מאמר שיטה

מערכת נגד ברירה מבוססת רעלנים למחיקת גנים ללא סימן ומוטגנזה של טרנספוזון Tn5 בצפיפות גבוהה ב-Pectobacterium brasiliense

DOI:

10.3791/70567

⸱

9 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biocontrol, School of Agriculture and Biotechnology, Sun Yat-sen University, 2Potato Engineering ' Technology Research Center, Inner Mongolia University, 3Urumqi Experimental School, 4Department of Plant Pathology and Weed Research, Agricultural Research Organization-Volcani Institute, 5Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Vegetables and Flowers

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מחיקות גנים לא מסומנות ולבניית ספריות מוטנטים להחדרת Tn5 כלל-גנום ב-Pectobacterium brasiliense, פיטופתוגן האחראי לריקבון תפוחי אדמה שחורים וריקבון רך. גישה זו מאפשרת ניתוח גנטי הפוך יעיל ומקלה על אפיון פונקציונלי של גנים הקשורים לאלימות באורגניזם זה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pectobacterium brasiliense הוא חיידק פתוגני מאוד האחראי לריקבון רך של פקעות תפוחי אדמה, לריקבון רגליים שחורות ולריקבון גבעול אווירי. הבהרת המנגנונים הפתוגניים שלה חיונית לשליטה במחלות; עם זאת, הכלים הגנטיים לאורגניזם זה עדיין מוגבלים. פותחה מערכת נגד ברירה מבוססת רעלנים כדי לאפשר מחיקת גנים ללא סימנים ומוטגנזה של טרנספוזון Tn5 בצפיפות גבוהה. הרעלן vmi480 שמקורו בפלסמיד pLP12 שימש כסמן נגד סלקציה לבניית וקטור התאבדות pKV2. באמצעות מערכת זו, גן recA בזן ה-SM של P. brasiliense נמחק בהצלחה. מוטנט recA שנוצר שימש כזן הורי לבניית ספריית הכנסת Tn5 הכוללת מעל 12,000 מוטנטים באמצעות הצמדה עם זן העזר RHO3 הנושא pKV2-LLtnp. בפלסמיד הנגזר הזה, רעל vmi480 הוחלף בטרנספוזאז Tn5 היפראקטיבי תחת שליטה של פרומוטר לק הפונה החוצה כדי להפחית את ההשפעות הקוטביות. בדיקות חיסון פקעות בתפוקה גבוהה אפשרו זיהוי מוטנטים חסרי פתוגניות, כולל החדרות למערכת ההפרשה מסוג II, שהיא גורם מרכזי למניעת אלימות המתווך בהפרשת אנזימים המפרקים את דופן תאי הצמח. פלטפורמה זו תומכת בגנומיקה פונקציונלית ומקלה על חקירת מנגנוני אלימות בפתוגן חשוב כלכלית זה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. brasiliense הוא אחד המינים האגרסיביים ביותר בסוג Pectobacterium והוא הגורם הסיבתי לריקבון רך של תפוחי אדמה, ריקבון רגליים שחורות וריקבון גבעול אווירי1. מחלות אלו מובילות לאובדן יבול מוערך של 30% בתפוחי אדמה, גידול המדורג כמקור המזון השלישי בחשיבותו בעולם ומרכיב מרכזיבמערכת הייצור החקלאית של סין. למרות השפעתו הכלכלית, המנגנונים המולקולריים השולטים בפתוגניות של P. brasiliense נותרו לא מובנים מספיק, בעיקר בשל היעדר כלים יעילים וניתנים לשחזור גנטי עבור מין זה 3,4,5.

מחקרים גנומיים פונקציונליים בחיידקים פיטופתוגניים רבים מסתמכים על מערכות חילוף אלליות חזקות ומוטגנזה טרנספוזונית; עם זאת, כלים גנטיים דומים ל-P. brasiliense נותרו מוגבלים או לא יעילים. במיוחד, סימני נגד סלקציה יעילים התואמים למין זה נדירים. בעוד שגן sacB משמש באופן נרחב כסמן נגד סלקציה למחיקת גנים בחיידקים שונים, P. brasiliense עשוי להציג סבילות גבוהה עד 50% סוכרוז במהלך תהליך הבחירה5. סבירות זו ככל הנראה משקפת חוסר רגישות לרעלים, ייתכן בגלל המרה אנזימטית של סוכרוז לפולימרים של סוכר. יתרה מזאת, ריכוזי סוכרוז גבוהים עלולים לגרום לזעזוע אוסמוטימזיק 6. בנוסף, שיטות מוטגנזה יעילות בקנה מידה גדול, כמו בניית ספריית החדרת טרנספוזונים Tn5, טרם הוכחו היטב עבור אורגניזם זה.

כדי להתמודד עם מגבלות טכניות אלו, פותחה מערכת נגד ברירה מבוססת רעלנים, והוקם תהליך סינון טוטגנזה Tn5 חזק עבור P. brasiliense. בהשוואה לשיטות מסורתיות מבוססות סוכרוז, גישה מבוססת רעלנים זו מציעה יתרונות ברורים, כולל קפדנות בחירה, שיפור הספציפיות בזיהוי אירועי חפיפה כפולה, והסרת לחץ אוסמוטי מבלבל. מערכות דומות המבוססות על נוגד-רעלן vmi480 יושמו בהצלחה כדי להתגבר על מחסומי ברירה במין Vibrio 7. המתודולוגיה המבוססת רלוונטית מאוד לאפיון תפקודי מהיר של גנים לא ידועים ומספקת פלטפורמה גמישה שניתן להתאים לפקטובקטריאקיאה רכה קשורה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת מוטנט למחיקת recA ללא סימן ב-P. brasiliense

  1. חילוץ DNA גנומי מ-P. brasiliense SM ופלסמיד pKV2 (pLP12 שמקורו בשינוי סמן הבחירה האנטיביוטי ואתר השיבוט המרובה) מזן תורם E. coli באמצעות שיטות הכנת DNA סטנדרטיות.
  2. אמת את איכות וריכוז ה-DNA הגנומי והפלסמיד שהופקו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וספקטרופוטומטריה של NanoDrop.
  3. ליניאריזציה של פלסמיד pKV2 באמצעות עיכול כפול עם EcoRI ו-NheI בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות. אמת עיכול מלא באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז וטיהור את הפלסמיד הלינארי.
  4. זהה כ-800 bp אזורים במעלה ומורד הזרם של גן recA באמצעות תוכנת ניתוח גנום ותכנן את זוגות הפריימרים המתאימים LBF/LBR ו-RBF/RBR (ראו טבלת חומרים לכל הפריימרים ששימשו במחקר זה).
  5. להגביר את שתי הזרועות ההומולוגיות בתנאי מחזור PCR סטנדרטיים ולטהר את מוצרי ה-PCR. PCR בנפח 50 מיקרוליטר מניב בדרך כלל 2.5 מיקרוגרם של מוצר.
    הערה: ערכי ה-Tm ותוכן ה-GC של הפריימרים ניתנים להתאמה על ידי שינוי גבולות האזורים ההומולוגיים.
  6. הרכיבו את הפלסמיד המתאבד הרקומביננטי pKV2-recA באמצעות ערכת הרכבה של DNA על ידי קישור הזרועות ההומולוגיות המטוהרות עם עמוד השדרה הפלסמיד הלינארי.
  7. להמיר את תערובת ההרכבה לתאי E. coli S17-1 λpir בעלי יכולת כימית באמצעות הלם חום, לשחזר את התאים בתווך LB, ולפלח את האגר LB המכיל קאנמיצין (LB + kan).
    הערה: הריכוזים הסופיים בהם נעשה שימוש הם 50 מ"ג/מ"ל קאנמיצין, 0.2% (עם וולט) גלוקוז, 0.3% (עם וולט) ערבינוז, ו-0.3 מ"מ חומצה דימינופימלית 2,6 (DAP).
  8. אימות שיבוטים חיוביים באמצעות עיכול הגבלה או PCR מושבה. (ראו טבלת חומרים לכל מתכוני המדיה ששימשו במחקר זה).
  9. חלצו את הפלסמיד pKV2-recA המאומת והמירו ל-E. coli WM3064 באמצעות טרנספורמציית הלם חום (קצב הטרנספורמציה הצפוי > 106 cfu/μg).
  10. בחרו טרנספורמנטים על אגר LB המכילים קאנמיצין וחומצה דימינופימלית (DAP).
  11. לבצע קונוגציה דו-הורית על ידי ערבוב תרביות לילה של זן התורם (WM3064 pKV2-recA) ושל המקבל P. brasiliense SM ביחס 1:1 (v/v), בדרך כלל מניב 104 עד10 6 טרנסקונוגנטים למיליליטר של תאי תורם ומקבל.
  12. שטפו את התרבית המעורבת פעם אחת במים סטריליים, הניחו את התערובת על אגר LB בתוספת קאנמיצין ו-DAP, ודוגרו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 48–72 שעות.
    הערה: אם לא נצפים טרנסקונג'גנטים, ניתן להגדיל את יחס התורם למקבל ל-2:1 (v/v) כדי לשפר את יעילות הקונוגציה. אם נצפה גידול רקע גבוה, ניתן להסיר את שארית ה-DAP על ידי שטיפת התרבית המעורבת פעמיים במים סטריליים.
  13. לשחזר את תערובת הקונוגציה והצלחת על אגר LB המכיל קאנמיצין וגלוקוז (ללא DAP) לצורך סלקציה נגדית.
  14. בחר 6–8 מושבות וצלח אותן על LB + kan ו-LB + kan + ארבינוז.
  15. בחרו מושבות שגדלות על LB + kan אך לא מצליחות לגדול על LB + kan + ערבינוז; אלו מועמדים ראשונים לקראת חציית מטוסים.
  16. החיסון אישר זנים חצייתיים ראשונים ל-LB Medium ומדגרים במהלך הלילה. הנח את התרביות על אגר LB המכיל L-ערבינוז כדי לגרום לרקומבינה הומולוגית שנייה.
  17. בחר כמה מושבות ותצליח להעתק אותן על LB + ערבינוז ו-LB + קאן. בחרו מושבות שגדלות על LB + ערבינוז אך לא על LB + kan; אלה מוטנטים פוטנציאליים למחיקת recA .
    הערה: אם לא נצפו מושבות לאחר אירוע החפיפה השני, יש להעריך את החיוניות הפוטנציאלית של גן היעד לצמיחת חיידקים. לחלופין, ניתן להרחיב את האזורים ההומולוגיים של הזרם העליון והתחתון ל-1,200 bp כדי לשפר את יעילות הרקומבינציה ההומולוגית.
  18. אשר את מוטנטי ה-recA באמצעות PCR מושבה באמצעות זוג פריימר checkF/checkR שנועדו להגביר את אזורי הפרומטר והטרמינטור של recA כדי לאמת את המחיקה בתוך המסגרת של הגן היעד. רצף את מוצר ה-PCR לאישור מחיקה מדויקת בתוך המסגרת של recA.
  19. מחיקה מוצלחת מסומנת על ידי הקטנה בגודל מוצר ה-PCR, שצריך להתאים לאורך קטע מסוג פראי פחות האורך הספציפי של מקטע הגן שנמחק.

2. בניית pKV2-LLtnp למוטגנזה של Tn5 ב-P. brasiliense

  1. הגברת קסטת Tnp טרנספוזאז מ-pMCS2-LLtnp8 באמצעות זוג פריימר Tnp-F/Tnp-R, והגברה של עמוד השדרה של oriγR6K Tn5 מ-pKV2 באמצעות זוג פריימר ori-F/ori-R. לטהר את כל מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור DNA.
  2. הרכיבו את קלטת Tnp המטוהרת ואת עמוד השדרה של oriγR6K Tn5 באמצעות ערכת הרכבת DNA. המרת תערובת ההרכבה לתאי E. coli S17-1 λpir בעלי יכולת כימית באמצעות הלם חום, שחזור במדיום LB, וצלחת על אגר LB בתוספת קאנמיצין (LB + kan).
  3. אימות שיבוטים חיוביים באמצעות PCR מושבה באמצעות זוגות פריימר ori-F/ori-R ו-Tnp-F/Tnp-R.
  4. הכינו תאים מיומנים ל-E. coli RHO3 על ידי חיסון מושבה בודדת לתוך מדיום LB ודגירה ללילה. מדלל את התרבית ב-1:100 ל-LB מדיום טרי וגדלל-OD 600 של 0.6.
  5. קרר את התרבית על קרח ושוטף את התאים שלוש פעמים עם 0.1 מיליון CaCl₂ מקורר מראש. החזירו את הכדור הסופי ל-500 מיקרוליטר של גליצרול מקורר מראש ב-20% ואחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
  6. המרה של 10 מיקרוליטר של הפלסמיד הרקומביננטי המאומת (pKV2-LLtnp) ל-100 מיקרוליטר של תאים מיומנים ל-RHO3 באמצעות הלם חום (קצב טרנספורמציה צפוי > 106 cfu/μg). דגרו על קרח במשך 30 דקות, הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, ואז מקררים על קרח למשך 2 דקות.
  7. הוסיפו 500 מיקרוליטר ליברות מדיום ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ערבוב. הפלטה על אגר LB המכיל קאנאמיצין ו-DAP (LB + kan + DAP) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  8. אימות טרנספורמנטים חיוביים של RHO3 באמצעות PCR מושבה באמצעות Tnp-F/Tnp-R.

3. בניית ספריית המוטנטים של Tn5 ב-P. brasiliense

  1. גדלו P. brasiliense ΔrecA במדיום LB בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס וגדלו RHO3/pKV2-LLtnp במדיום LB עם תוספת קאנמיצין ו-DAP (LB + kan + DAP) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אפשר לשני הזנים להגיעל-OD 600 של 1.
  2. מערבבים 100 מיקרוליטר של P. brasiliense ΔrecA עם 100 מיקרוליטר של RHO3/pKV2-LLtnp, צנטריפוגות את התערובת, זרקו את הסופרנאנט, ותלויים מחדש את הכדור השטוף ב-10 מיקרו ליטר של מדיום LB.
  3. למקם את התערובת התלויה על צלחת אגר LB עם תוספת DAP ולדגור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות כדי לאפשר הצמידה.
  4. שחזור תערובת הקונוגציה על ידי שטיפת משטח הפלטה במדיום LB סטרילי של 1 מ"ל. צנטריפוגה לזמן קצר, זרקו את הסופרנטנט, ושוטפים את הכדור פעמיים עם מדיום LB כדי להסיר את ה-DAP.
  5. החזירו את הכדור השטוף בדילול סדרתי של 300 מיקרוליטר LB ולוח על אגר LB בתוספת קאנמיצין וגלוקוז (LB + kan + glucose; ללא DAP) לבחירת טרנסקונוגנטים.
  6. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. בחרו חמש מושבות ואמת כל אחת באמצעות PCR מושבה באמצעות זוגות פריימר ori-F/ori-R ו-Tnp-F/Tnp-R כדי לאשר הכנסה מוצלחת של הטרנספוזון Tn5. רצף את כל חמש המושבות כדי לאמת הכנסת Tn5 לגנום.
    הערה: לפני הבנייה הרשמית של ספריית המוטנטים, שישה מושבות בודדות נבחרו באקראי מתוך לוח ההטיה. בוצעו בדיקות חילוץ פלסמיד לקביעת אתרי ההכנסה, תוך שימוש בשני אנזימי הגבלה שונים בנפרד כשתי קבוצות ביקורת מקבילות. בסך הכל הושגו 36 קריאות רצף. אירוע החדרה יחיד של Tn5 אומת רק כאשר ששת אתרי ההחדרה של כל מושבה היו זהים.
  7. הערך את קיבולת ספריית המוטנטים על ידי חזרה על שלב ההטיה וספירת מספרי מושבות. ודאו שגודל הספרייה הכולל עולה על 12,000 מושבות כדי להשיג כיסוי גנומי מספק לסקר במורד הזרם.
    הערה: אם נצפתה תדירות מוטגנזה נמוכה, יש לשקול שימוש בוריאנט טרנספוזאז היפראקטיבי של Tn5, כמו מוטנט E54K/M56A/L372P, כדי לשפר את יעילות הטרנספוזיציה.
  8. העבר מושבות מוטנטיות בודדות שהושגו בשלב 6 ללוחות של 96 בארות המכילות 200 מיקרו-ליטר LB + קאן לכל באר. דגרו את הצלחות בלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
  9. הוסף 133 מיקרוליטר של גליצרול סטרילי עם 50% לכל באר כדי להגיע לריכוז סופי של כ-20%. אטום ואחסן את לוחות ה-96 בארות בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס לשימור ארוך טווח.

4. בדיקות פתוגניות בתפוקה גבוהה באמצעות חיסון פקעות תפוחי אדמה וקנאביס

  1. הכינו פקעות תפוחי אדמה (cv. Favorita) על ידי שטיפה במים סטריליים, טבילה קצרה ב-75% אתנול, וייבוש באוויר על ספסל נקי. חתכו את הפקעות לחלקים בעובי ~8 מ"מ והניחו את הפרוסות בצלחות פטרי סטריליות בקוטר 90 מ"מ. הכינו לפחות שלוש פרוסות לשכפולים ביולוגיים.
  2. החרינו 1 מיקרו-ליטר מכל זן מוטנטי על פרוסות תפוחי אדמה באמצעות פיפטה רב-ערוצית, בהתאם לפריסת הצלחות של ספריית המוטנטים בת 96 בארות. כלול את P. brasiliense ΔrecA כבקרה חיובית ואת LB + kan כבקרה שלילית.
  3. דגרו את פרוסות תפוחי האדמה המודלקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 7–8 שעות. תיעודו מוטנטים שהראו הפחתה נראית לעין של השררה או אזורי נגעים קטנים יותר בהשוואה לבקרת ΔrecA . כמת את אזור הנגע על ידי מדידת אורכו ורוחבו. הגדרו אותם כמועמדים לסינון ראשוני.
    הערה: ודא שערכי OD600 של תרביות ובקרת מוטנטים מנורמלים ל-0.8 לפני החיסון.
  4. לצורך סינון משני, יש להזריק 5 מיקרוליטר מכל מסנן מועמד על פרוסות תפוחי אדמה טריות (6 זנים לכל פרוסה, מרווח שווה). הכינו שלושה שכפולים ביולוגיים לכל זן. דגרו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 7–8 שעות ורשמו את גודל הנגעים לאישור החלשה.
  5. בודדו זנים שמראים הפחתת אלימות עקבית על ידי רצועים על לוחות LB + kan. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במהלך הלילה ואחסנו מוטנטים עם אלימות מופחתת מאומתים ב-4 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר.
  6. לצורך אימות צמחי שלם, הסנקולציה גבעולי תפוחי אדמה עם 150 מיקרוליטר של תללים חיידקיים מנורמלים ל-1 x 108 CFU/mL. הזרקו תליות לאזור הגבעול הבסיסי באמצעות מזרק סטרילי. צפה בהתפתחות מחלה לאחר 48 שעות. לבצע שכפולים ביולוגיים על שלושה צמחים בודדים.
  7. ערוך את חומרת המחלה באמצעות סולם דירוג מחלת הרגל השחורה ("סולם סדרי בן 6 נקודות: 0, 1, 3, 5, 7, 9") וחשב את מדד המחלה כך:
    1. דרגה 0: אין תסמיני מחלה בכל הצמח.
    2. דרגה 1: נגעי גבעול מכסים לא יותר משליש מהיקף הגבעול, ו/או עלים בודדים נבולים.
    3. דרגה 3: נגעי הגבעול מכסים לא יותר מחצי מהיקף הגבעול, ו/או פחות מחצי מהעלים מראים נבילות קלה, ו/או כמה עלים תחתונים מכילים נגעים.
    4. דרגה 5: נגעי גבעול מכסים יותר מחצי מהיקף הגבעול, ו/או יותר מחצי מהעלים מראים נבילה קלה.
    5. דרגה 7: נגעי גבעול מקיפים את כל היקף הגבעול, ו/או יותר משני שלישים מהעלים נבולים.
    6. דרגה 9: כל עלי הצמח נבולים או מתים.
      משוואה 1
  8. הכינו מלאי אחסון ארוך טווח של מוטנטים מוחלשים מאומתים על ידי ערבוב תרביות בנפח שווה של גליצרול סטרילי 50% לריכוז סופי של 25%, ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

5. זיהוי אתרי החדרת Tn5 באמצעות חילוץ פלסמיד

  1. לגדל את המוטנט ה-Tn5 המעניין ולחלץ DNA גנומי באמצעות ערכת חילוץ DNA גנומי חיידקית. כמת את ריכוז ה-DNA כדי להבטיח קלט מספק לעיכול במורד הזרם.
  2. לעכל 1–2 מיקרוגרם DNA גנומי עם EcoRI בתגובה של 100 מיקרוליטר המכילה 10× בופר תגובה ו-5 מיקרוליטר אנזים, ולדגור את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מינימום של 3 שעות. בדוק את סיום העיכול באמצעות ג'ל אגרוז.
  3. השקיעו את ה-DNA המעכל על ידי הוספת 1/10 נפח של 3 מיליון נתרן אצטט ו-3 נפחים של אתנול אבסולוטי. ערבבו היטב ודגרו בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך שעה.
  4. צנטריפוגה ב-13,500 x גרם למשך 5 דקות ושוטפים את הכדור ברצף עם 75% אתנול ואתנול מוחלט. ייבשו את הכדור באוויר והחזירו אותו ב-17 מיקרוליטר מים סטריליים.
  5. קשירה עצמית של קטעי ה-DNA המעכלים על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של 10× ליגאזות DNA של T4 ו-1 מיקרוליטר של ליגז DNA T4. כלול בקרה שלילית (ללא ליגאז) כדי לבדוק את טרנספורמציית הרקע. דגרו את תגובת הקשיכה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה כדי לקדם מעגליזציה של קטעי הגבלה.
  6. המרו 10 מיקרוליטר מתערובת הליגציה ל-E. coli S17-1 λpir מיומנת כימית באמצעות טרנספורמציית הלם חום כפי שתואר קודם. לשחזר תאים ב-LB למשך שעה אחת ולוחט על אגר LB המכיל קאנמיצין (LB + kan) כדי לבחור פלסמידים הנושאים את קסטת Tn5.
  7. בחר חמש מושבות אקראיות עמידות לקאנאמיסין וחילץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת מיני-פרפ סטנדרטית של פלסמיד. אימות מבנה הפלסמיד על ידי עיכול 500 ng מכל פלסמיד עם HindIII ודגירה ב-37°C למשך 5 שעות. ניתוח דפוסי עיכול באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז.
  8. אם גודל רצועות הפלסמיד תואם את דפוסי המקטעים הצפויים, בצע ריצוף סנגר באמצעות פריימר 5' ME הממוקם בקצוות Tn5.
  9. זהה את אתר ההחדרה המדויק של Tn5 על ידי יישור רצף הצדדים של 50-100 bp במורד הזרם של אזור Tn5 5'-ME מול הגנום SM של P. brasiliense באמצעות BLAST או תוכנת ניתוח גנום.
  10. אשר שכל חמש תגובות הריצוף העצמאיות עבור כל מוטנט ממופות לאותה קואורדינטת גנומית (> 98% זהות רצף).
  11. אם אחת מחמש תגובות הריצוף מתמקדת בקואורדינטה גנומית שונה, הדבר מעיד על נוכחות של מספר אתרי החדרה של Tn5 באותו מוטנט. במקרים כאלה, יש לנתח מושבות נוספות כדי לקבוע את כל מיקומי ההכנסה. חלופה נוספת היא לבצע ריצוף Southern bloting או רצף גנום מלא כדי לקבל מיפוי אתרי החדרה חד-משמעי יותר.
  12. להגדיר מוטנטים עם אתר החדרה אחיד ואחיד בכל תגובות הריצוף כמוטנטים חד-החד-חד-תחומי Tn5 אמיתיים המתאימים לניתוחים פנוטיפיים או גנטיים בהמשך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להתגבר על חוסר היציבות שנגרם על ידי מוטציית ה-sucB ב-P. brasiliense, נעשה שימוש ברעל vmi480 מהפלסמיד pLP12 כסמן נגד-בחירה, וקטור התאבדות pKV2 (איור 1A) נבנה על ידי החלפת קלטת העמידות לאנטיביוטיקה והתאמת תצורת אתר השיבוט. כדי ליצור מוטנט למחיקת recA ללא סימן, ~800 bp זרועות הומולוגיות שמאל וימני של גן recA שוכפלו ל-pKV2, ולאחר מכן בוצעה הליך בחירה דו-שלבי לקבלת רקומביננטים כפולים. אימות PCR באמצעות זוג פריימר LBF/RBR וריצוף סנגר הראה הבדל של כ-600 bp בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אסטרטגיית המניפולציה הגנטית שפותחה במחקר זה מספקת אפשרות לגנומיקה פונקציונלית ב-P. brasiliense, פתוגן ראשוני לריקבון רך של תפוח אדמה 9,10. על ידי שילוב מערכת נגד ברירה מבוססת רעלן בתוך עמוד השדרה של פלסמיד התאבד, נוצר מוטנט ΔrecA ללא סימן. גישה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני מערכות מסורתיות מבוססות SACB; בעוד ש-SACB לעיתים קרובות מניב גידול רקע גבוה בזכות הסבילות המולדת לסוכרוז ורגישותו האוס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32472504 32561143029 ל-X.Z., 32201914 ל-J.W.), קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (2024A1515012708 עד X.Z.), קרן מדעי הטבע של מונגוליה הפנימית (2024QN03044 עד U.H.), ותוכנית הכישרונות של נהר הפרל (2021QN02N151 עד X.Z.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת חילוץ DNA גנומי חיידקיחילוץ DNA גנומי חיידקיTiangenDP302-02
חומצת דיאמינופימלית0.3 mM ב- 1 L מדיוםMacklinD836611-5g
ערכת הרכבת DNAהרכבת DNAVazymeC116-02
ערכת טיהור DNAטיהור DNATiangenDP214-02
קנמיצין50 mg/mLAladdinK103025-25g
גלוקוז0.2% (w/v)AladdinG116305-250mg
טריפטון10% ב- 1 L מדיוםOXOIDLP0042B
תמצית שמרים5% ב- 1 L מדיוםOXOIDLP0021B
NaCl10% ב- 1 L מדיוםBiofroxx1249KG001
אגר15% ב- 1 L מדיוםBiofroxx8211GR500
L-arabinose0.3% (w/v)AladdinA106196-25g
ערכת Miniprep פלסמידחילוץ פלסמידTiangenDP103-02
EcoRIאנדונקליאז רסטריקציהYugong BiotechEG15536
NheIאנדונקליאז רסטריקציהYugong BiotechEG15552
HindIIIאנדונקליאז רסטריקציהYugong BiotechEG15539
T4 DNA ליגאזמעגליות עצמית של DNA ליניאריYugong BiotechEG15205
צנטריפוגהRWDM1324R
PCR Thermal CyclerBIO-GENERGET3XG
מצלמה דיגיטליתSONYILCE-7M4
מערכת אלקטרופורזהLYDYY-6C
אמבט מיםJOANLABWB100-1F
מערכת תיעוד ג'לThermo Fisher ScientificiBright CL750
אוטוקלבYamatoSQ510C
חממה מרעידהZHICHUZQZY-AR8
חממה בטמפרטורה קבועהZQDHP-9272
NanoDropThermo Fisher ScientificLite Plus
ספקטרופוטומטר UV-VisHITACHIU-3900
אלקטרופורטורBIO-RADMicroPulser
זנים ופלסמידים
P. brasiliense SMחיידקים פתוגניים מתפוחי אדמהאוסף זנים מעבדה
E. coli S17-1 λpirתאים מתאימים של E. coliWEIDIDL2010S
E. coli WM3064תאים מתאימים של E. coliBIO SCI BIOC1039
E. coli RHO3תאים מתאימים של E. coliאוסף זנים מעבדה
pKV2הפלסמיד ההתאבדות המופעל  הורכב במחקר זה
pLP12פלסמיד התאבדותאוסף זנים מעבדה
pMCS2-LLtnpספק את השבר הנושא את Tn5אוסף זנים מעבדה
pKV2-LLtnpהפלסמיד המופעל שנושא את השבר Tn5.הורכב במחקר זה
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)מותאם אישית
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)מותאם אישית
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)מותאם אישית
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)מותאם אישית
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)מותאם אישית
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)מותאם אישית
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)מותאם אישית
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)מותאם אישית
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)מותאם אישית
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)מותאם אישית
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)מותאם אישית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martínez-Prada, M. D. M., Curtin, S. J., Gutiérrez-González, J. J. Potato improvement through genetic engineering. GM Crops Food. 12 (1), 479-496 (2021).
  2. Wang, N., Reidsma, P., Pronk, A. A., de Wit, A. J. W., van Ittersum, M. K. Can potato add to China’s food self-sufficiency? The scope for increasing potato production in China. Eur J Agron. 101, 20-29 (2018).
  3. Sun, Y., et al. Comparative genomic and transcriptome analyses of two Pectobacterium brasiliense strains revealed distinct virulence determinants and phenotypic features. Front Microbiol. 15, (2024).
  4. Liu, Y., Filiatrault, M. J. Complete genome sequence of the necrotrophic plant-pathogenic bacterium Pectobacterium brasiliense 1692. Microbiol Resour Announc. 9 (12), e00037-20(2020).
  5. Moleleki, L. N., Pretorius, R. G., Tanui, C. K., Mosina, G., Theron, J. A quorum sensing-defective mutant of Pectobacterium carotovorum ssp. brasiliense 1692 is attenuated in virulence and unable to occlude xylem tissue of susceptible potato plant stems. Mol Plant Pathol. 18 (1), 32-44 (2017).
  6. Polyudova, T., Eroshenko, D., Korobov, V. The effect of sucrose-induced osmotic stress on the sensitivity of Escherichia coli to bacteriocins. Can J Microbiol. 65 (12), 895-903 (2019).
  7. Luo, P., He, X., Liu, Q., Hu, C. Developing universal genetic tools for rapid and efficient deletion mutation in Vibrio species based on suicide T-vectors carrying a novel counterselectable marker, vmi480. PLoS One. 10 (12), e0144465(2015).
  8. Lv, W., et al. Essential gene dynamics across distinct growth conditions in Xanthomonas citri. Hortic Res. 12 (9), uhaf160(2025).
  9. Toth, I. K., Bell, K. S., Holeva, M. C., Birch, P. R. J. Soft rot erwiniae: from genes to genomes. Mol Plant Pathol. 4 (1), 17-30 (2003).
  10. Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (6), 614(2012).
  11. Pineau, C., et al. Structure-function analysis of pectate lyase Pel3 reveals essential facets of protein recognition by the bacterial type II secretion system. J Biol Chem. 296, 100305(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RecAII
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים