מאמר שיטה

הערכת ספרואידים בתלת-ממד למחקרי טרנסדוקציה של AAV

81 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70517

⸱

14 באוגוסט 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

במאמר זה

סיכום

מערכות גידול של ספרואידים בתלת-ממד משפרות את המודלים הדו-ממדיים הקונבנציונליים לפיתוח טיפולי גנים המבוססים על AAV. מתודולוגיה זו מאפשרת זיהוי רגיש של טרנסדוקציית AAV במינונים נמוכים, רלוונטיות פיזיולוגית מוגברת וניטור איתן לטווח ארוך. הפלטפורמה תומכת בהערכת פוטנציה (potency), סריקה בספיקת גבוהה ואופטימיזציה של וקטורים במגוון של סוגי תאים וסרוטיפים של AAV.

תקציר

נגיפים משפחתיים של אדנו-אסוסיאטד (AAVs) הם וקטורים עוצמתיים המשמשים להעברת גנים במוצרי תרפיה גנטית. פיתוחם דורש מערכות in vitro  שיכולות לזהות באופן מהימן הבדלים בעיצוב הווקטור, בביצועי הסרוטיפ, בעוצמת האלמנטים הרגולטוריים ובקינטיקת הביטוי. מערכות אלו חייבות לתמוך גם ביישומים כגון הערכת סמיכות (potency) ואופטימיזציה של הווקטור. כאן, אנו מתארים פלטפורמת ספרואידים תלת-ממדית יעילה, שעברה אופטימיזציה להערכת סמיכות של AAV, קינטיקת ביטוי של הגן המועבר (transgene) ויעילות טרנסדוקציה ספציפית לסרוטיפ במגוון של קווי תאים. ספרואידים אחידים נוצרים באמצעות פלטות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment plates) ונשמרים בתנאים התומכים במבנה יציב ובדימות לטווח ארוך. לאחר טרנסדוקציה של AAV, מדדים פלואורסצנטיים או לומנסצנטיים מנוטרים בזמן אמת באמצעות מערכות לדימות תאים חיים. הדבר מאפשר הערכה כמותית של אות הדיווח (reporter signal), תגובה למספר המנות, פעילות של אלמנטים רגולטוריים וזמן תחילת הביטוי באמצעות דימות קינטי רציף. הפלטפורמה מבדילה ביעילות בין עיצובי גנום של וקטורים עוצמתיים לבין עיצובים חלשים, ובין סרוטיפים שונים של AAV. שיטה זו מראה ביצועים חסונים הן בקווי תאים בעלי חלוקה איטית והן בקווי תאים בעלי חלוקה מהירה. תוצאות אלו מבססות את יעילותה כמערכת ניתנת להרחבה ובעלת רלוונטיות פיזיולוגית להערכה ופיתוח של תרפיה גנטית בשלב הפרה-קליני.

מבוא

וקטורים של AAV הפכו לאחת ממערכות העברת הגנים המועדפות ליישומים in vivo בשל פרופיל הבטיחות שלהם והיכולת שלהם להשיג ביטוי גני מתמשך1. טיפול גני מבוסס AAV מראה הצלחה בטיפול במספר אינדיקציות של מחלות נדירות, עם מאות מוצרים הנמצאים בשלבי פיתוח2. יתרה מכך, יישומים מתהווים כוללים העברה in vivo של רכיבים לעריכה גנומית כגון Cas9, עם פוטנציאל רב לסייע בטיפול באינדיקציות שקשה לטיפול3. אתגרי פיתוח מרכזיים כוללים עלויות ייצור גבוהות ויכולת ניבוי מוגבלת של בדיקות in vitro נוכחיות לקביעת איכות המוצר ויעילותו הקלינית4.

ההתקדמות של טיפולים מבוססי AAV מוגבלת באופן מהותי על ידי המחסור במבחני פעילות סטנדרטיים וניבויים שיכולים לחזות במדויק את הביצועים הקליניים4,5. מבחנים אלו הם מרכיב קריטי בתהליך הפיתוח, שכן הם משמשים למטרות מרובות, כולל סריקת ספריות של וקטורים מהונדסים, אופטימיזציה של שינויים בקפסיד לשיפור הדיוק במיקוד, והערכה של טרופיזם ספציפי לרקמות. הם משמשים גם לאפיון ההשפעה של רצפים רגולטוריים על ביטוי הגן המועבר6. מעבר לבחירת מועמדים, מבחני טרנסדוקציה של AAV תומכים גם בבקרת איכות קריטית בייצור באמצעות מבחני סמיכות (potency assays) המשמשים לשחרור מנות, למחקרי השוואה בין מנות ולהערכות יציבות6,7.

האתגר המדעי טמון בפיתוח בדיקות הלוכדות את מורכבות האינטראקציות בין הווקטור למארח, תוך שמירה על היתכנות מעשית לשימוש שגרתי7,8. גישות נוכחיות כוללות שימוש בשורות תאים מו अमरליזים המייצגים את איבר המטרה בתרביות דו-ממדיות (2D) מסורתיות של שכבה אחת. תנאי תרבית אלו חסרים רלוונטיות פיזיולוגית ודורשים מינוני תרופות גבוהים. דבר זה יוצר פער משמעותי בין התחזיות במעבדה לבין היכולת לתרגם אותן לקליניקה. שורות תאים הנדסית חדשניות, כגון מערכות עם ביטוי יתר של AAVR או מערכות המופעלות על ידי CRISPR, מהוות התקדמות חשובה אך אינן מצליחות לשחזר את המבנה התלת-ממדי ואת האינטראקציות עם המטריצה החוץ-תאית המאפיינות רקמות טבעיות9,10,11. מודלים מהדור הבא שיסמולו טוב יותר מיקרו-סביבות in vivo עשויים לגשר על הפער התרגומי הזה12,13,14.

פיתחנו לאחרונה מערכת ספרואידים בתלת-ממד המותאמת עבור טרנסדוקציית AAV כדי לשפר את יכולת התרגום של בדיקות טרנסדוקציית AAV. מערכת זו משפרת באופן משמעותי את יעילות הטרנסדוקציה של AAV במספר קווי תאים וסרוטיפים של AAV בהשוואה לבדיקות הדו-ממדיות המהוות את תקן הזהב. בנוסף לרגישות המשופרת ולשימור המוצר המשמש בבדיקה, מודלים אלו משפרים את השכבות הדו-ממדיות על ידי אספקת אינטראקציות תא-תא ריאליסטיות המשתנות בהתאם למיקום התאי בתוך הספרואיד. הם מאפשרים גם חקירה משמעותית של חדירות תרופות המדמה תנאים ממשיים באיברים11,15,16. יתרה מכך, גישת הספרואידים מציעה יתרונות מעשיים על פני מערכות אורגנואידים או מערכות תרביית-משותפת מורכבות יותר, שכן היא משתמשת בציוד מעבדה סטנדרטי ונמנעת מדרישות למדיום או לפיגום ייעודיים. פשטות זו מבטיחה הדירות ויכולת התרחבות, מה שהופך אותה למתאימה מאוד לתהליכי בדיקת טיפול גנטי שגרתייםים ולפיתוח וקטורים17.

פלטפורמת הספרואידים התלת-ממדית (3D) זו מתאימה במיוחד ליישומים הדורשים זיהוי רגיש של טרנסדוקציית AAV במינונים נמוכים והערכה השוואית של עיצובי גנום של וקטורים. היא תומכת גם בהערכה של טרופיזם התלוי בסרוטיפ. היא יעילה במיוחד עבור שורות תאים עם יעילות טרנסדוקציה נמוכה יחסית, הדורשות מינוני AAV גבוהים בתרביות דו-ממדיות (2D) קונבנציונליות. בהקשרים אלו, הרגישות המשופרת והרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה יותר של הפלטפורמה התלת-ממדית הן קריטיות. עם זאת, מערכת זו עשויה להיות פחות מתאימה למחקרים הדורשים רכיבים חיסוניים, אספקה וסקולרית או מורכבות רקמלית מלאה. זאת מכיוון שספרואידים אינם משחזרים באופן מלא את הסביבה in vivo .

לפיכך, אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת ספרואידים בתלת-ממד (3D) שעבר אופטימיזציה עבור בדיקות טרנסדוקציה של AAV, הכולל שני מדדים קריטיים ומשלימים: יעילות הטרנסדוקציה (המוגדרת כאן כאות reporter כוללת לספרואיד) וקינטיקת הטרנסדוקציה. שיטה זו מספקת פלטפורמה חסכונית, רלוונטית פיזיולוגית ומספקת מידע עבור הערכת פוטנציאליות (potency) של AAV, תכנון וקטורים ובדיקות נטרול.

פרוטוקול

במחקר זה נעשה שימוש בקווי תאים אנושיים מבוססים (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2, ו-A375) שהושגו ממקורות מסחריים או ממקורות שפורסמו בעבר. לא נעשה שימוש בדגימות ראשוניות של בני אדם או בעלי חיים, ולפיכך לא נדרש אישור אתי.

1. הקמה סטרילית של מערך הניסוי והכנה ראשונית של המגירה

  1. הפעילו את קבינת הבטיחות הביולוגית.
  2. הפעילו את קבינת הבטיחות המיקרוביולוגית בעלת זרימה למינרית מסוג Class II כ-15 דקות לפני התחלת העבודה, כדי לאפשר זמן מספיק לייצוב זרימת האוויר.
  3. רססו את כל משטחי הפנים של המנדף ב-70% (v/v) ethanol.
  4. הכינו תמיסת חיטוי של 5% (v/v) bleach בתוך כוס כימית מזכוכח בנפח 500 mL לצורך השלכת על-נוזל תאים ושיירי תאים.
  5. נקו את הציוד על ידי חיטוי יסודי של כל המיקרופיפטות וקופסאות התומכים (tips) באמצעות 70% (v/v) ethanol.

2. הכנת מצעי תרבית תאים

  1. הכינו 500 מ"ל של מצע בסיס DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) עם ריכוז גבוה של גלוקוז.
  2. הוסיפו למצע הבסיס 10 מ"ל סרום עגל עוברי (FBS) שעבר אינאקטיבציה בחום, 1 מ"ל תמיסת פניסילין/סטרפטומייסין (100 יחידות/מ"ל פניסילין ו-100 µg/מ"ל סטרפטומייסין), ו-5 מ"ל של L-glutamine בריכוז 2 mM.
    הערה: יש לשמור על טכניקות אספטיות לאורך כל הפרוצדורות. יש להכין מצע טרי עבור כל ניסוי. נא לעיין ב- טבלת חומרים עבור מפרטי ציוד ספציפיים.

3. הכנת ספרואידים

  1. הכינו מצע DMEM מלא כפי שמתואר לעיל.
  2. חממו את מצע התרבית באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10–15 דקות.
  3. הוציאו את שורות התאים הרלוונטיות ממכל החנקן הנוזלי.
  4. הפשיר במהירות תאי HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 ו-HeLa שהקפאו על ידי הנחתם באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C.
  5. הוציאו מיד מהאמבט מים ברגע שהגביש האחרון של הקרח הופשר.
  6. דללו 1 mL של תאים שהופשרו ב-9 mL של מצע DMEM מלא.
    הערה: כל שורות התאים המשמשות בפרוטוקול זה מתוחזקות באותו מצע DMEM ובתנאי תרבית זהים.
  7. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 350 × g. למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. שפכו את הנוזל העליון (supernatant).
  9. שחזרו את המשקע (pellet) ב-5 mL של מצע DMEM מלא.
  10. זרעו את התאים בבקבוק תרבית תאים מסוג T75.
  11. הניחו את הבקבוקים עם התאים באינקובטור לתרבית תאים המתוחזק בטמפרטורה של 37 °C, 5% CO2 ו-95% לחות.

4. ניטור צמיחת תאים

  1. הוסף 15 mL של מצע גידול בכל 3 ימים.
  2. בצע מעבר (passage) לתאי HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 ו-HeLa כאשר הם מגיעים ל-70% התמסכות (confluency), ושאב את מצע ה-DMEM המלא מבקבוקי ה-T75. 
  3. שטוף את התאים על ידי הוספת 5 mL של PBS לבקבוקי ה-T75 המכילים את התאים. 
  4. שאב את 5 mL של ה-PBS כ-30 s לאחר ההוספה לבקבוקי ה-T75. 
  5. חזור על שלב שטיפה זה פעם נוספת.  
  6. בצע טריפסינציה לתאים בעזרת 5 mL של 0.05% trypsin-EDTA למשך 5 min. 
  7. דגור את הבקבוקים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 5 min כדי לאפשר ניתוק מלא של התאים.  
  8. הוסף 5 mL של מצע DMEM מלא כדי לנטרל את ה טריפסין. 
  9. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-350 × g. למשך 5 min כדי להסיר את הטריפסין. 
  10. השהה מחדש את משקע התאים ב-5 mL של DMEM. 
  11. פצל את התאים בדילול של 1:10 לצורך מעבר תאים שגרתי. 
    הערה: מומלץ לבצע מעבר לתאים פעמיים לפני ביצוע הניסויים כדי לאפשר לתאים להגיע לפאזה לוגריתמית ולהפוך לפעילים מטבוליים. 
  12. המשך בדגימה תחת תנאים מבוקרים אלו עד שהתאים מגיעים ל-70% התמסכות, ולאחר מכן המשך בפרוטוקולים הניסויים הבאים.
    הערה: יש לנטר באופן קבוע את מורפולוגיית התאים ודפוסי הצמיחה שלהם. ודא מיקום נכון של הבקבוקים להחלפת גזים אופטימלית. תנאים סטריליים הם חיוניים לאורך כל תקופת הדגירה.

5. קציר תאים והכנה ראשונית של התאים

  1. הסיר את מצע התרבית על ידי שאיבה של מצע התרבית הקיים מבקבוקי ה-T75.
  2. שטוף תאי HEK293T, Huh7, HEP3B, A375, HEPG2 ו-HeLa 3 פעמים ב-PBS כדי להסיר שאריות מצע ופסולת.
  3. הוסף 5 mL של תמיסת trypsin בריכוז 1× שחוממה מראש לתאים אלה כדי לנתק את התאים הדבקים ממשטח הבקבוק.
    הערה: ודא שה-trypsin חומם מראש כדי לשמור על פעילות אנזימטית אופטימלית. הנח את הבקבוקים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 5 min כדי לאפשר ניתוק מלא של התאים. עקוב אחר זמן ה-trypsinization בקפידה כדי למנוע עיכול יתר.
  4. הוסף 5 mL של מצע תרבית מלא כדי להשבית את אנזים ה-trypsin.
  5. בצע פיפטינג (pipette) של התערובת למעלה ולמטה כדי להומוגניзировать את התמיסה.
  6. אסוף כל תרחף תאים על ידי העברת כל תרחף התאים למבחנות צנטריפוגה המסומנות באופן פרטני.
    הערה: יש לטפל בתאים בעדינות במהלך הרסספנציה (resuspension) כדי לשמור על חיוניותם.
  7. בצע צנטריפוגה לתאים במהירות של 350 × g למשך 5 min בטמפרטורת החדר כדי לשקיע את התאים למשקע (pellet).
  8. הסר את supernatant וסספנד (resuspend) בעדינות את משקע התאים ב-5 mL של מצע תרבית טרי.

6. ספירת תאים והערכת חיות תאים באמצעות מונה תאים

  1. הומוגניזרו את התרחיף על ידי פיפוט עדין מעלה ומטה כדי להבטיח פיזור תאים אחיד לאורך מבחנת הצנטריפוגה.
  2. הכינו מבחנות ספירה עבור תאי HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 ו-HeLa.
  3. הכינו דילול של 1:10 של הדגימה בתווך תרבית DMEM מלא. לדוגמה, 40 µL של תרחיף תאים לתוך 360 µL של תוך DMEM מלא.
  4. פפטו בעדינות את התערובת מעלה ומטה ארבע פעמים כדי להבטיח דילול הומוגני.
  5. סמנו את הדגימה ביומן הרישום, והקצו את סוג התא שנעשה בו שימוש, את הדילול ואת שם הדגימה.
  6. הטעינו את הדגימה לסופר התאים והניחו את המבחנה המכילה את תרחיף התאים המדולל במיקום המספר שהוקצה.
    הערה: סופר התאים הוא סופר תאים אוטומטי השואב דגימות תאים ומערבב אותן עם trypan blue, ובכך מפחית את השונות בין מפעילים שונים.
  7. המתינו דקה עד שהתרחיף יתייצב לפני ספירת הדגימה.
  8. שספו מחדש את התאים באופן אחיד לפני הספירה כדי לקבל תוצאות מדויקות.
  9. חשבו את מספר התאים הכולל.
  10. השתמשו בריכוז התאים החיוניים הכולל כדי לקבוע את מספר התאים לזריעה עבור הניסויים.
  11. השתמשו בתאים חיוניים עם חיוניות של > 90%.
  12. הבחינו בין תאים חיוניים (שאינם צבועים) לתאים שאינם חיוניים (צבועים בכחול).
    הערה: יש לשמור על קריטריוני ספירה עקביים בכל הדגימות.

7. זריעת ספרואידים ואופטימיזציה של הגודל

  1. שאוב את תרחיף התאים מעלה ומטה בעזרת פיפט כדי להומוגנז את התמיסה.
  2. זרע צפיפויות תאים שונות של תאי HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 או HeLa.
  3. התחל בזריעה של 1 x 104 תאים ב-200 µL בתוך פלטה בעלת 96 בארות עם תחתית עגולה וקישור נמוך במיוחד (ULA).
  4. בצע דילול סדרתי של 1 x 104 תאים לבערה בדילול של פי 2 עד להגעה לצפיפות התאים הרצויה עבור הניסויים.
  5. הוסף נפח אחד של מצע גידול מלא לכל השורות (1B-1H) למעט השורה העליונה.
  6. הוסף שני נפחים של 1 x 104 תאים לבערה בשורה 1A (השורה העליונה).
  7. בצע דילול סדרתי של שורה 1A על ידי הוספת נפח אחד משורה 1A לתוך 1B וכן הלאה. ראה דוגמה לסידור הניסויי להלן ב-Supplementary Figure 1.
    הערה - ודא שההשעיה אחידה על ידי הקשה עדינה על דפנות הפלטה.
  8. סבב את פלטת ה-ULA בצנטריפוגה ב-350 × g למשך 5 דקות כדי למשוך את התאים למרכז ולעודד מגע בין תאים.
    הערה: במידה ומשתמשים בסוגי תאים שאינם אלו שדווחו כאן, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של הפרמטרים, שכן סוגי תאים שונים מראים שיעורי גדילה ויצירת ספרואידים משתנים.
  9. הימנע מהפרעה לפלטות במהלך 24–48 השעות הראשונות כדי לאפשר היווצרות ראשונית של ספרואידים. תן לספרואידים להבשיל במשך 3 ימים עד שיגיעו לקוטר של ~400 µm.
  10. בדוק את אחידות גודל הספרואידים. ודא שהתאים השתעו באופן אחיד ושהפלטות אינן מעוותות.
    הערה: אין להשתמש בפלטות עם ספרואידים בגדלים לא עקביים. ודא שהספרואידים בעלי קוטר אחיד יחסית בתוך כל בארה.
  11. עקוב אחר מורפולוגיית הספרואידים.
    הערה: ספרואידים שהיווצרו היטב נראים עגולים עם קצוות מוגדרים.
  12. הכן ספרואידים בשלים המראים הידבקות תאית הדוקה, ולא אגרגטים תאיים רופפים.
  13. הגבר את צפיפות הזריעה או הארך את זמן ההיווצרות. אם הספרואידים אינם דחוסים, הגבר את צפיפות הזריעה או הארך את זמן ההיווצרות.
  14. צמצם את הופעתם של אגרגטים קטנים מרובים על ידי הפחתת צפיפות הזריעה או על ידי הארכת שלב הצנטריפוגציה.

8. ניטור ספרואידים בתאי חיים בזמן אמת

  1. לאחר סבב של תרחילי התאים (spun down), העבירו את הפלטה לדגרה בטמפרטורה של 37 °C (5% CO2, 95% לחות), המכילה מכשיר דימות תאים חיים לצורך דימות אוטומטי של תאים חיים.
  2. הגדירו את הפרמטרים לדימות תאי חיים של ספרואידים בהתאם לצורכי הניסוי:
    הערה: הפרמטרים הבאים שימשו עבור כל קווי התאים שנבדקו.
  3. היכנסו למערכת של תוכנת הרכישה.
  4. בחרו את הפקודות הבאות:|Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New.
  5. |Select Scan Type|: Spheroid. |Select the channels of interest|: Phase + Brightfield (למעקב אחר צמיחת הספרואידים), Green/Red (למעקב אחר טרנסדוקציית AAV, זמן רכישה של 300 ms או 400 ms בהתאמה).
  6. בחרו את ההגדלה הרצויה: 10x.
  7. בחרו את דגם הפלטה ואת מיקומה במגירה.
  8. בחרו את מיקום הבארים לדימות, ואת מספר התמונות הרצוי לכל באר.
  9. הזינו את תיאור הניסוי: שם, סוג התאים, מספר התאים.
  10. עבור הגדרות הניתוח, בחרו ב- Defer Analysis Until Later.
  11. לחצו לחיצה ימנית על ציר הזמן ובחרו באפשרות  Set Selected Scan Group Interval.
  12. הגדירו  סריקות נוספות בכל 6 h ו- סריקה ללא הגבלה. הגדירו את זמן ההתחלה הרצוי (לפחות 1 h לאחר הדגירה במכשיר הדימות האוטומטי).
  13. בדקו מדי יום את צמיחת הספרואידים באמצעות כניסה לתוכנת הדימות.
  14. בחרו באפשרות  View Recent Scans ולחצו פעמיים על הניסוי הרצוי. |בחרו ב- Brightfield בפאנל ערוצי התמונות| ולאחר מכן השתמשו בכלי ה- |Measure image| features כדי למדוד את קוטר הספרואידים.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך בתזמון הבשלה אופטימלי כדי להפיק ספרואידים דחוסים מהתאים הרלוונטיים.
  15. הוציאו את הפלטה ביום שבו הושגה התגבשות אופטימלית של הספרואידים והשתמשו בה לטרנסדוקציית AAV.

9. טרנסדוקציית AAV

  1. רכישה או ייצור של סרוטיפי AAV3 וטרנסגנים רלוונטיים.
  2. הכינו מצע DMEM המועשר ב-2% FBS לצורך טרנסדוקציות של AAV, על ידי הוספת 10 מ"ל של FBS ל-490 מ"ל של מצע DMEM.
    הערה: לסריקה של קפסידים או אלמנטים רגולטוריים גנומיים, טרנסגן GFP יעיל ביותר, כפי שמוצג בסעיף התוצאות המייצגות. יש לדלל את ה-AAV הרלוונטי במצע DMEM בתוספת 2% FBS, ללא אנטיביוטיקה.
  3. דלל בפלטה עגולה ייעודית בעלת 96 בארות עבור דילולים סדרתיים.
  4. הכינו מהולות ביחס של 1:10 מה-MOI ההתחלתי כדי לבצע טיטרציה של AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 ו-AAV9.
  5. ראה דוגמה למערך ניסויי להלן ב- איור משלים 2. חשב את ה-MOI הנדרש עבור טרנסדוקציית AAV, כפי שמוצג בסעיף הדיון.
  6. הוסיפו 33 µL של מלאי AAV ל-297 µL של מצע כדי להגיע לנפח כולל של 330 µL בריכוז MOI של 1 × 106.
  7. בצעו דילולים סדרתיים של פי 10, החל מ-MOI של 1 × 106 על ידי הוספה של 33 µL ל-297 µL של מצע DMEM מועשר ב-2% FBS.
    הערה: מומלץ להימנע משימוש ב-MOIs גבוהים כדי למנוע פגיעה בחיות התאים. ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של תנאי הניסוי עבור כל סוג תא וסרוטיפ של AAV, מכיוון שהם עשויים להשפיע באופן משמעותי על ה-MOI האופטימלי. לא כל הגנומים הויראליים הם זיהומיים; טייטרים פונקציונליים עשויים להיות שונים מערך ה-vg/mL.

10. מינון AAV

  1. שאבו את כל המצע מלוח הספרואידים שהוכן מראש באמצעות פיפט רב-ערוצי.
  2. הוסיפו 100 µL מה-MOI הרצוי על ידי העברת נפח זה מלוח הדילול ללוח הטיפול, באמצעות פיפט רב-ערוצי.
  3. החזירו את הלוחות למכשיר ההדמיה והתחילו במעקב אחר התעתוק באמצעות ניטור עצימות פלואורסצנטית ירוקה לאורך 72 h.
  4. במידה והניטור נמשך יותר מ-3 ימים, הוסיפו 100 µL של מצע DMEM מלא לכל באר בכל 3 ימים כדי להשלים את רכיבי התזונה.

11. דימוי תאים חיים, ניטור טרנסדוקציה וניתוח נתונים

  1. החזיר את הפלטה למכשיר לאחר הוספת ה-AAV וה-MOI הרצויים לקבוצת הטיפול.
  2. התחל להקליט את יעילות הטרנסדוקציה בכל 6 h.
    הערה: בדרך כלל נדרשים בין 3 ל-5 ימים כדי להגיע לביטוי GFP אופטימלי. הדבר תלוי בפרומוטור ובקונפיגורציית הגנום שנעשה בהם שימוש.
  3. נתח את הנתונים על ידי יצירת הגדרת ניתוח ספציפית לתאים ולגני הדוח (reporter genes) הרלוונטיים.
    הערה: לחלופין, שמור את הפלטה באינקובטור סטנדרטי ב-37 °C והערך את יעילות הטרנסדוקציה באמצעות qPCR, western blotting או ELISA.
  4. הגדר את פרמטרי הניתוח על ידי ביצוע ניתוח בשדה בהיר (Brightfield Analysis) לזיהוי הספרואידים הראשוניים.
  5. בצע אופטימיזציה לפרמטרי הסגמנטציה באופן הבא:
    1. סוג ניתוח: "Spheroid Brightfield."
    2. שיטת סגמנטציה: "Adaptive Threshold."
    3. טווח סף (Threshold Range): 0.3–0.8 (מומלץ לבצע כיוון אוטומטי בתחילה)
    4. מסנן Top-hat: 200–500 µm (מסיר תאורה לא אחידה)
  6. בצע אופטימיזציה לפרמטרי השדה הבהיר באופן הבא:
    1. טען תמונות מייצגות מנקודות זמן שונות.
    2. בדוק את טווח הסף (0.2–0.9) כדי למצוא זיהוי אופטימלי.
    3. כוון את מסנני הגודל בהתבסס על טווח הגדלים הצפוי של הספרואידים.
    4. אשש את הסגמנטציה על ידי בדיקת שכבת כיסוי (overlay) ויזואלית.
  7. בצע אופטימיזציה לערוץ הירוק לצורך הערכת טרנסדוקציית AAV באופן הבא:
    1. קבע את רמות הרקע של בארות שלא טופלו (MOI=0).
    2. הגדר סף בגובה של 2–3× מעל רעש הרקע.
    3. בדוק עם הדגימה שטופלה ב-MOI הגבוה ביותר.
  8. בצע אופטימיזציה לזמן החשיפה כדי למנוע רוויה תוך שמירה על האות
    הערה: עבור טרנסדוקציות AAV, דווח על אות הפלואורסנציה הכולל לספרואיד כמדד ליעילות הטרנסדוקציה.

12. ניתוח נתונים

  1. בחרו את הפרמטרים הנכונים, תוך התאמת המסננים והמסכות, כדי לבחור את התאים בתמונה ולא את רעשי הרקע.
  2. בחרו תמונה מייצגת כדי לאמן את התוכנה.
  3. החילו את הפרמטרים המותאמים (optimized) על כל התמונות במחקר.
  4. חלצו את הנתונים כערכים בודדים או מקובצים, והעבירו אותם למערכת לניתוח סטטיסטי לצורך הצגת הנתונים בהמשך.

13. חישוב זמן ההתחלה

  1. חשב את הזמן הדרוש לגילוי אות ה-GFP הראשון עבור כל MOI.
  2. בצע אינטרפולציה בערך של ממוצע הבארות שלא טופלו (MOI = 0) + 3 סטיות תקן (SD).
  3. העתק את עוצמת הפלואורסצנציה הירוקה של כל ספרואיד בכל נקודת זמן מתוכנת הדימוי של תאים חיים לתוכנה סטטיסטית.
  4. חשב ממוצע של החזרות.
  5. חשב את הממוצע ואת ה-SD של האותות בכל הבארות עם ספרואידים שלא טופלו (MOI = 0).
  6. השתמש בהתאמת עקומה מסוג Asymmetric Sigmoidal, 5PL כדי לבצע אינטרפולציה של זמן ההתחלה עבור כל MOI.
  7. לדוגמה, ערכי האינטרפולציה הבאים שימשו ב-טבלה 1:
    1. עבור scGFP: 254,955 (ממוצע) + 3 × 288,055 (SD) = 1,412,120 (אות אינטרפולציה)
    2. עבור ssGFP: 2,417,941 (ממוצע) + 3 × 26,093  (SD) =  3,200,746 (אות אינטרפולציה)

14. מדוד את הפלואורסצנציה באמצעות קורא פלטות (plate reader) בעל יכולות פלואורסצנציה.

  1. הפעיל את התוכנה של קורא הלוחיות הפלואורסצנטי במחשב המחובר לקורא הלוחיות.
  2. נווט אל  קובץ (File)  > פתיחת  פרוטוקול (Open Protocol), בחר את סוג הלוחית (למשל, 96 בארות, 384 בארות) וודא כי פריסת הבארות הנכונה נבחרה. 
  3. הגדר את זמן האינטגרציה לגילוי פלואורסצנטי, הקובע את משך הזמן שבו הקורא אוסף פלואורסצנציה מכל בארה.
  4. כוונן  את  הגדרות ה-gain  או  הרגישות (sensitivity) 
    אם  הבדיקה  דורשת  גילוי  אות  גבוה  או  נמוך  יותר.
  5. הגדר את הפרמטרים הפלואורסצנטיים עבור GFP באופן הבא: עירור (excitation): 485 nm ופליטה (emission): 528 nm.
  6. לחץ על "הפעל" (Run) בתוכנה כדי להתחיל את המדידה.
  7. מדוד  פלואורסצנציה  מכל  בארה. 
    הערה: לאחר סיום ההרצה, התוכנה מציגה ערכי פלואורסצנציה גולמיים, שניתן להשתמש בהם ליצירת גרפים על ידי חישוב ממוצעים והחסרת הרקע.
  8. ייצא  את  התוצאות  ב פורמט  המועדף  עבור  ניתוח  המשך  או  דיווח.
    הערה: אם פרוטוקול הדגימה שונה, השתמש ב-"קובץ" (File) > "שמירה בשם" (Save As) כדי ליצור גרסה ייחודית, תוך שמירה על הפרוטוקול המקורי לשימוש עתידי.

15. טרנסדוקציה של טרנסגן לומניסנטי

  1. יש לעקוב אחר אותו פרוטוקול זריעה ומתן מנוני AAV כפי שפורט לעיל.
  2. הוסף 100µL של AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, ו-AAV9 הנושאים טרנסגן nano luciferase ב-MOIs שונים בטווח של 0–106 ל-100 µL של ספרואידים של HeLa שכבר גודלו בצלחות ULA.
  3. דגרי את הצלחות באינקובטור רגיל ב-37 °C והערך את יעילות הטרנסדוקציה לאחר 3 ימים של טרנסדוקציה.

16. הכנת מעכב הלומנסנס החוץ-תאי ותסבסב הלומנסנס לזיהוי בבדיקת תאים חיים

  1. הוצא את פלטות הבדיקה מהאינקובטור ביום 3 (נקודת הסיום).
  2. הוסף מעכב לומנסינציה חוץ-תאי ותסרית (substrate) ישירות לתאים.
    הערה: אין צורך בהסרת המצע.
  3. הוצא את המעכב החוץ-תאי מאחסון ב-−20 °C והשאר להפשירה בטמפרטורת החדר.
  4. סבב במרכזפוגה למשך זמן קצר כדי לאסוף את הנוזל מהמכסה ומדפנות הפרונט.
  5. הכן את הכמות הרצויה של מעכב לומנסינציה חוץ-תאי שחודש בריכוז 15X, על ידי ערבוב של נפח 1  של המעכב החוץ-תאי עם 14  נפחים של מצע DMEM מלא.
    1. לדוגמה, אם הניסוי דורש 1.0 mL של ריאגנט, הוסף 67 µL של מעכב ל-933 µL  של DMEM. עבור פלטה אחת, הכן 1 mL של DMEM והוסף 67 µL של מעכב.
  6. העבר את המעכב שהוכן בשלב 16.5 למכל ריאגנטים סטרילי.
  7. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי לחלק 10 µL של מעכב לבוארות שעברו טרנסדוקציה עם AAV.
  8. הוצא את תסרית התאים החיים (Live Cell Substrate) מאחסון ב-−20°C וערבב.
  9. סבב במרכזפוגה למשך זמן קצר כדי לאסוף את הנוזל מהמכסה ומדפנות הפרונט.
  10. הכן את הכמות הרצויה של ריאגנט תאים חיים שחודש בריכוז 3.6X.
  11. הכן 4 mL של DMEM והוסף 144 µL של תסרית עבור פלטה אחת.
  12. העבר את התסרית שהוכנה בשלב 16.11 למכל ריאגנטים סטרילי.
  13. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי לחלק 50 µL של תסרית לאותן בוארות שעברו טרנסדוקציה עם AAV.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את נפח הריאגנטים אם מריצים מספר פלטות בדיקה בו-זמנית.
  14. נער את הפלטה ב-300 rpm למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. קרא את הפלטה באמצעות מכשיר מערכת דימיון in vivo בתוך שעתיים מהוספת ריאגנטי הגילוי הלומנסינציוניים.
    הערה: עצימות הלומנסינציה תדעי בהדרגה לאורך שעתיים.

17. דימוי בביולומינסנציה

  1. הפעילו את מערכת דימוי הביולומינסנציה לפחות 30 דקות לפני הדימוי כדי לאפשר למצלמת ה-CCD להתקרר (−90 °C).
  2. וודאו שהפלטות מוכנות לדימוי (למשל, הוספת תמיכה לדימוי תאים חיים עבור קריאת ביולומינסנציה).
  3. הסירו את מכסה הפלטה כדי למנוע השתקפות ופיזור של אור.
  4. נקו את תחתית הפלטה אם הדימוי מבוצע מלמטה.
  5. הניחו את הפלטה בתא הדימוי על הבמה.
  6. מקמו את הפלטה באופן מרכזי תחת המצלמה.
  7. הגדירו את פרמטרי הדימוי עבור Luminescence: חשיפה אוטומטית (Auto-exposure) או הגדרת זמן חשיפה (בדרך כלל 1–60 s), בינינג (מומלץ medium), ומספר צמצם (f/stop 1 לרגישות מקסימלית).
  8. צלמו תמונה למטרת ייחוס אנטומי.
  9. בצעו לכידה של תמונת הלומינסנציה.

18. ניתוח נתוני דימות ביו-לומינסצנציה

  1. השתמשו בכלי ROI כדי להקיף את הבארות או את האזורים המעניינים.
  2. הבטיחו גודל ROI עקבי בין הדגימות לצורך השוואה.
  3. מדדו את השטף הכולל (photons/second) עבור ביומינסנס.
  4. מדדו את היעילות הקרינתית (radiant efficiency).
  5. ייצאו את הנתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח סטטיסטי.
  6. שמרו את קבצי התמונה ואת תוצאות הניתוח.
  7. ייצאו את התמונות בפורמט TIFF או JPEG לצורך מצגות.

תוצאות

כאן, אנו מראים שניתן להשתמש בספרואידים בתלת-ממד (3D spheroids) ככלי להערכת טרנסדוקציית AAV, להבחנה בין עיצובי גנום של וקטורים כגון self-complementary (sc) ו-single-stranded (ss), ולהערכת קינטיקת הטרנסדוקציה. סקירה כללית של התהליך מוצגת ב-איור 1. בקצרה, התאים מורחבים תחילה בתרביות דו-ממדיות (2D) ונזרעים בלוחיות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ULA) כדי ליצור ספרואידים דחוסים (איור 1A). לאחר מכן, הלוחיות עוברות סנטריפוגציה כדי לעודד אגרגציה (איור 1B) ומועברות למערכת דימוי של תאים חיים למעקב בזמן אמת אחר היווצרות הספרואידים (איור 1C). ביום ה-3, הספרואידים עוברים טרנסדוקציה עם AAV בריכוזי MOI שונים (איור 1D). קינטיקת הטרנסדוקציה נמעקבת לאורך זמן באמצעות דימוי של תאים חיים (איור 1E), וניתוח נקודת סיום מבוצע באמצעות קריאות פלואורסצנציה או לומינסצנציה מבוססות לוחית (איור 1F).

איור 2 מציג את המורפולוגיה של ספרואידים מ-6 שורות תאים שונות, המדגימה טווח של צפיפויות, עגולות וצורות. כל שורות התאים גודלו במצע DMEM מלא למשך מספר מעברים לפני השימוש בכל ניסוי. ברגע שהתאים הגיעו לשלב הלוגריתמי (log phase), תאי HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 ו-Huh7 נאספו ודללו בסדרה בלוחות ULA בעגית תחתונה, החל מצפיפות תאים של 10,000 תאים לבאר, ודללו בסדרה פי 2 (מבנה הלוח כלול ב- נספחים איור 1 ותצאות מייצגות מוצגות ב- איור משלים 2). גודל הספרואיד יכול להיות קטן עד כדי 50 µm תוך שמירה על מבנה הספרואיד ועל רגישות מעולה לטרנסדוקציה. לאחר זריעת התאים, פלטת ה-ULA בעלת התחתית העגולה סובבה בצנטריפוגה במהירות של 350 × ג'. במשך 5 דקות, מה שאיפשר לתאים להתרכז במרכז הבאר ולהתרכב עצמית לספרואידים. שלב זה מועיל במיוחד עבור תאים שאינם נוטים להצטבר באופן טבעי. ניתן להאריך את זמן הצנטריפוגה מ-5 ל-15 דקות עבור תאים בעלי עמידות גבוהה, כגון לימפוציטים. ספרואידים שנוצרו היטב מראים פנוטיפ עגול ודחוס, כפי שנצפה בתאי HEK293T ו-Huh7, בעוד שספרואידים שאינם גבושים מספיק הם בעלי צבירה רופפת ונוטים להתפרק במהלך החלפת המצע.

לאחר מכן, מעבירים את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C המצויד במכשיר לניטור תאים חיים. הפלטות מנוטרות מדי יום במרווחים של 6 h כדי להעריך את היווצרות הספרואידים עבור כל אחד מקווי התאים המדווחים כאן. רוב קווי התאים דורשים 3 ימים כדי להתרכב עצמית לספרואיד. כפי שמוצג ב-איור 2, כל קו תאים הפגין מאפיינים מורפולוגיים מובחנים ורמות דחיסה משתנות לאחר 3 ימי זריעה. קווי תאים כבדיים (Huh7, HEPG2, ו-HEP3B) יצרו ספרואידים דחוסים וצפופים יותר מאשר קווי התאים האחרים. HEK293T יצר מראה כדורי עגול מאוד עם גרעין נמקרוטי מובחן, בעוד ש-A375 יצר אגרגט של תאים בצורה לא סדירה (שתואר בעבר כספרואיד מעוות)18,19. הבדלים אלו במורפולוגיה נחשבים לאינדיקטורים למצבים פתופיזיולוגיים של מחלה, דבר התומך עוד יותר בתועלת של מודלים בתלת-ממד בהשוואה למערכות תרבית דו-ממדיות18,19. פרוטוקול הרכבת הספרואידים הוא בעל הדירות גבוהה לאורך ששת קווי התאים שנבדקו והוחל על כל הטרנסדוקציות המוצגות כאן.

לאחר אופטימיזציה של ריכוז התאים, זמן היווצרות הספרואידים ומצב האוטופלורסצנציה הירוקה/אדומה (מוצג ב-Supplementary Figure 3), המשכנו לבחון טרנסדוקציה של AAV בספרואידים באמצעות מערכת דימוי תאים חיים וקורא לוחות (דוגמה לסידור הלוח עבור טיטרציה של AAV מוצגת ב-Supplementary Figure 4). Figure 3 מציג את פרוטוקול הספרואידים המופעל באופטימיזציה בארבעה קווי תאים שונים (HEK293T, Huh7, HEP3B, ו-HEPG2). ביום השלישי להיווצרות הספרואידים, הספרואידים עברו טרנסדוקציה עם שני וקטורי AAV2 הנושאים עיצובים שונים של גנום וקטורי, המסומנים ב-GFP, בריבויים שונים של זיהום (MOIs). שני עיצובי הטרנס-גן של AAV אלו מייצגים וריאנטים של GFP בעלי פוטנציאל גבוה (scGFP) ופוטנציאל נמוך (ssGFP). לאחר טרנסדוקציית התאים, הלוחות הונחו במערכת דימוי תאים חיים למעקב בזמן אמת אחר הטרנסדוקציה של AAV. בנקודת זמן של 72-h, עוצמת פלורסצנציה ירוקה זוהתה באמצעות תוכנת דימוי תאים חיים. ב-Figure 3, הקווים הכחולים מייצגים גנומי sc-GFP, בעוד שהקווים האדומים מייצגים גנומי ss-GFP. הספרואידים היו רגישים מאוד לטרנסדוקציית AAV, כאשר טרנסדוקציה חזקה זוהתה בטיטרי AAV נמוכים מאוד ובקווי תאים שונים עבור scGFP. סרטונים מייצגים של טרנסדוקציית AAV בקווי תאים וב-MOIs שונים, שתועדו בזמן אמת, מוצגים ב-Supplementary Movie 1, Supplementary Movie 2, Supplementary Movie 3, Supplementary Movie 4, Supplementary Movie 5, ו- Supplementary Movie 6. מנגד, טרנסדוקציית ספרואידים של AAV מסוג ssGFP נצפתה ברמות נמוכות יותר, מה שמשחזר את הטרנסדוקציה החלשה/איטית יותר הצפויה מסוג זה של אלמנט רגולטורי20,21. הדבר מדגים את התועלת של ספרואידים בתלת-ממד לטרנסדוקציות AAV חזקות וחלשות, כמו גם להבחנה בין גנים בעלי טרנסדוקציה חזקה, כגון sc-GFP, לבין גנים בעלי פוטנציאל נמוך יותר, כגון ss-GFP. צפינו בהבדל של 100-fold בפלורסצנציה יחסית בין הטרנס-גנים sc ו-ss ב-MOI של 106 בתאי HEK293T, והבדל של 3-fold בקווי תאים שקשה יותר לבצע להם טרנסדוקציה, כגון HEP3B.

לאחר מכן המשכנו לבחון את התעתוק של סרוטיפים שונים של AAV בצורה תלויית-מינון הן בספרואידים של HEK293T והן בספרואידים של Huh7. כפי שמוצג ב-איור 4, ספרואידים בתלת-ממד היו ניתנים לתעתוק של AAV-scGFP מארבעה סרוטיפים שונים. לאחר 72 שעות של תעתוק, נמדד ה-scGFP באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי (איור 4A,B) ותוכנה לדימוי תאים חיים (איור 4C,D). כל 4 הסרוטיפים זוהו בהצלחה באמצעות שני מכשירים אלו. מערכת דימוי התאים החיים הראתה טווח גבוה יותר בין האות לרעש מאשר קורא הלוחות הפלואורסצנטי, אם כי אות מנורמל לא הראה הבדלים משמעותיים. מצאנו של-AAV2 הייתה יעילות התעתוק החזקה ביותר בשני קווי התאים, ואחריו AAV1, בעוד ש-AAV5 ו-AAV9 הראו תעתוק נמוך משמעותית.

בשלב הבא, הערכנו את יעילות ההעברה (transduction) של לומנסנציה באמצעות פרוטוקול הספרואידים. כדי לבחון זאת, תאי HeLa גודלו לספרואידים תלת-ממדיים בהתאם לפרוטוקול האופטימלי המתואר כאן. ביום השלישי, תאי HeLa בספרואידים הועברו עם 5 סרוטיפים שונים של AAV המקודדים לגן דגל של ננו-לוסיפראז. לאחר 72 שעות של העברת AAV, התאים טופלו בתסבסב (substrate) של Live Cell והודגרו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הלומנסנציה נמדדה ודוגמה באמצעות מערכת לדימות ביולומנסנציה. (איור 5A)נצפתה התמרה יעילה עבור כל סרוטיפי ה-AAV באמצעות מערכת זו. נצפתה הבחנה רגישה בין יעילות ההתמרה של סרוטיפי AAV שונים, המצביעה על כך שהפרוטוקול אינו מוגבל לקריאות פלואורסצנציה. בהתאם למגמות שנצפו ב- איור 5טרנסדוקציה של AAV-nano luciferase בתאי HeLa הראתה כי AAV2 הוא הסרוטיפ העוצמתי ביותר, כפי שנראה עם וקטורי AAV-GFP. באופן דומה, יעילות הטרנסדוקציה הנמוכה ביותר נצפתה עבור הסרוטיפ AAV9, כפי שהודגם הן בווקטורים פלואורסצנטיים והן בווקטורים לומנצנטיים (איור 4 ו- 5). תמונה מייצגת של טרנסדוקציה של AAV-nano luciferase מוצגת ב- איור 5B.

בנוסף לעוצמת הטרנסדוקציה, פרוטוקולים של ספרואידים בתלת-ממד מאפשרים ניטור קינטי של הטרנסדוקציה. איור 6 מציג תוצאות מייצגות לקינטיקת טרנסדוקציה של AAV2-scGFP ו-AAV2-ssGFP בספרואידים תלת-ממדיים של HEK293T, כאשר אלו עברו טרנסדוקציה ב-MOIs שונים (0-106) (איור 6A-G). מצאנו כי טרנסדוקציה של AAV2-scGFP ניתנת לזיהוי ב-MOIs נמוכים עד כדי 101, כאשר עלייה באות ה-GFP ניתנת לזיהוי לאחר כ-34 h בהשוואה לתאים שלא טופלו, תוך שימוש במערכת דימוי תאים חיים. אות ה-AAV2-ssGFP חלש ואיטי הרבה יותר מאות ה-AAV2scGFP. כדי להשוות עוד יותר את מהירות הטרנסדוקציה, חישבנו את זמן ההתחלה (onset time) שבו אות ה-GFP הופך לניתן לזיהוי. הבחנו כי scGFP מהיר פי 4 בממוצע מ-ssGFP בטרנסדוקציית תאים. זמני התחלה אינדיבידואליים מדווחים ב-טבלה 1. מדידות קינטיות אלו מראות היבט נוסף של יעילות הטרנסדוקציה המועיל לאופטימיזציה של הבדיקה.

דיאגרמה של זרימת עבודת תרבית תאים; יצירת ספרואידים, טרנסדוקציה ואנליזה באמצעות IncuCyte.
איור 1: סקירה כללית של טרנסדוקציות AAV באמצעות תרביות תלת-ממדיות (3D). (A) תאים מורחבים בתרבית דו-ממדית (2D) ונזרעים בצלחות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ULA) ליצירת ספרואידים. (B) הצלחות עוברות צנטריפוגציה כדי לעודד אגרגציה ומועברות ל (C) מערכת IncuCyte S3 לניטור בזמן אמת של יצירת הספרואידים. (D) ביום ה-3, הספרואידים עוברים טרנסדוקציה עם AAV ב-MOIs משתנים. (E) קינטיקת הטרנסדוקציה נמעקבת לאורכה של תקופה באמצעות דימיון של תאים חיים, ו (F) ניתן לבצע אנליזת נקודת סיום באמצעות קריאות פלואורסצנציה או לומנסינציה מבוססות צלחת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה. 

השוואה של ספרואידים מתרבית תאים; תמונת מיקרוסקופיה של שש שורות תאים שונות בהגדרת הניסוי.
איור 2: אפיון מורפולוגי של ספרואידים על פני מספר שורות תאים. תמונות מייצגות של ספרואידים שנוצרו מתאי HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 ו-Huh7 מדגימות שונות בגודל, במורפולוגיה ובדחיסות, תוך שהן מספקות הדירות גבוהה בין חזרות (סרגל קנה מידה, 50 µm). כל שורות התאים נזרעו בריכוז של 1 x 104 תאים/באר למשך 3 ימים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח ביטוי גנים בתאים מסומנים ב-GFP; MOI לעומת פלואורסצנציה, מספר קווי תאים, גרף, תמונות.
איור 3: השוואה של יעילות טרנסדוקציית AAV בין וקטורים משלימים-עצמיים (scGFP) לווקטורים בעלי גדיל בודד (ssGFP) בקווי תאים שונים. ספרואידים בתלת-ממד של (A>) HEK293T, (B>) Huh7, (C>) HEP3B, ו-(D>) HEPG2 הורכבו עצמית ועברו טרנסדוקציה עם MOIs שונים של AAV2-scGFP (כחול) ו-AAV2-ssGFP (אדום). עוצמת הפלואורסצנציה הירוקה הכוללת נמדדה 72 שעות לאחר הטרנסדוקציה. תמונות מייצגות של ספרואידים שטופלו ב-MOI הגבוה ביותר עבור כל AAV, שצולמו בנקודת זמן של 72 שעות באמצעות מערכת דימוי של תאים חיים. פסי קנה מידה מייצגים 200 µm. פסי שגיאה מייצגים SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

גרפים של עוצמת פלואורסצנציה עבור סרוטיפים של AAV בתאי HEK293T ו-Huh7; MOI וזמן כמשתנים.
איור 4: טרנסדוקציית AAV בספרואידים בתלת-ממד מבדילה בין הפעילות של סרוטיפים שונים של AAV. ספרואידים בתלת-ממד של (A,C>) HEK293T ו-(B,D>) Huh7 עברו טרנסדוקציה עם AAV1, AAV2, AAV5 ו-AAV9, עם טרנסגן scGFP בטווח של MOIs שונים. יחידות עוצמת פלואורסצנציה נמדדו לאחר 72 h באמצעות קורא לוחות מבוסס פלואורסצנציה (A,B>) ומערכת דימות תאים חיים (C,D>). פסי השגיאה מייצגים SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

גרף ומפת חום של יעילות טרנסדוקציה של AAV; MOI לעומת שטף כולל; ניתוח וקטורים ויראליים.
איור 5: טרנסדוקציית AAV בספרואידים בתלת-ממד עם רפורטרים לומניסצנטיים. ספרואידים של HeLa עברו טרנסדוקציה באמצעות AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 ו-AAV9 המקודדים לגן רפורטר של nanoluciferase ב-MOIs עולים. הלומניסצנציה הודגמה ונמדדה באמצעות קריאת Endpoint במערכת דימוי לומניסצנציה 72 שעות לאחר הטרנסדוקציה. (A>) ערכי Total Flux. (B>) קריאת End-point מייצגת עם תמונות לומניסצנציה של פלטות ספרואידים המדגימה את התפלגות האות בין ה-MOIs והסרוטיפים. כל וקטור AAV הורץ בשני רפליקטים אופקיים. פסי השגיאה מייצגים SD. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח ביטוי גנים; גרפים של MOI לעומת זמן; עוצמת פלורסצנציה של sgGFP; תוצאות ניסיוניות.
איור 6: הערכת קינטיקת טרנסדוקציה בספרואידים בתלת-ממד. ספרואידים של HEK293T עברו טרנסדוקציה עם AAV2-scGFP (כחול) ו-AAV2-ssGFP (אדום) בטווח של 7 MOIs (A–G). עוצמת הצבע הירוק הכוללת נמדדה לאורך תקופה של 72 h, במרווחי זמן של 6 h, באמצעות מערכת Monitor spheroid formation/growth. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

MOI (ריבוי זיהום)scGFP (שעות)ssGFP (שעות)
1>72 שעות>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

טבלה 1: זמן התחלה לגילוי GFP.

איור משלים 1: פריסת פלטה לדילול ספרואידים. (A) פריסת פלטה מייצגת המראה את תכנית הדילול עבור ספרואידים של HEK293T, Huh7, HEP3B ו-HEPG2, אשר נוצרו מצפיפויות זריעה ראשוניות בטווח של 10,000 עד 78 תאים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: היווצרות ספרואידים בטווח של צפיפויות זריעה. תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של ספרואידים מסוג HEK293T ו-Huh7 שנוצרו מצפיפויות זריעה ראשוניות שנעו בין 10,000 ל-78 תאים ביום 3. סרגל קנה מידה מייצג 50 µm.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3: מידע על שורות תאים ליצירת ספרואידים בתלת-ממד (3D Spheroid).אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: פריסת פלטה לדילולים סדרתיים של AAV. (A) פריסת פלטה מייצגת המראה את תוכנית הדילולים הסדרתיים של AAV שנעשה בה שימוש עבור AAV1, AAV2, AAV5 ו-AAV9, החל מ-MOI של 106. ביקורת שלילית מוצגת בשורה H, המייצגת ספרואידים שלא טופלו.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 1: דימוי חי של תאים בזמן אמת של טרנסדוקציית AAV2-scGFP בספרואידים של HEK293T ב-MOI 106.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.

סרטון משלים 2: דימות תאים חיים בזמן אמת של טרנסדוקציית AAV2-scGFP בספרואידים של Huh7 ב-MOI 106.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 3: דימוי תאים חיים בזמן אמת של טרנסדוקציית AAV2-scGFP בספרואידים של HEP3B ב-MOI 106.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 4: דימוי תאי חיים בזמן אמת של טרנסדוקציית AAV2-scGFP בספרואידים של HEK293T ב-MOI 106, כחלק ממחקר תלות במינון.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 5: דימות תאי חיים בזמן אמת של טרנסדוקציית AAV2-scGFP בספרואידים של HEK293T ב-MOI 104.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

סרטon משלים 6: דימוי תאי חיים בזמן אמת של התמרה של AAV2-scGFP בספרואידים של HEK293T ב-MOI 101.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: חישוב ה-MOI הדרוש לטרנסדוקציית AAV.אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

אנו מציגים כאן פלטפורמה תלת-ממדית ( in vitro) יעילה לפיתוח AAV ובדיקת פוטנציאליות (potency). פלטפורמה זו מנצלת טרנסדוקציה משופרת, רגישות גבוהה ויכולת ניבוי תרגומית טובה יותר באמצעות תרבית תאים תלת-ממדית הדומית יותר למבנה הרקמה האנושית. מערכת זו מבדילה בהצלחה בין יעילות הטרנסדוקציה של סרוטיפים שונים של AAV ואלמנטים רגולטוריים, כולל וקטורים חד-גדיליים ווקטורים משלימים-עצמית (self-complementary), במספר קווי תאים. אנו מציינים כי בניגוד לבדיקות דו-ממדיות קונבנציונליות, שבהן יעילות הטרנסדוקציה מוגדרת לרוב כאחוז התאים החיוביים לגן הזר, מערכת הספרואידים התלת-ממדית אינה מאפשרת כימות בקנה מידה של תא בודד. לכן, יעילות הטרנסדוקציה במחקר זה מוגדרת כעוצמת אות הדיווח הכללית (פלואורסצנטית או לומניסצנטית), המשקפת את התרומה המשולבת של שיעור התאים שעברו טרנסדוקציה ורמת ביטוי הגן הזר לכל תא. הרגישות הגבוהה של הספרואידים מפחיתה משמעותית את הצורך בכמויות גדולות של מוצר, מה שהופך אותה לכלכלית, ורסטילית ורלוונטית פיזיולוגית למחקר ופיתוח של AAV.

גישה זו נותנת מענה לאתגרים מרכזיים בבדיקות תרביות תאים דו-ממדיות (2D) מסורתיות, המסתמכות על היצמדות למשטחים מלאכותיים וחסרות ארגון תאי, מה שעלול להוביל לתחזיות שגויות לגבי ביצועי הווקטור בסביבות קליניות. מערכת הספרואידים התלת-ממדית (3D) מדמה בצורה טובה יותר את מבנה הרקמה ואת דפוסי התפלגות התרופה, ובכך מספקת נתונים על התנהגות הווקטור התואמים יותר לתנאים ביולוגיים ממשיים22,23. הפרוטוקול משתמש במונחים פשוטים של פלטות בעלות היצמדות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment plates), מה שמאפשר שחזור קל של התהליך בתנאי מעבדה סטנדרטיים.

ניתן להשתמש במערכת גמישה זו עבור בדיקות נטרול של AAV, ללימוד חדירת AAV, ולפיתוח ניסויי תרבית משותפת (co-culture) מורכבים יותר כדי לבחון את השפעותיהם של סביבות תאיות שונות על טרנסדוקציה של AAV. בנוסף, פלטפורמות לסריקה של תרופות ווקטורים בתפוקה גבוהה יכולות להשתלב בקלות עם פלטפורמת הספרואידים, מה שמאפשר אוטומציה והפחתת עלויות בתהליכי גילוי ווקטורים לצורך פיתוח מוצרים ממוקדים יותר.

יתרון מעשי מרכזי של ספרואידים הוא יכולתם לגדול באופן רציף במשך שבועות ללא צורך במעבר תאים (cell passaging), דבר המאפשר מחקרים ממושכים של פעילות AAV. מערכת תרבית יציבה זו שומרת על אינטראקציות תא-תא ועל מרכיבי מטריקס חשובים, ובכך נמנעת מההפסקות הנגרמות מקציר תאים חוזר, כפי שנדרש בתרביות דו-ממדיות (2D)24. הסביבה התאית שנשמרת תומכת בארגון חלבונים טבעי ובמבני ממברנה החיוניים להערכת קישור וכניסה של AAV לתאים25.

למרות שספרואידים בתלת-ממד מראים פוטנציאל רב להערכות של טרנסדוקציית AAV, הם סובלים גם מחסרים תרגומיים מסוימים בהשוואה למודלים in vivo , בעיקר בשל מבנם המפושט יחסית לרקמות טבעיות. בספרואידים חסרים רכיבים פיזיולוגיים קריטיים, כולל מערכת כלי דם להובלת הווקטור, תאי מערכת החיסון להערכת אימונוגניות, ומחסומים ספציפיים לרקמה כגון מחסום דם-מוח, אשר עשויים להשפיע באופן משמעותי על ביצועי AAV26. הגבלות אלו מעידות על כך שספרואידים, למרות שהם מציעים רמה בינונית של מורכבות בין תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות למודלים של בעלי חיים in vivo, עדיין אינם מספיקים כדי לשחזר באופן מלא את המיקרו-סביבה הפיזיולוגית הדרושה להערכה מקיפה של AAV.

פרוטוקול הספרואידים המוצג כאן מתאר סוג תא בודד בכל פעם. ניתן לפתח פרוטוקול זה כך שיכלול 2–3 סוגי תאים נוספים המתקבצים למבנה תלת-ממדי בסיסי. מודלים תלת-ממדיים מורכבים יותר, כגון אורגנואידים או מערכות מיקרופלואידיקה, הם מערכות רב-תאיות המשחזרות את הגיוון התאי והארגון של איברים ספציפיים, ומכילות 10 או יותר סוגי תאים נבדלים המסודרים בתבניות דמויות רקמה. אורגנואידים תלת-ממדיים מתקדמים אלו עשויים לכלול תאים מרובים27, תרביות מוטמעות בהידרוג'ל, טכניקות של טיפה תלויה (hanging drop), ופלטפורמות מיקרופלואידיקה11,27,28. בעוד ששיטות אלו מספקות ארכיטקטורת רקמה מורכבת יותר שעשויה לסייע בהעמקת הבנתנו את הביולוגיה של AAV, הן נוטות לדרוש ריאגנטים וציוד ייעודיים יותר ומומחיות טכנית ניכרת. מנגד, ספרואידים תלת-ממדיים הנוצרים בלוחיות בעלות היצמדות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment plates) הם פשוטים הרבה יותר ומתאימים למעבדות רבות בשל יעילותם הכלכלית והיכולת לשחזר את התוצאות.

שלבים קריטיים ליישום מוצלח של פרוטוקול זה כוללים שמירה על חיוניות תאים גבוהה, שכן תאים פגומים עלולים לפגוע ביצירת הספרואידים וביעילות הטרנסדוקציה. השימוש בצלחיות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment) ואופטימיזציה של הסבב בצנטריפוגה הם אף הם קריטיים להשגת דחיסות של הספרואידים. אופטימיזציה של ה-MOI עבור כל סוג תא וסוג סרוטיפ של AAV חיונית למניעת אותות חלשים או רוויה. בחירת שיטת הדתקציה המתאימה היא קריטית אף היא, במיוחד עבור ניתוחים קינטיים, שבהם נדרשת תאימות למערכות דימות רציפות של תאים חיים. מספר שיקולים טכניים חשובים לצורך פרשנות מדויקת של טרנסדוקציית AAV בספרואידים תלת-ממדיים.

אות טרנסדוקציה חלש או חסר עשוי לנבוע מתיתר ויראלי נמוך, MOI שאינו אופטימלי או זמן אינקובציה לא מספיק; ניתן לטפל בכך על ידי אימות התיתרים הוויראליים, אופטימיזציה של ה-MOI והארכת זמן האינקובציה (בדרך כלל 3–5 ימים). אותות פלואורסצנציה או לומניסצנציה חלשים עשויים לשקף ביטוי נמוך של הגן הזר או חדירה מוגבלת של ריאגנטים בתוך המבנה התלת-ממדי, דבר שניתן לשפר באמצעות אופטימיזציה של הגדרות החשיפה או מתן זמן נוסף לדיפוזיית התסבס (substrate). אתגר מרכזי בסוגי תאים מסוימים, כגון תאי HeLa, הוא אוטופלואורסצנציה, שעלולה להוביל לאות רקע גבוה ולרגישות מופחתת במבחנים המבוססים על פלואורסצנציה. כדי להתגבר על מגבלה זו, יישמנו מערכת רפורטר של ננו-לוציפראז המבוססת על לומניסצנציה, המספקת יחס אות-רעש משופר ומאפשרת זיהוי מדויק יותר של טרנסדוקציה על רקע של אוטופלואורסצנציה. בנוסף, אות רקע עלול לנבוע מסף (thresholding) שגוי או מפלואורסצנציה הקשורה למצע הגידול, ויש לשלוט בו באמצעות בארות לא מטופלות (MOI = 0) להגדרה של רמות הבסיס. לבסוף, רוויית אות ב-MOIs גבוהים עשויה להתרחש עקב כמות ויראלית מופרזת או מגבלות הגלאי; ניתן לצמצם זאת על ידי הפחתת טווח ה-MOI ואופטימיזציה של הגדרות החשיפה של הגלאי כדי לשמור על המדידות בתוך הטווח הדינמי הליניארי.

בסיכום, מתודולוגיית הספרואידים התלת-ממדיים זו מספקת מערכת יעילה וניתנת לשחזור להערכת טרנסדוקציית AAV, עוצמה וקינטיקה. על ידי גישור על הפער בין בדיקות דו-ממדיות קונבנציונליות למחקרי in vivo, היא מאפשרת פיתוח וקטורים מושכל יותר ותומכת בקידום אסטרטגיות לטיפול גנטי בעלות רלוונטיות קלינית.

גילויים

למחברים אין הצהרות על ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מודים למורטן סיירופ (Morten Seirup) ולטריש הואנג (Trish Hoang) על אספקת הפלסמיד לייצור AAV nanoluciferase ואת ריאגנטים של ה-substrate החי. פרויקט זה נתמך על ידי מינוי לתוכנית השתתפות במחקר של ORISE ב-CBER, מינהל המזון והתרופות של ארה"ב (FDA), בניהול מכון אוק רידג' למדעים וחינוך (Oak Ridge Institute for Science and Education) במסגרת הסכם בין-סוכנותי בין משרד האנרגיה של ארה"ב לבין ה-FDA.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אינקובטור 37°CThermoFisher Scientific#51025983תנאי תרבית סטנדרטיים
תאי A375ATCCCRL-1619שורת תאים
פלסמיד AAV1Addgene112862פלסמיד AAV
פלסמיד AAV2Addgene104963פלסמיד AAV
פלסמיד AAV5Addgene104964פלסמיד AAV
פלסמיד AAV8Addgene112864פלסמיד AAV
פלסמיד AAV9Addgene112865פלסמיד AAV
קורא לוחות BioTek GEN5Agilent TechnologiesNAקריאת נקודת סיום עבור פלואורסצנציה או לומינסנציה
צנטריפוגהThermoFisher Scientific#TSO-MX1Rשמירה על תרחיף ספרואידים
Corning™ Phosphate Buffered Saline לתרבית תאים (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS לשטיפת תאים
DMEM גלוקוז גבוה, תוספת GlutaMAX, פירובטThermoFisher Scientific#10569010מצע גידול מלא
מעכב NanoLuc חוץ-תאי PromegaN235Bמנטרל כל אות NanoLuc® המגיע מהסביבה החוץ-תאית  
סרום עגל עובר (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLאספקת גורמי גדילה
תאי HEK293TATCCCRL-3216שורת תאים
תאי HeLaATCCCRM-CCL-2שורת תאים
תאי HEP3BATCCHB-8064שורת תאים
תאי HEPG2ATCCHB-8065שורת תאים
תאי Huh7ABMT8973שורת תאים
מיקרוסקופ הפוך IncuCyte S3SartoriusNAניטור היווצרות/גדילה של ספרואידים
מערכת דימות IVIS SpectrumSpectralinvivoNAקריאת נקודת סיום עבור לומינסנציה
ערכת Nano-Glo® לתאים חיים PromegaN2013ריאגנט מצע לומינסנטי לזיהוי תאים חיים
פניצילין-סטרפטומייצין (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122מניעת זיהום חיידקי
בקבוקי תרבית רקמה T75 עם אוורורFisher Scientific#NC0509296 בקבוקים לגידול תאים
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher Scientific#25300120ניתוק אנזימטי של תאים
לוחות בעלי היצמדות נמוכה במיוחד (Ultra-low attachment)Corning#7007מניעת היצמדות תאים לקידום היווצרות ספרואידים

מקורות

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
  5. Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.
  6. Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/
  7. Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products
  8. Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.
  9. Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.
  10. Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.
  11. Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.
  12. Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.
  13. Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.
  14. Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.
  15. Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.
  16. Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.
  17. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.
  18. McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.
  19. Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.
  20. Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.
  21. Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.
  22. El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.
  23. Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.
  24. Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.
  25. Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.
  26. Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
  27. Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.
  28. Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.