/70511

⸱

May 26th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ליצירת אורגנואידים של קרצינומה כבדית, יישום טיפול תרופתי וביצוע ריצוף RNA חד-תאי לפני ואחרי הטיפול לאפיון שינויים שעתוקיים הקשורים לטיפול.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרצינומה כבדית היא גורם מרכזי לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם ומאופיינת בהטרוגניות תוך-גידולית בולטת, התורמת לתגובות טיפול משתנות, להישנות הגידול ולהתקדמות המחלה. הבנה מעמיקה יותר של שינוי תאי הגידול ברמת השעתוק לפני ואחרי טיפול תרופתי היא חיונית לשיפור אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, תהליכי עבודה ניסיוניים מעשיים שמקשרים טיפול תרופתי מבוסס אורגנואידים לפרופיילינג טרנסקריפטומי חד-תאי במורד הזרם נותרו מוגבלים. במחקר זה פותח תהליך עבודה סטנדרטי ליצירת אורגנואידים של קרצינומה כבדית, יישום טיפול תרופתי מוגדר וביצוע ריצוף RNA חד-תאי על דגימות שנאספו לפני ואחרי הטיפול. הפרוטוקול כולל החייאה והרחבה של אורגנואידים, הערכת איכות לפני הטיפול, חשיפה לתרופות, הכנת אורגנואידים להתנתקות תא יחיד, בניית ספרייה וניתוח השוואתי בסיסי של נתוני טרנסקריפטומיה חד-תאיים. ניתנים אמצעי זהירות טכניים קריטיים לשיפור השכפול ואיכות הדגימה. תהליך עבודה זה מאפשר אפיון זה לצד זה של הרכב התאים ושינויים בתעתוק הקשורים לטיפול תרופתי באורגנואידים של קרצינומה כבדית. הפרוטוקול חזק, ניתן להרחבה וגמיש במערכות אורגנואידיות שונות, ומספק פלטפורמה מעשית לחקירת שינויים בביטוי גנים הקשורים לטיפול ברזולוציה של תא יחיד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרצינומה כבדית (HCC) היא סרטן כבד ראשוני נפוץ ביותר במבוגרים וגורם מרכזי למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם 1,2,3. התוצאה הקלינית הגרועה שלו נובעת מהטרוגניות תוך-גידולית משמעותית, מה שמוביל לעמידות לטיפול ולחזרה4. מחקר עדכני מצביע על כך שגיוון התפתחותי ופלסטיות במצב תא המונעים על ידי תוכניות שעתוק מרכזיות כמו ציר FOXM1/CEBPB תורמים לעמידות טיפולית ב-HCC5. ממצאים אלו מדגישים את הצורך להבין כיצד אוכלוסיות תאי הגידול מסתגלות ועוברות בין מצבים תחת לחץ טיפול מתמשך. עם זאת, רוב המודלים הפרה-קליניים ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים שהשתמשו ברקמות אנושיות נבדקו ואושרו על ידי הוועדות לסקירה אתית של המחקר של אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה (אישור מס' GYZL-2024-KY31). כל ההליכים הכוללים דגימות אנושיות בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות למחקר אנושי. התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המטופלים לשימוש בדגימות הקליניות שלהם למחקר רפואי. הריאגנטים והציוד בהם השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

תהליך זה כולל התאוששות והרחבה של אורגנואידים של קרצינומה כבדית מוקפרת, עם התאמות קלות להפרעות טיפוליות במורד הנהר וריצוף RNA חד-תאים. המטרה היא לייצר תרביות אורגנואידיות באיכות ועקביות מספקות לניסויים עתידיים בטיפול בתרופות12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מתאר את יצירתם ואפיון אורגנואידים של קרצינומה כבדית (HCC). באיור 1A, רקמות גידול שמקורן במטופל שימשו לקביעת תרביות אורגנואידיות לניתוח היסטולוגי ומחקרי טיפול. איור 1B מציג תמונות שדה בהיר של אורגנואידים בימים 1 ו-6 לאחר ההתאוששות, ומדגימה הישרדות והתרחבות בתנאי תרבית תלת-ממדיים סטנדרטיים. ביום הראשון, אורגנואידים נראים כמבנים קטנים וקומפקטיים, בעוד שביום השישי הם מראים גודל מוגבר ומורפולוגיה .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבטיח שחזוריות, יעילות וניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי איכותי, מספר שלבים טכניים בזרימת עבודה זו דורשים שליטה קפדנית. עקביות במהלך ההתחדשות וההתרחבות של אורגנואידים HCC שמקורם במטופל היא חיונית, שכן שינויים בצפיפות הזרעה, הרכב מטריצת הממברנה הבסיסית ותזמון התרבית יכולים להשפיע על מורפולוגיה אורגנואידית, גדילה ותגובות טיפול במורד הזרם13,14. בנוסף, חיוניות גבוהה של תאים במהלך דיסוציאציה היא קריטית ל-scRNA-seq, שכן עיכול אנזימטי קשה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (2023A1515011416), וקרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגג'ואו (2024A04J6575). חלק מהאלמנטים הסכמטיים נוצרו באמצעות 'בית לחוקרים' (https://www.home-for-researchers.com) והותאמו על ידי המחברים. איורים סכמטיים נוצרו באמצעות Figdraw (https://www.figdraw.com) והותאמו על ידי המחברים.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-גסטרין I אנושימרקG9145
מיקרוטיובס 1.5 מ"למרקAXYMCT150LC
1X RBC Lysis Bufferתרמו פישר סיינטיפיק00-4333-57
2.0 מ"ל בקבוקי קירור פנימיים עם חוטקן607001
A8301 (מעכב TGFb)Tocris Bioscience2939
נוגדן פוליקלונלי AFPפרויטנטק14550-1-AP
נוגדן אנטי-אלבומין [ALB/2144]אבקאםAB236492
נוגדן אנטי-HNF-4-אלפא [EPR16885] - דרגת ChIPאבקאםab181604
נוגדן אנטי-פראלבומין [EPR3219]אבקאםab92469
נוגדן אנטי-SOX9 [EPR14335-78]אבקאםab185966
תוסף B27 (503), ללא ויטמין Aתרמו פישר סיינטיפיק12587010
פתרון לשחזור תאים, 100 מ"לקורנינג354253תגובה המשמש להמסה של מטריצת ממברנה בסיסית ולשחזור אורגנואידים לפני ציפוי מחדש או עיבוד במורד הזרם
CellTiter-Glo®   מבחן הקיימות של תאים תלת-ממדייםפרומגהG9681
CHIR99021מרקSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, ספרייה ו-GEM ערכת חרוזי ג'ל v3.110x גנומיקהCG000227
מסננת תא קורנינג, בן 40 ויותר; m, כחול, S, IND, 1/50קורנינג431750
קוסטאר 24 בארים, תחתית שטוחה שקופה, חיבור אולטרה-נמוך, לוחות באר מרובים, עטופים בנפרד, סטרילייםקורנינג3473
BME עם גורם גדילה מופחת של Cultrex, סוג 2 PathClear (BME)מרק3533-005-02מטריצה חוץ-תאית המשמשת לתמיכה בתרבות אורגנית תלת-ממדית וביצירת כיפות
DMSOמרקC6164ממס המשמש להכנת תמיסות מלאי תרופות ושליטה ברכב
ה-F-12 של Dulbecco עם Modified Eagle/Ham's F-12תרמו פישר סיינטיפיק12634028DMEM/F-12 מתקדם
E7080 (לנבטיניב)סלקS1164מעכב טירוזין קינאז המשמש לטיפול אורגנואידי והפרעות טיפוליות
ערך סרום בקר עוברי FBSגיבקוA5256701
פורסקוליןTocris Bioscience1099
תוסף GlutaMAXתרמו פישר סיינטיפיק35050061
ערכת צביעת המטוקסילין ואיאוסיןביוטייםC0105S
HEPES, 1 Mתרמו פישר סיינטיפיק15630080
Leica DM6 B מיקרוסקופ ממונע פלואורסצנציהלייקהלא זמין
תוספת N2 (1003)תרמו פישר סיינטיפיק17502048
N-אצטילציסטאיןמרקA0737-5MG
ניקוטינאמידמרקN0636
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים בנפח 15 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק339651
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)תרמו פישר סיינטיפיק15140122
סליין מופעל בפוספטביוגרפיה של גנוםGNM20012בופר המשמש לשטיפת אורגנידים והכנת דגימות לעיבוד במורד הזרם
EGF אנושי רקומביננטיפפרוטקAF-100-15
FGF10 של אדם רקומביננטיפפרוטק100-26
HGF אנושי רקומביננטיפפרוטק100-39
נוגין אנושי רקומביננטיפפרוטק120-10C
מעכב רו קינאז Y-27632 דיהידרוכלורידמרקY0503מעכב ROCK המשמש לשיפור הישרדות אורגנואידים לאחר הפשרה או מעבר
מדיום מותנה ב-R-spodin1(ברוטייה ואחרים)לא זמיןהפרשת קווי תאים
Trypan Blue Stain, 0.4% מסונן ממברנה, מוכן במי מלח של 0.85%גיבקו15250061
אנזים TrypLE Express (פעם אחת), ללא פנול אדוםתרמו פישר סיינטיפיק12604013תחליף טריפסין
מדיום מותנה ב-Wnt-3a(ברוטייה ואחרים)לא זמיןהפרשת קווי תאים

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatocellular Carcinoma OrganoidsSingle Cell RNA SequencingDrug Treatment ResponseOrganoid Drug ScreeningOrganoid DissociationCell Viability AssayOrganoid Morphology AnalysisGene Expression ProfilingTumor HeterogeneityPathway Enrichment Analysis

Related Articles