מאמר שיטה

בידוד ויישום טיפולי של וזיקולות חוץ-תאיות שמקורן באגרגטים של תאי גזע מזנכימליים מורכבים בעצמם

DOI:

10.3791/70534

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד היעיל של וזיקולות חוץ-תאיות גדולות (LEVs) מאגרגטים של תאי גזע מורכבים בעצמם ואת יישומן הטיפולי להתחדשות עצם לסת התחתונה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) הן מתווכים חיוניים לתקשורת בין-תאית וסוכנים מבטיחים ללא תאים לרפואה רגנרטיבית. מבין תת-האוכלוסיות של EV, ווסיקולות חוץ-תאיות גדולות (LEVs) מתאימות במיוחד לתיקון רקמות בזכות המטען הפרו-רגנרטיבי העשיר שלהן. עם זאת, שיטות סטנדרטיות וניתנות לשחזור ליצירת LEVs תפקודיים שמקורם בתאי גזע דנטליים לצורך אפיון והערכה טיפולית בהמשך עדיין מוגבלות. בניצול הפוטנציאל האוסטוגני יוצא הדופן של תאי גזע מהפפילה האפיקלית (SCAPs), פיתחנו מודל תרבית תלת-ממדי בתנאי הידבקות נמוכה ליצירת אגרגטים SCAP מורכבים בעצמם. מודל זה מחקה עיבוי מזנכימלי פיזיולוגי, משפר משמעותית את האינטראקציות בין תאים ומגביר את הפרשת LEV. פרמטרים מרכזיים של תרבית והערות טיפול מסופקים לשיפור עקביות האגרגטיבית ולמקסום תפוקת LEV תוך שמירה על חיוניות התא. כאן אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי לייצור יעיל של LEVs פונקציונליים שמקורם ב-SCAP, הכולל יצירת אגרגט תלת-ממדית, בידוד באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית, ניתוח מעקב אחר חלקיקים ננו-חלקיקים (NTA), וניתוח התפלגות וריכוז של חלקיקים על בסיס NTA, והעברה טיפולית באמצעות הידרוג'ל משולב תרמית לתיקון פגמים בעצם הלסת התחתונה. גישה זו מייעלת את ייצור ה-LEV למחקרים מכניים במורד הזרם ולהערכה פרה-קלינית בהתחדשות קרניופציאלית. תהליך עבודה אופטימלי זה מבטיח הכנה שחזורית של LEVs ביואקטיביים עם תפוקות עקביות ומטען פרו-אוסטאוגני מועשר, ומסייע במחקר יסודי ומאיץ את התרגום הקליני של שחזור קרניופציאלי בתיווך EV. ביישומים מייצגים, LEVs טעונים בהידרוג'ל מספקים מחסן מקומי באתרי פגמים ומאפשרים טיפול נוח במהלך ההשתלה. ביחד, שיטה זו מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה להכנת LEVs שמקורם ב-SCAP ומדגישה שיקולים מרכזיים לדיווח סטנדרטי ולעיצוב מחקר תרגומי. גישה זו תומכת באימוץ רחב יותר במעבדות חשמליות קרניופציאליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזיקולות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-חלקיקים הקשורים לממברנה המשתחררים על ידי תאים, המתווכים תקשורת בין-תאית באמצעות העברת מטענים ביואקטיביים כגון חלבונים, miRNA וליפידים 1,2,3. מבין תת-האוכלוסיות של EV, וזיקולות חוץ-תאיות גדולות (LEVs) ייחודיות בשחרורן הישיר מממברנת התא ובהעשרת מולקולות פרו-רגנרטיביות, מה שהופך אותן למתאימות במיוחד לתיקון רקמותודרישות רגנרציה 4,5. ברפואה רגנרטיבית, EVs שמקורם בתאי גזע מזנכימיים (MSCs) מוכרים יותר ויותר כאלטרנטיבה בת קיימא ללא תאים ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הצבאית הרפואית הרביעית ונערכו בהתאם להנחיות ARRIVE. איסוף ושימוש בדגימות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית (אישור מס' IRB-REV-2022187). התקבלה הסכמה בכתב מדעת מכל התורמים לפני איסוף הדגימות; עבור תורמים שהיו קטינים או שלא יכלו להעניק הסכמה, התקבלה הסכמה בכתב מדעת מהאפוטרופוסים החוקיים שלהם. כל התגובות היו מסוננות סטרילית, והליכי תרבית התאים בוצעו בארון בטיחות ביולוגית לשמירה על סטריליות (ראו טבלת חומרים). לטפל בכל החומרים שמקורם בבני אדם (שיניים, רקמות, תאים ראשוניים, מדיה מותאמת ותכשירים ל-EV) כחומר ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפי זרימת העבודה הניסויית, בוצעו בהצלחה שלבים מרכזיים כולל בידוד SCAP, יצירת אגרגטים, חילוץ LEVs והשתלה טיפולית (איור 1). טוחנות שלישיות קליניות שנפגעו מתורמים הציגו קצוות לא בשלים עם רקמת פפילה אפיקלית שלמה מחוברת סביב פתחי התעלה הפתוחה, מה שמאשר את מקור SCAP המתאים (איור 2A). בעת תרבית במבחנה, SCAPs בצורת ציר עם תהליכים תאיים רבים נדדו מרקמת הפפילה האפיקלית והפכו בהדרגה למפגש בתוך 3 ימים, ויצרו סידור אופייני דמוי מערב.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העניין הגובר בטיפולים רגנרטיביים ללא תאים הציב את LEVs שמקורם בתאי גזע מזנכימיים כחלופות מבטיחות להשתלת תאים שלמים, בזכות יכולתם לספק מולקולות ביואקטיביות ללא הסיכונים הכרוכים בגישות מבוססות תאים. עם זאת, התרגום הקליני של טיפולים מבוססי LEV הוקשה בשל היעדר מערכות תרביות פיזיולוגיות רלוונטיות שיכולות לשמר ולשפר במלואן את תפקוד ה-LEV. תרביות מונו-שכבה דו-ממדיות קונבנציונליות שונות משמעותית מהמיקרו-סביבה הטבעית התומכת בתפקוד תאי גזע מזנכימיים ב-vivo, מה שמוביל ל-LEVs עם פוטנציאל רג.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים מתוכנית המחקר והפיתוח הלאומית המרכזית של סין (2021YFA1100600), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82471011, 82401201), פרויקט המעבדה המרכזית לשיקום והתחדשות אוראלית ולסת (2024MS04), קרן הפוסט-דוקטורט של סין (BX20230485) ופרויקט תוכנית שיתוף הפעולה וההחלפה במעבדות של האוניברסיטה הצבאית הרביעית לרפואה (2024HB014).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק 1 מ"ל עם מחטBD300841הרדמה
צלחת תרבית תאים באורך 10 ס"מקורנינג353003תרבית תאים
צינור צנטריפוגה פוליסטירן 15 מ"לקורנינג352095תרבית תאים
75% חיטוי אתנולהאי שי האי נואוHS-750תפעול
תפר נספג 4-0ג'ינחואן מדיקלR413תפעול
צנטריפוגה על ספסלויגנסCE187בידוד רכבים חשמליים
חממת CO2, 150 ליטר, סוג אוניברסליתרמופישר51032874תרבית תאים
קולגנאז סוג Iתרמופישר17100017תרבית תאים
כדורי כותנהדה-רויאל30-033תפעול
מספריים עם פעולה מעוקלתJZ Surgical InstrumentJ21040תפעול
יחידת טורבינה ניידת דנטליתKaVoS609Cתפעול
איזון אלקטרוניג'י קהZK-DSTתרבית תאים
צינור אפנדורףאפנדורף3810Xבידוד רכבים חשמליים
מלקחיים, בסדרJZ Surgical InstrumentJD1020תפעול
קרם להסרת שיערVeet1.00097E+11תפעול
כדור מהיר בורדנטספלי סירונהE0123תפעול
ידית מהירהKaVoKV-1-008-1644תפעול
מיקרוסקופ הפוךMshotMF53-Nתרבית תאים
MEM & alpha; (מדיום חיוני מינימלי &אלפא;)תרמופישר12561056תרבית תאים
מיקרוסקופ וידאו למעקב ננו-חלקיקים PMX-120מטריקס חלקיקיםZetaView PMX120ניתוח מעקב ננו-חלקיקים
פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)תרמופישר15140122תרבית תאים
פנטוברביטל נתרןסיגמא-אלדריץ'57-33-0הרדמה
מלח ממוגן בפוספט (PBS)תרמופישר10010023תרבית תאים
פלורוניק F-127סיגמא-אלדריץ'P2443השתלת EV
תמיסת יוד פובידוןBaxter PROSL500תפעול
סרום בקר עוברי מיוחד (FBS)תרמופישר12664025תרבית תאים
בלוק גזה סטריליניצחון10-000-681תפעול
מיקרו צנטריפוגה מהירה לשולחןהיטאצ'יCT15Eבידוד רכבים חשמליים
מקדח טרפיןמיקרופוקסציה של ביומט01-9182תפעול
טריפסין-אדטהתרמופישר25200072תרבית תאים
פלטת 24 בארות עם חיבור נמוך במיוחדקורנינג3473תרבית תאים
מערבל מיקסר ג'יניתעשיות מדעיותSI0425השתלת EV

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mesenchymal Stem CellsLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

מאמרים קשורים