הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יצירה וניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי של אורגנואידים של קרצינומה כבדית לאחר טיפול תרופתי

495 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70511

⸱

26 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ליצירת אורגנואידים של קרצינומה כבדית, יישום טיפול תרופתי וביצוע ריצוף RNA חד-תאי לפני ואחרי הטיפול לאפיון שינויים שעתוקיים הקשורים לטיפול.

תקציר

קרצינומה כבדית היא גורם מרכזי לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם ומאופיינת בהטרוגניות תוך-גידולית בולטת, התורמת לתגובות טיפול משתנות, להישנות הגידול ולהתקדמות המחלה. הבנה מעמיקה יותר של שינוי תאי הגידול ברמת השעתוק לפני ואחרי טיפול תרופתי היא חיונית לשיפור אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, תהליכי עבודה ניסיוניים מעשיים שמקשרים טיפול תרופתי מבוסס אורגנואידים לפרופיילינג טרנסקריפטומי חד-תאי במורד הזרם נותרו מוגבלים. במחקר זה פותח תהליך עבודה סטנדרטי ליצירת אורגנואידים של קרצינומה כבדית, יישום טיפול תרופתי מוגדר וביצוע ריצוף RNA חד-תאי על דגימות שנאספו לפני ואחרי הטיפול. הפרוטוקול כולל החייאה והרחבה של אורגנואידים, הערכת איכות לפני הטיפול, חשיפה לתרופות, הכנת אורגנואידים להתנתקות תא יחיד, בניית ספרייה וניתוח השוואתי בסיסי של נתוני טרנסקריפטומיה חד-תאיים. ניתנים אמצעי זהירות טכניים קריטיים לשיפור השכפול ואיכות הדגימה. תהליך עבודה זה מאפשר אפיון זה לצד זה של הרכב התאים ושינויים בתעתוק הקשורים לטיפול תרופתי באורגנואידים של קרצינומה כבדית. הפרוטוקול חזק, ניתן להרחבה וגמיש במערכות אורגנואידיות שונות, ומספק פלטפורמה מעשית לחקירת שינויים בביטוי גנים הקשורים לטיפול ברזולוציה של תא יחיד.

מבוא

קרצינומה כבדית (HCC) היא סרטן כבד ראשוני נפוץ ביותר במבוגרים וגורם מרכזי למקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם 1,2,3. התוצאה הקלינית הגרועה שלו נובעת מהטרוגניות תוך-גידולית משמעותית, מה שמוביל לעמידות לטיפול ולחזרה4. מחקר עדכני מצביע על כך שגיוון התפתחותי ופלסטיות במצב תא המונעים על ידי תוכניות שעתוק מרכזיות כמו ציר FOXM1/CEBPB תורמים לעמידות טיפולית ב-HCC5. ממצאים אלו מדגישים את הצורך להבין כיצד אוכלוסיות תאי הגידול מסתגלות ועוברות בין מצבים תחת לחץ טיפול מתמשך. עם זאת, רוב המודלים הפרה-קליניים אינם תופסים כראוי את האופי הדינמי והרציף של מעברי המצב הקשורים לטיפול, מה שמגביל את החקירה המכניסטית של התאמת הגידול וכישלון טיפולי.

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) מספקים פלטפורמה שימושית למטרה זו, שכן הם שומרים על שינויים גנומיים חשובים והטרוגניות תאית של הגידול המקורי6. ניתן לשמר אורגנואידים של HCC בתרבות ארוכת טווח תוך שמירה על תכונות רקמה מרכזיות7, מה שהופך אותם למתאימים במיוחד למחקרי טיפול-תגובה. בנוסף, מחקרים מבוססי אורגנואידים הוכיחו את היתכנות השימוש באורגנואידים של סרטן הכבד לבדיקות תרופות ולכידת הבדלים ברגישות טיפולית בין מטופלים לתוך-גידוליים, ותומכים בערכם כמודלים פרה-קליניים למחקר טיפול-תגובה 8,9. עם זאת, רוב מחקרי התרופות המבוססים על אורגנואידים עדיין מסתמכים בעיקר על מדידות כדאיות בנקודות קצה או מתמקדים בעיקר בתגובות פנוטיפיות גדולות, ובכך מספקים מידע מוגבל בלבד על תגובות תאיות הטרוגניות ושינויים שעתוקיים הקשורים לטיפול. במקביל, הפיתוח המהיר של אסטרטגיות טיפוליות מבוססות RNA ל-HCC מדגיש עוד יותר את הצורך במערכות פרה-קליניות שיכולות לחזות ולנתח באופן מכני תגובות טיפול ברזולוציה של תא יחיד10.

ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הרכב התאים ומצבי שעתוק בתוך מודלים אורגנואידיים11. כאשר מיישמים על אורגנואידים שנאספו לפני ואחרי הטיפול, scRNA-seq יכול לחשוף שינויים בביטוי גנים, שינויים באוכלוסיות התאים ותגובות הטרוגניות שאינן נתפסות בבדיקות גדולות. גישה זו מהווה לכן אסטרטגיה מעשית ועוצמתית לחקירת עיצוב מחדש של שעתוק הקשור לטיפול באורגנואידים של HCC. עם זאת, עדיין חסר זרימת עבודה מעשית וניתנת לשחזור המשלב תרבית אורגנואידים של HCC, טיפול תרופתי וריצוף RNA חד-תאי לפני ואחרי הטיפול. תהליך כזה יעיל במיוחד כאשר נשמרת שלמות האורגנידים במהלך החשיפה לתרופות ומקבלים מספיק תאים חיוניים לפרופיל תא יחיד במורד הזרם. כמו בגישות אחרות המבוססות על אורגנואידים, מגבלות חשובות כוללות ייצוג לא מלא של רכיבים סטרומליים, כלי דם ומערכת החיסון של מיקרוסביבת הגידול, וכן אפשרות להטיית בחירה במהלך תרבית ממושכת במבחנה.

מתוארת זרימת עבודה ניסיונית משולבת ליצירת אורגנואידים של HCC, יישום טיפול תרופתי מוגדר ועיבוד דגימות אורגנואידים לריצוף RNA חד-תאי לפני ואחרי הטיפול. תהליך עבודה זה כולל החייאה והרחבה של אורגנואידים, הערכת איכות לפני הטיפול, חשיפה מבוקרת לתרופות, וריצוף RNA חד-תאי של דגימות תואמות במורד הזרם. הגישה מספקת מסגרת מעשית להשוואה, ברזולוציה של תא יחיד, שינויים הקשורים לטיפול בהרכב התאים ובתוכניות ביטוי גנים באורגנואידים של HCC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקרים שהשתמשו ברקמות אנושיות נבדקו ואושרו על ידי הוועדות לסקירה אתית של המחקר של אוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה (אישור מס' GYZL-2024-KY31). כל ההליכים הכוללים דגימות אנושיות בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות למחקר אנושי. התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המטופלים לשימוש בדגימות הקליניות שלהם למחקר רפואי. הריאגנטים והציוד בהם השתמשו מופיעים בטבלת החומרים.

תהליך זה כולל התאוששות והרחבה של אורגנואידים של קרצינומה כבדית מוקפרת, עם התאמות קלות להפרעות טיפוליות במורד הנהר וריצוף RNA חד-תאים. המטרה היא לייצר תרביות אורגנואידיות באיכות ועקביות מספקות לניסויים עתידיים בטיפול בתרופות12.

1. הקמה והרחבה של אורגנידים שמקורם במטופלים ב-HCC

  1. הפשרה ושיקום של אורגנידים משומרים בקריו.
    1. הכנה לפני הפשרה
      1. חמם אמבט מים מראש ל-37 מעלות צלזיוס. יש לאזן צלחת עם 24 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לפחות שעה לפני ההצפה.
      2. הכן מדיום תרבית אורגנואיד מלא מראש ושמור על תמצית ממברנת הבסיס (BME) על קרח עד לשימוש. הרכב כל מדיום התרביות האורגנואידי מופיע בטבלה משלימה 1.
    2. הפשרת אורגנואידים
      1. הסירו קריוביאלים המכילים אורגנואידים קפואים של HCC מאחסון חנקן נוזלי והניחו אותם מיד באמבט מים באורך 37 מעלות צלזיוס.
      2. ערבבו בעדינות את הבקבוקון ועצרו את ההפשרה כאשר נשאר רק גביש קרח קטן.
    3. הסרת מגן קריופרוטקטן
      1. הפעילו בעדינות את המתלה המופשר פעם אחת כדי להחזיר את התכולה.
      2. העבר את המתלה לצינור קוני בנפח 15 מ"ל המכיל 3–5 מ"ל של מדיום תרבית אורגני שלם.
      3. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
  2. הטמעה וציפוי מחדש של אורגנואידים
    1. הכנת תערובת ההתאוששות
      1. החזירו את הכדור האורגנואידי למדיום מלא של תרבית אורגנואיד. הרכב כל מדיום התרביות האורגנואידי מופיע בטבלה משלימה 1.
      2. ערבבו בעדינות עם נפח שווה של BME קר כדי ליצור את תערובת הצלחות.
        הערה: שמרו על התערובת על קרח כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת.
    2. ציפוי כיפות אורגנואידיות
      1. יש לחלק 50 מיקרו-ליטר מתערובת המטריצת אורגנואידים לכל באר של לוח 24 בארות מחומם מראש.
      2. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר התגבשות מטריצה.
      3. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנידים מלא בתוספת 20 מיקרומום Y-27632 לכל באר לאורך קיר הבאר.
        הערה: יש להגביל את השימוש ב-Y-27632 ל-2–3 הימים הראשונים לאחר ההפשרה או העברה. ודאו שכל כיפה נשארת קומפקטית ומחוברת לתחתית הבאר, מבלי להתפשט החוצה.
  3. תרבות אורגנואידים והתרחבות
    1. תנאי תרביות התאוששות
      1. שמרו על אורגנואידים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
      2. השתמשו במדיום המכיל 20 מיקרומום Y-27632 במהלך 2–3 הימים הראשונים לאחר הפשרה.
    2. החלפה בינונית
      1. החלפת מדיום התרבית כל 3–4 ימים באמצעות שאיבה עדינה.
      2. הוסיפו מדיום טרי לאורך קיר כל באר כדי למנוע הפרעה לכיפות מטריצה.
      3. שמרו על אותו לוח זמנים להחלפת מדיום בכל הבארות באותו ניסוי.
    3. ניטור צמיחה
      1. מעקב אחרי התאוששות והתרחבות אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם הגדרות הדמיה עקביות.
      2. הקלט תמונות מייצגות בנקודות זמן מוגדרות במהלך ההתאוששות וההרחבה.
      3. אשר התאוששות מוצלחת כאשר רוב המבנים נשארים שלמים, אורגנואידים מציגים מורפולוגיה עגולה עד אליפטית עם גבולות חלקים, נצפית התרחבות הדרגתית לאורך זמן, וקיימים מעט מאוד שברים או מבנים קרסו.
      4. להוציא בארות המכילות פחות מ-10 אורגנידים שלמים מניתוח כמותי במורד הזרם.
    4. קריטריוני מעבר והרחבה
      1. נצפים אורגנואידים מעבר לאחר התרחבות יציבה.
      2. אשר התרחבות יציבה על ידי עלייה שניתנת לשחזור בגודל האורגנואיד או בשטח הכולל עם מורפולוגיה משומרת.
      3. השתמש בקריטריוני מרווח הדמיה, הגדלה והכללה עקביים בין ניסויים.
      4. ליצור עקומות צמיחה מייצגות בהתבסס על שטח או ספירה אורגנואידית כדי לאשר יציבות.
    5. קריטריונים לניסויים במורד הזרם
      1. השתמשו בקווים אורגנואידיים שמציגים גדילה תלת-ממדית יציבה, אינם מראים זיהום או קריסה נרחבת, ומספקים תפוקה מספקת לתנאי ניסוי מקבילים.
      2. שמרו על תרביות לפחות 7–10 ימים לאחר ההפשרה או עד להשלמת ההתאוששות ומחזור התרחבות אחד.
      3. התקדמו רק קווים אורגנואידים המראים מורפולוגיה עקבית על פני בארות שכפול.

2. הכנת אורגנואידים להפרעה טיפולית

  1. הערכת איכות לפני הטיפול
    1. הערכה מבוססת מורפולוגיה
      1. אשר שאורגנואידים הם עגולים עד אליפטיים במורפולוגיה.
      2. ודאו שאורגנואידים מציגים גבולות חלקים ומוגדרים היטב.
      3. וודא שיש פסולת תאית מינימלית בתוך הכיפה.
      4. החריגו תרביות עם פיצול נרחב, לומנים כהים, קריסה נרחבת או זיהום ברור.
    2. הערכת מצב התרחבות
      1. השתמש רק בתרביות אורגנואידים שסיימו את ההחלמה ונכנסו להתרחבות יציבה.
      2. אשר התרחבות הדרגתית לאורך זמן.
      3. אשר מורפולוגיה עקבית בין בארות שכפול.
  2. ציפוי מחדש של אורגנידים לטיפול בסמים
    1. שחזור אורגנואידים ממטריצה
      1. המיס כיפות אורגנואידיות על קרח באמצעות 1 מ"ל של תמיסת התאים קרים לכל באר למשך 15–20 דקות.
      2. פיפטה עדינה כל 5 דקות במהלך הדגירה.
      3. צנטריפוגה את המתלים ששוחזרו ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      4. החזירו את הכדור למדיום מלא של תרבית אורגנואיד.
    2. סטנדרטיזציה לפני החלפת ציפוי
      1. לאחד את העומס האורגנואידי ההתחלתי בין בארות לפני הטיפול בתרופות.
      2. לקבוע את מספר התאים הקיים לאחר דיסוציאציה חלקית כאשר הדבר אפשרי.
      3. נרמל דגימות לאותו מספר תאי קלט בכל באר.
      4. לוחן כ-1,000–5,000 תאים ברי קיימא בכל באר בפורמט של 24 בארות.
      5. אם לא מתבצעת ספירת תאים ישירה, יש לנרמל על ידי הבטחת מספר דומה של אורגנואידים שלמים מורפולוגית בכל באר והתפלגות גודל דומה בין הקבוצות.
      6. רשמו את מספר האורגנידים הראשוני ואת המורפולוגיה הבסיסית לכל אחד זמן לפני הטיפול.
      7. השתמש בקריטריוני הכללה ואסטרטגיית ציפוי זהים בכל הבארות באותו ניסוי.
    3. החלפת פלטה לטיפול בסמים
      1. ערבבו אורגנואידים שנתפסו עם מטריצת ממברנת בסיס קרח בריכוז סופי של 30%–50%.
      2. זרקו 50 מיקרו-ליטר כיפות לכל באר של פלטת 24 בארות.
      3. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר פולימריזציה.
      4. הוסיפו 500 מיקרול של תרבית אורגנית מלאה לכל באר לאורך קיר הבאר.
        הערה: ודאו שכל כיפה נשארת קומפקטית ומחוברת לתחתית הבאר, מבלי להתפשט החוצה. השתמש בנפח כיפה זהה וריכוז מטריצה בכל הבארות באותו ניסוי.
  3. החלמה לפני טיפול בסמים
    1. התאוששות לאחר החזרת הפלטה
      1. אפשר לאורגנואידים להתאושש בלילה בתנאי תרבית סטנדרטיים.
      2. התחל טיפול רק לאחר שמורפולוגיה שלמה מתבססת מחדש בתוך כיפות מצופות מחדש.
    2. קריטריוני כניסה לטיפול בסמים
      1. התחילו טיפול תרופתי רק כאשר האורגנואידים נשארים שלמים לאחר החזרת הציפוי, אין קריסה נרחבת או פסולת מופרזת, ועומס האורגנידים דומה בין הבארות.
      2. רשמו תמונות בסיס בשדה בהיר לכל קבוצות הניסוי לפני הטיפול.
      3. שמור על אותו עומס אורגנואידי התחלתי, זמן החלמה לאחר הפלטה מחדש, וזמן התחלת טיפול בכל הבארות הביקורת והמטופלות.
  4. שיקולי בטיחות
    1. בצע את כל ההליכים הכוללים אורגנואידים שמקורם באדם באמצעות ציוד מגן אישי מתאים ונהלי בטיחות ביולוגית.
    2. טפל בזהירות בתגובות דיסוציאציה אנזימטיות כדי להימנע מחשיפה לעור או לעיניים.
    3. להשליך פסולת ביולוגית נוזלית ומוצקה בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.

3. טיפול תרופתי באורגנואידים של HCC

  1. הכנה וטיפול בתרופות
    1. הכנת תרופות
      1. הכינו את תמיסת המלאי של לנבטיניב ב-DMSO לפי הוראות היצרן.
      2. מדלל את התמיסה המקורית במדיום התרבית המחומם מראש מיד לפני השימוש לריכוז העבודה המוגדר מראש.
      3. לשמור על ריכוז DMSO סופי זהה בכל הבארות (≤ 0.1%).
      4. הכינו מספיק נפח כדי להבטיח נפח טיפול סופי שווה בכל באר.
    2. טיפול בסמים
      1. הוסף מדיום המכיל לנבטיניב (20 מיקרומטר) לאורך קיר כל באר כדי למנוע הפרעה לכיפות מטריצה.
      2. כלול בקרת רכב עם אותו ריכוז סופי של DMSO.
      3. דגרו אורגנואידים בתנאי תרבית סטנדרטיים לתקופת הטיפול המוגדרת מראש.
      4. החלפת מדיום המכיל תרופות כל 48–72 שעות למשך טיפול הארוך מ-72 שעות.
      5. השתמש באותו לוח זמנים להחלפת מדיום בכל הבארות בתוך הניסוי.
      6. הקליטו תמונות בסיס בשדה בהיר לפני הטיפול.
      7. לצלם תמונות במרווחים קבועים במהלך הטיפול באמצעות הגדרות מיקרוסקופ זהות, הגדלה ומיקומי שדה זהים.
  2. הערכת תגובת הטיפול
    1. הערכה מבוססת מורפולוגיה
      1. הערך את תגובת הטיפול באמצעות הקריאות המבוססות על תמונות הבאות: עקומת גדילה באזור האורגנואידים, קוטר אורגנואידים ממוצע, וספירת אורגנואידים ששרדה.
      2. השתמש בהגדרות חשיפה, הגדלה וספי ניתוח זהים לכל התמונות.
      3. מדידו את עקומת הצמיחה של שטח האורגנואיד על ידי חישוב שטח האורגנואיד הכולל לכל באר או שדה בכל נקודת זמן ונרמול לבסיס.
      4. מדידת קוטר אורגנואיד ממוצע על ידי קביעת קוטר של אורגנידים שלמים בודדים וחישוב הערך הממוצע לכל באר.
      5. קבעו את ספירת האורגנידים ששרדו על ידי ספירת אורגנואידים שלמים מזוהים מורפולוגית והשלמת שברים ושברים שהתמוטטו.
    2. מדידת כדאיות אופציונלית
      1. יש לבצע בדיקת כדאיות תלת-ממדית של זוהר בנקודת קצה הטיפול אם נדרשת הערכת כדאיות נרחבת נוספת.
      2. פעלו לפי הוראות היצרן לביצוע הבדיקה.
  3. ניתוח נתונים
    1. שרטט עקומות גדילה של שטח אורגנואידים לאורך זמן.
    2. השווה את קוטר האורגנואיד הממוצע בין קבוצות שטופלו ברכב לבין קבוצות שטופלו בלנווטיניב.
    3. השווה ספירות אורגנואידים ששרדו בין קבוצות הטיפול.
    4. יש ליישם לוחות זמנים זהים לרכישת תמונה, קריטריוני הכללת אורגנואידים ופרמטרי ניתוח על כל הקבוצות כדי להבטיח שחזוריות.

4. הכנת אורגנואידים לריצוף RNA חד-תאי

  1. ברירה ושיקום של אורגנואידים
    1. הערכת טרום-דיסוציאציה
      1. בחרו בארות אורגנואידיות שמציגות מורפולוגיה תלת-ממדית שלמה ללא קריסה נרחבת, מכילות חומר מספק ללכידה של תא יחיד במורד הזרם, ואינן מראות זיהום ברור.
      2. לאסוף אורגנואידים בנקודות זמן ניסיוניות תואמות בין דגימות ביקורת וטופלו.
      3. שמור על צפיפות ציפוי זהה, לוח זמנים לטיפול ותנאי החלפת תווך בין הדגימות.
      4. הקליטו תמונות שדה בהיר של כל אחד שנבחר זמן רב לפני הדיסוציאציה באמצעות הגדרות מיקרוסקופ זהות, הגדלה וקריטריוני בחירת שדה.
    2. הסרת מטריצה
      1. מדיום תרבות שאיפה לחלוטין מכל באר.
      2. שטפו כל באר פעמיים עם PBS קר כדי להסיר שארית מדיום ופסולת.
      3. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת התאים קרים לכל באר.
      4. דגרו על הקרח למשך 20–30 דקות.
      5. פיפט בעדינות כל 5–7 דקות במהלך הדגירה כדי להקל על המסה של המטריצה.
      6. העבר חומר מומס לצינורות מקוררים מראש באמצעות קצה פיפטה רחב או חתוך כדי למזער את מאמץ הגזירה.
      7. יש לעבור לדיסוציאציה אנזימטית רק לאחר שהמטריצה מוסה ברובה ונשארות שאריות ג'ל מינימליות נראות.
  2. פירוק אנזימטי והכנת תלייה חד-תאית
    1. דיסוציאציה אנזימטית
      1. צנטריפוגה את המתלה האורגנואידי שהוחזר ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. הסר את הסופרנטנט בזהירות מבלי להפריע לכדור.
      3. החזירו את הכדור ל-1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה של תאים רקומביננטיים.
      4. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–10 דקות.
      5. פיפטה בעדינות 8–10 פעמים כל 2–3 דקות עם קצה P1000 רחב קוטר כדי לעודד דיסוציאציה.
      6. עצור את העיכול כאשר רוב שברי האורגנואיד התפזרו לתאים בודדים ונשארים רק אשכולות קטנים שאריתיים.
      7. הימנעו מעיכול ממושך כדי למנוע ירידה בחיוניות התאים, ארטיפקטים של שעתוק הקשורים ללחץ, וזיהום RNA סביבתי מוגבר.
    2. הקפאה וסינון
      1. הוסף 4 מ"ל של PBS קר עם 2% סרום בקר עוברי כדי לעצור את העיכול.
      2. סנן את המתלה דרך מסננת תא 40 מיקרון.
      3. שטוף פעם אחת עם PBS כדי להסיר שאריות אנזימים, אגרגטים ופסולת.
      4. בצע ניתוק תאי דם אדומים אם קיים זיהום באריתרוציטים, בהתאם להוראות היצרן.
    3. הכנת תאים ובקרת איכות
      1. ספירת תאים באמצעות החרגת טריפאן בלו.
      2. קבע את עמידות התאים לפני הכנת הספרייה.
      3. השתמש רק בדגימות עם עמידות ≥ 85%.
      4. כוונן את ריכוז התאים הסופי ל-700–1,200 תאים/מיקרוליטר.
      5. יש להוציא דגימות עם פסולת מופרזת, תאים מתים בשפע, אגרגטים גדולים נראים לעין, או דיסוציאציה לא שלמה.
      6. יש לחזור על הסינון לפני הטעינה אם קיימים אגגטים.
      7. בקרת תהליך ודגימות מטופלות בתנאים זהים, כולל אנזים הדיסוציאציה, זמן העיכול, תדירות הפיפטרציה, שיטת הסינון, ריכוז התאים ואסטרטגיית הטעינה.
  3. הכנת ספריית תא יחיד וריצוף
    1. לכידת תא יחיד והכנת ספרייה
      1. טען את המתלה היחיד המוכן על פלטפורמת לכידה חד-תאית מבוססת טיפות לפי הוראות היצרן.
      2. בצע שעתוק הפוך, הגברה של cDNA ובניית ספריות באמצעות זרימת העבודה של תא יחיד 3′ מתאימה.
    2. פרמטרי ריצוף
      1. ספריות רצף בעומק של לפחות 50,000 קריאות לכל תא.
      2. תאי טעינה כדי להשיג התאוששות של כ-6,000–10,000 תאים בכל ספרייה.
      3. הקלט כימיה של ריצוף, מבנה קריאה והגדרות מכשירים.
  4. קריטריוני איכות לניתוח במורד הזרם
    1. ודא שההכנה הסופית כוללת עמידות תאית גבוהה, פסולת מינימלית ועומס מצטבר נמוך.
    2. לאשר התאמה לניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי במורד הזרם של הטרוגניות תאית ומעברי מצב תא.

5. עיבוד בסיסי ובקרת איכות של נתוני ריצוף RNA תא יחיד

  1. עיבוד ראשוני
    1. יצירת מטריצת ספירה
      1. עבדו נתוני רצף גולמיים באמצעות צינור הייצור המומלץ עבור הפלטפורמה הנבחרת.
      2. יצר מטריצת ספירת גן אחר תא.
      3. גרסת תוכנת הקלטה, בניית גנום ייחוס, ושחרור הערות תמלול.
    2. הערכת איכות ראשונית ברמת הספרייה
      1. סיכם מדדי ריצוף לכל ספרייה, כולל סך הקריאות, מספר התאים המשוחזר המשוער, גנים חציוניים לכל תא, UMI חציוני לתא, ורוויית ריצוף (אם רלוונטי).
      2. השתמש בגנום ייחוס והגדרות אנוטציה זהות בכל הדגימות.
  2. בקרת איכות ברמת התא
    1. סינון תאים באיכות נמוכה
      1. העריכו עבור כל תא את מספר הגנים שזוהו, סך ספירת ה-UMI, שיעור התמלילים המיטוכונדריאליים, והראיות לכפולים או מולטיפלטים.
      2. יש להוציא תאים עם ספירת גנים נמוכה מאוד, ספירת UMI נמוכה מאוד, או שברי תמלול מיטוכונדריה גבוהים באופן חריג.
      3. הגדר ספי סינון בהתבסס על התפלגות מערכי הנתונים.
      4. יש להחיל ספים זהים בין קבוצות טיפול תואמות.
    2. הסרת דאבלטים סבירים
      1. זהה דאבלטים סבירים באמצעות שיטה חישובית מתאימה.
      2. הסר דאבלטים באמצעות תהליך זיהוי תואם לפלטפורמה.
      3. יישם את אותה אסטרטגיית זיהוי כפול על כל הדגימות.
  3. נרמליזציה, אשכולות והערות
    1. נרמול נתונים
      1. נרמול מטריצת הספירה המסוננת באמצעות זרימת עבודה סטנדרטית של RNA-seq חד-תא.
      2. יישם נהלי נרמול זהים על כל הדגימות.
    2. הפחתת ממדיות ואשכול
      1. בצע הפחתת ממדות.
      2. לבצע קיבוץ לא מפוקח לזיהוי אוכלוסיות שעתוק עיקריות.
      3. המחישו מצבי תאים באמצעות שיטת הטמעה מממד נמוך כמו UMAP.
    3. זיהוי גן סמן
      1. זיהוי גנים של סמנים באמצעות ניתוח ביטוי שונה בין אשכולות.
      2. הקצו פרשנות ביולוגית למצבי תאים אפיתל עיקריים בהתבסס על ביטוי הסמן.
  4. ניתוח השוואתי של תנאי טיפול
    1. אינטגרציה של מטא-דאטה
      1. הערות על כל תא עם מצב הטיפול, קו אורגנואידים שמקורו במטופל, ואצווה של עיבוד.
      2. שמור על מבנה מטא-דאטה עקבי בכל הדגימות.
    2. ניתוח שינויים הקשורים לטיפול
      1. השווה בין דגימות מקרה לדגימות מטופלות.
      2. זיהוי שיפוץ שעתוק הקשור לטיפול.
      3. זהה שינויים בהרכב מצב התא.
      4. זיהוי אוכלוסיות תאים מועמדות הקשורות להתאמה טיפולית.
      5. פרש תוצאות יחד עם קריאות מבוססות מורפולוגיה וקריאות כדאיות.
  5. תוצאות ניתוח נתונים
    1. יצירת מטריצת ספירת גנים לפי תא מבוקרת איכות.
    2. יצר ויזואליזציות מממד נמוך של אוכלוסיות שונות משעתוק.
    3. זהה גני סמן לאשכולות עיקריים.
    4. שמירה על עקביות בכל הדגימות בגנום הייחוס, תהליך העיבוד המוקדם, קריטריוני הסינון, אסטרטגיית האשכול וקריטריוני ההערות.
    5. תעד כל סטייה ספציפית לדוגמה מתהליך העבודה הסטנדרטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מתאר את יצירתם ואפיון אורגנואידים של קרצינומה כבדית (HCC). באיור 1A, רקמות גידול שמקורן במטופל שימשו לקביעת תרביות אורגנואידיות לניתוח היסטולוגי ומחקרי טיפול. איור 1B מציג תמונות שדה בהיר של אורגנואידים בימים 1 ו-6 לאחר ההתאוששות, ומדגימה הישרדות והתרחבות בתנאי תרבית תלת-ממדיים סטנדרטיים. ביום הראשון, אורגנואידים נראים כמבנים קטנים וקומפקטיים, בעוד שביום השישי הם מראים גודל מוגבר ומורפולוגיה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי להבטיח שחזוריות, יעילות וניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי איכותי, מספר שלבים טכניים בזרימת עבודה זו דורשים שליטה קפדנית. עקביות במהלך ההתחדשות וההתרחבות של אורגנואידים HCC שמקורם במטופל היא חיונית, שכן שינויים בצפיפות הזרעה, הרכב מטריצת הממברנה הבסיסית ותזמון התרבית יכולים להשפיע על מורפולוגיה אורגנואידית, גדילה ותגובות טיפול במורד הזרם13,14. בנוסף, חיוניות גבוהה של תאים במהלך דיסוציאציה היא קריטית ל-scRNA-seq, שכן עיכול אנזימטי קשה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (2023A1515011416), וקרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגג'ואו (2024A04J6575). חלק מהאלמנטים הסכמטיים נוצרו באמצעות 'בית לחוקרים' (https://www.home-for-researchers.com) והותאמו על ידי המחברים. איורים סכמטיים נוצרו באמצעות Figdraw (https://www.figdraw.com) והותאמו על ידי המחברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
[Leu15]-גסטרין I אנושימרקG9145
מיקרוטיובס 1.5 מ"למרקAXYMCT150LC
1X RBC Lysis Bufferתרמו פישר סיינטיפיק00-4333-57
2.0 מ"ל בקבוקי קירור פנימיים עם חוטקן607001
A8301 (מעכב TGFb)Tocris Bioscience2939
נוגדן פוליקלונלי AFPפרויטנטק14550-1-AP
נוגדן אנטי-אלבומין [ALB/2144]אבקאםAB236492
נוגדן אנטי-HNF-4-אלפא [EPR16885] - דרגת ChIPאבקאםab181604
נוגדן אנטי-פראלבומין [EPR3219]אבקאםab92469
נוגדן אנטי-SOX9 [EPR14335-78]אבקאםab185966
תוסף B27 (503), ללא ויטמין Aתרמו פישר סיינטיפיק12587010
פתרון לשחזור תאים, 100 מ"לקורנינג354253תגובה המשמש להמסה של מטריצת ממברנה בסיסית ולשחזור אורגנואידים לפני ציפוי מחדש או עיבוד במורד הזרם
CellTiter-Glo®   מבחן הקיימות של תאים תלת-ממדייםפרומגהG9681
CHIR99021מרקSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, ספרייה ו-GEM ערכת חרוזי ג'ל v3.110x גנומיקהCG000227
מסננת תא קורנינג, בן 40 ויותר; m, כחול, S, IND, 1/50קורנינג431750
קוסטאר 24 בארים, תחתית שטוחה שקופה, חיבור אולטרה-נמוך, לוחות באר מרובים, עטופים בנפרד, סטרילייםקורנינג3473
BME עם גורם גדילה מופחת של Cultrex, סוג 2 PathClear (BME)מרק3533-005-02מטריצה חוץ-תאית המשמשת לתמיכה בתרבות אורגנית תלת-ממדית וביצירת כיפות
DMSOמרקC6164ממס המשמש להכנת תמיסות מלאי תרופות ושליטה ברכב
ה-F-12 של Dulbecco עם Modified Eagle/Ham's F-12תרמו פישר סיינטיפיק12634028DMEM/F-12 מתקדם
E7080 (לנבטיניב)סלקS1164מעכב טירוזין קינאז המשמש לטיפול אורגנואידי והפרעות טיפוליות
ערך סרום בקר עוברי FBSגיבקוA5256701
פורסקוליןTocris Bioscience1099
תוסף GlutaMAXתרמו פישר סיינטיפיק35050061
ערכת צביעת המטוקסילין ואיאוסיןביוטייםC0105S
HEPES, 1 Mתרמו פישר סיינטיפיק15630080
Leica DM6 B מיקרוסקופ ממונע פלואורסצנציהלייקהלא זמין
תוספת N2 (1003)תרמו פישר סיינטיפיק17502048
N-אצטילציסטאיןמרקA0737-5MG
ניקוטינאמידמרקN0636
צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים בנפח 15 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק339651
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)תרמו פישר סיינטיפיק15140122
סליין מופעל בפוספטביוגרפיה של גנוםGNM20012בופר המשמש לשטיפת אורגנידים והכנת דגימות לעיבוד במורד הזרם
EGF אנושי רקומביננטיפפרוטקAF-100-15
FGF10 של אדם רקומביננטיפפרוטק100-26
HGF אנושי רקומביננטיפפרוטק100-39
נוגין אנושי רקומביננטיפפרוטק120-10C
מעכב רו קינאז Y-27632 דיהידרוכלורידמרקY0503מעכב ROCK המשמש לשיפור הישרדות אורגנואידים לאחר הפשרה או מעבר
מדיום מותנה ב-R-spodin1(ברוטייה ואחרים)לא זמיןהפרשת קווי תאים
Trypan Blue Stain, 0.4% מסונן ממברנה, מוכן במי מלח של 0.85%גיבקו15250061
אנזים TrypLE Express (פעם אחת), ללא פנול אדוםתרמו פישר סיינטיפיק12604013תחליף טריפסין
מדיום מותנה ב-Wnt-3a(ברוטייה ואחרים)לא זמיןהפרשת קווי תאים

מקורות

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ריצוף RNA של תא בודדתגובה לטיפול תרופתיסריקת תרופות באורגנואידיםדיסוסיאציה של אורגנואידיםבדיקת חיוניות תאיםניתוח מורפולוגיה של אורגנואידיםפרופיל ביטוי גניםהטרוגניות גידוליתניתוח העשרה של מסלולים
יצירה וניתוח טרנסקריפטומי חד-תאי של אורגנואידים של קרצינומה כבדית לאחר טיפול תרופתי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.