מאמר שיטה

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70512

⸱

13 במרץ 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research: Hubrecht Institute, 2Oncode Institute, 3Royal Netherlands Academy of Arts and Science (KNAW), 4University Medical Center Utrecht

במאמר זה

סיכום

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תקציר

טכנולוגיית אורגנואיד מספקת פלטפורמה ניסיונית במבחנה לחקר פיזיולוגיה אנושית בבריאות ומחלות. בהשוואה למערכות אחרות במבחנה , כגון קווי תאים שמקורם בסרטן או אקספלנטים, אורגנואידים שמקורם בתאי גזע רקמתיים (TSC) מציעים יתרונות מרכזיים: ניתן להרחיב אותם ללא הגבלת זמן תוך שמירה על יציבות גנומית וניתנים לשינוי CRISPR. מכיוון שאורגנידים אלו נוצרים מ-TSCs תקינים, הם מכילים את סוגי התאים של רקמת המקור שלהם. דבר זה הופך את האורגנואידים לחשובים במיוחד לחקירת אינטראקציות בין חיידקים לתאים אנושיים מובחנים שאינם גידוליים. אורגנואידים במעי גדלים כמונו-שכבות דו-ממדיות מקוטבות על מרכיבי תרבית תאים מצופים בתמצית ממברנת בסיס (BME) או בפולש, חלופה חסכונית ללא בעלי חיים, וניתן להבדיל אותם לסוגי תאי אפיתל במעי עיקריים לצורך זיהום ב-E. coli פולש דבק פתוגני. קריאות מפתח של זיהום כוללות ניטור ביטוי גנים אפיתל באמצעות PCR כמותי של שעתוק הפוך (RT-qPCR), הדמיית אינטראקציות בין חיידקים לאפיתל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וכימות פריצת מחסום אפיתלי. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות לחקר איברים אחרים ומינים של חיידקים, ומספק פלטפורמה גמישה לחקר אינטראקציות בין מארח למיקרואורגניזמים באורגנידים.

מבוא

האפיתל המעי מהווה את קו ההגנה הראשון נגד חיידקים פתוגניים הנמצאים בלומן המעיים. מודלים חוברת גופנית של אפיתל המעי שימשו רבות לחקר האופן שבו חיידקים מתקשרים עם תאי אפיתל, כיצד תאים אלו מגיבים לזיהום, וכיצד חיידקים חודרים את מחסום האפיתל1. מודלים אלו חשובים במיוחד לחקירת פתוגנים ספציפיים לאדם בסביבה מבוקרת ורדורדיוניסטית. היסטורית, ביולוגיית זיהום חוץ-גופית התבססה על קווי תאים שמקורם בגידולים, כגון תאי Caco-2, או על צמחים חיצוניים שמקורם בחולה שנשמרו מחוץ לחיים 2,3. לאחרונה, אורגנואידים במעי שנוצרים מתאי גזע ברקמה אנושית הפכו לכלי עוצמתי המשלב את יתרונות שתי הגישות: בדומה לקווי תאים, אורגנואידים יכולים לעבור מעבר, להרחיב אותם, להקפיא, להפשיר ולעבור מניפולציה גנטית; וכמו explants, הם נגזרים מתאי גזע לא-גידוליים המסוגלים להתמיין לכל סוגי תאי האפיתל העיקריים 4,5.

כאשר הם מוטמעים במטריצה כמו Matrigel או תמצית ממברנת הבסיס (BME), אורגנואידים של המעי האנושי בדרך כלל מתארגנים את עצמם למבנים כדוריים מקוטבים עם משטח אפיקלי הפונה פנימה ומשטח בסיסי הפונה החוצה. מכיוון שרוב הפתוגנים במעי ניגשים לתאי אפיתל מהצד האפיקולי, פותחו מספר אסטרטגיות לחשיפת משטח זה לחיידקים באורגנואידים4. גישה אחת היא הזרקת חיידקים מיקרו ישירות לתוך האורגנואידלומן 6. תוכנית נוספת כוללת הפיכת הקוטביות של אורגנואידים על ידי שחרורם מהמטריצה החוץ-תאית, ויצירת אורגנואידים "אפיקל-אאוט" בתנאיתלייה 7. אסטרטגיה שלישית היא להפריד אורגנואידים לתאים בודדים ולזרוע אותם על אינסרטים לתרבות תאים ליצירת שכבות מונו-שכבות דו-ממדיות מקוטבות (יריעות אורגנואיד דו-ממדיות) כאשר הצד האפיקלי פונה לתא העליון8. לשתי השיטות הראשונות יש מגבלות חשובות: מיקרו-הזרקה גוזלת זמן ודורשת עבודה רבה, מגבילה את קצב התפוקה, ואורגנואידים עם אפיקל-אאוט שורדים רק מספר ימים ללא תמיכה מטריצה ואינם ניתנים להבחנה1. לעומת זאת, גיליונות אורגנואידים דו-ממדיים תומכים בניסויים בעלי תפוקה גבוהה (ניתן פשוט להוסיף חיידקים לתא העליון) וניתן לשמור עליהם במשך מספר שבועות תוך התמיינות לתאי אפיתל במעי עיקריים9.

בניגוד לקווי תאים מונצחים שמתחברים בקלות למשטחי פלסטיק, תאים שמקורם באורגנואידים דורשים ציפוי לוחות לצורך הידבקות יעילה. ניתן לבצע ציפוי באמצעות BMEמדולל 10, או לחלופין באמצעות אינוסין, חלבון חיידקי הקושר אינטגרינים לתאי אורגנואיד11. Invasin קל לייצור במעבדה, חסכוני משמעותית מ-BME או Matrigel, וללא בעלי חיים לחלוטין.

פרוטוקול זה מתאר את הקמתה והבדלת של אורגנואידים במעי כשכבות מונו-שכבות דו-ממדיות מקוטבות על תוספות לתרבות תאים מצופות בתמצית אינבסין או תמצית ממברנת בסיס (BME). היריעות האורגנואידיות המובחנות נדבקו לאחר מכן ב-Escherichia coli (AIEC), זן פתוגני הקשור למחלת מעי דלקתית12. מספר קריאות זיהום במורד הזרם מתוארות להערכת תגובות אפיתל והעברת חיידקים. בהינתן ש-AIEC פולש לתאי אפיתל וחודר לאפיתל המעי – מנגנון הנחשב לתרום לפתוגניות שלו – פריצת האפיתל נמדדת על ידי מדידת חיידקים שמגיעים לתא הבזולטרלי של תרבית התא לאחר אישור שלמות המחסום באמצעות מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית/טרנסאנדותלית (TEER)13. ניתנים גם פרוצדורות לתיקון והדמיה של שכבות מונולייריות נגועות לצורך המחשת AIEC תוך-תאי וחוץ-תא, וכן לחילוץ RNA להערכת תגובות השעתוק האפיתל לזיהום. הפרוטוקול המלא ניתן לבצע בפחות משבועיים ודורש רק ציוד מעבדה נפוץ זמין, כולל ארון BSL-2, מיקרוסקופ קונפוקלי ומכשיר PCR כמותי.

בסך הכול, פרוטוקול זה מספק שיטה חסכונית, רב-שימושית ונגישה לחקר זיהום חיידקי באפיתל מעי אנושי ממויח במבחנה. ניתן להתאים אותו בקלות למערכות אורגנואידיות אחרות ולמינים מיקרוביאליים אחרים, מה שהופך אותו לתבנית שימושית למחקרי ביולוגיה של זיהומים במבחנה .

פרוטוקול

האורגנואידים של המעי האנושי נוצרו מחומרי פסולת של מטופלים שעברו ניתוח סרטן המעי הגס במרכז הרפואי האוניברסיטאי באוטרכט (UMCU). המטופלים נתנו הסכמה מדעת ליצירת האורגנואידים שלהם, בהתאם לפרוטוקול UPORT Cancer Biobank 21-042, שאושר על ידי הוועדה המקומית לאתיקה לביובנקינג. איור 1A ממחיש את שמונת הסעיפים של הפרוטוקול. פרטי הריאגנט והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. ציפוי תרבית התאים

  1. ציפוי באינוואסין
    1. בצע את כל ההליכים בתוך מכסה תרבית רקמה בתנאים סטריליים.
    2. הכינו תמיסה של 5 מיקרוגרם/מ"ל של אינוואסין במי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS).
    3. הוסיפו 100 מיקרוליטר מהתמיסה הזו לתא העליון של כל הכנסת תרבית תאי פוליאסטר נקבוביות בגודל 3 מיקרון, המונחת בלוח עם 24 בארות.
    4. ודא שהממברנה מכוסה לחלוטין.
    5. דגירה ללילה בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: הימנעו מהיווצרות בועות בזמן ההזנה, שכן בועות מונעות ציפוי אחיד.
  2. ציפוי בתמצית ממברנת הבסיס (חלופה)
    1. הפשרה של תמצית ממברנה במרתף על קרח.
    2. הכינו תמיסה של 10% ב-DMEM קר מאוד.
      הערה: שמור את התמיסה קרה כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת.
    3. הוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה המדוללת לתא העליון של כל תרבית תא נקבוביות של 3 מיקרון.
    4. ודא כיסוי מלא של פני הממברנה.
    5. דגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר.

2. זריעה של תאים אורגנואידיים

  1. הכנת אורגנואידים
    1. הסרת מדיום תרבית מלוחות אורגנואיד הנשמרים בתנאי התרחבות (3-5 ימים לאחר הפיצול).
    2. החזירו אורגנואידים ל-1 מ"ל DMEM קר14.
    3. העבר את המתלה לצינור קוני בנפח 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל DMEM קר כקרח.
      הערה: השתמש בערך באר אחת מלאה מצלחת עם 12 בארים כדי לזרוע 4 תרביות תאים.
  2. אורגנואידים של פלט
    1. צנטריפוגה ל-5 דקות ב-500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר את הסופרנטנט לחלוטין.
  3. אורגנואידים מתנתקים
    1. החזירו את הכדור ל-3 מ"ל תחליף טריפסין רקומביננטי.
    2. פיפט למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000 כדי לשבש מכנית את האורגנואידים.
    3. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות עד שמתקבלים תאים בודדים או אשכולות קטנים (3-4 תאים).
      הערה: אין לעלות על 20 דקות דגירה. פיפטה כל 5 דקות כדי להקל על התנתקות. הכנס קצה P10 לתוך קצה P1000 אם נדרש כוח מכני נוסף.
  4. תאי שטיפה
    1. הוסיפו 5 מ"ל DMEM קר.
    2. צנטריפוגה ל-5 דקות ב-500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את הסופרנטנט.
  5. הכנת תליית תא
    1. החזירו תאים למרחק התפשטות (100 מיקרוליטר לכל תרבית תא הכנסה; ראו טבלה 1 להרכב מדיום ההתפשטות).
      הערה: אין לכלול אנטיביוטיקה. כלול מעכב רו קינאז למניעת אנואיקיס.
    2. ספירת תאים באמצעות מד תאים או המוסיטומטר.
    3. התאימו לכ-2 × 106 תאים למ"ל.
  6. זריעה בתרבות התאים
    1. הסר את תמיסת הציפוי מהתוספות.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר של תליית תא (2 × 105 תאים) לתא העליון.
    3. הוסף 500 מיקרוליטר מדיום התפשטות לתא התחתון.

3. תרבית הinsert של תרבית תאים והבחנה

  1. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 עד להגיע למפגש (כ-3 ימים).
    הערה: רענן מדיום בשני התאים כל 4-5 ימים אם צריך.
  2. לאחר ההתלכדויות, שטוף את שני התאים עם DMEM מחומם מראש.
  3. הוסף מדיום דיפרנציאציה של 500 מיקרוליטר (טבלה 2) לתא התחתון.
  4. הוסף 100 מיקרוליטר DMEM/F12 מתקדם בתוספת HEPES וגלוטאמקס (AdvDMEM++) (טבלה 3) לתא העליון.
  5. דגרו במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
  6. החלפת מדיה בשני התאים כל יומיים.

4. מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית/טרנסאנדותל (TEER)

  1. סטריליזציה של אלקטרודות TEER ב-70% אתנול למשך 15 דקות.
  2. שטוף אלקטרודות ב-PBS סטרילי.
  3. הכנס את האלקטרודה הקצרה לתא העליון ואת האלקטרודה הארוכה לתא התחתון.
    הערה: אל תיגע בשכבה היחידה עם קצה האלקטרודה.
  4. תעד ערכי התנגדות.
  5. מדדו התנגדות ריקה באמצעות תוספת ללא תאים המכילה PBS (100 מיקרוליטר עליון, 500 מיקרוליטר תחתון).
  6. חשב TEER: TEER = (הכנסת תרבית R_cell − R_blank) × שטח פנים (ס"מ²)
    הערה: עבור הכנסות עם 24 בארות, שטח הפנים = 0.33 ס"מ².

5. זיהום ב-AIEC

  1. הכינו תרבית חיידקים
    1. חיסון AIEC פלואורסצנטי ב-3 מ"ל LBבינוני 15.
    2. דגור בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור.
      אזהרה: בצע את כל ההליכים החיידקיים במכסה BSL-2.
  2. הכין את החיסון
    1. תרבית 500 מיקרולטר בצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-1500 × גרם.
    2. השעיה מחדש ב-1 מ"ל AdvDMEM++.
    3. מדידת צפיפות אופטית (OD).
    4. מדלל לכ-1 × 10⁸ CFU/mL ב-AdvDMEM++.
      הערה: OD = 1 מתייחס לכ-1 × 10⁹ CFU/mL.
  3. הדבקה של המונולייירים
    1. החלף מדיה בשני התאים.
    2. הוסף מדיום דיפרנציאציה של 500 מיקרוליטר לתא התחתון.
    3. הוסף 100 מיקרוליטר תלייה חיידקית לתא העליון למצב הנגוע.
    4. הוסף 100 מיקרו-ליטר AdvDMEM++ לתא העליון עבור מצב שאינו נגוע.
    5. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.

6. הערכת פריצת אפיתל

  1. ב-2.5 שעות לאחר ההדבקה, אספו 100 מיקרוליטר מהתא התחתון.
  2. מדלל ב-PBS וצלחת על אגר LB.
  3. הוסיפו 100 מיקרוליטר מדיום הגזרה טרי לתא התחתון.
  4. דגירה של צלחות במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. חזור על הדגימה 5 שעות לאחר ההדבקה.
  6. יחידת הקמת המושבה (CFU) ביום הבא.
  7. חישב CFU לכל תרבית תא הכנסה: CFUs/תרבית תא insert = מושבות × 5 × פקטור דילול

7. זיהום תמונה

  1. 5 שעות לאחר ההדבקה, הסר את המדיה ומקבע עם 4% פאראפורמלדהיד.
    אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ונדיץ. הידית בתוך מכסה אדים תוך כדי לבישת כפפות.
  2. תיקון ל-30 דקות.
  3. שטוף שלוש פעמים עם PBS.
  4. הסר את הכנסת הממברנה ומניח את התאים הפונים כלפי מעלה בלוח באר.
  5. צבע בפאלואידין פלואורסצנטי למשך 1-2 שעות.
  6. שטוף שלוש פעמים עם PBS.
  7. צבע גרעיני DAPI למשך 10 דקות.
  8. שטוף שלוש פעמים עם PBS.
  9. התקן על מגלש זכוכית עם מדיום התקנה ומרח כיסוי (coverslip).
  10. אטום עם לק לציפורניים.
  11. לרכוש תמונות קונפוקליות של DAPI, אקטין ותעלות חיידקים.
  12. רכישת מחסנית z המשתרעת על פני בסיס עד משטחים אפיקליים עם מרווחים של 1 מיקרון.
  13. תמונות פתוחות בפיג'י.
  14. בחר תמונה → פרויקט Z → עוצמה ממוצעת.
  15. בחר → תמונה → תצוגות אורתוגונליות כדי להמחיש חתכים רוחביים.

8. ניתוח תגובת אפיתל

  1. 5 שעות לאחר ההדבקה, הסר את המדיום.
  2. הוסיפו בופר ליזיס של 350 מיקרוליטר לתא העליון.
  3. פיפט לליז תאים ומועבר לצינור ללא RNase על קרח.
  4. בצע חילוץ RNA לפי הוראות הערכה.
  5. למדוד ריכוז RNA ולנרמל דגימות.
  6. בצע תמלול הפוך.
  7. לבצע PCR כמותי בהתאם להוראות היצרן (רצפי פריימר ל-TNFα ולגן הייחוס β-אקטין מוצגים בטבלה 4).

תוצאות

לאחר הגעת ההתנגשות, תאי המעי בכניסת תרבית התא הציגו דפוס דמוי פסיפס (איור 1B) ללא פערים נראים לעין בשכבה החד-שכבתית. לאחר התמיינות, הוערכה ההידוק האפיתל על ידי מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER) (איור 1C). ערכי TEER מעל 500 Ω·ס"מ² היו תואמים להיווצרות שכבה מונואתלית צפופה¹⁶.

כמות ה-AIEC שזוהתה בתא הבזולטרלי עלתה עם הזמן, מה שמשקף פריצה חיידקית של מחסום האפיתל (איור 2A,B). היעדר AIEC בתא התחתון מעיד על כישלון בטרנסלוקציה של חיידקים.

תהליך הוויזואליזציה של זיהום מסוכם באיור 3A. הדמיה קונפוקלית הדגימה את היווצרות שכבה מונו-שכבה מקוטבת, עם גרעינים ממוקדים בבסיס והעשרה אפיקלית של רשת האקטין (איור 3B). הגדלה גבוהה יותר חשפה הן חיידקים תוך-תאיים של AIEC והן חיידקים חוץ-תאיים המחוברים לממברנה האפיקלית (איור 3C).

ניתוח RT-qPCR הראה עלייה בביטוי TNFα בתגובה לזיהום AIEC (איור 4A,B), מה שמאשר הפעלת תגובה דלקתית אפיתלית.

figure-results-1
איור 1: סקירה של הפרוטוקול. (א) שרטוטים של הפרוטוקול. (B) תמונת שדה בהיר של תאי אורגנואידים במעי שנתרמו והובחנו על תרבית תאים מצופה בפולש. מוט סולם: 50 מיקרומטר. (C) עמידות חשמלית טרנסאפיתליאלית/טרנסאנדותל (TEER) של אורגנואידים מעיים שגדלו והתמיינו על תרביות תאים מצופות פולש. כל נקודה מציגה ניסוי עצמאי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: הערכת שרטוטים של פריצת אפיתל (A) של הפרוטוקול. (ב) כימות יחידות יוצרות מושבות (CFUs) של AIEC לאורך זמן בתא התחתון של הכנסת תרבית התאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: זיהום בהדמיה. (א) שרטוטים של הפרוטוקול. (B) הדמיה קונפוקלית של אורגנואידים מעיים שנדבקו ב-AIEC פלואורסצנטי למשך 5 שעות. אפור: DAPI. מג'נטה: פאלואידין. סיאן: AIEC. פס סולם: 50 מיקרון. תצוגות אורתוגונליות של התמונה המאוחדת מוצגות למעלה ומימין. (ג) הגדלה גבוהה של הריבוע הלבן ב-B. אפור: DAPI. מג'נטה: פאלואידין. סיאן: AIEC. פס קנה מידה: 10 מיקרון. תצוגות אורתוגונליות מוצגות מימין. AIEC תוך-תאי (*) ו-AIEC חוץ-תאית המחוברים לקרום האפיקלי של תאי האפיתל ($) מודגשים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: ניתוח תגובת אפיתל. (א) שרטוטים של הפרוטוקול. (ב) ביטוי של TNFα על ידי אורגנואידים מעיים לאחר 5 שעות של זיהום ב-AIEC (ירוק) לעומת ביקורת לא נגועה (אפור). ביטוי TNFα נורמל לביטוי B-אקטין באמצעות הנוסחה 2-(Cq(TNFα)-Cq(β-actin)). n=4 משוכפל. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t סטודנט לא מזווג. P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

רכיבריכוז 
עו"ד DMEMגמר 1X
HEPES1% v/v
גלוטמקס1% v/v
תחליף נשים0.5 ננומטר
R-spo1 UPE2% v/v
נוגין UPE1% v/v
B27 ללא ויטמין A2% v/v
N-אצטיל ציסטאין1.25 מ"מ
ניקוטינאמיד10 מיקרומטר
hEGF50 ng/mL
A83-01 (מעכב TGF-β)0.5 מיקרומטר
SB202190 (מעכב עמוד 38)3 מיקרומטר
פרוסטגלנדין פרק 21 מיקרומטר
מעכב רו קינאז10 מיקרומטר

טבלה 1: מדיום התרחבות לאורגנואידים של המעי האנושי. הרכב מדיום ההתרחבות המשמש לתחזוקה והתרבות של אורגנואידים במעי האדם.

רכיבריכוז
עו"ד DMEMגמר 1X
HEPES1% v/v
גלוטמקס1% v/v
R-spo1 UPE2% v/v
נוגין UPE1% v/v
B27 ללא ויטמין A2% v/v
NAC1.25 מ"מ
hEGF50 ng/mL

טבלה 2: מדיום התמיינות לאורגנידים במעי האדם. הרכב מדיום ההתמיינות המשמש לקידום בשלה אפיתלית של שכבות מונו-שכבות אורגנואידיות במעי האנושי.

רכיבריכוז
עו"ד DMEMגמר 1X
HEPES1% v/v
גלוטמקס1% v/v

טבלה 3: מתקדם DMEM++ לזיהום. הרכב מדיום מתקדם DMEM/F12 בתוספת HEPES וגלוטאמקס (Adv DMEM++) בשימוש במהלך בדיקות זיהום חיידקי.

שםרצף
TNFα FCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG
TNFα RATGGGCTACAGGCTTGTCACTC
β-אקטין FTGACGTTGACATCCGTAAAG
β-אקטין RGAGGAGCAATGATCTTGATCTCT

טבלה 4: פריימרים ל-qPCR של TNFα. מציג את רצפי הפריימר המשמשים לניתוח PCR כמותי של TNFα באמצעות β-אקטין כגן ייחוס.

דיון

מחקר זה קבע פרוטוקול לחקר זיהום חיידקי בתאי אפיתל במעי האנושי באמצעות אורגנואידים שמקורם ב-TSC שנגרמו על הכנסות תרבית תאים. הכנסות עם 3 מיקרון אפשרו חיבור תאים יעיל והעברת חיידקים, בעוד נקבוביות של 0.4 מיקרון אינן מאפשרות מעבר AIEC, בהתאם לגודל המשוער של 1 מיקרון של E. coli. לא נצפתה העברת תאים אורגנואידיים דרך נקבוביות בגודל 3 מיקרומטר, ככל הנראה בשל הפנוטיפ האפיתל והלא פולשני שלהם.

מספר משתנים ניסיוניים היו קריטיים לשחזוריות, כולל חיבור תאים יעיל, צפיפות זריעה מתאימה ומפגש מלא לפני ההדבקה. תאי אפיתל שמקורם באורגנואידים אינם נדבקים לפלסטיק לא מצופה, מה שהופך את הציפוי לחיוני. BME סיפק יעילות התקשרות גבוהה ועקבית. ציפוי הפלישה הניב תוצאות דומות ומייצג אלטרנטיבה חסכונית11, אם כי יש לייצר אותו בתוך החברה. ציפוי קולגן הוצע גם כחלופה17.

תנאי צמיחת חיידקים משפיעים מאוד על יעילות הזיהום. זני E. coli גדלים היטב ב-DMEM; עם זאת, אנטיביוטיקה שנותרה עלולה לעכב התפשטות. בתנאים מיטביים, תרביות נגועות בדרך כלל מציגות עכירות מוגברת בהשוואה לבקרות, וניתן לאשר את צמיחת החיידקים על ידי ציפוי תכולת תא האפיקלי.

אסטרטגיית ההדמיה אפשרה ויזואליזציה של חיידקים תוך-תאיים וחוץ-תאיים על ידי מיקוד ב-AIEC המבטא פלואורופור תחת פרומוטר מהותי (למשל, באמצעות הפלסמיד pMB1-spect-PthrC-eGFP). שיטות חלופיות מאפשרות גילוי סלקטיבי של חיידקים תוך-תאיים, כולל צביעת אימונופלואורסצנציה שונה18 או צביעת דיווחים בשלבים מוגדרים של פלישה19. בדיקות הגנה על גנטמיצין מספקות גישה כמותית נוספת20.

מודל זה הוא בכוונה רדוקציוניסטי ומתמקד באינטראקציות ישירות בין חיידקים לאפיתל המעיים. הוא מאפשר חקירת זיהום במונולאייר אפיתל מובייל ללא סוגי תאים נוספים ב-invivo. מדיום ההתמיינות עורר בעיקר התמיינות של תאי אנטרוציטים וגביע21, אך ניתן לשנותו כדי לשנות את הרכב האפיתל 22,23. מורכבות המערכת יכולה להיות מוגברת על ידי שילוב תאי חיסון או תאי סטרומל בתאהבסיסי 24.

המערכת אינה משחזרת את הארכיטקטורה התלת-ממדית של רירית המעי. פלטפורמות אורגן-על-שבב מתגברותעל מגבלות מבניות מסוימות, אך דורשות מורכבות טכנית ומשאבים גדולים יותר. יתרה מזאת, המודל מתאים במיוחד לזיהומים חריפים, שכן צמיחת חיידקים מגבילה את הניסויים לכ-8 שעות. נדרשות מערכות מורכבות יותר, כגון פלטפורמות מיקרופלואידיות המאפשרות החלפה רציפה של מדיום, כדי לחקור זיהומים כרוניים במבחנה26.

מערכות זיהום אורגנואידיות מבוססות תרביות תאים דומות יושמו על רקמות ופתוגנים רבים, כולל אורגנואידים בקיבה שנדבקו בהליקובקטר פילורי27,28, אורגנואידים מעיים שנדבקו בשיגלה29, אורגנואידים בדרכי הנשימה נגועים בפסאודומונס aeruginosa10, ואורגנואידים אורותליאליים שנדבקו ב-Enterococcus faecalis30. לכן, פרוטוקול זה מספק מסגרת גמישה לחקירת אינטראקציות אפיתליאליות-חיידקיות בין מערכות איברים, בתנאי שמתחשבים בדרישות גידול ייחודיות לפתוגן.

טכנולוגיית אורגנואיד מספקת מודלים אנושיים פיזיולוגיים רלוונטיים לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן בתאי אפיתל לא שעברו טרנספורמציה 4,5. בהינתן העומס הגובר של זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה והקשר שלהם למחלות דלקתיות כרוניות וסרטן, מערכות חוץ גופיות כאלה מהוות כלים חשובים למחקר מכני ותרגומי.

גילויים

H.C. הוא ממציא של מספר פטנטים הקשורים לטכנולוגיית אורגנואידים. הגילוי המלא של H.C. ניתן ב-https://www.uu.nl/staff/JCClevers/.

תודות

המחברים מודים ל-Utrecht Portal for Organoid Technology (UPORT), ובמיוחד לאנטה ברוסאלי, יורייקה סאליג' וארנולד בינדה, וכן למטופלים והמנתחים של המרכז הרפואי האוניברסיטאי באוטרכט על מתן רקמות המעי הגס. המחברים גם מודים לניקולס ברניך על שיתוף הזן LF82 של AIEC. עבודה זו נתמכה על ידי מענק CRUK OPTIMISTIC (C10674/A27140). TG מומן על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקה-קירי 101107988. סכמות נוצרו באמצעות BioRender (https://www.biorender.com/).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
A83-01 (מעכב TGF ובטא)טוקריס2939
Escherichia coli LF82 דביק-פולשמתנה נדיבה של ניקולא ברניך
DMEM/F12 מתקדםInvitrogen12634-010
B27 ללא ויטמין AInvitrogen12587010
ערכת cDNAמערכות ביולוגיות יישומיות4387406המדריך זמין כאן: https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN
0017977_highcap_cDNA_RT_UG.pdf
מונה תאיםדה-נוביקסH2796
מונה תאיםלייקהסטלריס
כיסויי כיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"ממנזל-גל ואומל; זרBB024050S1
תמצית ממברנת הבסיס של קולטרקס (BME)R& D Systems, ביוטכניקה3533-001-02
DAPIסיגמא-אלדריץ'10236276001
סקלפל חד-פעמי סטריל N° 10סוואן מורטון3033838
DMEMגיבקו11965092
פיג'יפיג'יפיג'י פתוחה וניתן להוריד אותה כאן: https://imagej.net/software/fiji/downloads
גלוטמקסגיבקו35050-061
hEGFפפרוטקAF-100-15
HEPESגיבקו15630-080
אינוואסיןבהתאמה אישית לפי Wijnakker ואחרים. PNAS 2024
LBתרמופישרCM0996
LB אגרתרמופישרCM1116
חדר מלאסזקובה87144E
שקופיות מיקרוסקופסקייסקראפט18901
וולטוהמטר תא מילי (מדידת TEER)מרקMERS00002
מדיום הרכבהמעבדות וקטורסוקטשילד H-1000-10
N-אצטיל ציסטאיןסיגמא-אלדריץ'A9165
ניקוטינאמידסיגמא-אלדריץ'N0636
נוגין UPEIPA TherapeuticsN002
תמיסת פאראפורמלדהיד 4%סיגמא-אלדריץ'1.00496
פאלואידין 647סיגמא-אלדריץ'65906-10NMOL
פלסמיד pMB1-spect-PthrC-eGFPאדג'ין107408
פרוסטגלנדין E2טוקריס2296
מכונת qPCRביוראדC1000-Touch
מעכב רו קינאזאבמולM1817
ערכת חילוץ RNAקיאגן74534המדריך זמין כאן: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=bf60203
F-291D-48AE-8206-86B0696B28C0&
lang=en
R-spo3 UPEIPA TherapeuticsR001
SB202190 (מעכב עמוד 38)סיגמא-אלדריץ'S7076
ספקטינומיציןסיגמא-אלדריץ'S9007
לוח תלייה לתרבות אורגנואידיםגריינר665102
SYBR ירוקביוראד170-8887המדריך זמין כאן: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106212.pdf
תרמוקלרביוראדT100
הכנסת תרבית תאיםטרנסוולס 24w 3 ומיקרו; m pores, Greiner662631
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'T8787
TrypLEגיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק12605-010
תחליף נשיםU-Protein Expressסדר מותאם אישית  https://www.life-sciences-europe.com/organisation/protein-express-immunoprecise-group-utrecht-netherlands-west-europe-2001-30404.html

מקורות

  1. McCoy, R., et al. In vitro Models for Investigating Intestinal Host-Pathogen Interactions. Adv Sci. 11 (8), 2306727(2023).
  2. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  3. Gustafsson, J. K., Ermund, A., Johansson, M. E. V., Schütte, A., Hansson, G. C., Sjövall, H. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  4. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  5. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Kim, M., Fèvre, C., Lavina, M., Disson, O., Lecuit, M. Protocol for live imaging of bacteria-cell interactions in genetically modified mouse small intestinal organoids. STAR Protoc. 5 (1), 102773(2024).
  7. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nat Protoc. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  8. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunol. 7 (4), 818-828 (2014).
  9. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  10. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Dual RNA sequencing of a co-culture model of Pseudomonas aeruginosa and human 2D upper airway organoids. Sci Rep. 15 (1), 2222(2025).
  11. Wijnakker, J. J. A. P. M., et al. Integrin-activating Yersinia protein Invasin sustains long-term expansion of primary epithelial cells as 2D organoid sheets. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2420595121(2025).
  12. Darfeuille-Michaud, A., et al. Presence of adherent Escherichia coli strains in ileal mucosa of patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 115 (6), 1405-1413 (1998).
  13. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  14. Pleguezuelos-Manzano, C., Puschhof, J., van den Brink, S., Geurts, V., Beumer, J., Clevers, H. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  15. Anilionyte, O., Liang, H., Ma, X., Yang, L., Zhou, K. Short, auto-inducible promoters for well-controlled protein expression in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (16), 7007-7015 (2018).
  16. Chen, S., Einspanier, R., Schoen, J. Transepithelial electrical resistance (TEER): a functional parameter to monitor the quality of oviduct epithelial cells cultured on filter supports. Histochem Cell Biol. 144 (5), 509-515 (2015).
  17. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), e59357(2019).
  18. Quereda, J. J., et al. A dual microscopy-based assay to assess Listeria monocytogenes cellular entry and vacuolar escape. Appl Environ Microbiol. 82 (1), 211-217 (2016).
  19. Schulte, M., Grotheer, L., Hensel, M. Bright individuals: Applications of fluorescent protein-based reporter systems in single-cell cellular microbiology. Mol Microbiol. 121 (3), 605-617 (2024).
  20. Sharma, A., Puhar, A. Gentamicin protection assay to determine the number of intracellular bacteria during infection of human TC7 intestinal epithelial cells by Shigella flexneri. Bio-protocol. 9 (13), e3292(2019).
  21. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  22. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture conditions. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  23. He, G. -W., et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 29 (9), 1333-1345 (2022).
  24. Ding, L., et al. Toll-like receptor 9 pathway mediates Schlafen⁺-MDSC polarization during Helicobacter-induced gastric metaplasias. Gastroenterology. 163 (2), 411-425 (2022).
  25. Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nature Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
  26. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomed Eng. 3 (7), 520-531 (2019).
  27. Vllahu, M., et al. Inflammation promotes stomach epithelial defense by stimulating the secretion of antimicrobial peptides in the mucus. Gut Microbes. 16 (1), 2390680(2024).
  28. Aguilar, C., et al. et al.Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nature Commun. 13 (1), 1-14 (2022).
  29. Llanos-Chea, A., et al. Bacteriophage therapy testing against Shigella flexneri in a novel human intestinal organoid-derived infection model. J Ped Gastroenterol Nutr. 68 (4), 509-516 (2019).
  30. Horsley, H., Dharmasena, D., Malone-Lee, J., Rohn, J. L. A urine-dependent human urothelial organoid offers a potential alternative to rodent models of infection. Sci Rep. 8 (1), 1238(2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אורגנואידים של המעיציפוי אינווזין (Invasin Coating)שכבה חד-שכבתיות מקוטבת (Polarized Monolayer)מחסום אפיתליאלימיקרוסקופיה קונפוקליתRT-qPCRהתנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית
תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.