הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מערכת Invitro להפעלת כוח מתיחה על תאי גזע שלדיים באמצעות מערכת מתח תאים מחזוריים

47 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70570

⸱

12 ביוני 2026

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

במאמר זה

סיכום

תאי גזע שלדיים פריוסטיליים של עכבר (SSCs) בודדו על ידי FACS וגודלו במבחנה. הוקמה מערכת ניסויית נשלטת ליישום גירוי מכני מתיחה מחזורי על SSCs, מה שהוביל לירידה בביטוי הגנים הקשורים להזדקנות התאים, במיוחד p16 ו-p21.

תקציר

עצם היא איבר רגיש למכניקה מרכזי שמגיב כל הזמן לרמזים פיזיים בגוף. למרות שגירוי מכני ממלא תפקידים חשובים בהתפתחות השלד, הומאוסטזיס ותיקון פציעות, התגובות הספציפיות של תאי גזע שלדיים (SSCs) למתח מכני נותרות בלתי מובנות במלואן. כדי להתמודד עם שאלה זו, הקמנו מודל במבחנה לבידוד SSCs פריוסטיליים בעכבר ויישום גירוי מכני. תאי פריוסטיל בעכבר התקבלו לראשונה באמצעות עיכול אנזימטי, ו-SSCs בודדו לאחר מכן באמצעות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) המבוסס על סמנים על פני השטח. לאחר ההצמדה לתרבית, SSCs עברו גירוי מכני מתיחה באמצעות מערכת מתח-מתח מחזורית של תאים. מערכת זו מאפשרת יישום שכפול של כוח מתיחה על תאים מתורבתים ומספקת פלטפורמה לניתוח תגובות SSC לקלט מכני. באמצעות גישה זו, מצאנו כי הביטוי של הגנים הקשורים להזדקנות התאית p16 ו-p21 ירד משמעותית ב-SSCs לאחר גירוי מכני. ממצאים אלו מצביעים על כך שגירוי מתיחה עשוי להשפיע על שינויים הקשורים להזדקנות ב-SSCs בתנאי מבחנה . בסך הכול, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה שימושית ומתאימה לחקר התנהגות SSC תחת גירוי מכני ולחקר כיצד רמזים מכניים משפיעים על תפקוד SSC.

מבוא

כאיבר התומך הגדול והחשוב ביותר בגוף האדם, מערכת השלד לא רק מספקת אתרי חיבור והגנה לאיברים אחרים, אלא גם משמשת כבסיס לתפקוד מוטורי. לכן, מערכת השלד חשופה כל הזמן לגירויים מכניים שונים הן מסביבות פנימיות והן מסביבות חיצוניות. אותות גירוי מכניים חשובים לא פחות להתפתחות העצם ולתחזוקה התפקודית. כבר בשנת 1893 הוצע שיש מתאם חיובי מסוים בין צפיפות העצם לבין הכוח המכני שהעצמות נושאות, וזהו חוק וולף1. בשנים האחרונות, מחקרים מסוימים הראו את חשיבות מערכת השלד הנושאת כוחות מכניים להתפתחות תקינה של עצמות 2,3,4,5. תגובת מערכת השלד לכוח מכני תלויה חלקית ברכיבים התאיים בעצם6. האוסטאוציטים מהווים 85% עד 90% מהרכיבים התאיים במערכת השלד. בשל התפוצה הרחבה שלהם ומורפולוגיית התאים הדנדריטיים הייחודיים, האוסטאוציטים הם כיום סוג תא השלד הנחקר ביותר מבחינת תגובה מכנית 7,8. מלבד היכולת המוכרת של האוסטאוציטים להגיב לכוח מכני, תאי קדם-שלד ממלאים גם תפקיד חיוני בכך. נמצא כי תגובת תאי הפריוסטל לאותות מכניים ווסתתה את שינוי גורלם, ובכך משפיעה על תיקון נזקי רקמה9.

תאי גזע שלדיים (SSCs) הם סוג של תאי גזע ספציפיים לרקמה בעלי יכולת התחדשות עצמית, שיכולים להתמיין לסוגי תאי עצם בוגרים הנדרשים לצמיחה, תחזוקה ותיקון העצם. בשנת 2015 זוהו גני סמן שטח עבור SSCs בעכברים10. בהמשך, מחקרים רבים הראו כי ל-SSCs יש תפקיד חשוב מאוד בהיבטים שונים כגון התפתחות העצם, תחזוקת הומאוסטזיס ותיקון פגיעות עצם11,12. בשל מאפיין המערכת השלדית שמגיבה לכוחות מכניים, ניתן לראות באותות כוח מכניים גורם חיוני בוויסות תפקוד תאי הגזע השלדיים. כדי לחקור את השינויים ההתנהגותיים של SSCs תחת גירוי מכני, עלינו להקים מערכת ניסויית מתאימה להפעלת כוח מכני במבחנה.

השיטות העיקריות לגירוי מכני במבחנה לתאים כוללות מאמץ גזירה של נוזל, מאמץ דחיסה, כוח מתיחה, לחץ הידרוסטטי, קשיחות מטריצה וטופולוגיית מטריצה 6,13. בהתבסס על גני סמן פני השטח של SSCs של עכברים, קיבלנו SSCs פריו-סטלי של עכבר באמצעות מיון ציטומטריית זרימה, שכן ה-SSCs המעורבים בתיקון שבר מגיעים בעיקר מהפריאוסטאום14. בהמשך, כוח מתיחה מתאים הוחל על SSCs הפריוסטלי דרך מערכת מתח תאית מחזורית. לאחר גירוי כוח מתיחה, ניתן לקבל דגימות תאים, וניתן לבצע ניתוחים מולטי-אומיקס, כולל ריצוף טרנסקריפטום, ריצוף פרוטאום ו-ATAC-seq. לכן, הקמת פרוטוקול זה מספקת בסיס איתן לחקר תגובות SSC לגירוי מכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויי העכברים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מכון שנחאי לביוכימיה וביולוגיה תאית, האקדמיה הסינית למדעים (SIBCB-S350-2312-41).

1. בידוד תאי פריוסטאל בעכברים

  1. הניחו עכברים בני 4 עד 6 שבועות בקופסת המתת חסד עם CO₂ וחשפו אותם ל-CO₂ ברציפות במשך 3 דקות עד שהנשימה מפסיקת.
  2. חטא את פני גוף העכברים עם 75% אלכוהול. השתמש במספריים עיניים להפרדת הגפיים האחוריות. לאחר מכן השתמשו במלקחיים מחודדים ומספריים עיניים כדי להסיר את שרירי השלד מהגפיים האחוריות, כדי להבטיח שאזורי המפרקים של עצם הירך והשוק יישארו שלמים.
  3. שמרו את העצמות המבודדות ב-PBS מקורר, ואז ציפו את שני קצות העצמות באגרוז עם התכה נמוכה (5-10% בבופר TAE).
  4. לעכל את עצם הירך והטיביות במינימום חיוני אלפא (α-MEM) המכיל 1 מ"ג/מ"ל קולגנאז, 2 מ"ג/מ"ל דיספאז II, ו-0.1 מ"ג/מ"ל DNase I ב-37°C ו-0.3 × גרם למשך 30 דקות פעמיים. אסוף את התאים המעכלים לתוך מדיום התרבית (α-MEM + 10% סרום בקר עוברי (FBS)).
  5. מסנן את תליית התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרון ואז צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות כדי להסיר את הסופרנטנט.
  6. החזירו את השקיעה של התא עם בופר לליזת תאי דם אדומים למשך 2 דקות ומסיימים את התגובה עם בופר ציטומטריית זרימה (PBS + 2% FBS).
  7. צנטריפוג את התאים ב-500 × גרם למשך 5 דקות וזרוק את הסופרנטנט. החזירו את התאים עם בופר ציטומטריית זרימה ב-1 ×-10-7 תאים למ"ל למיון תאים.

2. מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה

  1. צבעו את תליית התא בנוגדנים הבאים כך: PerCP/Cy5.5 נגד עכבר מצומד CD45, אנטי-עכבר מצומד PerCP/Cy5.5 CD31, אנטי-עכבר מצומד PerCP/Cy5.5 Ter119, אנטי-עכבר מצומד FITC 6C3/Ly-51, אנטי-עכבר מצומד Brilliant Violet 605-קונוגט CD90.2, אנטי-עכבר מצומד PE/Cy7 CD105, אנטי-עכבר מצומד APC CD200.
  2. מדלל את הנוגדנים הנ"ל ביחס של 1:500 ודוגר אותם על קרח למשך 30 דקות, מוגן מאור.
  3. שטפו את התאים עם בופר ציטומטריית זרימה, ובצעו מיון תאים באמצעות מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה כדי לקבל SSCs של CD45-CD31-Ter119-CD90.2-6C3-CD105-CD200+. אספו את ה-SSCs הממוינים עם מדיום התרבית. נתחו את הנתונים שנאספו באמצעות תוכנת FlowJo v10.8.1.
  4. הרחבו את ה-SSCs הממוינים בצלחות תרבית עם מדיום התרחבות באינקובטור תאים 5%CO2 . ניתן היה לבצע מעבר אחד לפני גירוי מכני.
    הערה: כ-1 ×-10 5 SSCs פריוסטלי ניתן להשיג מכל זוג עכברים בני 6 שבועות.

3. גירוי מכני של SSCs

  1. דיללו את קולגן זנב העכברוש מסוג I בחומצה אצטית של 0.02 מ' מעוקר לריכוז סופי של 0.15 מ"ג/מ"ל. תמיסה זו ניתנת לשימוש חוזר 3 פעמים ויש לשמור עליה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הוסף 1.5 מ"ל קולגן מסוג I של זנב עכברוש מדולל לכל באר של צלחת תרבית גמישה עם 6 בארות. לאחר ציפוי הלוחות במשך שעה בטמפרטורת החדר, שאפו את עודף הקולגן ושטפו את הצלחות פעם אחת עם PBS לשימוש מאוחר יותר.
  3. הערה: לשימוש מיידי, יש לשטוף את הצלחת ב-PBS כדי להסיר שאריות חומצה. לפני האחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, יש לייבש את הצלחת לחלוטין עם הסרת המכסה.
  4. לעכל את ה-SSCs הפריוסטלי של העכבר המגודל, לבצע צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות, להחזיר את משקעי התא בתווך התרבית להשגת צפיפות תאים של 1 ×10 5 תאים/מ"ל, להוסיף 2 מ"ל של תליית תאים לכל באר של לוח התרבית הגמיש בעל 6 בארות, ולהכניס אותו לאינקובטור התא.
  5. 24 שעות לאחר זריעת התאים, יש להניח את פלטת התרבית הגמישה בפלטת הבסיס המתוחה, ולשמור על לוח תרבית גמיש נוסף כקבוצת ביקורת ללא גירוי מכני.
  6. הגדר את הפרמטרים בתוכנת FX-6000 גרסה 1.0 כך: עוצמת מתיחה 8%, תדר 0.1 הרץ, צורת גל כגל מרובע, מחזור עבודה של צורת גל 80%, ומשך מתיחה למשך 12 שעות.
    הערה: יש ארבעה מיקומים על לוח הבסיס המתוח להנחת פלטת תרבית גמישה עם 6 בארות. אם התאים הנדרשים לניסוי הם פחות מ-4, יש למלא את המקומות הריקים בלוחות תרבית גמישים חדשים עם 6 בארות. לאחר יישום גירוי מכני מתאים, SSCs יכולים לעבור בדיקות פונקציונליות, כגון התמיינות תאים או התפשטות, או שניתן להפיק דגימות לצורך ריצוף מולטי-אומיקס.

4. PCR כמותי בזמן אמת (RT-qPCR)

  1. לאחר סיום הגירוי המכני של התאים, השליכו את מדיום התרבית, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS, חילצו את כל ה-RNA עם TRIzol Reagent, ומבצעים שעתוק הפוך של RNA.
    הערה: לאחר סיום חילוץ ה-RNA, ניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -80°C. ה-cDNA המתקבל משעתוק הפוך יכול להישמר גם ב-20°- לבדיקות נוספות.
  2. בצע RT-qPCR עם מערכת PCR בזמן אמת. קבוצות הפריימרים ששימשו היו כדלקמן:
    HPRT: קדימה 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAAA-3',
    Hprt: הפוך 5'-AGGGCATATCCAACAACAACTT-3',
    עמוד 16: קדימה 5'-GGTCACACGACTGGGGGATT-3',
    עמ' 16: הפוך 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAGAG-3',
    עמ' 21: קדימה 5'-GCCTGGTTCCTTGCCACTTCTT-3',
    עמ' 21: הפוך 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. השפעות הטיפול הקצר טווח בלחץ מכני

  1. הגדר את הפרמטרים בתוכנת FX-6000 גרסה 1.0 כך: עוצמת מתיחה 8%, תדר 0.1 הרץ, צורת גל כגל מרובע, מחזור עבודה של צורת גל 80%. התאים עוברים ליזה באמצעות בופר RIPA Lysis I (עם קוקטייל מעכב פוספטאז וקוטקטייל מעכב פרוטאז) לאחר 10 דקות ו-60 דקות לאחר גירוי מתח מכני.
  2. בצע את ה-Western Blot עם נוגדן Erk ו-p-Erk.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר יישום פרוטוקול זה, כוח מתיחה הוחל בהצלחה על SSCs פריוסטולי של עכברים. ראשית, SSCs הושגו מהפריאוסטאום של עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה. תוצאות ציטומטריית הזרימה הראו כי שיעור ה-SSCs בפריאוסטאום היווה כמעט 30% מ-Lin- (CD45-, CD31-, Ter119-) CD90.2-6C3- (איור 1), שהיה גבוה בהרבה מאשר במח העצם. בהינתן התפקיד המשמעותי של SSCs פריוסטולי בהתפתחות העצם ותיקון השברים14,15

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשנים האחרונות, גנים לסמן תאי גזע שלדיים מחלקים שונים של העצמות התגלו ברציפות 11,12,17. עם זאת, מחקר על ויסות ישיר של תפקוד SSCs עדיין צריך להעמיק, במיוחד בתחום ויסות גירוי הכוח המכני. עד כה, המחקר על ההשפעות הרגולטוריות המכניות של תאי גזע שלדיים/תאי קדם התבסס בעיקר על בניית מודלים של עכברי נוקאאוט Piezo1 9,18, ועדיין אין ראיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים למתקן הליבה לציטומטריית זרימה ולמתקן ליבת בעלי החיים של מכון שנגחאי לביוכימיה וביולוגיה תאית, האקדמיה הסינית למדעים. העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32471190, 82502903) ותוכנית המומחים הזרים של מחוז היינאן (506068033010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
α-MEMCorning10-022-CVבידוד תאים פריוסטליים
APC anti-mouse CD200BioLegend123809מיון SSCs
BioFlex 6-Well Culture Plate FlexcellBF-3001Aתרבית תאים
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317מיון SSCs
CollagenaseSigmaC0130בידוד תאים פריוסטליים
Dispase IISigmaD4693בידוד תאים פריוסטליים
DNase ISigmaDN25בידוד תאים פריוסטליים
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701מיון SSCs
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305מיון SSCs
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 מתיחת תאים
Flow Cytometry SorterBDBD FACSAria Fusionמיון SSCs
MesenCult Expansion Kit (Mouse)Stem cell05513תרבית תאים
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409מיון SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522מיון SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132מיון SSCs
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228מיון SSCs
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat tail type I collagenCorning354236תרבית תאים
real-time PCR systemThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 red blood cell lysis buffer Beyotime C3702בידוד תאים פריוסטליים
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail IIMCEHY-K0022WesterBlot
 RIPA Lysis Buffer ISangon BiotechNO. C500005WesterBlot
Protease Inhibitor Cocktail MCEHY-K0010WesterBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling Technology9102WesterBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology4370WesterBlot

מקורות

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
  3. Sun, W., et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. eLife. 8, 47454(2019).
  4. Wang, L., et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 11, 282(2020).
  5. Zhou, T., et al. Piezo1/2 mediate mechanotransduction essential for bone formation through concerted activation of NFAT-YAP1-ß-catenin. eLife. 9, 52779(2020).
  6. Wang, L., et al. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 10, 16(2022).
  7. Qin, L., Liu, W., Cao, H., Xiao, G. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 8, 23(2020).
  8. Uda, Y., et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 15, 318-325 (2017).
  9. Wang, L., et al. Piezo1 balances the osteogenic-tenogenic plasticity of periosteal progenitor cells through the YAP pathway. Cell Rep. 44, 115630(2025).
  10. Chan, C. K., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160, 285-298 (2015).
  11. Feng, H., et al. Skeletal stem cells: origins, definitions, and functions in bone development and disease. Life Med. 1, 276-293 (2022).
  12. Yuan, G., et al. Skeletal stem cells in bone development, homeostasis, and disease. Protein Cell. 15, 559-574 (2024).
  13. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Mol Med. 17, 823-832 (2013).
  14. Jeffery, E. C., et al. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells make distinct contributions to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29, 1547-1561 (2022).
  15. Liu, Y. L., et al. Fibrous periosteum repairs bone fractures and maintains the healed bone throughout mouse adulthood. Dev Cell. 59, 1192-1209 (2024).
  16. Hu, H., et al. ZKSCAN3 counteracts cellular senescence by stabilizing heterochromatin. Nucleic Acids Res. 48, 6001-6018 (2020).
  17. Li, Q., Xu, R., Lei, K., Yuan, Q. Insights into skeletal stem cells. Bone Res. 10, 61(2022).
  18. Shen, B., et al. A mechanosensitive peri-arteriolar niche for osteogenesis and lymphopoiesis. Nature. 591, 438-444 (2021).
  19. Yu, H. S., et al. Impact of mechanical stretch on the cell behaviors of bone and surrounding tissues. J Tissue Eng. 7, 2041731415618342(2016).
  20. Chang, X., Xu, S., Zhang, H. Regulation of bone health through physical exercise: Mechanisms and types. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1029475(2022).
  21. Ma, Q., et al. Significance of mechanical loading in bone fracture healing, bone regeneration, and vascularization. J Tissue Eng. 14, 20417314231172573(2023).
  22. Sakurai, M., Ishitsuka, K., Becker, H. J., Yamazaki, S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells and clinical applications. Cancer Sci. 115, 698-705 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.