מאמר שיטה

בידוד ויישום טיפולי של וזיקולות חוץ-תאיות שמקורן באגרגטים של תאי גזע מזנכימליים מורכבים בעצמם

DOI:

10.3791/70534

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד היעיל של וזיקולות חוץ-תאיות גדולות (LEVs) מאגרגטים של תאי גזע מורכבים בעצמם ואת יישומן הטיפולי להתחדשות עצם לסת התחתונה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) הן מתווכים חיוניים לתקשורת בין-תאית וסוכנים מבטיחים ללא תאים לרפואה רגנרטיבית. מבין תת-האוכלוסיות של EV, ווסיקולות חוץ-תאיות גדולות (LEVs) מתאימות במיוחד לתיקון רקמות בזכות המטען הפרו-רגנרטיבי העשיר שלהן. עם זאת, שיטות סטנדרטיות וניתנות לשחזור ליצירת LEVs תפקודיים שמקורם בתאי גזע דנטליים לצורך אפיון והערכה טיפולית בהמשך עדיין מוגבלות. בניצול הפוטנציאל האוסטוגני יוצא הדופן של תאי גזע מהפפילה האפיקלית (SCAPs), פיתחנו מודל תרבית תלת-ממדי בתנאי הידבקות נמוכה ליצירת אגרגטים SCAP מורכבים בעצמם. מודל זה מחקה עיבוי מזנכימלי פיזיולוגי, משפר משמעותית את האינטראקציות בין תאים ומגביר את הפרשת LEV. פרמטרים מרכזיים של תרבית והערות טיפול מסופקים לשיפור עקביות האגרגטיבית ולמקסום תפוקת LEV תוך שמירה על חיוניות התא. כאן אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי לייצור יעיל של LEVs פונקציונליים שמקורם ב-SCAP, הכולל יצירת אגרגט תלת-ממדית, בידוד באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית, ניתוח מעקב אחר חלקיקים ננו-חלקיקים (NTA), וניתוח התפלגות וריכוז של חלקיקים על בסיס NTA, והעברה טיפולית באמצעות הידרוג'ל משולב תרמית לתיקון פגמים בעצם הלסת התחתונה. גישה זו מייעלת את ייצור ה-LEV למחקרים מכניים במורד הזרם ולהערכה פרה-קלינית בהתחדשות קרניופציאלית. תהליך עבודה אופטימלי זה מבטיח הכנה שחזורית של LEVs ביואקטיביים עם תפוקות עקביות ומטען פרו-אוסטאוגני מועשר, ומסייע במחקר יסודי ומאיץ את התרגום הקליני של שחזור קרניופציאלי בתיווך EV. ביישומים מייצגים, LEVs טעונים בהידרוג'ל מספקים מחסן מקומי באתרי פגמים ומאפשרים טיפול נוח במהלך ההשתלה. ביחד, שיטה זו מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה להכנת LEVs שמקורם ב-SCAP ומדגישה שיקולים מרכזיים לדיווח סטנדרטי ולעיצוב מחקר תרגומי. גישה זו תומכת באימוץ רחב יותר במעבדות חשמליות קרניופציאליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים הקשורים לממברנה המשתחררים על ידי תאים, המתווכים תקשורת בין-תאית באמצעות העברת מטענים ביואקטיביים כגון חלבונים, miRNA וליפידים 1,2,3. מבין תת-האוכלוסיות של EV, וזיקולות חוץ-תאיות גדולות (LEVs) ייחודיות בשחרורן הישיר מממברנת התא ובהעשרת מולקולות פרו-רגנרטיביות, מה שהופך אותן למתאימות במיוחד לתיקון רקמותודרישות רגנרציה 4,5. ברפואה רגנרטיבית, EVs שמקורם בתאי גזע מזנכימיים (MSCs) מוכרים יותר ויותר כאלטרנטיבה בת קיימא ללא תאים לטיפול תאי שלם 6,7,8. הם מסכמים את ההשפעות הרגנרטיביות הפרקריניות של MSCs הוריים, תוך הימנעות ממגבלות של השתלת תאים ישירה, כגון יעילות השתלה נמוכה, אימוגניות ושונות אצווה 7,8,9,10. מבין מקורות MSC, תאי גזע מהפפילה האפיקלית (SCAPs) מציגים פוטנציאל התמיינות אוסטאוגני ואודונטוגני מעולה 11,12,13, מה שהופך את ה-EVs שמקורם ב-SCAP לאטרקטיביים במיוחד לתיקון עצם ורקמת שיניים אורופציאלית 8.

ראוי לציין כי הביוגנזה והפונקציונליות של EVs מושפעות עמוקות מהמיקרו-סביבה התאית14,15. תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות קונבנציונליות (2D) סוטות משמעותית מההקשר הרקמתי הטבעי16,17, ולעיתים קרובות מניבות EVs עם יכולת רגנרציה פגועה18. לעומת זאת, אגרגטים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של MSC המורכבים בעצמם משכפלים היבטים מרכזיים של עיבוי מזנכימי פיזיולוגי, שלב התפתחותי המאופיין בצפיפות תאים גבוהה, מגע אינטנסיבי בין תאים, ומטריקס חוץ-תאי מועשר (ECM), המספק תמיכה מבנית ומספק רמזים ביוכימיים ומכניים המווסתים את ההיצמדות, ההגירה והחלטות הגורל של התא 19,20,21. מיקרו-סביבה תלת-ממדית ביוממטית זו לא רק משפרת את התקשורת הבין-תאית ואת איתות הפרקריני22,23, אלא גם מקדמת הפרשת EVs עם תפוקה גבוהה יותר ופרופילי מטען ביואקטיביים משופרים 24,25,26. שימוש באגרגטים MSC תלת-ממדיים מורכבים בעצמם מתגלה כאסטרטגיה מבטיחה מאוד להשגת רכבים חשמליים בעלי עוצמה פונקציונלית ליישומים רגנרטיביים18.

למרות היתרונות הברורים של רכבים חשמליים שמקורם באגרג, פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד ואפיון ממערכות תלת-ממד נותרו לא מפותחים. שיטות הבידוד הנוכחיות של רכבים חשמליים, כגון צנטריפוגה דיפרנציאלית, מבוססות היטב ומספקות מסגרת ניתנת להרחבה לייצור רכבים חשמליים27. באופן דומה, דווחו שיטות ליצירת אגרגטים של MSC, לעיתים התבססו על עיקול ואגרגציה תאי מונעים על ידי ויטמין C מתאי2D 28. עם זאת, ארכיטקטורת ה-ECM בתוך האגרגטים המונעים על ידי ויטמין C עשויה עדיין להיות שונה מהמיקרו-סביבה המאורגנת מרחבית, דמוית עיבוי, של רקמות מזנכימליות מקומיות. לעומת זאת, הרכבה עצמית ללא פיגום בתנאי הידבקות נמוכה מקלה על יצירת אגרגטים קומפקטיים וכדוריים המתקרבים לתכונות מרכזיות של עיבוי מזנכימלי19,29. נכון להיום, חסרה זרימת עבודה שיטתית וניתנת לשחזור לבידוד ויישום רכבים חשמליים מאגרגטים תלת-ממדיים SCAP בעלי הידבקות נמוכה כאלה. מבחינה מעשית, ייצור LEV מתרבויות SCAP דו-ממדיות קונבנציונליות בדרך כלל נמצא בטווח ~10 11 חלקיקים למיליטר לפי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA), ואגרגציה תלת-ממדית עם הידבקות נמוכה צפויה להגדיל את תפוקת ה-LEV פי כמה תוך שמירה על שחזוריות ליישומים במורד הזרם. כדי לטפל בפער זה, אנו מפרטים כאן פרוטוקול מקיף שמנצל את הפונקציונליות האוסטוגנית/אודונטוגנית הטבועה ב-SCAPs וממקסם את מיקרו-סביבת MSC באמצעות אגרגציה תלת-ממדית בעלת הידבקות נמוכה. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אמין של LEVs איכותיים, ומספק כלי סטנדרטי לקידום טיפולים רגנרטיביים ללא תאים ברפואה קרניופציאלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הצבאית הרפואית הרביעית ונערכו בהתאם להנחיות ARRIVE. איסוף ושימוש בדגימות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית (אישור מס' IRB-REV-2022187). התקבלה הסכמה בכתב מדעת מכל התורמים לפני איסוף הדגימות; עבור תורמים שהיו קטינים או שלא יכלו להעניק הסכמה, התקבלה הסכמה בכתב מדעת מהאפוטרופוסים החוקיים שלהם. כל התגובות היו מסוננות סטרילית, והליכי תרבית התאים בוצעו בארון בטיחות ביולוגית לשמירה על סטריליות (ראו טבלת חומרים). לטפל בכל החומרים שמקורם בבני אדם (שיניים, רקמות, תאים ראשוניים, מדיה מותאמת ותכשירים ל-EV) כחומר זיהום פוטנציאלי. בצע את כל ההליכים הכוללים דגימות אנושיות בארון בטיחות ביולוגית מוסמך באמצעות ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות והגנה לעיניים. לצורך בטיחות ביולוגית וסילוק פסולת, פעלו לפי הנחיות BSL-2 המוסדיות: לטפל בכל החומרים שמקורם בבני אדם ובכל החומרים החד-פעמיים המזוהמים כפסולת ביו-מסוכנת BSL-2; חטא משטחים/ציוד עם חומר חיטוי מאושר מוסדית לאחר השימוש. אספו פסולת ביולוגית נוזלית במכלים מסומנים ונטבו אותה בשיטות מאושרות לפני ההשלכה. השליכו את החריצים מיד במיכלים מאושרים (ללא מכסה מחדש). לטפל ברקמות/גופות בעלי חיים ובשאריות הרדמה/כימיות כפסולת ביולוגית/כימית מפוקחת ולהיפטר מהם באמצעות שירותים מוסדיים בהתאם לתקנות החלות.

1. בידוד ותרבות של SCAPs אנושיים

הערה: P/S הוא תערובת אנטיביוטיקה ביואקטיבית ועלולה לגרום לגירוי עור/עיניים או לתגובות אלרגיות. הידית בתוך ארון בטיחות ביולוגית BSL-2 בעת הפתיחה; ללבש כפפות והגנה על העיניים; להימנע מיצירת אירוסולים; ולהשליך פסולת בהתאם להנחיות הפסולת הכימית המוסדית. קולגנאז סוג I (תמיסה) הוא אנזים ביואקטיבי ועלול לגרום לגירוי בעור/עיניים או לתגובות אלרגיות. ידית בארון בטיחות ביולוגית BSL-2; ללבש כפפות והגנה על העיניים; להימנע מהתזות ויצירת אירוסולים במהלך פיפטינג; ולנקות דליפות במהירות בהתאם לנהלים מוסדיים. להגן על קולגנאז סוג I מאור במהלך אחסון ושימוש (ראו טבלת החומרים).

  1. אספו טוחנות שלישיות עם קצה לא בשלים מתורמים בריאים (16–21 שנים) ושוטפים היטב במי מלח עם בופר פוספט (PBS) המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) (ראו טבלת חומרים).
  2. נתח את רקמת הפפילה האפיקלית מהקצה השורש באמצעות פינצטה עינית סטרילית ומספריים, ואז קצוץ אותה לחתיכות קטנות (<1 מ"מ 3).
  3. העבר את כל שברי הרקמה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. לעכל את השברים עם 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג I בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת, עם ניעור עדין כל 15 דקות.
  4. עצרו את העיכול על ידי הוספת נפח שווה של מדיום חיוני שלם α-מינימום (α-MEM) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: זמן העיכול של קולגנאז סוג I אינו קבוע ותלוי במצב העיכול של הרקמות. יש לעקוב מקרוב, להפסיק את העיכול כאשר הרקמות נשחקות חלקית על ידי הוספת מדיום. עיכול יתר עלול לפגוע בחיוניות התאים.
  5. צנטריפוגה את מתלי התא ב-100 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, זרקו את הסופרנאנט, והחזירו את הכדור ל-2 מ"ל של α-MEM מלא.
  6. זורעים את תליית הרקמה המעכלת בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ והוסף 8 מ"ל של α-MEM מלא לנפח סופי של 10 מ"ל לכל צלחת.
  7. תרבות SCAP בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לחות עם 5% CO₂.
    הערה: יש לעקוב אחרי התרביות באופן רציף, התאים נודדים בדרך כלל מחלקי רקמה ונצמדים לצלחת בתבנית רדיאלית בתוך 3–7 ימים. אם חיוניות הרקמה לקויה או שלא נצפתה נדידת תאים בתוך 5 ימים, עברו ל-α-MEM מלא עם תוספת של 20% סרום.
  8. לצורך מעבר תאים, התאים נשטפו עם 5 מ"ל PBS כדי להסיר מדיום שאריתי לאחר שהגיעו ל-80–90% מפגש תאים. לאחר מכן, הם דוגרו עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-1 מ"מ EDTA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (ראו טבלת חומרים).
    הערה: טריפסין–EDTA הוא מגרה ועלול להזיק לעור/עיניים. יש לטפל בכפפות והגנה על העיניים, להימנע מהתזות ויצירת אירוסולים, ולשטוף מיד עם הרבה מים אם יש מגע. להשליך פסולת נוזלית המכילה טריפסין בהתאם להנחיות המוסדיות.
  9. כאשר תאים מעוגלים עם צמתים בין-תאיים מופרעים תחת מיקרוסקופ, יש לנתק בעדינות תאים מהצלחת מבלי להזיק לנזק מבני מופרז. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של α-MEM מלא.
  10. אסוף את התאים על ידי פיפטינג עדין וחוזר לתוך צינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל. לאחר הצנטריפוגה ב-100 × גרם למשך 5 דקות, יש להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את כדור התא למצב α-MEM מלא. זרעו את התאים שהוחזרו לתוך צלחות תרבית טריות או צלחות באר. החלף את המדיום כל יומיים.
    הערה: ודאו ש-SCAPs המשמשים לתרבות מצטברת נמצאים בסעיף 5. הגזע ויכולת ההצטברות יורדים עם עלייה במספרי המעבר30,31, מה שעשוי להפחית את יעילות הייצור הכולל ואת הביצועים הפונקציונליים.

2. הרכבה עצמית של אגרגטים של SCAP

  1. קציר 3–5 SCAPs באמצעות טריפסיניזציה, צנטריפוגה ב-100 × גרם למשך 5 דקות, והשעיה מחדש ב-α-MEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי מדולל EV (FBS) ו-1% P/S (ראו טבלת חומרים).
    הערה: הכינו FBS עם דליל חשמלי על ידי צנטריפוגה של FBS בטמפרטורה של 150,000 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה להסרת EVs וזיהומים נוספים32.
  2. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר וזרע 1 ×-10-5 תאים לכל באר בלוחות 24 בארות עם חיבור נמוך במיוחד. כוון את הנפח הבינוני ל-500 מיקרוליטר לבאר כדי לשמור על מצב מתלה.
  3. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 72 שעות, והחליפו את מדיום הגידול כל 48 שעות.
  4. עוקבים אחרי היווצרות האגרגטים מדי יום תחת מיקרוסקופ אופטי הפוך. איסוף רכבים חשמליים כאשר האגרגטים מגיעים לקוטר של 200–400 מיקרון ומציגים מבנה קומפקטי וחלק.
    הערה: הגדר "אצווה" ייצור אחד כ-LEVs המבודדים מהמדיום המותנה המאוחד שנאספו מאגרגטים של SCAP שנזרעו באותו יום מאותו מעבר תא ונשמרו בתנאי תרבית זהים בתוך חלון איסוף יחיד (72 שעות). עיבוד כל אצווה באופן עצמאי באמצעות צנטריפוגה. החליפו את מדיום הגידול לאחר 48 שעות לאחר הזריעה וממלאים באותו נפח של מדיום טרי. לייצור LEV, יש לאסוף מדיום מותאם ב-48 שעות ושוב ב-72 שעות לאחר הזריעה, ולאגד את המדיום שנקטף (0–48 שעות ו-48–72 שעות) כאצווה אחת. שמור על המדיום המבוקר המאוגד ב-4 מעלות צלזיוס ועבד אותו לבידוד LEV.

3. בידוד ואפיון של רכבים חשמליים מאגרגטים של SCAP

  1. צנטריפוגה דיפרנציאלית לבידוד LEVs גדולים
    1. אסוף את מדיום הגידול המכיל אגרגטים של SCAP לצינורות צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להסרת אגרגטים שלמים ופסולת תאים גדולה.
    3. העבר את הסופרנטנט לצינורות חדשים בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות טסיות ושברי תאים קטנים.
    4. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינורות חרוטיים סטריליים של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-16,800 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להוציא LEVs בכדורים.
      הערה: השתמש בצינורות קוניים של 1.5 מ"ל כדי לשפר את תפוקת ה-LEVs.
    5. להשליך את הסופרנאנט, להחזיר את הכדור ל-1 מ"ל של PBS סטרילי, ולהפעיל שוב צנטריפוגה ב-16,800 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור בזווית קבועה (תואם לצנטריפוגה סטנדרטית על שולחן) כדי לשחק את ה-LEVs.
    6. כוון את ההאטה/בלם למצב "איטי" או "נמוך" (בדרך כלל רמת בלמים 1 או 2) כדי למנוע השעיית כדור ה-LEV מחדש במהלך שלב ההאטה הסופי.
    7. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדור ה-LEV האחרון ב-50 מיקרוליטר של PBS סטרילי. השתמש במתלה מיד (בתוך 24 שעות) או שמור אותו ב-4 מעלות צלזיוס. הימנעו מהקפאה כדי למזער אובדן פעילות ביולוגית.
      הערה: יש להכין כ-80 בארות של אגרגטים כדי לקבל מספיק LEVs לניסויים טיפוסיים במורד הזרם. דגימות LEVs מומלצות לאפיון מיידי או לשימוש טיפולי במקום אחסון ארוך טווח. אם נדרש אחסון ארוך יותר, יש להעלות את מתלה ה-LEV (למשל, 5–10 מיקרוליטר לצינור) כדי למנוע תנודות טמפרטורה חוזרות ומחזורי הקפאה-הפשרה. הקפאה מהירה על קרח יבש ואחסון בטמפרטורה של −80°C לאחסון ממושך לטווח קצר (למשל, עד חודש עד 3 חודשים). הפשרה פעם על הקרח והשתמשו מיד. יש לשים לב שהקפאה עשויה להפחית פעילות ביולוגית ולשנות את התאוששות/התפלגות גודל החלקיקים; לכן, ככל האפשר, יש לבצע מחקרים פונקציונליים באמצעות LEVs שהוכנו לאחרונה. לצורך בקרת איכות לאחר האחסון, יש למדוד מחדש את ריכוז החלקיקים והתפלגות הגודל באמצעות NTA, ולהמשיך רק אם הערכים נשארים בטווח הקבלה שהוגדר מראש. בנוסף, בפרוטוקול זה, ריכוז חלקיקי NTA משמש כשיטת הכימות העיקרית כדי למנוע אובדן וזיקולות הקשורים לבדיקות מבוססות חלבון כמו BCA, ובכך למקסם את התפוקה ליישומים במורד הזרם.
  2. NTA לגודל וריכוז חלקיקים
    הערה: NTA מתבצע באמצעות מנתח מעקב ננו-חלקיקים זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) להערכת התפלגות הגודל וריכוז החלקיקים.
    1. דילל 1 מיקרוליטר של מתלה LEVs (מסעיף 3.1, שלב 6) ב-1,499 מיקרוליטר של PBS סטרילי בצינור קוני סטרילי בנפח 1.5 מ"ל וערבב היטב.
    2. הפעל את התוכנה התואמת ומלא את תא הדגימה ב-10 מ"ל מים אולטרה-טהורים. ודאו שמספר חלקיקי הרקע הוא < 10 לכל פריים כדי להבטיח שהמערכת נקייה (ראו טבלת חומרים).
    3. כייל את המכשיר עם תמיסה סטנדרטית מוכנה. הגדר את פרמטרי התוכנה ל: רגישות 70, תריס 70, מינימום אזור 5, ומינימום בהירות 20. בצע "AutoAlignment" כדי לוודא שהלייזר ממוקד. כוון את הדילול הסטנדרטי עד שמספר החלקיקים המוצגת בתוכנה הוא 50–400 (רצוי ~200) ואז הרץ את תוכנית הכיול.
      הערה: הכינו את התמיסה הסטנדרטית על ידי שיקום 1 מיקרול חרוזי כיול ב-1 מ"ל מים מזוקקים ליצירת תמיסה ראשונית. מדלל 100 מיקרוליטר מהתמיסה הראשית ב-25 מ"ל מים מזוקקים (דילול של 1:250,000) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
    4. שטוף את תא הדגימה ב-5 מ"ל מים מזוקקים לפני הניתוח.
    5. שטוף את התעלה ב-1 מ"ל מים מזוקקים וודא שמספר החלקיקים בממשק הזיהוי הוא <10.
    6. הזרקו 1 מ"ל מדגימת ה-LEVs המדוללת במהירות קבועה של 0.5 מ"ל לשנייה באמצעות מזרק סטרילי בנפח 1 מ"ל.
      אזהרה: שלוט ידנית במזרק כדי לשמור על מהירות הזרקה יציבה.
    7. בצע ניתוח חלקיקים ויצר דוחות. בתוכנה, צור מדידה חדשה ובחר מצב גודל/ריכוז. הגדר את הרכישה ל-3 הקלטות, 60 שניות להקלטה, ב-25 מעלות צלזיוס תוך שימוש באותם פרמטרי זיהוי כמו בשלב 3 (רגישות 70, תריס 70, מינימום אזור 5, מינימום בהירות 20).
    8. התחל באיסוף ואמת שמספר החלקיקים על המסך נשאר בטווח של 50–400 חלקיקים לפריים (רצוי ~200); אם מחוץ לטווח זה, עצור וכוון את דילול הדגימה, ואז חזור על שלב 6. לאחר הרכישה, יש לבצע את הניתוח כדי לקבל גודל ממוצע, גודל מצב, D10/D50/D90, וריכוז חלקיקים (חלקיקים/מ"ל). לאחר מכן ייצא את גרפי התוצאות וההתפלגות בגודל כ-.csv ו-.pdf (או פורמטים דו"חים שקולים) ושומרים את קובץ המדידה לשמירת רשומות.

4. יישום טיפולי של LEVs בגידול עצם לסת התחתונה

  1. הכנת הידרוג'ל טעון ב-LEV
    1. הכן את המלאי Pluronic F-127 (20% עם חשמל). הוסיפו אבקת פלורונית F-127 ל-PBS סטרילי לריכוז סופי של 20% (w/v) וערבבו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עד שהיא מומסת לחלוטין והומוגנית (ראו טבלת חומרים). שמור על התמיסה בטמפרטורה של 4°C לאורך כל ההכנה כדי למנוע ג'לציה מוקדמת.
      הערה: 20% (w/v) פלורוני F-127 נוזלי בטמפרטורה של 4°C ועוברת תרמוג'לציה בטמפרטורה ~20–25 °C (תלוי בצינור/חדר); הוא הופך לג'ל יציב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. טעינו LEV בתנאים קרים. צינורות קדם-קירור, קצות פיפטה וההידרוג'ל עד 4 מעלות צלזיוס. ערבב LEVs של 50 מיקרוגרם (שווה ערך ל-LEVs משני לוחות 24 בארים של אגרגטים) עם 1 מ״ל של 20% פלורוני F 127 באמצעות פיפטינג עדין ומערבולת קצרה במהירות נמוכה כדי להבטיח פיזור אחיד. שמרו על התערובת על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להשתלה.
    3. הנחיות לטיפול/שימוש (בשביל שחזוריות). בצע טעינה וטעינת מזרק/קצה במהירות על הקרח. אם התערובת מתחממת מעל ~20–25 מעלות צלזיוס, הצמיגות עולה וניתן להתחיל בג'לציה; במקרה כזה, יש לחזור ל-4 מעלות צלזיוס עד שהחומר יחזור לזרימה מלאה לפני השימוש. לאחר מיקום הפגם, יש לאפשר לג'לציה להתרחש במקום בטמפרטורת הגוף (37 מעלות צלזיוס).
  2. הקמת מודל הפגם בעצם לסת התחתונה של העכברים
    1. הרדמו עכברים בני 8 שבועות מסוג C57Bl/6 (זכרים או נקבות) באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של פנטוברביטל נתרן (50 מ"ג/ק"ג) (ראו טבלת חומרים).
      אזהרה: פנטוברביטל נתרן הוא חומר הרדמה/הרדמה חזק והוא רעיל לבני אדם אם מוזרק, נבלע או נשאף בטעות. הכינו ונתנו את הטיפול באמצעות שיטות בטיחות (אין להחזיר את הכיסוי; להשליך מיד למיכל הגזים), ללבוש כפפות והגנה על עיניים, להימנע ממגע עור, ולשמור/לתעד שימוש בהתאם למדיניות מוסדית מבוקרת סמים. אשר הרדמה תקינה בעכברים על ידי בדיקת היעדר רפלקס קרנית וללא משיכת גפה בעת צביטת כרית הרגל. מרחו משחה עינית מגן למניעת ייבוש בקרנית.
    2. לגלח את הפרווה מעל אזור הלסת התחתונה השמאלית ולחטא לסירוגין עם 10% פובידון-יוד ו-75% אתנול.
      זהירות: 75% אתנול דליק מאוד; השתמשו בו הרחק ממקורות ההצתה ודאגו לאוורור טוב. פובידון-יוד עלול לגרום לגירוי בעור/עיניים או לתגובות אלרגיות; לבשו כפפות, הימנעו ממגע עם עיניים/רירית, ונקו שפיכות במהירות.
    3. בצע חתך אורך של 1 ס"מ לאורך קצה הלסת התחתונה וחתך את הרקמות הרכות בצורה קהה כדי לחשוף את זווית הלסת התחתונה.
    4. ליצור פגם עצם עגול (בקוטר 2 מ"מ) באמצעות מקדחה דנטלית עם השקיה רציפה במלח כדי למנוע נזק תרמי (ראו טבלת חומרים).
      זהירות: יש לעקוב מקרוב אחר דימום תוך כירורג, לשלוט בדימום באמצעות כדורי כותנה קטנים לשמירה על שדה ניתוחי פנוי, ולהפחית את הסיכון לזיהום. הימנעו ממגע עם הרקמות הרכות הסובבות עם המקדחה כדי למנוע הסתבכות.
  3. השתלה של הידרוג'ל טעון ב-LEV
    1. טעינו את תערובת LEV-הידרוג'ל למזרק סטרילי והזרקו אותה לפגם העצם, כדי להבטיח מילוי מלא.
      הערה: הנח ~10 מיקרוגרם LEVs לכל עכבר. נדרשות שתי לוחות של 24 בארות של אגרגטים SCAP כדי לספק מספיק LEVs לניסוי עם n = 5 עכברים.
    2. לקבוצת הביקורת, יש להזריק נפח שווה של הידרוג'ל פלורוני F-127 ללא LEVs.
    3. תפרו את החתך עם 4-0 תפרים נספגים ונתנו משכך כאבים תת-עוריים (קרפרופן, 5 מ"ג/ק"ג) להקלה על כאב לאחר הניתוח (ראו טבלת חומרים).
      אזהרה: קרפרופן הוא NSAID פעיל תרופתית ועלול להיות מזיק אם מוזרק בטעות או אם הוא נוגע בעור/עיניים. לבשו כפפות, הימנעו מפציעות חדות, זרקו מחטים/מזרקים במיכל חדים, והשליכו תרופות לא בשימוש וחומרים מזוהמים בהתאם להליכי פסולת תרופתית מוסדיים.
    4. הניחו את העכברים על שמיכת חימום מחדש עד להחלמה מההרדמה, ואז העבירו לכלובים נפרדים עם גישה חופשית למזון ולמים.
      הערה: אין להשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם מחזירים את ההכרה המספקת לשמירה על שכיבת הסטרנל. החזר עכברים לדיור קבוצתי רק לאחר החלמה מלאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפי זרימת העבודה הניסויית, בוצעו בהצלחה שלבים מרכזיים כולל בידוד SCAP, יצירת אגרגטים, חילוץ LEVs והשתלה טיפולית (איור 1). טוחנות שלישיות קליניות שנפגעו מתורמים הציגו קצוות לא בשלים עם רקמת פפילה אפיקלית שלמה מחוברת סביב פתחי התעלה הפתוחה, מה שמאשר את מקור SCAP המתאים (איור 2A). בעת תרבית במבחנה, SCAPs בצורת ציר עם תהליכים תאיים רבים נדדו מרקמת הפפילה האפיקלית והפכו בהדרגה למפגש בתוך 3 ימים, ויצרו סידור אופייני דמוי מערב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העניין הגובר בטיפולים רגנרטיביים ללא תאים הציב את LEVs שמקורם בתאי גזע מזנכימיים כחלופות מבטיחות להשתלת תאים שלמים, בזכות יכולתם לספק מולקולות ביואקטיביות ללא הסיכונים הכרוכים בגישות מבוססות תאים. עם זאת, התרגום הקליני של טיפולים מבוססי LEV הוקשה בשל היעדר מערכות תרביות פיזיולוגיות רלוונטיות שיכולות לשמר ולשפר במלואן את תפקוד ה-LEV. תרביות מונו-שכבה דו-ממדיות קונבנציונליות שונות משמעותית מהמיקרו-סביבה הטבעית התומכת בתפקוד תאי גזע מזנכימיים ב-vivo, מה שמוביל ל-LEVs עם פוטנציאל רג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים מתוכנית המחקר והפיתוח הלאומית המרכזית של סין (2021YFA1100600), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82471011, 82401201), פרויקט המעבדה המרכזית לשיקום והתחדשות אוראלית ולסת (2024MS04), קרן הפוסט-דוקטורט של סין (BX20230485) ופרויקט תוכנית שיתוף הפעולה וההחלפה במעבדות של האוניברסיטה הצבאית הרביעית לרפואה (2024HB014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 מ"ל עם מחטBD300841הרדמה
צלחת תרבית תאים באורך 10 ס"מקורנינג353003תרבית תאים
צינור צנטריפוגה פוליסטירן 15 מ"לקורנינג352095תרבית תאים
75% חיטוי אתנולהאי שי האי נואוHS-750תפעול
תפר נספג 4-0ג'ינחואן מדיקלR413תפעול
צנטריפוגה על ספסלויגנסCE187בידוד רכבים חשמליים
חממת CO2, 150 ליטר, סוג אוניברסליתרמופישר51032874תרבית תאים
קולגנאז סוג Iתרמופישר17100017תרבית תאים
כדורי כותנהדה-רויאל30-033תפעול
מספריים עם פעולה מעוקלתJZ Surgical InstrumentJ21040תפעול
יחידת טורבינה ניידת דנטליתKaVoS609Cתפעול
איזון אלקטרוניג'י קהZK-DSTתרבית תאים
צינור אפנדורףאפנדורף3810Xבידוד רכבים חשמליים
מלקחיים, בסדרJZ Surgical InstrumentJD1020תפעול
קרם להסרת שיערVeet1.00097E+11תפעול
כדור מהיר בורדנטספלי סירונהE0123תפעול
ידית מהירהKaVoKV-1-008-1644תפעול
מיקרוסקופ הפוךMshotMF53-Nתרבית תאים
MEM & alpha; (מדיום חיוני מינימלי &אלפא;)תרמופישר12561056תרבית תאים
מיקרוסקופ וידאו למעקב ננו-חלקיקים PMX-120מטריקס חלקיקיםZetaView PMX120ניתוח מעקב ננו-חלקיקים
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)תרמופישר15140122תרבית תאים
פנטוברביטל נתרןסיגמא-אלדריץ'57-33-0הרדמה
מלח ממוגן בפוספט (PBS)תרמופישר10010023תרבית תאים
פלורוניק F-127סיגמא-אלדריץ'P2443השתלת EV
תמיסת יוד פובידוןBaxter PROSL500תפעול
סרום בקר עוברי מיוחד (FBS)תרמופישר12664025תרבית תאים
בלוק גזה סטריליניצחון10-000-681תפעול
מיקרו צנטריפוגה מהירה לשולחןהיטאצ'יCT15Eבידוד רכבים חשמליים
מקדח טרפיןמיקרופוקסציה של ביומט01-9182תפעול
טריפסין-אדטהתרמופישר25200072תרבית תאים
פלטת 24 בארות עם חיבור נמוך במיוחדקורנינג3473תרבית תאים
מערבל מיקסר ג'יניתעשיות מדעיותSI0425השתלת EV

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mesenchymal Stem CellsLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

מאמרים קשורים