מאמר שיטה

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ במלנוציטים ראשוניים בבני אדם באמצעות טרט-בוטיל הידרופרוקסיד

DOI:

10.3791/70595

⸱

29 במאי 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biomedical Aging Research, Universität Innsbruck, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), 3European Innovation Center, Proya Europe

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת ב-HNM באמצעות tBHP, פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח סמנים מרכזיים של הזדקנות, כולל עצירת גדילה, פעילות SA-β-גלקטוזידאז וגורמי SASP.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורמי לחץ סביבתיים, כולל קרינת UV, זיהום אוויר או עשן סיגריות, גורמים להזדקנות עור חיצונית. חשיפה לגורמי הזדקנות חיצוניים אלו מקדמת הצטברות תאים מזדקנים, התורמים להיווצרות קמטים והפרעות פיגמנטציה. מלנוציטים, המספקים הגנה ראשונית מפני UV, מראים פעילות מופחתת עם הגיל. מלנוציטים מזדקנים מצטברים בעור המזדקן ותורמים למראהו המזדקן; עם זאת, ישנם מעט מודלים לחקר הזדקנות של המלנוציטים, ועבודה זו שואפת לפתח מודל שניתן לשחזור למחקר נוסף. במחקר זה אנו מציגים מודל הזדקנות של מלנוציטים יילודים (HNM) באמצעות טרט-בוטיל הידרופרוקסיד (tBHP), גורם לחץ חמצוני מאופיין היטב. tBHP משבש את ההומאוסטזיס של החמצון על ידי דילול ההגנות הנוגדי חמצון התאיות ומקדם ייצור יתר של רדיקלים, מה שמוביל לנזק ל-DNA ולחלבונים. אנו מאפיינים את פנוטיפ ההזדקנות של מלנוציטים שטופלו ב-tBHP באמצעות ניתוח סמנים מבוססים של הזדקנות, כולל פוטנציאל גדילה מוגבל, שינויים מורפולוגיים ופעילות SA-β-Galactosidase. מודל זה מספק כלי חשוב לחקר הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ במלנוציטים, ומציע תובנות לגבי תפקידם בהזדקנות עור חיצונית ובהפרעות פיגמנטציה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזדקנות העור מורכבת משני גורמים מובחנים: הזדקנות פנימית והזדקנות חיצונית 1,2. הזדקנות פנימית נגרמת מתהליכים כרונולוגיים טבעיים וגורמים גנטיים, בעוד שהזדקנות חיצונית נגרמת מחשיפה מצטברת ללחצים סביבתיים, בעיקר קרינה אולטרה סגולה, אך גם מזיהום אוויר, עשן סיגריות וחומרים כימיים, שמאיצים את תהליך ההזדקנות מעבר לקצב הכרונולוגי הרגיל 3,4. חשיפות סביבתיות יוצרות לחץ חמצוני שמכריע את ההגנות הנוגדות חמצון התאיות, וגורמות לנזק ל-DNA, חמצון חלבונים ופרוקסידציה של שומן. שינויים מולקולריים אלו מפעילים תגובות נזק DNA מתמשכות ותפקוד לקוי תאי, ובסופו של דבר מעודדים הזדקנות מוקדמת 5,6. הזדקנות הנגרמת מלחץ תורמת לתכונות קליניות של עור מזדקן, כולל קמטים, פיגמנטציה לא אחידה, ירידה בגמישות ופגיעה בתפקוד המחסום7.

המלנוציטים שוכנים בתוך האפידרמיס הבסיסי ומשמשים כהגנה העיקרית של העור מפני נזקי UV על ידי סינתזת מלנין והעברתו לקרטינוציטים הסובבים. באופן פרדוקסלי, תפקיד מגן זה הופך אותם לפגיעים במיוחד ללחץ חמצוני ולהזדקנות מוקדמת במהלך הזדקנות חיצונית 8,9. תהליך המלנוגנזה עצמו מייצר מיני חמצן תגובתיים משמעותיים כתוצרי לוואי של תגובות קטליזציה בטירוזינאז, ויוצר עומס חמצוני מובנה שמועצם עוד יותר על ידי חשיפות סביבתיות כמו קרינת UV וזיהום10,11. כתוצאה מכך, לחץ סביבתי כרוני עלול לגרום לנזק חמצוני, לתפקוד לקוי של המיטוכונדריאה, ולבסוף להזדקנות תאית12. למרות חשיבותם, נותרו שאלות מרכזיות לגבי המסלולים המולקולריים השולטים בזדקנות המלנוציטים וכיצד לחץ חמצוני מתחיל תהליך זה. יתרה מזאת, השפעת המלנוציטים המזדקנים על מיקרו-סביבת העור הסובבת כמניע לשינויים בעור הקשורים לגיל, במיוחד דרך שחרור גורמי SASP, נותרה לא מובנת מספיק13,14.

למרות שמלנוציטים רגישים במיוחד להזדקנות הנגרמת מלחץ חמצוני, מודלים ניסיוניים ללימוד תהליך זה מוגבלים15,16. רוב מחקרי ההזדקנות ממשיכים להסתמך על מודלים של הזדקנות משכפלים או מונעת מלחץ בפיברובלסטים, אך גישות אלו אינן תופסות את הביולוגיה הייחודית של המלנוציטים או את הפוטנציאל שלהם להשפיע על הזדקנות העור דרך דיבור משולב עם תאים סמוכים ופרופיל SASP שלהם17. פער זה מדגיש את הצורך במודלים של הזדקנות ספציפיים למלנוציטים המשקפים בצורה מדויקת יותר את תגובותיהם הפיזיולוגיות ללחצים סביבתיים18,19 ואת תרומתם להזדקנות העור האנושי.

למרות זמינות גישות הזדקנות הנגרמות מלחץ, יישומן במלנוציטים ראשוניים בבני אדם נותר מאתגר מבחינה טכנית ולעיתים קרובות קשור לשונות משמעותית. המלנוציטים רגישים במיוחד ללחץ חמצוני, מה שיוצר חלון ניסוי צר בין השראת הזדקנות אפקטיבית לבין ציטוטוקסיות מופרזת. בנוסף, הבדלים התלויים בתורמים בהכנות התאים הראשוניים תורמים עוד יותר לתוצאות לא עקביות בין המחקרים. אתגרים אלו לעיתים קרובות מדווחים בחסר, ופרוטוקולים לעיתים אינם סטנדרטיים מספיק, מה שמגביל את השחזוריות. הפרוטוקול הנוכחי מתמודד עם פער זה על ידי מתן משטר טיפול אופטימלי וניתן לשחזור, לוח מינונים מוגדר וקריאות סטנדרטיות להשראה והערכה אמינה של הזדקנות במלנוציטים ראשוניים בבני אדם.

טרט-בוטיל הידרופרוקסיד (tBHP) הוא גורם מאופיין היטב ללחץ חמצוני שמקדם הזדקנות על ידי יצירת מיני חמצן תגובתיים והחלשת ההגנות הנוגדי חמצון התאיות. הוא שימש רבות ליצירת הזדקנות בפיברובלסטים דרמליים, שם הוא מפעיל סימני הזדקנות ייחודיים תוך שמירה על חיוניות התא20,21. מכיוון ש-tBHP מייצר לחץ חמצוני מתמשך דרך מסלולים ביוכימיים מוגדרים, הוא מציע מערכת ניתנת לשחזור ונגישה לחקר הזדקנות הנגרמת על ידי לחץ חמצוני ולחקירת המנגנונים המולקולריים המקשרים בין נזק חמצוני לתהליכי הזדקנות22,23. בניגוד למודלים מבוססי UV, tBHP הוא יתרון מיוחד כאשר נדרשת השראה מבוקרת וניתנת לשחזור של מתח חמצוני, ללא תלות בפרמטרי הקרינה וללא צורך בציוד מיוחד.

HNM מספק מודל רלוונטי לחקר מנגנוני הזדקנות חיצוניים24. בתור תאים ראשוניים שמקורם בעורלה, הם שומרים על מסלולי תגובה ללחץ ושלמים ונמנעים מהחפצים הקשורים לשינוי גנטיאו הנצחה. מלנוציטים יילודים מספקים מודל ניסויי אופטימלי שכן הם מציגים נזק בסיסי מינימלי, ומאפשר הערכה ברורה של מסלולי הזדקנות הנגרמות על ידי גורמים סביבתיים26,27.

מחקר זה עושה שימוש בלחץ חמצוני המושרה על ידי tBHP במלנוציטים ניאונטליים ראשוניים בבני אדם, ומתגבר על מגבלות של מודלים תאיים לא-מלנוציטיים ובלתי מונצחים הנפוצים במחקר הזדקנות. הוא מספק פלטפורמה סטנדרטית לבחינת מנגנוני הזדקנות ספציפיים למלנוציטים ולאפיון הפנוטיפ המזדקן עם סימנים מבוססים. בסך הכול, פרוטוקול זה מספק מודל שכפול ורלוונטי פיזיולוגית לחקר הזדקנות הנגרמת מלחץ חמצוני במלנוציטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מותאם למחקר על מלנוציטים ראשוניים של יילודים (HNM) לחקר מנגנוני הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ הנגרמת על ידי tBHP (איור 1). המלנוציטים נגזרו מעור עורלה קווקזי יילודים (פוטוטיפ פיגמנטציה קלה) והושקו ממקור מסחרי. לפי תיעוד הספק, רקמות אנושיות נאספות מתורמים שמודעים היטב ונתנו הסכמה, בהתאם למסגרות אתיות ומשפטיות מבוססות, כולל הצהרת הלסינקי ותקנות הגנת המידע החלות. התאים סופקו בצורה לא מזוהה. לא נדרשה אישור אתי נוסף לשימוש בהם במחקר זה. כל הניסויים בוצעו באמצעות אותו קו מלנוציטים כדי להבטיח עקביות. יש לשים לב שכאשר משתמשים בקווי תאים ראשוניים שונים, ייתכן שיהיה צורך בהתאמה נוספת של תנאי התרבית, כמו גם בריכוזים ונהלי הטיפול.

1. הכנות

הערה: כדי להתחיל טיפול ב-tBHP, יש להפשיר מלנוציטים לפחות שלושה ימים מראש כדי לאפשר התאוששות וחיבור מספקים. שלב הטיפול נמשך 4 ימים, כאשר יום הזריעה מוגדר כיום 0. פרטים על כל החומרים בהם השתמשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

  1. להכנת מדיום התרבית, שלבו את מדיום הבסיס של המלנוציטים עם גורמי גדילה מתאימים. להבעיר את מכסה כל בקבוקון לפני הוספת תכולתו למדיום כדי למזער זיהום. הוסף 1% (v/v) PenStrep למדיום המוכן ואחסן אותו ב-4°C עד לשימוש.
  2. לפני הזריעה, יש להכין את תמיסת מעכב הטריפסין על ידי דילול מעכב טריפסין סויה ב-DPBS. מסננים את התמיסה דרך ממברנה של 0.22 מיקרון, אליקווט, ואחסנו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה, ניתן להשתמש בה עד 10 ימים.

2. הפשרת תאים (יום -3)

אזהרה: כל חומר במגע עם תאים אנושיים צריך להיחשב כמזוהם ביולוגית ולהיפנה בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות. כדי להעריך הזדקנות, אנו משתמשים בבדיקות משלימות שמעריכות עצירת גדילה, פעילות SA-β-gal וסמנים מולקולריים נוספים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים לבדיקות אלו ואת התוצאות הצפויות בעבודה עם מדדי ההזדקנות הללו.

  1. פיפטה 20 מ"ל של מי מלח בופר פוספט של דולבקו (דרגת תרבית תאים) לצינור קוני של 50 מ"ל בטמפרטורת החדר. שמור על תאי הבקבוקון המכילים קרח עד להפשרה.
  2. להבעיר את המכסה לפני פתיחת הבקבוקון שמכיל את התאים, שחרר והדליק שוב את הצדדים כדי למנוע זיהום פוטנציאלי.
  3. העבר 500 מיקרוליטר DPBS לבקבוקון המכיל את התאים. הפשיר בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ואז העבר את כל התכולה לצינור.
  4. צנטריפוגה ב-100 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הכדור המתקבל אמור להיראות בז' עד חום (או כהה יותר, תלוי במוצא התורם).
  5. הכן בקבוק T75 עם 14 מ"ל מדיום מלנוציטים.
  6. להבעיר פיפטת פסטר מזכוכית (להבעיר בכל פעם בעת טיפול במלנוציטים), שאפו בזהירות את ה-DPBS, והחזירו את הכדור ל-1 מ"ל של מדיום.
  7. העבר לבקבוק שהוכן מראש.
  8. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, וצפו מדי יום תחת מיקרוסקופ. החלף בינוני לפחות כל 48 שעות.
    הערה: כל בקבוקון מוקפא מכיל כ-1 ×-106 מלנוציטים ראשוניים בבני אדם. כל הניסויים בוצעו באמצעות תאים בקטע 9.

3. זריעת תאים (יום 0)

  1. יש להבטיח מפגש של 80–90% מהתאים ביום הזריעה.
  2. שאפו את המדיום מהבקבוקון ושטפו פעמיים עם DPBS.
  3. נתק תאים על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-אדטה ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
  4. הקישו בעדינות על הבקבוקון והתבוננו תחת מיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק תאים מלא (דגרו זמן רב יותר במידת הצורך).
  5. עצור את התגובה על ידי הוספת פי 1.5 מנפח מעכב הטריפסין.
  6. העבר את תליית התא לצינור קוני של 15 מ"ל ודילל עם DPBS לנפח סופי של 10 מ"ל.
  7. צנטריפוגה את המתלה של התא ב-100 × גרם למשך 5 דקות.
  8. שאפו את הסופרנטנט והחזירו את הנפח הרצוי במידיום.
  9. לצלחות מטופלות ב-tBHP, זרעים 6 ×10 5 תאים לכל צלחת של 10 ס"מ. לצלחות ביקורת, זרעו 4 ×-105 תאים בכל צלחת.
    הערה: עבור לוחות שטופלו ב-tBHP, יש לזרוע צפיפות תאים גבוהה יותר כדי להבטיח מספיק תאים זמינים לניסויים, שכן קצב הגדילה שלהם ירד בהדרגה במהלך הטיפול. אם זורעים תאים על כיסויי כיסוי לניסויי מיקרוסקופיה, יש לצפות את הכיסוי ב-0.1 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין ולייבש לחלוטין לפני זריעת התאים.
  10. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. החלף מדיום כל 48 שעות ללוחות בקרה.

4. טיפול ב-tBHP (ימים 1–4)

  1. הכינו תמיסת עבודה של 10 mM מקת tBHP (מדולל ב-DPBS או מדיה).
    הערה: tBHP רגיש לאור: כסה את המיכל כשאתה עובד איתו. התמיסה העובדת יכולה לשמש עד שבוע כאשר היא מאוחסנת כראוי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לוח טיפולים: יום 1 (היום שאחרי הזרעה) מסמן את תחילת החשיפה ל-tBHP. המלנוציטים מטופלים פעמיים ביום עם מרווח של לפחות 4 שעות בין השימושים. משטר זה חוזר על עצמו מהיום הראשון ועד היום הרביעי, בסך הכול 4 ימי טיפול. ריכוז tBHP שנבחר ולוח הטיפולים הותאמו ממחקרים קודמים בפיברובלסטים דרמליים, שבהם ריכוזים נמוכים הספיקו לגרימת הזדקנות. במלנוציטים ראשוניים, עם זאת, נדרשו ריכוזים גבוהים יותר כדי להשיג השראת הזדקנות עמידה, ו-100 מיקרומו tBHP זוהו כאופטימלי בהתבסס על ניסויי טיטרציה שאיזונו בין השראת הזדקנות לחיוניות התאים
  2. הוסיפו 100 מיקרומום tBHP לתאים למשך שעה לכל טיפול (כדי להתחיל, הוסיפו את נפח התמיסה המתאימה, תוך הבטחת פיפטה לתוך הנוזל).
  3. הזז את הפלטה קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את ה-TBHP באופן שווה בכל המדיום.
    הערה: הימנעו מתנועות מעגליות כי הן עלולות לגרום לחלוקה לא אחידה של tBHP דרך התווך.
  4. דגרו בדיוק שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
  5. כדי להפסיק טיפול ב-tBHP, יש לשאוף את המדיום.
  6. שטוף את הפלטות פעמיים עם DPBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס).
  7. הוסיפו את הנפח המתאים של מדיום טרי לצלחות.
  8. אפשר לתאים להתאושש באינקובטור לפחות 4 שעות לפני תחילת הטיפול הבא.
  9. חזרו על ההליך הזה באותו יום לטיפול השני והמשיכו בימים הנותרים. שמרו את התאים בתרבות לאחר סיום הטיפול עד היום התשיעי כדי להעריך סימני הזדקנות.
  10. פקח על לוחות הבקרה והמעבר אם הם מתכופפים.

5. ניתוח עקומת צמיחה

  1. ספירת תאים ובקרות שטופלו ב-tBHP בהתאם לפרוטוקול הזרעה.
  2. זרע מחדש את אותה צפיפות התחלתית או את כל התאים במקרה שאתה סופר פחות מ-6 ×10 5 תאים לפלטות tBHP.
  3. בצע ספירת תאים בימים 4, 9 ו-15 של התרבית.
  4. חשב את עקומת הצמיחה באמצעות הנוסחה הבאה:
    LG (ספירה) - log (seed) / 0.301 + cPDL
    ספירה: מספר התאים שהושגו בסוף המעבר.
    זרע: מספר התאים שצופים לראשונה בתחילת המעבר.
    cPDL: רמת הכפלה מצטברת של האוכלוסייה שהועברה מהמעברים הקודמים.

6. פעילות SA-β-גלקטוזידאז

  1. ביום התשיעי, שטפו תאים פעמיים ב-PBS לפני הקיבוץ עם 2% פורמלדהיד ו-0.4% גלוטראלדהיד.
  2. שטוף תאים פעמיים עם PBS.
  3. דגרו תאים קבועים עם תמיסת צביעה עם pH של 6.0 (150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ מ"מ מיג"קל, 5 מ"מ פריציאניד אשלגן, 5 מ"מ פרוציאניד אשלגן, 40 מ"מ חומצה ציטרית, 12 מ"מ פול נתרן פוספט, ו-1 מ"ג/מ"ל 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטוזיד (X-גל).
  4. לאחר 18 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37°C בהיעדר CO₂, שטוף תאים פעמיים עם PBS.
  5. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור.
  6. כמת את מספר התאים המוכתמים בכחול תחת המיקרוסקופ על ידי ספירת מספר התאים הכחולים וחלוקה במספר התאים הכולל בשדה. הביעו את התוצאות כאחוז של תאים חיוביים.

7. צביעת אימונופלואורסצנציה

אזהרה: יש לטפל בפסולת פורמלדהיד, גלוטראלדהיד ופראפורמלדהיד כפסולת כימית מסוכנת ולהיפנות בהתאם לתקנות הבטיחות המוסדיות.

  1. השתמשו בתאים שתרבתו על כיסויי כיסוי מצופים מראש ב-0.1 מ"ג/מ"ל פולי-די-ליזין.
  2. ביום התשיעי, שטוף תאים פעמיים, ואז מקבע עם 4% פאראפורמלדהיד למשך 15 דקות.
  3. שטוף תאים פעמיים עם PBS.
  4. פרמיאביליז באמצעות 0.3% טריטון-X ו-0.1% נתרן ציטראט ב-PBS.
  5. בלוק עם 1% BSA ב-PBS-T למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. דגרו תאים עם נוגדן ראשוני γH2AX כדי לזהות תגובת נזק קבוע ל-DNA במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C בתא לח.
  7. למחרת, שטוף פעמיים עם PBS.
  8. מרח נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  9. צבע גרעיני DAPI אם רוצים.
  10. שטוף פעמיים עם PBS-T, אחר כך פעמיים עם PBS ופעמיים עם ddH2O.
  11. התקן כיסויי כיסוי ותן להם להתייבש לגמרי לפני ההדמיה.
  12. ניתוח עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת ו/או מוקדי γH2AX באמצעות תוכנת ImageJ.

8. בידוד RNA ו-RT-qPCR

זהירות: β-מרקפטואנול הוא רעיל מאוד ויש לטפל בו במכסה אדים. פסולת המכילה β-מרקפטואנול צריכה להיות מושלכת כפסולת כימית מסוכנת.

  1. ביום התשיעי, טריפסיניזציה של תאים באמצעות 2 מ"ל טריפסין-אדטה.
  2. עצור את התגובה על ידי מריחת פי 1.5 יותר של מעכב טריפסין.
  3. העבר את מתלה התא לצינור קוני של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-100 x g למשך 5 דקות.
  4. שאפו בזהירות את הסופרנטנט.
  5. כדורי תאי ליז על ידי השעיה מחדש בבופר RLT של 350 מיקרוליטר המכיל 1% β-מרקפטואנול.
  6. בידוד RNA באמצעות ערכת טיהור RNA מבוססת עמודה.
  7. קבעו את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר (260 ננומטר).
  8. לסינתזת cDNA, השתמשו ב-1 מיקרוגרם RNA לשעתוק הפוך בנפח תגובה כולל של 10 מיקרוליטר באמצעות תערובת שעתוק הפוך סטנדרטית (כולל בופר RT, dNTPs, פריימרים אקראיים, טרנסקריפטאז הפוך ומעכב RNase) ואחריהם תנאי מחזור תרמי לפי הוראות היצרן.
  9. בצע RT-qPCR עבור גורמי SASP
    הערה: גורמי SASP שנבחרו (IL-8, IL-6 ו-MMP-1) מייצגים רכיבים מבוססים היטב בפנוטיפ ההפרשה הקשור להזדקנות ונבחרו על פי רלוונטיותם לביולוגיית העור, כולל איתות דלקתי ועיצוב מחדש של מטריצת חוץ-תאית
    IL-6 (הנעה קדמית: 5' AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
    IL-8 (קדמי: 5' ACCGGAAGGAACCATCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACACAGAG 3')
    MMP-1 (הנעה קדמית: 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' הפונט: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTG 3')
    GAPDH (קדמית: 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' Rev: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
  10. ניתוח ביטוי mRNA יחסי באמצעות שיטת ΔΔCt עם נרמול לגן הניקיון GAPDH.

9. בידוד חלבון ו-Western Blot

  1. ביום התשיעי, אספו ליזאטים של חלבון.
  2. שאיפת מדיום ושטיפה פעמיים עם DPBS קר.
  3. תאי ליז משתמשים מכנית במגרד תאים לאחר הוספת בופר RIPA של 150 מיקרוליטר (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS ו-2 מ"מ EDTA) בתוספת מעכבי פרוטאז ומועברים לצינור של 1.5 מ"ל.
  4. בצע שלושה מחזורי הקפאה והפשרה ואחריהם דגירה של 30 דקות על הקרח.
  5. צנטריפוגה ב-9600 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. קבעו את ריכוז החלבון של הסופרנטנט באמצעות בדיקת BCA.
  7. הפריד כמויות שוות (20 מיקרוגרם) של חלבון על ג'לים פוליאקרילאמידיים ומועבר לממברנות PVDF מופעלות.
  8. חסום ממברנות בחלב רזה 5% ב-TBS-T.
  9. דגרו עם נוגדנים ראשוניים pRB ולמינB1 בלילה בטמפרטורה של 4°C.
  10. למחרת, שטוף את הממברנות 3 פעמים ב-TBS-T.
  11. דגרו בנוגדנים משניים מתאימים עם ה-HRP למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  12. לזהות חלבונים באמצעות כימלומינסצנציה ולבצע ניתוח צפוף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול ב-tBHP גורם לעצירת גדילה במלנוציטים יילודים בבני אדם.
טיפול ב-tBHP מעכב התרבות מלנוציטים בהשוואה לביקורת שלא טופלה (n = 3) (איור 2A). ביום התשיעי, התאים המטופלים מגיעים רק ל-1.4 cPDL, בעוד שהבקרים מגיעים ל-3.1 cPDL. הסטייה הזו גדלה עם הזמן, כאשר המלנוציטים המטופלים מתקרבים לרמה של 1.9 cPDL ביום ה-15, בעוד שהבקרים ממשיכים להתרחב לכמעט 5.1 cPDL. ההפחתה המתמשכת ביכולת ההתרבות תואמת את הפנוטיפ של הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה קובע גישה סטנדרטית להשראת הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ (SIPS) במלנוציטים יילודים אנושיים באמצעות tBHP, ומציע מודל איתן לחקר הזדקנות ספציפית בסוג תא זה. שינויים עקביים בהתפשטות, במורפולוגיה, בפעילות SA-β-gal, בסמני נזק DNA וברכיבי SASP תומכים בפנוטיפ המושרה. על ידי התמקדות במלנוציטים, תאים שטרם נחקרו במחקר ההזדקנות למרות תפקידם המרכזי בפיזיולוגיה של העור והפרעות פיגמנטציה27,28 מודל זה מסייע בפתרון פער קריטי בתחום. ההשראה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים. Lieve Declercq קשור ל-Proya Europe; עם זאת, לחברה לא הייתה השפעה על עיצוב המחקר, איסוף הנתונים, הניתוח, הפרשנות או ההחלטה לפרסם. המחברים מוסיפים כי כלי בינה מלאכותית (AI) שימשו אך ורק לסיוע בעריכת שפה ושיפור טקסט. כל התוכן המדעי, עיצוב הניסויים ופרשנות הנתונים פותחו ואומצו על ידי המחברים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במימון מקרן Tiroler Wissenschaftsfunds (ZAP746010, F.33287/10-2021, F.50279/7-2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 µמ מסנן ממברנהMerck SLGVR33RS
1 M חומצת לימון Merck K91567844הכן ב-aq. dest.
1 M MgCl2MerckA649033הכן ב-aq. dest.
1 M Na2HPO4MerckK56036736הכן ב-aq. dest.
10 M NaOHLab Honeywell30620הכן ב-aq. dest.
37% פורמלדהידSigma252549
4% פרפורמלדהידCarlRoth0335.3
5 M נתרן כלוריד SigmaS3014הכן ב-aq. dest.
50% גלוטראלדהידSigmaG6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)SigmaB9146
נוגדן משני צמוד Alexa Fluor-2 מג/מ"לInvitrogenA11008
BSA (אלבומין סרום בקר)SigmaA7030
חומר מצע כימילומינסנטיSigmaWBKLS0500
Costar CellLifter Corning3008
כיסויים לתרבית תאים/מיקרוסקופיהEprediaCB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal MediumCellSystemsLM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit CellSystemsLS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline SigmaD8537
מלנוציטים ניאו-נטליים אנושייםCellSystemsFC-0023
נוגדן LaminB1 (ארנב)AbcamAB16048דילול 1:1000 ב-5% BSA
תווך הטבעה המכיל DAPIAbcamAB104139
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין SigmaP4333
ג'לים מדורגים של פוליאקרילאמידBio-Rad456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 מ"ג/מ"ל GibcoA38904-01
אשלגן פריציאנידSigmaP8131
אשלגן פרוציאנידSigmaP-9387
נוגדן pRB (ארנב)CellSignalling93085דילול 1:1000 ב-5% BSA
קוקטייל מעכבי פרוטאזמוכן עצמיתN/A500 מ"מ NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 מ"מ PMSF; 1 מ"מ פעיל Na-Orthovanadate
חיץ RIPA מוכן עצמיתN/Aהמכיל: 50 מ"מ Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 מ"מ NaCl; 2 מ"מ EDTA
חיץ RLTQiagen1015762כלול ב-RNeasy Mini Kit 
RNeasy Mini KitQiagen74106
אבקת חלב סחוט (ל-5% חלב ב-TBS-T)Sigma70166
נתרן ציטרט (לתמיסת 0.1%)SigmaS4641
מעכב טריפסין סויה, 0.5 מ"ג/מ"ל Thermofisher17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)Sigma458139
Triton X-100 (לתמיסת 0.3%)SigmaT9284
תמיסת טריפסין-EDTASigmaT3924
β-mercaptoethanolCarlRoth4227.3
נוגדן γH2AX (ארנב)CellSignalling2577Sדילול 1:200 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight. J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).
  2. Dorf, N., Maciejczyk, M. Skin senescence-from basic research to clinical practice. Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).
  3. Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model. Sci Rep. 13, 17969 (2023).
  4. Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).
  5. Zhang, S., Duan, E. Fighting against skin aging: the way from bench to bedside. Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).
  6. Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review. Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).
  7. Addor, F. A. S. Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging. Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).
  8. Mucha, M., Skrzydlewska, E., Gęgotek, A. Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes. Commun Biol. 8, 1283 (2025).
  9. Hughes, B. K., Bishop, C. L. Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing. Biomedicines. 10, 3111 (2022).
  10. Kamiński, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development. Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).
  11. Jiménez-Cervantes, C., Martínez-Esparza, M., Pérez, C., et al. Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor. J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).
  12. Dańczak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Polańska, A., et al. Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents. Aging Cell. 22, e13845 (2023).
  13. Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis. Bioessays. 46, e2400135 (2024).
  14. Ali, L., Al Niaimi, F. Pathogenesis of melasma explained. Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).
  15. Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing. Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).
  16. Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
  17. Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts. Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).
  18. Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro. Cells. 11, 1489 (2022).
  19. Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation. Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).
  20. Kučera, O., Endlicher, R., Roušar, T., et al. The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro. Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).
  21. Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging. Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).
  22. Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD. Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).
  23. Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research. Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).
  24. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142, 620-632 (2015).
  25. Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Curr Protoc. 3, e774 (2023).
  26. Martic, I., Wedel, S., Jansen-Dürr, P., et al. A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes. Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).
  27. Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction. EMBO J. 38, e101982 (2019).
  28. Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging. Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).
  29. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).
  30. Kang, H. Y., Ortonne, J. P. What should be considered in treatment of melasma. Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).
  31. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases. Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).
  32. Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).
  33. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).
  34. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153, 1194-1217 (2013).
  35. Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. Mechanisms regulating melanogenesis. An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).
  36. Ratz-Łyko, A., Arct, J. Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review. J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).
  37. Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).
  38. Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice. Aging Cell. 20, e13296 (2021).
  39. Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SA Beta Galactosidase

מאמרים קשורים