מאמר שיטה

תכנות מחדש של קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מדגימות מעילי באפי קפוא

DOI:

10.3791/70522

⸱

10 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שלבים לאיתור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים (PBMCs) של דגימות מטופלים, שקשה היה לתכנת מחדש בהתאם להוראות היצרן. פרוטוקול זה ייחודי לדגימות שכבת באפי קפואה, אך ניתן ליישמו גם לתכנות מחדש של PBMCs מטוהרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) הם כלי חשוב למידול מחלות. תאי גזע נוספים יכולים להיות מתוכנתים מחדש מתאי סומטיים בוגרים, הנקראים תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC). טכנולוגיית iPSC מאפשרת הערכה של משתתפי מחקר ספציפיים ואוכלוסיות, ויוזמות בתחום הרפואה המותאמת אישית. דם נלקח באופן שגרתי ומוקפיא למטרות מחקר. דגימות אלו מעובדות או כשכבות באפי, דגימת דם המכילה תאי דם לבנים וטסיות, או כתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים (PBMCs), המייצגים אוכלוסייה מטוהרת יותר של תאי דם לבנים ללא אאוזינופילים, בזופילים, טסיות או תאי דם אדומים. שניהם מקור נגיש יחסית ולא פולשני לתאים סומטיים הניתנים לתכנות מחדש. כמה דיווחים מתארים תכנות מחדש מ-PBMCs, בעוד שרק אחד מתאר את התהליך הזה ממעילים קפואים. ניסיון עדכני חשף כי פרוטוקולי תכנות מחדש של PBMC הזמינים בספרות וביצרנים אינם מוצלחים כאשר הם מיושמים על דגימות של מעיל באפי קפוא, מה שדרש את ההתאמות ואסטרטגיות פתרון הבעיות המתוארות כאן. עבור חוקרים רבים המשתמשים בטכנולוגיות iPSC, חיוני שיהיו פרוטוקולים יסודיים עם שיעור הצלחה גבוה, במיוחד במקרים שבהם דגימות מטופלים עשויות להכיל רק מספר קטן של תאים, מתקבלות במרווחי זמן רחבים, מגיעות ממאגר משתתפים מוגבל, או בעלות ערך רב. כאן מזוהים נקודות ביקורת ואסטרטגיות פתרון תקלות כדי להגדיל את הסיכוי לתכנות מחדש של מעילי באפי קפואים או PBMCs מזוהרים. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לזהות מנבאים להצלחת תכנות מחדש ולתכנן גישות חלופיות לשיפור הסיכויים להצלחת הגזרת iPSC.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) היא מקור קל להרחבה ומתחדש של תאים אנושיים שניתן להבדיל לכל סוג תא בגוף, מה שמאפשר לחוקרים לחקור סוגי תאים ורקמות שקשה להשיג או בלתי נגישים אצל מטופלים. יתרה מזאת, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) יכולים להיגזר ישירות מתאי הסומטיקה של המטופל1. דבר זה מאפשר הבחנה בין סוגי תאים ספציפיים למטופל, כלי יקר ערך למידול מחלות וגילוי תרופות. לכן, שיטות קפדניות, ניתנות לשחזור ומוצלחות לתכנות מחדש של תאים סומטיים ל-iPSC הן קריטיות.

פיברובלסטים, תאי שתן ותאי דם 2,3, שלכל אחד מהם מגבלות משלו, הם מהמקורות הנפוצים ביותר לתאי הסומטיקה להפקת iPSC. פיברובלסטים, שהיו הבחירה הפופולרית ביותר לתכנותמחדש של 3, אינם נגישים בקלות, ודורשים ביופסיה של עור פולשנית למדי. תאים ניתנים לתכנות מחדש ניתן להפיק מדגימות שתן, שהן קלות להשגה ולא פולשניות, אך תהליך התכנות מחדש חייב להתחיל בדגימות טריות עד 48 שעות לאחר איסוף4. דם מהווה מקור מצוין לתאים הניתנים לתכנות מחדש, שכן הוא זעיר פולשני להשגה וזמין בקלות. קיימים פרוטוקולים רבים לתכנות מחדש מתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים (PBMCs), תאי דם עם גרעין יחיד כולל לימפוציטים, מונוציטיםותאי הרג טבעיים. מכיוון ש-PBMCs פחות צפופים מתאי דם אחרים, ניתן לבודד/לטהר אותם מדגימות דם שלמות מבודדות טריות באמצעות צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות5. לחילופין, בעת הצנטריפוגה, הדם המלא מתפצל לשלוש שכבות מובחנות: פלזמה, פרווה באפי ותאי דם אדומים6. מעילי באפי מכילים PBMCs וכן טסיות וחלק מהאריתרוציטים. עם זאת, PBMCs פחות זמינים ברוב הבנקים הביולוגיים, בעוד שפרווה של דם מלא או פרווה באפי נפוצים ונגישים7. למרות זמינות מעילי באפי בבנקים ביולוגיים ונוכחות PBMCs ניתנים לתכנות מחדש בדגימות אלו, מעט מאוד פרוטוקולים מפרטים תכנות מחדש ממעילי באפיקפוא 8, מה שמשאיר זאת משאב לא מנוצל.

נכון להיום, קיימים פרוטוקולים רבים שפורסמו 1,8,9 וערכות10 הזמינות מסחרית לייעול התכנות מחדש; עם זאת, הם אינם מבחינים לעומק כיצד למקסם את ההצלחה של תאי תורם מטופלים שקשה לתכנת מחדש. מקובל שחלק מהתאים פשוט לא מתכנתים מחדש, וכאשר זה קורה, חוקרים רבים עשויים לנסות עם סוג תא תורם שונה או מטופל אחר. עם זאת, ייתכן שזו לא אפשרות ישימה עבור חוקרים רבים או אוכלוסיות מטופלים. בניגוד לפרוטוקוליםשפורסמו בעבר 8,9, פרוטוקול זה כולל מדריך עם נקודות בדיקה וקריטריונים, שעל פיהם ניתן לחזות את הצלחת התכנות מחדש, והוא נוקט בגישה ייחודית על ידי טיהור שכבות באפי קפואה באמצעות צנטריפוגציה בגרדיאנט צפיפות בעת הפשרה.

התהליך מתחיל בלקיחת דם מפרטים נבחרים ובידוד של PBMCs או מעילי באפי. לניסויים חדשים, זה צפוי לכלול גיוס תורמים חדשים שיבצעו לקיחת דם טרייה באישור IRB ועם טופס הסכמה מתאים. השלב הבא הוא התפשטות תאים סומטיים, שבה תאי דם קפואים מופשרים ומתרבותים בתנאים שמקדמים התרבות של תאי גזע המטופואטיים ואבי אריתרואידים, תאי הדם שהם המועמדים הטובים ביותר לתכנות מחדש11. לאחר 10–14 ימים, התאים אמורים להיות מוכנים לתכנות מחדש, כפי שניתן לראות במורפולוגיה מובחנת שלא נדונה בפרוטוקולים קודמים, ולאחר מכן מועברים באמצעות חיסון לווירוס סנדאי הנושא את גורמי יאמאנקה Oct4, Sox2, c-Myc ו-Klf41. לאחר הטרנסדוקציה, התאים יתחילו לבטא את גורמי השעתוק של יאמאנקה ויחזרו למצב פלוריפוטנטי, המסומן שוב בשינוי מורפולוגי ברור ובהתרבות למושבות תאי גזע. מושבות מתהוות נבחרות, מורחבות ומוקפאות בנפרד. לאחר עשרה מעברים, אפיון באמצעות אישור ביטוי של סימני גבעול ופוטנציאל התמיינות לשלוש שכבות הנבט מאמת קו iPSC מתוכנת מחדש בהצלחה.

פרוטוקול זה עובד בצורה הטובה ביותר עבור פרותות באפי שמורות בקריופר, שנשמרו במשך < חודש, או ל-PBMCs שמוקפאים עד שנתיים עם לפחות מיליון תאים ברי קיימא בעת הפשרה. עם זאת, נקודות הביקורת המתוארות עשויות לסייע בפתרון תקלות בתכנות מחדש מכל דגימת דם איכותית. בנוסף, פרטים על התאמת iPSCs מתוכנתים מחדש לתנאים ללא הזנה יכולים להיות רלוונטיים לכל תהליך תכנות מחדש של iPSC, ללא קשר לסוג התא הסומטי ההתחלתי.

פרוטוקול זה, שנוצר באמצעות פתרון תקלות מעשי, מפרט תכנות מחדש של iPSCs מתוך שכבות באפי קפואות ומזהה אינדיקטורים מורפולוגיים להצלחה בתכנות מחדש, ומספק מדריך מעשי לתכנות מחדש של דגימות קשות. בסופו של דבר, יישום אסטרטגיות אלו מוביל לחיסכון בזמן, כסף, תגובות ודגימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה פועל לפי הנחיות ועדת האתיקה למחקר אנושי של אוניברסיטת ג'ורג'יה. כל המחקרים בבני אדם בוצעו בהתאם להנחיות הצהרת הלסינקי של האגודה הרפואית העולמית. בהתבסס על דיווח עצמי, המתנדבים לא סבלו מהמחלות הבאות: סיסטיק פיברוזיס, מחלת ריאות חסימתית כרונית, שחפת, אסתמה, סוכרת או זיהומים חריפים בדרכי הנשימה. גויסו מתנדבים בגילאי 18–50 ומשני המינים. נשים בהריון הוצאו מהמחקר.

1. חילוץ ושימור באפי קואט או PBMC

קריטריוני החלטה: אם הדגימות יישארו לאורך זמן, עדיף לבחור באפשרות 2. אם החומרים לטיהור PBMC אינם זמינים, או שהדגימות יישמרו לתקופה קצרה, אפשרות 1 מתאימה.

  1. אפשרות 1: חילוץ מעיל באפי
    1. בצע פלבוטומיה (ניקוב ורידים ללקיחת דם) לפי WHO12 ולקחת 7–10 מ"ל דם מלא לצינורות איסוף דם מצופים נוגדי קרישה. תשמור דגימות על הקרח.
    2. העבר 7–10 מ"ל דם מלא לצינור קוני של 15 מ"ל. סובב דם למטה באמצעות צנטריפוגה מתנדנדת ב-200 x g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כשהבלמים כבויים. זה אמור ליצור 3 שכבות עם פלזמה צהובה מעל, שכבת פרווה לבנה במרכז, ואדמדומים אדומים בתחתית.
    3. אספו את הפלזמה באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית מבלי להפריע לשכבת הפרווה השחורה. זרוק את הפלזמה. העבר את שכבת שכבת הבוז הלבנה לצינור קוני טרי של 15 מ"ל (כ-1–2 מ"ל).
      אזהרה: השליכו את הפלזמה בפח פסולת ביולוגית מסוכנת מתאים.
      הערה: זיהום פלזמה מסוים בפרווה הבופי בסדר כי הוא מסייע בהתאוששות לאחר הפשרה.
    4. הוסיפו DMSO לשכבת הבאפי כך שההרכב הסופי יהיה 10% DMSO v/v ומקפיאים בקירור (1 מ"ל לבקבוקון) בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס מיד. ביום שאחרי, העבר את המבחנות לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
      הערה: לדוגמה, עבור 2 מ"ל של Buffy Coat, הוסיפו 200 מיקרול DMSO, ערבבו היטב, ואז מחלקים ל-2 בקבוקונים. זה בדרך כלל מוביל ל-1–3 בקבוקונים מוקפאים לכל דגימה.
  2. אפשרות 2: טיהור PBMC
    1. לבצע פלבוטומיה (ניקוב ורידים ללקיחת דם) לפי שיטות העבודה הטובות של ארגון הבריאות העולמי12 ולקחת 7–10 מ"ל דם מלא לצינורות איסוף דם מצופים נוגדי קרישה. תשמור דגימות על הקרח.
    2. הוסיפו תמיסה גרדיאנט צפיפות של 4 מ"ל 1 לצינור קוני חדש של 15 מ"ל. שכב בזהירות 4 מ"ל דם מעל תמיסת גרדיאנט הצפיפות 1.
    3. צנטריפוגה משתמשת בצנטריפוגת דלי מתנדנדת בעוצמה 400 x g ב-RT למשך 30 דקות, וכיבוי הבלמים. זה יגרום לפלזמה בשכבה העליונה, PBMCs בשכבה האמצעית, ושארית הדם תהיה בתחתית.
    4. אסוף את שבר ה-PBMC לצינור קוני חדש של 15 מ"ל, ואז שטוף אותו 2–3 פעמים עם 1x PBS על ידי צנטריפוגה עם צנטריפוגה מתנדנדת ב-350 x g ב-RT למשך 5 דקות עם הבלם פועל. זרוק את הסופרנטנט. כדי לדלג על הקפאה ולהתחיל מיד בתכנות מחדש, המשיכו לשלב 2.3.4.
      אזהרה: השליכו את הסופרנטנט בפח הפסולת הביולוגית המסוכן המתאים.
    5. החזירו את הכדור במדיה לשימור קריופריונרי (90% סרום ו-10% DMSO) והקפאו בקירור (1 מ"ל לבקבוקון) בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס מיד. ביום שאחרי, העבר את המבחנות לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
      הערה: ניתן להשתמש בצינורות איסוף דם מבודדים ב-PBMC במקום בצנטריפוגה עם גרדיאנט צפיפות לטיהור PBMC מדם טרי. ניתן גם לשמר קריושימור באמצעות אמצעי הקפאה חלופיים זמינים מסחרית. התפוקה הטיפוסית היא 1–4 בקבוקים קפואים לדגימה.

2. הכינו דגימות להתרחבות תאים סומטיים

  1. הכנה לתקשורת
    1. הכינו את מדיית ההרחבה (EM)9 על ידי ציטוט של 45 מ"ל של בסיס אלקטרומגנטי. הוסף 127.8 מיקרוליטר L-אסקורבית (50 מיקרוגרם/מ"ל ממלאי 100 מ"מ) ו-450 מיקרוליטר פניצילין-סטרפטומיצין (100 מ"מ).
    2. הכינו EM + ציטוקינים13 עד 4 מ"ל EM, הוסיפו 2 מיקרוליטר פקטור תאי גזע (SCF) (50 ng/mL ממאגר 100 מיקרוגרם/מ"ל), 2 מיקרוליטר אינטרלוקין-3 (IL-3) (10 ng/mL ממאגר 20 מיקרוגרם/מ"ל), 16 מיקרוליטר אריתרופויטין (EPO) (2 U/mL ממלאי 500 U/mL), 4 מיקרוליטר מקדם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF1) (40 ng/mL ממאגר 40 מיקרוגרם/מ"ל), ו-4 מיקרוליטר דקסמתזון (1 מיקרומום ממלאי של 1 מ"מ'). השתמש ב-EM + ציטוקינים באותו יום שבו הוא מוכן.
      הערה: ייתכן שישמשו מערכות מדיות התרחבות מסחריות חלופיות.
  2. אפשרות 1: טיהור PBMC ממעיל באפי הקפוא
    קריטריוני החלטה: אם נבחרה אפשרות 1 בשלב 1 (כלומר חילוץ באפי קואט), אז בחרו באפשרות 1 בשלב 2 (כלומר, טיהור PBMC ממעיל באפי קפוא).
    1. שלפו את פתרון גרדיאנט הצפיפות 2 ומאפשרים להגיע לטמפרטורת החדר. ערבבו היטב על ידי הפיכת הבקבוק. העבר באופן אספטי תמיסה עם גרדיאנט צפיפות 3 מ"ל 2 לצינור קוני של 15 מ"ל.
    2. הכן צינור קוני נוסף בנפח 15 מ"ל עם 12 מ"ל מלח בופר פוספט של דולבקו (DPBS).
    3. הוציא את הבקבוקון של מעיל הבאפי הקפוא מהחנקן הנוזלי. שמור על הקרח עד שתהיה מוכנה להפשרה. הפשרו בעדינות את הדגימה על ידי סיבוב באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הסר כאשר נשאר רק גביש קרח קטן.
    4. העבר בזהירות (בכיוון הדרופ) את תוכן הבקבוקון לצינור הקוני המכיל DPBS. שטוף את הבקבוקון ב-1 מ"ל DPBS והוסף לצינור הקוני המכיל תאים שנלקחו.
    5. צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגת דלי מתנדנדת בעוצמה של 200 x g ב-RT למשך 10 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט והשעה מחדש את כדור התאים ב-4 מ"ל DPBS עם 1% סרום בקר עוברי (FBS).
    6. שכב בעדינות את תערובת המעטפת של Buffy מעל תמיסת גרדיאנט הצפיפות, תוך זהירות שלא לאפשר ערבוב. צנטריפוגה בצנטריפוגה מתנדנדת בדלי ב-800 x g למשך 20 דקות ב-RT עם הבלם כבוי.
    7. באמצעות פיפט, להסיר ולהשליך את שכבת הפלזמה העליונה מבלי להפריע לממשק הפלזמה-גרדיאנט. עם פיפט, הסר את שכבת ה-PBMC בממשק (איור 1A) והעבר לצינור נקי בנפח 15 מ"ל.
      זהירות: השליכו את השכבות האחרות במיכל הפסולת הביולוגית המתאימה.
    8. שטוף את ה-PBMCs עם 3 מ"ל EM על ידי צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 10 דקות ב-RT. הסר בזהירות את הסופרנטנט ותשהה מחדש את הכדור ב-2 מ"ל EM + ציטוקינים. צלחת בבאר אחת מתוך צלחת עם 12 בארות.
    9. הנח את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו-20% O2.
  3. אפשרות 2: הפשרת PBMCs קפואים
    קריטריוני החלטה: אם נבחרה אפשרות 2 בשלב 1 (כלומר, טיהור PBMC), או אם יש חשש שכבות באפי קפואה יהיו בעלות עמידות נמוכה (כלומר, באחסון ליותר מחודש) (איור 1B), אז בחרו באפשרות 2 בשלב 2 (כלומר, הפשרת PBMCs קפואים).
    1. הכן צינור קוני של 15 מ"ל עם 12 מ"ל DPBS.
    2. שלפו את הבקבוקון של PBMCs הקפואים מחנקן נוזלי. השאר על הקרח עד שיהיה מוכן להפשרה. הפשיר בעדינות את הדגימה על ידי סיבוב באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. הסר כאשר נשאר רק גביש קטן.
    3. העבר בזהירות (מבחינת נפילה) את תוכן הבקבוקון לצינור הקוני. ודא שאתה שולף את כל התאים מהבקבוקון על ידי שטיפת הבקבוקון ב-1 מ"ל של DPBS.
    4. צנטריפוגה בצנטריפוגה דלי מתנדנדת בעוצמה של 200 x g ב-RT למשך 10 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט ותליה מחדש את הכדור (איור 1C) ב-2 מ"ל EM, ואז לקח 10 מיקרוליטר לביצוע בדיקת הדרה כחולה טרייפן ליכולת התאים ולהשיגספירת תאים 14.
      אזהרה: השליכו את הסופרנטנט בפח הפסולת הביולוגית המסוכן המתאים.
    5. לוח 1.0 x 106–2.0 x 106 תאים/מ"ל ב-2 מ"ל EM + ציטוקינים באר אחת של לוח עם 12 בארות. הנח את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו-20% O2.

3. התרחבות תא סומטי (יום אחד לאחר הפשרה)

  1. הסר בזהירות 1 מ״ל של חומר ריק מכל באר. מדיום משומש ניתן לאסוף באר או צינור צנטריפוגה אחר ולבדוק כדי לוודא שלא אובדו תאים.
  2. החלף מדיה משומשה ב-1 מ"ל של EM + ציטוקינים טריים.
  3. חזור על שלבים 3.1 ו-3.2 וצלם PBMCs כל יומיים עד שנצפה שינוי משמעותי במורפולוגיה, עם תאים בהירים ועגולים בגודל גדול וקטן (איור 2A, חץ כתום וכחול, בהתאמה), שהם האריתרובלסטים, סוג התא לתכנות מחדש. זה ייקח כ-10–14 ימים.
    הערה: תאים שאינם מציגים את המורפולוגיות הללו, בדרך כלל חסרים את התאים העגולים הגדולים (איור 2B), אינם צפויים לתכנת מחדש בהצלחה ועלולים להיות מתים (איור 2C).

4. טרנסדוקציה (10–14 ימים לאחר הפשרה)

  1. הכינו את וירוס סנדאי
    1. באמצעות ערך הטיטר הספציפי לאצט, חשבו את נפח כל וירוס הנדרש להעברה של 2.0 × 10תאים 5 באמצעות KOS: c-Myc: Klf4 עם ריבוי זיהום (MOI) של 5:5:3, כפי שהומלץ על ידי היצרן. המשוואה לחישוב זה נמצאת במסמכי המוצר שסופקו על ידי היצרן.
    2. שלפו וירוסים מהמקפיא, שומרים אותם על הקרח עד שהגיע הזמן להפשרה. אחד אחד, הפשרו בעדינות את הווירוסים על ידי סיבוב באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    3. הכינו אליקווטים שבהם כל שלושת הווירוסים מעורבבים בנפח המתאים להעברה של 2.0 × 10תאים 5 ב-MOI של 5:5:3. הקפיאו את האליקוות בטמפרטורה של -80°C עד שיהיו מוכנים לשימוש.
      אזהרה: הקפידו להלבין היטב את כל הפסולת שנגעה בנגיף סנדאי.
      הערה: הוראות היצרן ממליצות על ספירה ממשית של תאים עם חישוב MOI כדי לקבוע את נפח הווירוס שנוסף, אך ההערכה של 2.0 × 105 הצליחה לצורך פרוטוקול זה. אליקיוטינג יכול להיות חסכוני יותר ולהפחית את מחזורי ההקפאה וההפסה של וירוסים.
  2. יום ההעברה (d0)
    1. אם ה-PBMCs לא הוזנו יום קודם, הסר 1 מ"ל של מדיה משומשה והחלף ב-1 מ"ל של EM + ציטוקינים טריים. להפשיר את הווירוס על הקרח, ואז להוסיף ישירות לבאר, לסחרר את התקשורת.
    2. עטוף את הפלטה בפארפילם וצנטריפוגה בצנטריפוגה של דלי מתנדנד ב-350 x g ב-RT למשך 90 דקות. הנח את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו-20% O 2 במהלך הלילה.
      אזהרה: הקפידו להלבין היטב את כל הפסולת שנגעה בנגיף סנדאי.
  3. יום אחד לאחר ההעברה (d1)
    1. אסוף את התאים לצינור קונוסי של 15 מ"ל. שטפו היטב עם 2 מ"ל EM ובדקו תחת מיקרוסקופ לוודא שכל התאים נאספו. תאי צנטריפוגה ב-300 x g ב-RT למשך 10 דקות.
    2. הסר בזהירות את הסופרנטנט ותשהה מחדש ב-2 מ"ל EM + ציטוקינים. הניחו באר נקייה של צלחת עם 12 בארות והחזרו את הפלטה לדוגמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו-20% O2.
      אזהרה: הקפידו להבהיר היטב את כל הפסולת שבאה במגע עם נגיף סנדאי.

5. החלפת תאים שהועברו לתאי הזנה

  1. הכנת תא ההזנה
    1. ל-43.5 מ"ל תווך איגל (DMEM) המותאם של דולבקו הוסיפו 5 מ"ל FBS (ריכוז סופי של 10%), 0.5 מ"ל מינימום של חומצות אמינו חיוניות חיוניות (MEM-NEAA) (ממלאי 100x), 50 מיקרוליטר 2-מרקפטואנול (55 מיקרומום ממאגר 55 מ"מ"מ), ו-0.5 מ"ל אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (ממלאי 100x).
    2. הכינו לוחות מצופים ג'לטין עם 6 בארות על ידי הוספת 600 מיקרוליטר ג'לטין (0.1% מ-2% מלאי) ל-12 מ"ל DPBS וחלוקת 2 מ"ל לכל באר. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    3. שלפו בקבוקון קפוא של פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרנים (MEFs) והפשרו בעדינות על ידי סיבוב באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    4. הוסיפו דרופווייזם לצינור קונוסי של 15 מ"ל עם 10 מ"ל DPBS ושוטפים בקבוקון עם 1 מ"ל DPBS נוסף. צנטריפוגה ב-200 x g ב-RT למשך 5 דקות.
    5. הסר בזהירות את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא לתחום של 1 מ"ל פיברובלסטים. הסרת 10 מיקרוליטר כדי לבצע בדיקת הדרה כחולה של טריפאן לבדיקת עמידות התאים ולקבל את ספירת התאים14.
    6. הסר את תמיסת הג'לטין מהלוחות עם 6 בארות ומה-MEF המוקרנת ב-2.5 × 104 תאים/ס"מ 2. דגרו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-20%O 2 למשך 6–48 שעות.
      הערה: יש להכין את לוחות תאי ההזנה לפני הציפוי מחדש של תאים מומרת. התוצאות הטובות ביותר נרשמו כאשר דגירות MEF מוארות מוקרנות במשך כ-2 ימים לפני הציפוי מחדש, אך דגירה למשך לפחות 6 שעות יכולה להספיק.
  2. תאים מועברים ללוחות מחדש
    1. הכינו מדיה iPSC 90 מ"ל DMEM/F12 עם 10 מ"ל FBS (ריכוז סופי של 10%), 1 מ"ל mem-neaa (ממלאי 100x), 1 מ"ל L-גלוטמין (2 מ"מ ממלאי 200 מ"מ), 1 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (ממלאי 100x), 100 מיקרוליטר 2-מרקפטואנול (55 מיקרומום ממאגר 55 מ"מ"ר), ו-100 מיקרוליטר פקטור גדילה פיברובלסטים 2 (FGF2) (10 ng/mL ממאגר 10 מיקרוגרם/מ"ל). הוסף חומצה L-אסקורבית (50 מיקרוגרם/מ"ל) טרייה בכל האכלה.
    2. ביום השלישי לאחר ההעברה, אסוף את כל המדיה והתאים מהבאר המומרת לצינור קוני של 15 מ"ל. שטוף היטב עם לפחות 1 מ"ל נוסף של EM וצנטריפוגה בצנטריפוגה דלי מתנדנדת ב-300 x g ב-RT למשך 10 דקות.
    3. תלה מחדש את הכדור במדיה iPSC של 6 מ"ל. שאפו את המדיה משלושה בארות של הלוח עם MEFים מוארים.
    4. תאים מועברים לפלטות אל שלושת הבארות של MEF מואר (2 מ"ל/באר). דגרו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-20%O2.

6. תחזוקה עד הקמת המושבה

  1. בימים 4, 5 ו-6 לאחר ההעברה, הוסף 1 מ"ל של חומר iPSC טרי לכל באר בכל יום. דבר זה מגביל הפרעות מיותרות לתאים שזה עתה תוכנתו מחדש כשהם מתיישבים על המאכילים, ובו בזמן מספק להם חומרים מזינים טריים.
  2. ביום השביעי אחרי ההעברה, הסר את כל המדיה הישנה והחלף ב-2 מ"ל של מדיה iPSC טרייה לכל באר. המשך להאכיל במדיה iPSC כל יומיים עד שיתחילו להיווצר מושבות.
  3. הכינו hES media 78 מ"ל DMEM/F12 עם תוספת חופשית של 20 מ"ל FBS (20%), 1 מ"ל mem-neaa (100x), 1 מ"ל L-גלוטמין (2 מ"מ ממלאי 200 מ"מ"), 1 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (100x), 100 מיקרוליטר 2-מרקפטואנול (55 מיקרומטר ממאגר 55 מ"מ), ו-100 מיקרוליטר FGF2 (10 ng/mL ממאגר 10 מיקרוגרם/מ"ל). הוסף חומצה L-אסקורבית (50 מיקרוגרם/מ"ל) טרייה בכל האכלה.
  4. כאשר קולוניות קטנות מתחילות להיווצר, המשך לשמור על התאים המומרת על ידי הזנה אחת ליומיים עם מדיה hES (איור 3A).
    הערה: מושבות יתחילו להופיע כבר 7 ימים לאחר ההעברה. אם לא נוצרו מושבות עד שלושה שבועות לאחר ההעברה, סביר להניח שמושבות לא יופיעו אי פעם.

7. לבחור מושבות לאחר שהן גדלו לגודל גדול יותר (איור 3B)

הערה: לעיתים תאים שעברו שינוי מורפולוגי שאינו יוצר מושבה דמוית תאי גזע (איור 3C). זה לא נחשב למושבה שיכולה להוביל לקו iPSC מוצלח.

הערה: מהופעת המושבות, קווי iPSC יצטרכו להיות מותאמים לתנאי הגידול המועדפים של המעבדה. פרוטוקול זה יראה כיצד קווי iPSC הותאמו לתנאים ללא הזנה, גודלו על לוחות מצופים ויטרונקטין (VTN), מוזנים במדיה hPSC מוגדרת כימית וזמינה מסחרית. אם המושבות אינן מסתגלות היטב לתנאים החדשים, ייתכן שהן זקוקות למעבר עדין יותר, כמו להיתפס על תאי הזנה עם תווך hES.

  1. הכינו צלחות מצופות VTN על ידי הפשרה וערבוב יסודי של VTN. לפלטה עם 24 בארות, יש להכין 12 מ"ל DPBS עם 120 מיקרו-ליטר VTN (5 מיקרוגרם/מ"ל ממלאי 500 מיקרוגרם/מ"ל) וחלוק 0.5 מ"ל VTN תמיסת/באר. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
  2. הכינו מדיום hPSC על ידי הפשרת בקבוק אחד של תוסף hPSC בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. לאחר ההפשרה, הוסף 10 מ"ל תוסף hPSC לבקבוק 500 מ"ל של מדיום בסיס hPSC.
  3. הכינו את הלוחות לאיסוף על ידי הסרת תמיסת VTN מבארות של פלטת 24 בארות והוספת מדיה hPSC של 0.5 מ"ל עם 0.5 מיקרוליטר Y-27632 (10 מיקרומום ממלאי 10 מילימטר) לכל באר.
  4. הביאו את הפלטה החדשה, את ה-6 בארות המכיל את התאים/המושבות המועברות, מחטי מזרק סטריליות, ופיפטה p200 וקצוות למיקרוסקופ ניתוח בתנאים סטריליים.
  5. הניחו את הפלטה המכילה את התאים המומרים והמושבות שנוצרו על מיקרוסקופ הניתוח והשתמשו במיקרוסקופ כדי לאתר מושבה אחת לבחירה. הרם את מכסה הפלטה כדי לחשוף את הבאר.
  6. פתח את המזרק באופן אספטי וחשוף את המחט. בהנחיית המיקרוסקופ, השתמש בקצה המחט כדי לנתק את המושבה מכל תאי ההזנה הסובבים על ידי מעקב אחר קווי המתאר של המושבה באמצעות המחט.
  7. השתמש בקצה המחט כדי לחתוך את המושבה לכמה חתיכות בגודל שווה. אם חתיכות המושבה עדיין לא נפרדו מהפלטה, השתמש בצד המחט כדי להוציא או לגרד אותן מהצלחת כך שהן צפות.
    אזהרה: השליכו את המחט במיכל החדות המתאים.
  8. עם ה-p200, השתמש במיקרוסקופ כדי להעביר את המושבה שנקטפה. שאפו את המושבה הצפה עם הפיפטה והעבירו לבאר של לוח 24 בארות מוכן. נסה להכניס את כל המושבה לבאר בלי לקבל מושבות או תאי הזנה נוספים.
  9. הנח את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו-20% O2.
  10. האכילו את המושבות שנבחרו ב-1 מ"ל מדיום hPSC מדי יום עד שהן מתאחדות.
    הערה: למושבות יש פוטנציאל להיות מובחנות גנטית זו מזו. כל באר בצלחת 24 בארות חייבת להכיל רק מושבה אחת שנקטפה. כל מושבה שנבחרו מקבלת מזהה ייחודי ומכאן והלאה מטופלת כקו תאים שונה מקולוניות אחרות שנבחרו בה. לסבב תכנות מחדש קפדני, בחר לפחות 24 מושבות והרחיב ואפיין לפחות 3.

8. הרחבה

  1. תחזוקת hPSC
    1. המושבות שנבחרו מוכנות להתפצל כאשר הן גדולות ועגולות עם קצוות זוהרים (איור 4A). מושבות נשברות למספר חלקים כשהן נקטפות. אם יש מספר מושבות בבאר אחת, חלקו אותן לפני שהן גדלו מספיק כדי ליצור קשר ולהתחיל להתבדל.
    2. הכינו פלטת 6 בארות מצופה VTN: עבור פלטת 6 בארות, יש להכין 12 מ"ל DPBS עם 120 מיקרו-ליטר VTN (5 מיקרוגרם/מ"ל ממלאי 500 מיקרוגרם/מ"ל) וחלוקה 1 מ"ל תמיסת VTN לבאר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. ניתן להחליף את תמיסת VTN ב-DPBS ולאחסן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 למשך חודש. בבארות שיחולקו ל-DPBS והחליפו ב-1 מ"ל hPSC בינוני.
    3. שואב את המדיה מהבאר כדי לפיצול, ואז שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל DPBS. שאיפת ה-DPBS והוספה בופר פירוק EDTA של 500 מיקרוליטר 0.5 מ״מ EDTA (מוכן ב-500 מ״ל DPBS עם 0.9 גרם NaCl וחיטוי מסנן)15. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 למשך 2 דקות, עד שהמושבות מתחילות להשתחרר, והתאים בתוך כל מושבה מתחילים להתעגל ולהתנתק זה מזה.
    4. הסר את הפלטה מהאינקובטור, שאיף את בופר הדיסוציאציה של EDTA. באמצעות פיפטת p1000, אספו את התאים עם מדיום hPSC של 1 מ"ל על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה עד שהמושבות מתנתקות לחלוטין ומפורקות מעט. העבר את 1 מ"ל של מדיום ותאים לבאר החדשה עם 6 בארות המכילה 1 מ"ל מדיום hPSC טרי. הפיצול הראשון הזה מתבצע ביחס פיצול של 1:1, וכל התאים מהלוח המקורי מועברים ללוח החדש.
    5. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו-20% O2. האכיל iPSCs מדי יום עד שהבאר מתאחדת ומוכנה להתפצל.
      הערה: מורפולוגיה לקויה של תאי גזע (איור 4B) יכולה להיות מפחיתה על ידי התאמת פרוטוקול הפיצול כגון פיצול מוקדם יותר, שימוש בזמן דגירה קצר יותר של EDTA, או התאמת יחס הפיצול.
    6. מרחיב לתבנית של 10 ס"מ.
      1. כאשר התאים מתאחדים בכל באר של לוחות 6 בארות, יש לצפות צלחת בגודל 10 ס"מ ב-VTN (7 מ"ל DPBS עם 70 מיקרו-ליטר VTN (5 מיקרוגרם/מ"ל ממלאי 500 מיקרוגרם/מ"ל), מודגר למשך שעה אחת ב-RT).
      2. פרוטוקול פיצול חוזר, הפעם מתרחב מבאר 6 לתבנית תרבית רקמה באורך 10 ס"מ (יחס פיצול 1:1). השתמש ב-7–10 מ"ל של hPSC בינוני לכל צלחת 10 ס"מ.
      3. לאחר שתאים בצלחת 10 ס"מ מתאחדים, יש לחזור על תהליך הפיצול הזה (passaging). בכל קטע, שימו לב למספר הקטע. יחס הפיצול תלוי במורפולוגיה ובצפיפות התא. יחס טיפוסי הוא 1:10, כאשר עשירית התאים מהפלטה המקורית מועברת לפלטה החדשה.
  2. הקפאות והכנות למלאי
    1. לאחר כ-3 מעברים, הרחיב לארבע מנות תרבית רקמה בגודל 10 ס"מ למלאי המעבר המוקדם. ברגע שתאים בצלחות בגודל 10 ס"מ מתאחדים, הם מוכנים להקפאה.
    2. הכינו קריוביאלים והניחו אותם במקפיא לקרירות. ודא שהתווית כוללת את קו התא, השיבוט, מספר המעבר ותאריך ההקפאה.
    3. הכינו חומר הקפאה: 90% hPSC בינוני ו-10% DMSO, תצטרכו 1 מ"ל לבקבוקון (3 בקבוקים קפואים לכל צלחת של 10 ס"מ).
    4. בצע פרוטוקול פיצול כרגיל, באמצעות בופר דיסוציאציה EDTA של 4 מ"ל 0.5 מ"מ לכל צלחת 10 ס"מ.
    5. לאחר הדגירה של EDTA, שאפו EDTA. הוסיפו בעדינות 10 מ"ל מדיום hPSC למנה.
    6. שטפו בעדינות את התאים מהכלי על ידי פיפטינג של המדיה. התאים ייצאו בקלות מרצפת הצלחת ויתערבבו במדיה. פיפטה רק 2–5 פעמים כדי לפרק בעדינות מושבות ולמנוע דיסוציאציה לתאים בודדים.
    7. צנטריפוגה ל-5 דקות בעוצמה של 200 x g ב-RT. שואף את הסופרנטנט והחזיר את כדור התא למדיום קפוא.
    8. בידוד והקפא מיד בטמפרטורה של -80°C. העבר את הבקבוקים הקפואים למיכל החנקן הנוזלי לאחסון ארוך טווח.
    9. הקפיאו עוד מניות באותו אופן לאחר שהאפיון הושלם.

9. אפיון של iPSCs:

  1. ביטוי של סימני גבעול. לאחר הרחבה של לפחות 10 מעברים, כאשר מושבות ב-24 בארות מוכנות לפיצול, יש לקבע עם 4% פאראפורמלדהיד ולצבוע באמצעות אימונוהיסטוכימיה לסמן הגבעול NANOG. יידרשו לפחות 10 מעברים עד שהמושבות יהיו שליליות ל-Sendai Virus (SeV), שניתן לאשר זאת באמצעות אימונופלואורסצנציה (איור 4C).
  2. בדיקת יכולת פלוריפוטנטיות: שלוש הבחנות שכבת נבט. פלוריפוטנטיות iPSC מאושרת על ידי התמיינות מוצלחת לכל אחת משלוש שכבות הנבט. כל התבגרות מתחילה מצלחת מתכופפת בקוטר 10 ס"מ המציגה מורפולוגיית hPSC טובה (איור 4A).
    1. אקטודרם16
      1. היום שלפני תחילת ההתמיינות (יום 1): זרעי iPSC על לוחות מצופים מטריצה של 24 בארות בצפיפות של 2.6 × 105 תאים/ס"מ 2 במדיום hPSC עם Y-27632 (ריכוז סופי של 10 מיקרומון) ו-XAV-939 (ריכוז סופי של 2 מיקרומון).
      2. יום 0–יום 1: האכלה עם בסיס התמיינות של 1 מ"ל/באר עם LDN (ריכוז סופי של 100 ננומטר), SB (ריכוז סופי של 10 מיקרומון), ו-XAV (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר).
      3. יום 2–יום 7: האכלה עם בסיס התמיינות של 1 מ"ל/באר עם LDN (ריכוז סופי של 100 ננומטר) ו-SB (ריכוז סופי של 10 מיקרומון). מ-d3, להאכיל כל יומיים.
      4. יום 8: תיקון עם 4% פאראפורמלדהיד וצביעה על ידי אימונוהיסטוכימיה לסמן האקטודרם PAX617 ואישור אובדן הסמן הרב-פוטנטי NANOG (איור 4D).
    2. מזודרם18:
      1. היום שלפני תחילת ההתמיינות (יום -1): זרעי iPSC על לוחות מצופים מטריצה של 24 בארות בצפיפות של 2.5 × 105 תאים/סמ"ר בתווך hPSC עם Y-27632 (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר).
      2. יום 0: האכלה עם DMEM/F12 עם חומצה אסקורבית L-(ריכוז סופי של 64 מיקרוגרם/מ"ל), נתרן סלניט (ריכוז סופי של 13.6 ננוגרם/מ"ל), הולוטרנספרין (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל), ריכוז שומנים מוגדר כימית (100x), ו-CHIR (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר).
      3. יום 1: האכלה עם DMEM/F12 עם חומצה L-אסקורבית (ריכוז סופי של 64 מיקרוגרם/מ"ל), נתרן סלניט (ריכוז סופי של 13.6 ננוגרם/מ"ל), הולוטרנספרין (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל), ריכוז ליפידים מוגדר כימית (100x), והפארין (ריכוז סופי 0.6 U/mL).
      4. יום 2: תיקון עם 4% פאראפורמלדהיד וצביעה על ידי איממונוהיסטוכימיה עבור BRACHYURY-T19 ואישור אובדן הסמן הרב-פוטנטי NANOG (איור 4E).
    3. אנדודרם20
      1. היום שלפני תחילת ההתמיינות (יום -1): זרעי iPSC על לוחות מצופים מטריצה עם 24 בארות בצפיפות של 1.0 × 105 תאים/סמ"ר רבוע במדיום hPSC עם Y-27632 (ריכוז סופי של 10 מיקרומון).
      2. יום 0–יום 4: על d0, שטוף עם DPBS והאכיל עם RPMI עם תחליף L-גלוטמין (100x), FBS (ריכוז סופי של 0.5%) ואקטיבין A (ריכוז סופי של 100 ng/mL). מ-d0, תזין מדי יום עם אותה מדיה.
      3. יום 5: תיקון עם 4% פאראפורמלדהיד וצביעה באמצעות אימונוהיסטוכימיה לסמן האנדודרם SOX1721 ואישור אובדן הסמן הרב-פוטנטי NANOG (איור 4F).
        הערה: ההבדלים נעשו בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר. לפי ניסינו, ציפויי מטריצה יכולים להיות ניתנים להחלפה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצלחת הפרוטוקול הזה ניתנת למעקב בשלבים שונים. טבלה 1 מציגה סיכום של דגימות שעליהן בוצע פרוטוקול זה. דגימות התחלתיות, שהן או שכבות באפי שמורות בקירור שנשמרו לשבוע או PBMCs שמורות בקריופ, שיש להן דגימה איכותית בעת הפשרה ומראה מורפולוגי מובחן לאחר התפשטות התא שהתכנתו מחדש בהצלחה 6/7 פעמים (טבלה 1, קטגוריה 1). שתי דגימות נוספות של באפי, שנאספו ואוחסנו בתנאים דומים, הציגו איכות ומורפולוגיה דומות, אך נלקחו להקמת בדיקות אחרות במקום לתכנות מחדש. חלופה נוספת היא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לטכנולוגיית iPSC יש פוטנציאל עצום בתחום הביו-רפואי בכל הנוגע לגילוי מנגנוני מחלה, רפואה מותאמת אישית ו"ניסויים קליניים במנה" 22,23. פרוטוקולים יעילים וגמישים לתכנות מחדש של iPSC מדגימות דם הם מפתח למימוש הפוטנציאל הגדול של טכנולוגיית iPSC, שכן הם קלים לאסוף ולעיתים זמינים בקלות בבנקים ביולוגיים. למרות שישנם פרוטוקולים רבים שפורסמו המפרטים תכנות מחדש מ-PBMCs מזוהרים, פרוטוקול זה מפרט תכנות מחדש מדגימות דם פחות מזוהרות, כלומר שכבות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מצהירים כי המחקר בוצע ללא קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להיחשב כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נבדקים אנושיים גויסו וקיבלו הסכמה מדעת לתרומת דם בהתאם לפרוטוקול IRB UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659, ו-Emory# 000002114. המחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר 5T32GM142623 ל-J. Art, R01MH115174 ל-V. Michopoulos, ו-R01NS114567 ל-N. Zeltner. התוכן נמצא באחריות המחברים בלבד ואינו בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מנות תרבית רקמה סטנדרטיות בגודל 10 ס"מפלקון353003
12 לוחות בארפלקון353043
צינורות חרוטיים בקוטר 15 מ"לפישר7200886
24 לוחות בארקורנינג7200740
4% תמיסת פאראפורמלדהידתרמו-סיינטיפיקJ19943-K2
6 לוחות בארפישר סיינטיפיקFB012927
accuSpin1Rפישר סיינטיפיק75003449
אקטיבין Aביוטכניקה338-AC
AF488-donkey & alpha; עזInvitrogenA11055
AF555-donkey & alpha; RBTInvitrogenA31572
AF647-donkey & alpha; mInvitrogenA31571
AF647-donkey & alpha; RBTInvitrogenA31573
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X)פישר15 240 096 
פיפטים סרולוגיים פוליסטירן מבאסיקפישר14955233
14955234
14955235
14955236
מזרקי BD טוברקוליןפישר14-826-87
צינורות הכנת תאים מונוגראליים מזכוכית BD Vacutaine (CPT)פישר סיינטיפיק02-685-125צינורות איסוף דם מבודדים ב-PBMC
BD  צינורות איסוף דם מפלסטיק Vacutainer עם K2EDTA: סגירת המוגארדפישר סיינטיפיק02-657-32צינורות איסוף דם מצופים נוגדי קרישה
B-מרקפטואנולפישר21 985 023 
ג'לטין בקרסיגמאG1393
עז פוליקלונלית בראכיורי-T IgGR& DAF2085
סלדרופ BFדנוביקססלדרופ BF
צנטריפוגה 5702אפנדורףEP022628102-1EA
ריכוז שומנים מוגדר כימיתפישרNC9022744
צ'יר 99021 R& D4423
חממת CO2סניוMCO-20AIC
מערכת אחסון הקפאהמערכות ביוגניות מותאמות אישיתV-1500AB
CryoStor CS10טכנולוגיות תאי גזע100-1061מדיום הקפאה חלופי
ערכת תכנות מחדש של CytoTune-iPS 2.0 SendaiפישרA16517
דקסמתזוןסיגמאD2915
DMEMפישר11965118
DMEM/F12פישר11330057
DMSOפישרBP231-1
DPBS 1X ללא CA MG פישרMT21031CM
EDTAפישרAM9262
אריתרופואיטין (EPO)ביו-טכנה287-TC-500
Essential 6 בינוני (E6)פישרA1516401בסיס התמיינות 
Essential 8 בינוני (E8)פישרA1517001מדיום בסיסי hPSC
מיקרוסקופ EVOS FLתרמוAMF4300
סרום בקר עובריVWR45000-734
בסיס FGF (FGF2)ביוטכניקה233-FB/CF 
ג'לטרקספישרA1413202ציפוי מטריצה
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות Gibco MEM (100X)פישר11140050
גלוטמקספישר35050061תחליף L-גלוטמין  
הפאריןטכנולוגיות תאי גזע7980
Histopaque 1077סיגמא10771פתרון גרדיאנט צפיפות 1 
הולוטרנספריןסיגמאT0665
גורם תאי גזע אנושיים (SCF)פפרוטק300-07-100UG
אינסולין דומה לגורם גדילה 1 (IGF1)פפרוטק100-11-100UG
אינטרלוקין-3 (IL-3)פפרוטק200-03-2UG
אמבט מים בטמפרטורה 210פישר סיינטיפיק210
תחליף סרום נוקאאוט (KSR)פישר10828028תוסף חינם ל-FBS 
חומצה L-אסקורביתסיגמאA4544-100G
LDN193189סטמגנט04-0074
L-גלוטמיןפישר25030081
לימפופרפטכנולוגיות תאי גזע7801פתרון גרדיאנט צפיפות 2
מטריג'לקורנינגCB-40234ציפוי מטריצה
פיברובלסטים עובריים בעכברפישרA34964 
עז פוליקלונלית Nanog IgGR& DAF1997-SP
ביובנקאות Nunc וצינורות קריוגניים לתרבות תאיםפישר סיינטיפיק12-565-163N
פניצילין/סטרפטומיציןפישר15140122
IgG פוליקלונלי של ארנב אנטי-Pax-6 אנטי-פקס-6 מטוהרביולג'נד901301
QBSF-60 מדיום ללא סרוםאיכות ביולוגית160-204-101בסיס EM
מדיום הקפאת תרבית תאים לשחזורתרמו פישר סיינטיפיק12648010מדיום הקפאה חלופי
rhVitronectin (VTN)פישרA31804
RPMI 1640 בינוניפישר11875093
SB431542R& D1614
נגיף סנדאי HN נוגדן מונוקלונלי בעכבר IgG2aInvitrogen14649482
סודיום סלניטסיגמאS5261
עז פוליקלונלית נוגדן Sox17 IgGR& Daf1924
תוסף התרחבות Erythroid של StemSpanטכנולוגיות תאי גזע2692תוספת למדיה הרחבה מסחרית חלופית
מדיום StemSpan SFEM IIטכנולוגיות תאי גזע9605מדיום התרחבות מסחרי חלופי
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדתרמו פישר סיינטיפיקTSX60086A
טיפים אוניברסליים לפיפטה - מסונןVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939ביוטכניקה3748/10
Y-27632 דיהידרוכלורידביוג'מס1293823

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources utilized for the efficient generation of induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 17 (6), 1954-1974 (2021).
  3. Raab, S., Klingenstein, M., Liebau, S., Linta, L. A comparative view on human somatic cell sources for ipsc generation. Stem Cells Int. 2014, 768391(2014).
  4. Sauer, V., et al. Human urinary epithelial cells as a source of engraftable hepatocyte-like cells using stem cell technology. Cell Transplant. 25 (12), 2221-2243 (2016).
  5. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
  6. Quirynen, M., Siawasch, S. aM., Yu, J., Miron, R. J. Essential principles for blood centrifugation. Periodontol 2000. 97 (1), 43-51 (2025).
  7. Perry, J. N., Jasim, A., Hojat, A., Yong, W. H. Procurement, storage, and use of blood in biobanks. Methods Mol Biol. 1897, 89-97 (2019).
  8. Meraviglia, V., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids. J Vis Exp. (100), e52885(2015).
  9. Yang, W., et al. iPSC reprogramming from human peripheral blood using Sendai Virus mediated gene transfer. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  10. Cerneckis, J., Cai, H., Shi, Y. Induced pluripotent stem cells (ipscs): Molecular mechanisms of induction and applications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 112(2024).
  11. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  12. guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy. , World Health Organization. Geneva. (2010).
  13. Robb, L. Cytokine receptors and hematopoietic differentiation. Oncogene. 26 (47), 6715-6723 (2007).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3 B 1-A3 B 3 (2015).
  15. Chen, G. Splitting hESC/hiPSC lines with EDTA in feeder free conditions. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  16. Zeltner, N., Lafaille, F. G., Fattahi, F., Studer, L. Feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (87), e51609(2014).
  17. Zhang, X., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7 (1), 90-100 (2010).
  18. Lin, Y., Zou, J. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in fully chemically defined conditions. STAR Protoc. 1 (1), (2020).
  19. Technau, U. Brachyury, the blastopore and the evolution of the mesoderm. Bioessays. 23 (9), 788-794 (2001).
  20. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a psc-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  21. Kanai-Azuma, M., et al. Depletion of definitive gut endoderm in sox17-null mutant mice. Development. 129 (10), 2367-2379 (2002).
  22. Kirkeby, A., Main, H., Carpenter, M. Pluripotent stem-cell-derived therapies in clinical trial: A 2025 update. Cell Stem Cell. 32 (1), 10-37 (2025).
  23. Verma, I., Seshagiri, P. B. Current applications of human pluripotent stem cells in neuroscience research and cell transplantation therapy for neurological disorders. Stem Cell Rev Rep. 21 (4), 964-987 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Buffy CoatPBMCNANOG

מאמרים קשורים