SNRNP70 מראה פוטנציאל כסמן אבחנתי לאוסטיאוארתריטיס (OA), עם ביטוי עקבי נמוך יותר ברקמות OA מאשר בביקורת. הוא עשוי גם להפעיל השפעות אנטי-דלקתיות, מה שמרמז על דרך טיפולית. מחקרים מכניים עתידיים עשויים לסייע בקידום ניהול ה-OA.
מאמר מחקר
SNRNP70 קשור לחתימות הקשורות להידבקות מוקדית ולדלקת בכונדרוציטים באוסטיאוארתריטיס
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוסטיאוארתריטיס (OA) היא מחלת מפרקים ניוונית המתאפיינת בפירוק סחוס מתקדם ודלקת סינוביאלית, אך הגורמים המולקולריים המרכזיים לפתוגנזה שלה עדיין אינם מובנים במלואם. כאן נערכה הבדיקה האם SNRNP70 — רכיב מרכזי בקומפלקס U1 snRNP החיוני לחיבור קדם-mRNA — תורם להתקדמות ה-OA. ניתוח של עשרה מערכי נתונים ציבוריים של טרנסקריפטומיה הראה כי SNRNP70 היה מופחת באופן עקבי בסחוס OA בהשוואה לביקורת תקינה. מטא-אנליזה הצביעה על דיוק אבחוני טוב ל-OA, עם AUC מצטבר של 0.92. בכונדרוציטים ראשוניים בעכברים שהוגרו באינטרלוקין-1β (IL-1β), הביטוי SNRNP70 דוכא בתנאים דלקתיים. ביטוי כפוי של SNRNP70 לא רק הפחית את ייצור המתווכים הפרו-דלקתיים (IL-6 ו-MMP-13), אלא גם שיקם רכיבי מטריצה חוץ-תאיים (ECM) מרכזיים (ACAN ו-COL2A1) וקידם נדידת כונדרוציטים וריפוי פצעים. הקורלציה של פירסון, ואחריה העשרת KEGG, הצביעו על כך שאיתות הידבקות מוקדי הוא מסלול הקשור לוויסות SNRNP70 . ניסויי חילוץ תמכו ברעיון ש SNRNP70 משפר את יכולת השיקום של הכונדרוסיטים, לפחות בחלקו, על ידי הפעלת מסלול זה. יחד, ממצאים אלו מצביעים על כך SNRNP70 עשויים לשמש כרגולטור שלא זוהה קודם לכן לתפקוד הכונדרוסיטים הדלקתיים ולהומאוסטזיס הסחוס. הם גם מעלים את האפשרות לקשר מכניסטי בין פעילות הספליסאוזומים לבין סינתזת מטריצה המתווכת על ידי הידבקות מוקדית, מה שדורש הערכה נוספת של SNRNP70 כסמן אבחוני מועמד או מטרה טיפולית ב-OA.
מבוא
אוסטאוארתריטיס (OA) מייצגת בעיה נפוצה במפרקים הפוגעת בעיקר באנשים בגיל 65 ומעלה, ומשפיעה על כ-7%מאוכלוסיית העולם. באופן מדהים, בין 1990 ל-2019, שכיחות ה-OA העולמית זינקה בשיעור מדהים של 113.25%, ועלתה מ-247.51 מיליון מקרים ל-527.81 מיליון3. OA מאופיין בעיקר בהתקדמות מתוחכמת של שינויים ניווניים ברקמות המפרק, הכוללים באופן בולט פירוק סחוס ודלקת סינוביאלית 4,5,6. ראוי לציין כי העומס המכני והקצב הבלתי נמנע של הזמן הוכחו כשני גורמי הסיכון הבולטים ביותר התורמים לפתוגנזה 7,8. בנוסף, מספר הולך וגדל של מחקרים מדגישים את התפקיד המרכזי שמילאה ניוון המניסקול כאלמנט אינטגרלי בפתולוגיה המורכבת של OA9. מחקרים קודמים הראו באופן משכנע כי נגעים במניסקוס פוגעים ב-68% עד 90% מחולות OA 10,11.
ברמה המולקולרית, גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך ש-OA אינו רק תוצאה של לחץ ביומכני והזדקנות, אלא גם מחלה המונעת משינויים מורכבים בוויסות הגנים ובבקרה לאחר שעתוק 12,13,14. מבין המנגנונים הללו, הספליסאוזום זכה לתשומת לב גוברת בהקשרים שונים של מחלה. מעניין לציין שלמרות שהיה מוקד מחקר נרחב על הפתוגנזה של דלקת, תפקיד הספליסאוזום ב-OA נותר פחות נחקרב-15,16,17. בעצם, ניתן לתאר את הספליסאוזום כריבוזים מתכתי מונחה חלבון18,19. מבין המנגנונים הללו, חיבור RNA הפך לגורם קריטי של פנוטיפ כונדרוציטים וההומאוסטזיס של ECM. חיבור מדויק מבטיח ביטוי נכון של חלבוני מבנה ואיתות החיוניים לשלמות הסחוס, בעוד שחיבור חריג יכול להפריע להחלפת ECM, לקדם מסלולים קטבוליים ולהאיץ את התנוונות של הסחוס 20,21,22.
מחקרים עדכניים הדגישו חלבוני ספליסאוסומליים כגורמים מרכזיים להומאוסטזיס רקמת המפרק, אך תפקידם של חלבונים אלה בפתוגנזה OAנותר ברובו לא נחקר. במיוחד, SNRNP70, רכיב מרכזי במתחם ריבונוקלאו חלבון גרעיני קטן U1, שולט בזיהוי אתרי חיבור בגודל 5′ במהלך עיבוד קדם-mRNA ובכך משפיע על הכללה או הדרה של אקסונים ספציפיים24,25. דיסרגולציה של SNRNP70 הייתה מעורבת במצבים פתולוגיים שונים, אך תרומתה לניוון הסחוס לא תוארה קודם לכן. אחד היעדים הפוטנציאליים של ויסות מתווך ספליסאוזום הוא קינאז הדבקה מוקדית (FAK), מולקולת איתות מרכזית המשלבת רמזים מכניים וביוכימיים לשליטה בהידבקות כונדרוציטים, דינמיקת שלד, הישרדות וטרנסדוקציה26. פעילות מוגברת של FAK נקשרה לעלייה באיתות הידבקות מוקדית, אשר בתורו מקדם סינתזת ECM והגברת ויסות חלבונים ספציפיים לסחוס, כולל אגרקן (ACAN) וקולגן סוג II אלפא 1 (COL2A1)27,28. חלבונים אלו חיוניים לשמירה על מבנה ותפקוד הסחוס, והירידה בוויסות שלהם היא סימן היכר של התקדמות דלקת מירוקית.
למרות התקדמות במחקר שעתוק ואפיגנטי ב-OA, תפקיד ויסות FAK המתווך על ידי ספליסאוסומים בשליטה באיתות הידבקות מוקדית ובמטבוליזם של ECM נותר לא מוגדר היטב. בהתבסס על תצפיות אלו, הוחנק כי SNRNP70 יכול להשפיע על התנהגות כונדרוציטים וההומאוסטזיס של ECM על ידי ויסות חיבורים חלופיים של FAK ואיתות הידבקות מוקדית במורד הזרם. כדי לבדוק רעיון זה, השאלה הראשונה הייתה האם הביטוי SNRNP70 משתנה ב-OA; הפוטנציאל שלו כסמן אבחוני הוערך, ונחקרו הקשרים האפשריים שלו לתגובות דלקתיות ולמסלולים הקשורים להידבקות מוקדית בכונדרוציטים.
פרוטוקול
פרוטוקול מחקר בעלי החיים אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת גואנגשי הרפואית ושל בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת גואנגשי (קוד פרוטוקול 202109001, מס' 2022-KY-E-252).
אזהרה: כל ההליכים חייבים לעמוד בהנחיות מוסדיות וארציות לטיפול בבעלי חיים. אנשי צוות מיומנים חייבים ללבוש ציוד מגן אישי (כפפות, מסכות, חלוקי מעבדה) בעת טיפול בבעלי חיים או דגימות. ניתוחים דורשים הרדמה מספקת ומעקב לאחר הניתוח. דווח על תופעות לוואי (דימום, זיהום, שינויים בהתנהגות) במהירות. השליכו גופות וחומרים מזוהמים בצורה נכונה. בצע בדיקות שוטפות במתקן כדי לוודא עמידה בתקנים. הפרטים המסחריים של בעלי החיים, התגובות והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.
מטופלים ומאגרי ביטוי גנים
כדי לחקור את דפוסי הביטוי של SNRNP70 ב-OA, אוספו באופן שיטתי מאגרי נתוני ריצוף RNA (RNA-seq) ומיקרו-מערך זמינים לציבור ממסד הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)21. אסטרטגיית החיפוש כללה את מילות המפתח הבאות: "SNRNP70 OR RPU1 או SNP1 או U1AP או U170K או U1RNP או RNPU1Z או SNRP70 או U1-70K" בשילוב עם "OA". קריטריוני ההכללה הוגדרו כך: (i) מערכי נתונים שמקורם בדגימות אנושיות; (ii) מחקרים המתמקדים במיוחד בדלקת מפרקים שגרונית, כאשר דלקת מפרקים שגרונית ומחלות דלקתיות נוספות אינן כלולות; (iii) זמינות של לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים הן בקבוצות OA והן בקבוצות ביקורת נורמליות (NC), ובכך לאפשר חישוב הבדלים ממוצעים סטנדרטיים (SMD). תהליך עיבוד נתונים: לאחר זיהוי מערכי נתונים זכאים, הורדו נתוני הביטוי הגולמיים והמטא-דאטה הקליניים המתאימים. עבור מערכי נתוני מיקרו-מערך, נתוני רמת הגשוש נורמל באמצעות אלגוריתם ממוצע רב-מערך (RMA) החזק, והגשושים הועברו לסימני גנים רשמיים באמצעות קבצי ההערות של הפלטפורמה. עבור מערכי נתונים של RNA-seq, ספירות גולמיות הומרו לערכים של תמלילים למיליון (TPM), ואז עברו ל-log-2 כדי להבטיח השוואה בין מערכי נתונים. כאשר מספר גשושים מופו לאותו גן, נשמר הגלאי עם השונות הגבוהה ביותר בביטוי בין דגמים. בקרת איכות והרמוניזציה: כדי למזער השפעות אצווה במחקרים שונים, הוחל פונקציית ComBat מחבילת "sva" R. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) בוצע לפני ואחרי תיקון כדי להעריך את יעילות הסרת אפקט באצווה. מערכי נתונים שהציגו איכות ירודה, הערות לא שלמות או שלא הבחינו בין קבוצות OA ל-NC הוצאו מניתוח נוסף.
זיהוי SNRNP70 המובע באופן שונה ברקמות OA וברקמות סחוס תקינות
כדי להעריך את הביטוי השונה של SNRNP70 בין רקמות OA לרקמות סחוס תקינות (NC), נעשה שימוש בגישה אנליטית רב-שלבית. ראשית, נתוני ביטוי עבור SNRNP70 הופקו ממאגרי נתונים זמינים. השוואות סטטיסטיות בין קבוצות OA ל-NC בוצעו באמצעות מבחן t של סטודנט כדי לקבוע האם רמות הביטוי הממוצעות שונות באופן משמעותי. כדי להעריך עוד את עוצמת ההבחנה של SNRNP70, נוצרו עקומות מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) באמצעות GraphPad Prism 8.0 ופלטפורמת Sangerbox (http://vip.sangerbox.com/). השטח מתחת לעקומה (AUC) חושב כדי לכמת את יעילות האבחון של רמות הביטוי SNRNP70 .
לאחר מכן בוצעה מטא-אנליזה באמצעות Stata 14.0 לשילוב ממצאים בין מספר מערכי נתונים. ההטרוגניות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן Q של קוקרן וסטטיסטיקת I2 . כאשר ההטרוגניות הייתה נמוכה (p > 0.01 ו-I2 < 50%), יושם מודל אפקטים קבועים; אחרת, אומץ מודל השפעות אקראיות. הפרש הממוצע הסטנדרטי (SMD) עם רווח האמון (CI) המתאים שלו (CI) חושב כדי לכמת ביטוי SNRNP70 שונה בין רקמות OA ל-NC. לצורך דיוק אבחון, בוצעה מטא-אנליזה אבחנתית באמצעות מודול מידאס ב-Stata. ניתוח זה העריך רגישות משותפת, ספציפיות, יחס סבירות חיובי (PLR), יחס סבירות שלילי (NLR) ויחס סיכויים אבחנתיים (DOR) עבור SNRNP70. בנוסף, נבנתה עקומת סיכום מאפייני הפעלה של מקלט (sROC) כדי לספק הערכה כוללת של ביצועי האבחון. לבסוף, בוצעו ניתוחי רגישות על ידי השללת מערכי נתונים בודדים ברצף כדי להעריך את החוסן והיציבות של התוצאות המאוחדות. הטיית הפרסום הפוטנציאלית הוערכה באמצעות מבחן א-סימטריית תרשים משפך של דיקס. באמצעות מסגרת אנליטית משולבת זו, דפוסי הביטוי והפוטנציאל האבחוני של SNRNP70 ברקמות OA בהשוואה לרקמות NC הוערכו באופן שיטתי.
בידוד תאים ותרבות
כונדרוציטים ראשוניים בודדו מהסחוס המפרקי של עכברי ספרג–דולי ביום השני לאחר הלידה. בסך הכל שימשו שישה חולדות יילודות בכל בידוד. מכיוון שהחיות נאספו בשלב מוקדם לאחר הלידה, לא נקבע מין. לכל הכנה עצמאית של תא, רקמות סחוס מכל ששת העכברים נאספו ואוגדו לפני התרבית. כל הכנה מבודדת של כונדרוציטים — שמקורה בקבוצה נפרדת של בעלי חיים — טופלה כשכפול ביולוגי אחד. שכפולים טכניים, כולל בארות חוזרות או תגובות qRT-PCR חוזרות מאותו הכנת תא, לא נחשבו לשכפולים ביולוגיים עצמאיים.
בקיצור, חולדות יילודות הושמתו בתנאים סטריליים, ומפרקי הברך נחתכו כדי לחשוף את הסחוס המפרקי. רקמת הסחוס הופרדה בזהירות מהעצם התת-כונדרלית באמצעות מספריים מיקרוכירורגיים, נחתכו לחתיכות של כ-1 מ"מ מעוקב, ולאחר מכן עוכלה ברצף עם אנזימים. קטעי הרקמה הוגברו תחילה עם 0.25% טריפסין–EDTA למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להסרת רקמת חיבור שנותרה. לאחר שטיפה עם מי מלח עם בופר פוספט, החלקים הנותרים עוכלו עם 0.2% קולגנאז סוג II ב-DMEM ללא סרום למשך 4–6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. ההשעיה התאית שהתקבלה עברה סינון דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרון, צונטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות, והושתה מחדש ב-DMEM מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. התאים הוזרעו לתוך בקבוקי תרבית ונשמרו על 37 מעלות צלזיוס בתנור לח עם 5% CO₂. המדיום הוחלף כל 2–3 ימים. רק כונדרוציטים במעבר 1 או 2 שימשו בניסויים הבאים כדי למזער את הדה-דיפרנציאציה.
זהות וטוהר הכונדרוציטים אושרו לפני השימוש בניסוי. מורפולוגית, תאים ראשוניים הראו מראה טיפוסי של כונדרוציטים בפוליגונל או דמוי אבן מרוצפת תחת מיקרוסקופיית פאזה-ניגודיות. ברמה המולקולרית, זהות הכונדרוציטים אושרה על ידי ביטוי של סמנים הקשורים לסחוס, כולל COL2A1 ו-ACAN, באמצעות כתם מערבי. במודל הדלקתי במבחנה , כונדרוציטים ראשוניים גורו עם אינטרלוקין-1β עכברוש רקומביננטי (IL-1β) בעוצמה של 10 ng/mL במשך 48 שעות. תאים לא מטופלים שתרבו בתנאים זהים שימשו כקבוצת ביקורת נורמלית. בניסויים SNRNP70 בביטוי יתר, כונדרוציטים מתכשירים ביולוגיים עצמאיים עברו טרנספקציה נפרדת, וכל שכפול ביולוגי עובד באופן עצמאי לאורך כל תהליך טרנספקציה, גירוי IL-1β, הפקת RNA/חלבון וניתוח סטטיסטי.
PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)
סך ה-RNA בודד מתרביות כונדרוציטים תת-מתנגשות (~80% קונפלינציה) באמצעות ערכת RNAfast200. טוהר ה-RNA הוערך על NanoDrop 2000, שקיבל רק דגימות עם יחס A260/280 של 1.8–2.0, והשלמות אושרה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1%. cDNA בגדיל ראשון הועתק הפוך מ-1 מיקרוגרם RNA כולל באמצעות ערכת qPCR RT בתגובה של 20 מיקרוליטר הכוללת פריימרים אקראיים ו-dNTPs. הפרופיל התרמי לשעתוק הפוך היה 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. qPCR בוצע עם פרה-מיקס מבוסס SYBR Green על מערכת PCR בזמן אמת. כל תגובה בנפח 20 מיקרוליטר כללה 10 מיקרוליטר SYBR Green Master Mix, 0.5 מיקרוליטר של פריימרים קדמיים ואחוריים (10 מיקרומון), 2 מיקרוליטר cDNA, ו-7 מיקרוליטר מים ללא גרעין. תנאי הרכיבה היו: 95 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, לאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות ל-5 שניות ו-60 מעלות ל-30 שניות. ניתוח עקומת ההתכה בוצע לאחר ההגברה כדי לאמת את הספציפיות של מוצר יחיד. GAPDH שימש כהפניה פנימית, והביטוי היחסי חושב בשיטת 2−ΔΔCt . התגובות בוצעו בשלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. רצפי פריימר מפורטים בטבלה 1.
כתם מערבי
הביטוי החלבוני של ACAN, COL2A1 ו-MMP13 הוערך בכונדרוציטים לאחר טיפול ב-IL-1β וביטוי יתר SNRNP70. התאים נשטפו פעמיים עם מי מלח עם בופר פוספט קר (PBS) ופורסמו בבופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז. הליזטים דוגרו על קרח במשך 30 דקות עם מערבולת מחזורית, ואז צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ריכוזי החלבון בסופרנטנטים שננקו נקבעו באמצעות ערכת BCA. כמויות שוות של חלבון (30 מיקרוגרם לכל נתיב) הופרדו על ידי 10% SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF באמצעות העברה רטובה. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן ב-TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולאחר מכן נבדקו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד ACAN (1:1000), COL2A1 (1:1000) או MMP13 (1:1000). לאחר שלוש שטיפות TBST (10 דקות כל אחת), הממברנות דגרו בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (1:5000) למשך שעה בטמפרטורת החדר. האות פותח באמצעות מגיב ECL ונקלט במערכת ChemiDoc XRS+. בוצעה צפיפות רצועה באמצעות ImageJ, וכל אותות החלבון המטרה נורמל ל-GAPDH כבקרת עומס. הנתונים מוצגים כרמות חלבון יחסיות לעומת קבוצת הביקורת.
טרנספקציה
כונדרוציטים עברו טרנספקט עם פלסמיד הבעה מופרזת SNRNP70 (oe-SNRNP70) לאחר שהתרביות הגיעו לכ-80% מפגש בערך. לצורך טרנספקציה, תאים הוזרעו לצלחות עם 6 בארות בכמות של 2 × 10⁵ תאים בכל באר והושארו להיצמד ללילה במדיום גדילה סטנדרטי (DMEM עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂. הטרנספקציות בוצעו באמצעות LipoFiter 3.0 בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, 2–3 מיקרוגרם DNA פלסמיד בכל באר דוללו ב-100 מיקרוליטר של תווך חופשי מסרום והתערבבו עם כמות מתאימה של תגובת שומן. קומפלקסי ה-DNA-ליפידים דוגרו במשך 15–20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר יצירת קומפלקסים, ואז נוספו בעדינות לכל באר המכילה כונדרוציטים במדיום טרי וללא סרום. לאחר 6 שעות, המדיום הוחלף במדיום גדילה מלא כדי להפחית ציטוטוקסיות.
יעילות הטרנספקציה והביטוי SNRNP70 הוערכו 48–72 שעות לאחר הטרנספקציה. רמות SNRNP70 mRNA נמדדו באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR), כאשר GAPDH משמש כבקרה פנימית. ביטוי החלבון הוערך באמצעות מערכת Western Blot האוטומטית הפשוטה לפי פרוטוקול היצרן. בקצרה, הוכנו ליזאטים של תאים, נמדדו ריכוזי חלבון, והדגימות הוטענו על מחסניות קפילריות להפרדה אוטומטית וזיהוי חיסוני באמצעות נוגדנים נגד SNRNP70. יעילות הטרנספקציה חושבה על ידי השוואת ביטוי SNRNP70 בתאים שעברו SNRNP70-OE-טרנספקט לזה בתאי בקרה שעברו טרנספקציה עם הוקטור הריק.
אימונופלואורסצנציה
אימונופלואורסצנציה שימשה לבחינת רמות חלבוני IL-6 ו-MMP-13 בכונדרוציטים OE-SNRNP70 לאחר גירוי IL-1β. בקצרה, תאים הוזרעו על מסגרות זכוכית סטריליות בלוחות עם 24 בארות וגודלו בתנאים סטנדרטיים עד שהגיעו למפגש של 70–80%. לאחר מכן הם תוקנו עם 4% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ונשטפו שלוש פעמים עם PBS. לצורך חדירה, הוחל 0.1% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אתרי קישור לא ספציפיים נחסמו על ידי דגירה של התאים באלבמין סרום בקר (BSA) של 5% ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.
לאחר החסימה, התאים דוגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד IL-6 ו-MMP-13 (מדולל ב-1:200 ב-1% BSA/PBS). לאחר שלוש שטיפות עם PBS להסרת נוגדנים ראשוניים לא קשורים, תאים נדגרו בנוגדנים משניים מצומדים פלואורופור ספציפיים למין (מדוללים ב-1:500) למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. הגרעינים צובעו נגד ב-4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 5 דקות. כיסויי כיסוי הותקנו על שקופיות זכוכית עם מדיום הרכבה נגד פייד, ותמונות פלואורסצנציה צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בהגדלה של 20×. לניתוח כמותי, 10 תאים שנבחרו באקראי לכל דגימה נותחו ב-ImageJ למדידת עוצמת הפלואורסצנציה של חלבוני היעד. עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת חושבה לכל קבוצה ושימשה להשוואה סטטיסטית.
בדיקת סגירת פצע בשריטה תאים
בוצעה בדיקת סגירת פצע לשריטה כדי להעריך את יכולת הכונדרוציטים לסגור פער פצע מלאכותי בתנאי טיפול שונים. כונדרוציטים ראשוניים נזרעו בלוחות של 6 בארות בצפיפות של 1 ×-10 עד 5 תאים בכל באר וגודלו עד שהושגה כ-90% מפגש באזור. נוצרה שריטה ליניארית בשכבת התא באמצעות קצה פיפטה סטרילי בנפח 200 מיקרוליטר. תאים מנותקים הוסרו על ידי שטיפה פעמיים עם PBS, ולאחר מכן נוספה מדיום תרבית מלא טרי המכיל את הטיפולים המיומנים. התאים חולקו לקבוצות הבאות: ביקורת תקינה, מטופלת ב-IL-1β, ו-IL-1β בתוספת ביטוי יתר SNRNP70 . תמונות של אותו אזור פצע צולמו בנקודות זמן של 6 שעות ו-12 שעות לאחר הגירוד באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור משלים 1). סגירת הפצע חושבה כאחוז ההפחתה בשטח הפצע ביחס לאזור הפצע ההתחלתי ב-0 שעות באמצעות הנוסחה הבאה:
סגירת הפצע (%) = [(אזור הפצע ב-0 שעה - אזור הפצע בנקודת הזמן המצוינת) / אזור פצע ב-0 שעות] × 100. (1)
ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים הכמותיים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) משלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים (n = 3) אלא אם צוין אחרת. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism 8.0. להשוואות בין שתי קבוצות, נעשה שימוש במבחן t לסטודנט לא מזווג. המובהקות הסטטיסטית צוינה כך: *p < 0.05 ו-**p < 0.01.
תוצאות
SNRNP70 ביטוי ברקמות חלל מפרקים
כדי לחקור באופן מקיף את תפקיד SNRNP70 ב-OA, נערך סקר שיטתי של 10 מאגרי נתונים RNA-seq ומיקרו-מערך זמינים לציבור שעמדו בקריטריוני הכללה והחרגה מחמירים (טבלה 2). רמות הביטוי SNRNP70 הופקו ונותחו בקפידה בין מערכי הנתונים הללו. באופן מרשים, ב-6 מתוך 10 קבוצות, הביטוי SNRNP70 היה מופחת משמעותית ברקמות OA בהשוואה לביקורת תקינה (p < 0.05), מה שמרמז על דפוס עקבי של דיכוי שעתוק (איור 1).
ראוי לציון, שלושה מערכי נתונים (GSE114007, GSE169077 ו-GSE19060) לא חשפו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין OA למדגם ביקורת. במקום להתעלם מהסתירות הללו, שימשו אסטרטגיות תיקון אצווה ואינטגרציה של מערכי נתונים כדי לשפר את החוסן והאמינות של הניתוח. באופן ספציפי, מערכי נתונים שמקורם בפלטפורמות ריצוף זהות אוחדו כדי להגדיל את הכוח הסטטיסטי. לדוגמה, GSE114007 שולב עם GSE89408 ליצירת GSE114007-89408, בעוד GSE169077, GSE12021 ו-GSE55457 אוחדו ל-GSE169077-12021-55457 (איור 1). גישה אינטגרטיבית זו צמצמה את השונות בין המחקרים וחיזקה את השחזוריות של הממצאים. לסיכום, ניתוחים של מערכי נתונים אנושיים חושפים ירידה עקבית בוויסות SNRNP70 ברקמות מפרקים של OA, מה שמרמז על פוטנציאל שלה כסמן ביולוגי אבחני. עם זאת, לא ברור האם ירידה זו גורמת ישירות לדיסרגולציה של הספלייזינג או להידרדרות הסחוס בבני אדם וממתין לאישור, רצוי במודלים של רקמות אנושיות.
יכולת אבחון קלינית של SNRNP70
כדי להעריך בקפדנות את הערך האבחוני של SNRNP70 ב-OA, בוצעה מטא-אנליזה מקיפה ששילבה נתונים מ-165 דגימות OA ו-125 ביקורת תקינה. זה מייצג, לפי מיטב הידע הזמין, את ההערכה השיטתית של SNRNP70 כסמן ביולוגי פוטנציאלי ב-OA. ניתוח ההטרוגניות גילה הטרוגניות משמעותית בין מערכי נתונים (I2 = 72.9%; p = 0.001), מה שמחייב מודל אפקטים אקראיים. הניתוח המאוחד הראה ירידה יציבה ועקבית בביטוי SNRNP70 ברקמות OA בהשוואה לביקורת תקינה, עם הפרש ממוצע סטנדרטי (SMD) של -1.07 (רווח סמך 95%: -1.34 עד -0.80) (איור 2A–B). מעבר לפרופילינג ביטוי, ביצועי האבחון של SNRNP70 הוערכו בהמשך. תוצאות בדיקות האבחון המאוחדות חשפו רגישות משולבת של 0.82 (רווח בר-סמך 95%: 0.57–0.94) וסגוליות של 0.88 (רווח בר-סמך 95%: 0.73–0.95), מה שמדגיש את יכולת ההבחנה החזקה שלה (איור 3א). באופן עקבי, עקומת מאפיין הפעולה הסיכום של מקלט (SROC) הניבה שטח מתחת לעקומה (AUC) של 0.92 (רווח בר-סמך 95%: 0.90–0.94), מה שמדגיש עוד יותר את הדיוק הגבוה של SNRNP70 בהבחנה בין חולי OA לאנשים בריאים (איור 3B).
כדי להבטיח את עמידות הממצאים הללו, בוצע ניתוח רגישות, שאישר כי הדרה רציפה של מערכי נתונים בודדים לא שינתה באופן מהותי את גודל ההשפעה הכולל (איור 4A). חשוב לציין כי גם מבחן אסימטריית גרף המשפך של דיק (p = 0.41) וגם מבחן אגר לא הראו הטיית פרסום משמעותית, מה שחיזק את אמינות התוצאות (איור 4B). יחד, הנתונים הללו מראים כי הביטוי SNRNP70 מצטמצם ב-OA ומציעים שהוא עשוי לשמש כסמן ביולוגי אבחני. עם זאת, ההטרוגניות בין מערכי הנתונים והיעדר קבוצת אימות עצמאית מצדיקים זהירות. לכן, ממצאים אלו נחשבים לראשוניים, ממתינים למחקרים נוספים להבהרת התועלת הקלינית של SNRNP70 באבחון ובניהול OA.
SNRNP70 מודולציה של ביטוי גנים דלקתיים ב-OA
כדי להגדיר את תפקיד הרגולציה של SNRNP70 באיתות דלקתי במהלך התקדמות OA, מודל OA במבחנה הוקם תחילה על ידי חשיפת כונדרוציטים ל-IL-1β, ציטוקין פרו-דלקתי מאופיין היטב. ניתוח qRT-PCR שנערך לאחר 48 שעות של גירוי IL-1β חשף ירידה משמעותית ברמות SNRNP70 mRNA בהשוואה לקבוצת NC (איור 5). דיכוי הביטוי SNRNP70 בתנאים דלקתיים היה תואם לנתונים טרנסקריפטומיים ממאגרי נתונים זמינים לציבור של OA, ובכך סיפק ראיות מוצקות לכך ש SNRNP70 מדוכאת באופן עקבי בדלקת הקשורה ל-OA. כדי לבדוק לעומק האם שיקום הביטוי SNRNP70 יכול לווסת את הפנוטיפ הדלקתי של כונדרוציטים, תאים עברו טרנספקציה באמצעות פלסמיד בעל הבעה יתר SNRNP70 (oe-SN). באופן מרשים, ביטוי מאולץ של SNRNP70 הקל משמעותית על דלקת הנגרמת על ידי IL-1β, כפי שמשתקף הן בשינויים שעתוקיים והן בשינויים תרגומיים. באופן ספציפי, qRT-PCR הראה ירידה משמעותית ברמות ה-mRNA של IL-6 ו-MMP-13 בקבוצת ה-oe-SN בהשוואה לביקורת שטופלו ב-IL-1β (איור 5).
בנוסף לממצאים המולקולריים הללו, צביעת אימונופלואורסצנציה סיפקה ראיות תאית ישירה לפוטנציאל האנטי-דלקתי של SNRNP70. בתאים שטופלו ב-IL-1β, IL-6 הציג הצטברות ציטופלזמית בולטת, התואמת מצב דלקתי מופעל. באופן בולט, ביטוי יתר של SNRNP70 הוביל להחלשה ניכרת בעוצמת הצביעה הציטופלזמטית של IL-6 (איור 6A), ובכך הדגיש את יכולתו להפוך את התגובה הדלקתית ברמה התאית. דפוס דומה נצפה עבור MMP-13, שבו טיפול ב-IL-1β שיפר את ביטו, אך ביטוי יתר SNRNP70 דיכא באופן משמעותי את מיקום ועוצמת האות של MMP-13 (איור 6B).
בניגוד למחקרים קודמים שהתמקדו בעיקר בנזק מבני לסחוס, נתוני ה-in vitro מכונדרוציטים של חולדות מצביעים על כך SNRNP70 פועל כגורם רגולטור של ביטוי גנים דלקתיים. בפרט, ביטוי כפוי של SNRNP70 מתווכים פרו-דלקתיים מונעים על ידי IL-1β מוחלשים, כולל IL-6 ו-MMP-13, במודל עכברוש זה. חשוב לציין שמכיוון שניסויים אלו נערכו אך ורק במודל דלקתי של חולדות, הם אינם משחזרים ישירות את ממצאי מערך הנתונים האנושי. עם זאת, תוצאות אלו מציעות מסגרת מושגית, המצביעה על כך ש SNRNP70 עשוי לשמש לא רק כגורם חיתוך אלא גם כמודולטור פוטנציאלי של דלקת — אפשרות שמצדיקה מחקר נוסף ברקמות האדם.
זיהוי מסלולים הקשורים ל-SNRNP70 ב-OA
כדי לחקור מסלולים ביולוגיים הקשורים לביטוי SNRNP70 באוסטאוארתריטיס, בוצע ניתוח קורלציה פירסון בנפרד במאגרי הנתונים הציבוריים של GSE98918, GSE117999, GSE129147, GSE51588, GSE169077_12021_55457, GSE114007-89408 ו-GSE82107-19060. גנים עם מקדם מתאם מוחלט (|r|) > 0.8 ו-p < 0.05 נחשבו כקשורים באופן מובהק לביטוי SNRNP70 בכל מאגר נתונים. נוצר איחוד גנים מקושרים בכל מערכי הנתונים, והניב 929 גנים הקשורים ל-SNRNP70.
ניתוח העשרת מסלולי KEGG בוצע לאחר מכן באמצעות חבילת clusterProfiler, עם התאמות לבדיקות מרובות בשיטת Benjamini–Hochberg. ניתוח זה חשף העשרה משמעותית של הגנים שזוהו בכמה מסלולים, כולל מסלול ההיצמדות המוקדית (איור 7). מפל האיתות הזה ידוע בכך שהוא מווסת הידבקות כונדרוציטים, טרנסדוקציה מכאנוטרנסדוקציה ועיצוב מחדש של ECM, כולם תהליכים מרכזיים בהתקדמות OA. יחד, ממצאים אלו מצביעים על קשר בין ביטוי SNRNP70 לבין חתימות ביטוי גנים הקשורות להידבקות מוקדית במאגרי OA.
SNRNP70 מתווך תיקון דלקתי של כונדרוציטים דרך מסלול ההיצמדות המוקדי
כדי להעריך את תפקיד SNRNP70 ביכולת הריפוי של כונדרוציטים דלקתיים, בוצעה בדיקת סגירת פצע באמצעות כונדרוציטים ראשוניים. התאים חולקו לשלוש קבוצות: ביקורת תקינה, מטופלת ב-IL-1β, ו-IL-1β בתוספת ביטוי יתר SNRNP70. גירוי IL-1β הפחית את היקף סגירת פער השריטה בהשוואה לקבוצת הביקורת התקינה, מה שמעיד על פגיעה ביכולת ההחלמה של פצעים במצבים דלקתיים. לעומת זאת, ביטוי יתר SNRNP70 קידם סגירת פער גירוד בכונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β ביחס לטיפול ב-IL-1β בלבד (איור 8A). ביחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שהביטוי המוגזם SNRNP70 משפר את תגובת סגירת הפצעים של כונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β.
ברמה המולקולרית, ניתוחי ווסטרן בלוט הראו כי טיפול ב-IL-1β מדכא את הביטוי של חלבוני מטריצת סחוס ACAN ו-COL2A1, תוך קידום העלאת הוויסות של האנזים המתפרק MMP13. חשוב לציין שהביטוי המופרז SNRNP70 לא רק החזיר את רמות ACAN ו-COL2A1, אלא גם הוריד משמעותית את ויסות MMP13, ובכך שמר על שלמות ה-ECM (איור 8B). מבחינה מכנית, במעבדה, ההשפעות המועילות של SNRNP70 היו קשורות קשר הדוק להפעלת מסלול איתות ההידבקות המוקדית.
ביחד, ניתוחי מערכי נתונים אנושיים מגלים כי SNRNP70 מווסת פחות ב-OA ושהביטוי שלו מתאם לגנים המעורבים במסלול ההיצמדות המוקדית. בכונדרוציטים של עכברים החשופים לגירוי IL-1β, ביטוי כפוי של SNRNP70 מקדם תיקון תאי דלקת וסינתזת ECM, וגם קשור לאיתות הידבקות מוקד. למרות שתצפיות אלו במבחנה ממודל עכברוש הן מרמזות, הן אינן תומכות ישירות בממצאים שהתקבלו ממאגרי נתונים אנושיים. עם זאת, קווי הראיות המתכנסים הללו תומכים במודל שבו SNRNP70 תורם לפתוגנזה של OA בבני אדם באמצעות איתות הידבקות מוקדית — השערה שכעת ממתינה לאישור סופי ברקמות אנושיות או במודלים בחיים בעלי רלוונטיות אנושית.
זמינות נתונים:
מערכי הנתונים ששימשו ונותחו במחקר זה זמינים ממאגר הנתונים GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). כל הנתונים שנוצרו או נותחו במהלך מחקר זה הוצגו במלואם ונדונו בתוך כתב היד. הנתונים הגולמיים של מחקר זה מועלים כקובץ משלימה.
איור 1: מבחן ה-t ועקומת ה-ROC של התלמידים לשבעה מחקרים. התוצאות הצביעו על כך שהביטוי SNRNP70 היה נמוך יותר ברקמות OA מאשר ברקמות NC ב-GSE117999, GSE129147, GSE98918, GSE51558, GSE114007-89408 ו-GSE169077-12021-55457 (p < 0.05), ו-ROC AUC הצביע על היתכנות גבוהה. p < 0.05 (*), p < 0.01(**). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 2: המטא-אנליזה לשבעה מערכי נתונים. (A) התוצאות הראו ש-I2 = 72.9%, p = 0.001, וה-SMD הכולל היה -1.07. (B) דיאגרמת המשפך הוערכה להטיית פרסום במטא-אנליזה. נמצא שהוא בעצם סימטרי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 3: ביצועי האבחון של SNRNP70. (א) מבחן ה-Q חשף כי גם לרגישות וגם לספציפיות היו ערכי p < 0.05, עם ערכי I2 של 86.05% ו-77.18%, בהתאמה, מה שמעיד על הטרוגניות משמעותית. המחקר דיווח על רגישות של 0.82 וספציפיות של 0.88, מה שמדגיש את ביצועיו הבולטים. (B) ה-AUC של ה-sROC היה 0.92, מה שמעיד על רמת אמון גבוהה במחקר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 4: ניתוח השפעה ותפיסת המשפך של דיק. (א) ניתוח ההשפעה הצביע על כך שהחרגת מחקר בודד לא השפיעה באופן משמעותי על התוצאות הכוללות. (B) בשבעה מחקרים, כל התוצאות לא הראו הטיה מובהקת (p = 0.41). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 5: תוצאות qRT-PCR מצביעות על ירידה משמעותית בביטוי SNRNP70 בכונדרוציטים לאחר טיפול ב-IL-1β. בקבוצת ה-OE-SN נרשמה ירידה ניכרת ברמות הביטוי של הסמנים הדלקתיים IL-6 ו-MMP13 בהשוואה לקבוצת IL-1, מה שמרמז כי ביטוי יתר של SNRNP70 יכול להפוך את הסמנים הדלקתיים בכונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD מ-n = 3 שכפולים ביולוגיים עצמאיים. ערכי p < 0.05 (*), ערכי p < 0.01(**). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 6: ניתוח IF של כונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β לאחר טיפול ב-IL-1β, המראה את עוצמת הפלואורסצנציה. (א) עוצמת הפלואורסצנציה של IL-6 ו-(B) MMP13 עלתה באופן משמעותי. עם זאת, ביטוי יתר של SNRNP70 הוביל לירידה משמעותית בעוצמת הפלואורסצנציה של הסמנים הדלקתיים IL-6 ו-MMP13. תוצאות אלו מצביעות על כך שהביטוי המופרז SNRNP70 עשוי להפחית דלקת בכונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β. כל התמונות המיקרוסקופיות צולמו בהגדלה פי 10. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD מ-n = 3 שכפולים ביולוגיים עצמאיים. ערכי p < 0.05 (*), ערכי p < 0.01(**). פס קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוח העשרת KEGG מבוסס קורלציה של גנים הקשורים ל-SNRNP70 במאגרי נתונים של דלקת מפרקים ניוסטית. עשרת המסלולים המועשרים המובילים שזוהו על ידי clusterProfiler (תיקון Benjamini–Hochberg). גודל הבועה = ספירת גנים; צבע = מובהקות (-log10(ערך p )). מסלול ההיצמדות המוקדי (מודגש) מתווך הידבקות כונדרוציטים, מכנוטרנסדוקציה ועיצוב מחדש של ECM ב-OA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 8: ביטוי יתר SNRNP70 משחזר תיקון ECM בכונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β. (א) תמונות של סגירת פצע בשריטה בבקרה, מטופלת ב-IL-1β, ו-IL-1β בתוספת כונדרוציטים עם הבעה יתר של SNRNP70. (B) כתמים מערביים מייצגים של מטריצת סחוס מרכזית וחלבונים קטבוליים. נבדקו ממברנות עבור ACAN, COL2A1 ו-MMP13. GAPDH מוצג כבקרת טעינה. ההגדלות הן כדלקמן: קבוצות NC, IL-1β ו-IL-1β+oe-SN: בהגדלה של 4x: פס סקאלה = 10 מיקרון. בהגדלה פי 10: פס סקאלה = 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.
איור משלים 1: ניתוח כמותי של סגירת פצעים וצפיפות כתם מערבי. (א) כימות סגירת שריטות בכונדרוציטים ראשוניים מקבוצות NC, IL-1β ו-IL-1β + oe-SNRNP70 . (B) כימות צפוף של תחומי הכתמים המערביים ACAN, COL2A1 ו-MMP13. עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות ImageJ ונרמלו ל-GAPDH. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD מ-n = 3 שכפולים ביולוגיים עצמאיים. *p < 0.05, **p < 0.01. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.
| גן המטרה | רצף פריימר קדמי | רצף פריימר קדמי |
| GAPDH | 5'-TCTCTGCTCCTCCCTGTTCTCT-3' | 5'-ATCCGTTCACACCGACCTTC-3' |
| SNRNP70 | 5'-GAGACATGCACTCCACCACG-3' | 5'-TGCGGTGTGTGATCTTACC-3' |
| IL6 | 5'-ACAAGTCCGGAGGAGAGACT-3' | 5'-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3' |
| MMP13 | 5'-GGACAAAGACTATCCCCGCC-3' | 5'-GGCATGACTCTCACAATGCG-3' |
טבלה 1: המבנים לגנים היעדים. רצפי פריימר קדימה ואחוריים עבור GAPDH, SNRNP70, IL6 ו-MMP13 המשמשים ב-qRT-PCR מוצגים, כולם בכיוון 5′ > 3′. GAPDH היה הבקרה הפנימית.
| מזהה מחקר | פלטפורמה | NC (נק) | OA (n) | טישו |
| GSE114007 | GPL11154, GPL18573 | 18 | 20 | סחוס |
| GSE117999 | GPL20844 | 10 | 10 | סחוס |
| GSE129147 | GPL15207 | 9 | 10 | סחוס |
| GSE169077 | GPL96 | 5 | 6 | סחוס |
| GSE12021 | GPL96 | 13 | 20 | סינוביום |
| GSE55457 | GPL96 | 10 | 10 | סינוביום |
| GSE89408 | GPL11154 | 28 | 22 | סינוביום |
| GSE82107 | GPL570 | 7 | 10 | סינוביום |
| GSE19060 | GPL570 | 3 | 5 | מניסקוס |
| GSE98918 | GPL20844 | 12 | 12 | מניסקוס |
| GSE51588 | GPL13497 | 10 | 40 | עצם תת-כינורית |
טבלה 2: מערכי הנתונים במחקר זה מתוך מסד הנתונים GEO. סיכום של 11 מערכי נתונים GEO זמינים לציבור העומדים בקריטריוני הכללה. לכל מאגר נתונים מסופקים מזהה גישה, פלטפורמה, ומספרי דגימות ביקורת תקינה (NC) ואוסטאוארתריטיס (OA), יחד עם סוג הרקמה. n = מספר הדגימות.
דיון
המחקר הנוכחי מציע כי SNRNP70 עשוי לשמש כגן מגן בפתוגנזה של OA, הפרעה מפרקית רב-פנים שמציבהאתגר בריאותי עולמי משמעותי. מחקר זה הוא הראשון שמדווח על תפקיד SNRNP70 ב-OA. במחקר זה הראינו ירידה משמעותית בביטוי SNRNP70 ברקמות OA, כפי שניתן לראות בניתוח נתוני GEO (SMD כולל = -1.07, רווח בר-סמך 95%: -1.34, -0.80; איור 2). חשוב לציין שממצא זה אומת לאחר מכן בכונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β. בנוסף, מחקר זה בחן את תפקיד SNRNP70 בתגובה הדלקתית של כונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β. כגן מגן הקשור ל-OA, SNRNP70 הפגין יכולת לעכב את התקדמות ה-OA על ידי דיכוי הביטוי של IL-1 ו-MMP13. עד כה, זהו המחקר הניסויי הראשון שדיווח על פער ניכר ברמות הביטוי SNRNP70 בין רקמות OA ל-NC, מה שמרמז על תפקיד פוטנציאלי ל-SNRNP70 בפתוגנזה של OA. תצפית מסקרנת זו מעוררת אותנו לשקול את ההשלכות האבחנתיות האפשריות של SNRNP70 ב-OA.
המטא-אנליזה שערכנו, שכללה מאגרי נתונים ומערכים מרובים של RNA-seq, הניעה ראיות לרלוונטיות האבחנתית הפוטנציאלית של SNRNP70. ה-SMD של -1.07 הדגיש את הירידה המתמשכת ב-SNRNP70 ברקמות OA, מה שהעלה את האפשרות לשימושו כמועמד אבחני. ניתוח עקומות ROC הדגיש עוד יותר פוטנציאל זה, עם AUC של 0.92, המצביע על כוח אפליה חזק. יתרה מזאת, ערכי הרגישות והספציפיות המשולבים תמכו ברעיון ש-SNRNP70 עשויים לאפשר אבחון מוקדם ומדויק יותר של OA. מעבר להבטחת האבחון שלו, SNRNP70 נשאר מועמד מעניין בהקשר של ניהול OA. הפתוגנזה של OA היא תהליך רב-גורמי הכולל עומס מכני, הזדקנות, נטייה גנטית ודלקת31,32. מבין הגורמים הללו, דלקת זכתה להכרה הולכת וגוברת כגורם מרכזי להתקדמות דלקת OA33,34. הוא מארגן שרשרת של אירועים, כולל התדרדרות סחוס, דלקת סינוביאלית ושינוי הומאוסטזיס מפרקים.
מחקר זה בחן את הפוטנציאל האנטי-דלקתי של SNRNP70, מונע מתפקידו כמרכיב ספליסאוסום35,36. באמצעות מודל מבחץ, טופלו כונדרוציטים בעכבר רקומביננטי IL-1β כדי לחקות את המיקרו-סביבה הדלקתית במפרקי OA. ממצאים אלו מצביעים על כך SNRNP70 עשוי למלא תפקיד בוויסות דלקת בכונדרוציטים המונעים על ידי IL-1β. בדיקות IF סיפקו תמיכה נוספת לתכונות האנטי-דלקתיות של SNRNP70. כונדרוציטים שטופלו ב-IL-1β הראו ביטוי מוגבר של חלבונים דלקתיים, שהוחלשו על ידי oe-SN. מודולציה זו של ביטוי החלבון הדלקתי על ידי SNRNP70 מדגישה קשר פוטנציאלי למפל הדלקתי הקשור לפתוגנזה של OA.
בעוד שמחקר זה מספק ראיות תצפיתיות לפוטנציאל האבחוני והטיפולי של SNRNP70 ב-OA, המנגנונים המדויקים שעומדים מאחורי השפעותיו נותרו תחום מעניין37. SNRNP70 הוא מרכיב קריטי בספליסאוזום, קומפלקס המעורב בחיבור RNA, תהליך יסודי בוויסות ביטוי גנים. חיבור RNA ממלא תפקיד מרכזי בביטוי גנים על ידי הסרת אזורים לא מקודדים (אינטרונים) וחיבור אזורי קידוד (אקסונים) של מולקולות mRNA, ובסופו של דבר מעצב את הפרוטאום 38,39,40. סביר להניח כי מעורבות SNRNP70 בחיבור RNA עשויה להשפיע על ביטוי גנים הקשורים לפתוגנזה של OA. היעדים הספציפיים של RNA ואירועי החיתוך המוסדרים על ידי SNRNP70 ברקמות המושפעות מ-OA עדיין לא ברורים. הבנת מנגנונים אלו עשויה להציע תובנות חשובות לגבי הבסיס המולקולרי של OA ומטרות מועמדות להמשך חקירה. יתרה מזאת, מחקר עתידי צפוי לחקור את האינטראקציה בין SNRNP70 למולקולות אחרות המעורבות בפתוגנזה של OA. חקירת השיח הצלב שלו עם מסלולי איתות המעורבים בדלקת, התפרקות סחוס ועיצוב רקמת מפרקים יכולה לספק הבנה מקיפה יותר של השפעותיו הרב-ממדיות.
למחקר זה יש מגבלות מסוימות שמצדיקות התייחסות. בעוד שהמטא-אנליזה כללה מספר משמעותי של מערכי נתונים, שינויים בעיצוב המחקר, בדמוגרפיה של מטופלים ובעיבוד הנתונים עשויים להכניס הטרוגניות. בנוסף, מערכי הנתונים שנכללו השתנו במקור הרקמה (למשל, סחוס לעומת סינוביום) ובפלטפורמות עיבוד, מה שעשוי להסביר חלקית את ההטרוגניות שנצפתה בין המחקרים (I2 = 73.3%). יתרה מזאת, ניתוח אינטגרטיבי זה התבסס על מאגרי נתונים אנושיים זמינים לציבור, בעוד שהניסויים התפקודיים השתמשו בכונדרוציטים שהופרדו מחולדות. פער זה בין מינים מגביל את היקף ההסקה הישירה של ממצאי חוץ גופים לפתופיזיולוגיה של OA אנושית. הסתייגות נוספת היא ההסתמכות על מודל גירוי IL-1β חריף, שלועד רק את התגובה הדלקתית המוקדמת ואינו משחזר במלואו את הטבע הכרוני, המתקדם והרב-גורמי של OA בבני אדם. בנוסף, הניסויים הפונקציונליים הוגבלו לגישות רווח תפקוד (SNRNP70 הבעה יתר); ניסויי אובדן תפקוד (למשל, SNRNP70 knockdown) לא בוצעו, מה שמייצג מגבלה של המחקר הנוכחי. לבסוף, אף שניתוחי הקורלציה מצביעים על SNRNP70 במסלול ההידבקות המוקדית, אירועי חיבור FAK לא נבדקו ישירות, ולא הוצגו ראיות ניסיוניות לכך שאיתות הידבקות מוקדי משתנה לאחר SNRNP70 . לכן, יש צורך באישור בקבוצות מטופלים גדולות יותר ובמודלים של בעלי חיים כדי לחזק את עמידות הממצאים הללו. יתרה מזאת, ניסויי ה-in vitro השתמשו במודל תרבית תאים, שעשוי שלא לשחזר במלואו את המיקרו-סביבה המורכבת ב-in vivo של מפרקי OA. מחקרים עתידיים צריכים לחקור את השפעות SNRNP70 במודלים בעלי חיים של OA כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי שלה בהקשר פיזיולוגי רלוונטי יותר.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
מחקר זה מומן על ידי מחקר המפתחות של גואנגשי, סין (GuiKe AB22035014), קרן מיוחדת לצוות חדשנות אופיינית של בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת גואנגשי לרפואה (YYZS2022003), והפרויקט המשותף לחדשנות במדעי הבריאות והטכנולוגיה של מחוז היינאן לשנת 2026 (WSJK2026QN087).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Anti-aggrecan (ACAN) antibody | Abcam | ab36861 | נוגדן ראשוני, דילול 1:1000 |
| Anti-collagen type II alpha 1 (COL2A1) antibody | Abcam | ab34712 | נוגדן ראשוני, דילול 1:1000 |
| Anti-IL6 antibody | Proteintech | 21865-1-AP | אנטיביוטיקה לתרבית תאים |
| Anti-MMP13 antibody | Proteintech | 18165-1-AP | נוגדן ראשוני, דילול 1:1000 |
| ערכת BCA protein assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | קביעת ריכוז חלבון כולל |
| מערכת זיהוי PCR בזמן אמת CFX96 | Bio-Rad | 1855195 | מערכת זיהוי PCR בזמן אמת |
| מערכת הדמיה ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | מערכת הדמיה כימילומינסנטית |
| Collagenase type II | Sigma-Aldrich | C6885 | עיכול רקמת סחוס, 2 מ"ג/מ"ל |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | צביעת נגד גרעינית |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Gibco | 11320033 | מדיום תרבית תאים בסיסי |
| ECL reagent | Thermo Fisher Scientific | 34580 | רגנט כימילומינסנציה משופרת |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10082147 | ריכוז 10% כתוסף תרבית |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Olympus | BX53 | דימות אימונופלואורסצנטי (הגדלה 20x) |
| מאגר הנתונים GEO | NCBI | N/A | מסדי נתונים ציבוריים של RNA-seq ומערכי מיקרו-מערכים |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad | N/A | ניתוח עקומת ROC |
| נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | נוגדן משני |
| תוכנת ImageJ | NIH | N/A | תוכנת ניתוח דנסיטומטרי |
| LipoFiter 3.0 | Hanbio | HB-TF3001 | רגנט טרנספקציה |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | מדידת טוהר ריכוז RNA (יחס A260/280) |
| oe-SNRNP70 | Hanbio | HB-OV5101 | פלסמיד ליצירת יתר |
| פניצילין | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | אנטיביוטיקה לתרבית תאים |
| Primer-BLAST | NCBI | N/A | עיצוב פריימר ספציפי לגן |
| פריימרים (סינתזה) | Sangon Biotech | N/A | סינתזה מסחרית של פריימרים ל-PCR |
| קוקטיילים של מעכבי פרוטאז ופוספטאז | Roche | 4693159001 | קוקטייל של מעכבי פרוטאז ופוספטאז |
| קרום PVDF | Millipore | IPVH00010 | ממברנת העברת חלבונים |
| ערכת ReverTra Ace qPCR RT | TOYOBO | FSQ-101 | סינתזת cDNA תקן ראשון |
| חיץ RIPA | Beyotime | P0013B | חיץ ליזה תאי עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז |
| רקומביננט rat interleukin-1β | PeproTech | 400-01B | גרימה לתגובה דלקתית בכונדרוציטים |
| פלטפורמת Sangerbox | http://vip.sangerbox.com/ | N/A | ניתוח עקומת ROC |
| מערכת Simple Western Automated Western Blot | ProteinSimple Jess | Jess (דגם 004-600) | מערכת אוטומטית לגילוי ביטוי חלבונים |
| Stata 14.0 | Stata | N/A | מטא-אנליזה |
| סטרפטומיצין | Thermo Fisher Scientific | אנטיביוטיקה לתרבית תאים | |
| ערכת SYBR® Premix Ex Taq™ Kit | Takara | QPK-201 | PCR כמותי בזמן אמת |
| ערכת RNAfast200 | Fastagen Biotech | 220010-100 | חילוץ RNA כולל מכונדרוציטים |
| טריפסין-EDTA | Gibco | 25200072 | ניתוק תאים, 0.25% טריפסין-EDTA |
מקורות
- David, J. H., Lyn, M., Mabel, C. Osteoarthritis in 2020 and beyond: a Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
- Leifer, V. P., Katz, J. N., Losina, E. The burden of OA-health services and economics. Osteoarthritis Cartilage. 30 (1), 10-16 (2022).
- Long, H., et al. Prevalence Trends of Site-Specific Osteoarthritis From 1990 to 2019: Findings From the Global Burden of Disease Study 2019. Arthritis Rheumatol. 74 (7), 1172-1183 (2022).
- Loeser, R., Collins, J., Diekman, B. Aging and the pathogenesis of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 12 (7), 412-420 (2016).
- Tang, Y., Wang, Z., Cao, J., Tu, Y. Bone–brain crosstalk in osteoarthritis: pathophysiology and interventions. Trends Mol Med. 31 (3), 281-295 (2025).
- Chen, M., et al. Remodeling the Proinflammatory Microenvironment in Osteoarthritis through Interleukin-1 Beta Tailored Exosome Cargo for Inflammatory Regulation and Cartilage Regeneration. ACS Nano. 19 (4), 4924-4941 (2025).
- Murphy, M., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Nat Med. 26 (10), 1583-1592 (2020).
- Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
- MacMullan, P., McCarthy, G. The meniscus, calcification and osteoarthritis: a pathologic team. Arthritis Res Ther. 12 (3), 116(2010).
- Jarraya, M., et al. Meniscus morphology: Does tear type matter? A narrative review with focus on relevance for osteoarthritis research. Semin Arthritis Rheum. 46 (5), 552-561 (2017).
- Fu, X., et al. Erythropoietin enhances meniscal regeneration and prevents osteoarthritis formation in mice. Am J Transl Res. 12 (10), 6464-6477 (2020).
- Li, C., et al. Integrated Analysis of Transcriptome Changes in Osteoarthritis: Gene Expression, Pathways, and Alternative Splicing. Cartilage. 14 (2), 235-246 (2023).
- Liu, H., et al. Regulation of Chondrocyte Metabolism and Osteoarthritis Development by Sirt5 Through Protein Lysine Malonylation. Arthritis Rheumatol. 77 (9), 1216-1227 (2025).
- Zhou, H., et al. FTO-mediated SMAD2 m6A modification protects cartilage against Osteoarthritis. Exp Mol Med. 56 (10), 2283-2295 (2024).
- Li, Y., et al. A Wnt-induced lncRNA-DGCR5 splicing switch drives tumor-promoting inflammation in esophageal squamous cell carcinoma. Cell Rep. 42 (6), 112542(2023).
- Mann, M., et al. Bromodomain-containing Protein 4 regulates innate inflammation via modulation of alternative splicing. Front Immunol. 14, 1212770(2023).
- Zhang, L., et al. RNF213 loss of function reshapes vascular transcriptome and spliceosome leading to disrupted angiogenesis and aggravated vascular inflammatory responses. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2107-2122 (2022).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular Mechanisms of pre-mRNA Splicing through Structural Biology of the Spliceosome. Cold Spring Harb Perspect Biol. 11 (1), (2019).
- Borisek, J., et al. Atomic-Level Mechanism of Pre-mRNA Splicing in Health and Disease. Acc Chem Res. 54 (1), 144-154 (2020).
- Pala, D., et al. Focal adhesion kinase/Src suppresses early chondrogenesis: central role of CCN2. J Biol Chem. 283 (14), 9239-9247 (2008).
- Kim, Y. H., Lee, J. W. Targeting of focal adhesion kinase by small interfering RNAs reduces chondrocyte redifferentiation capacity in alginate bead culture with type II collagen. J Cell Physiol. 218 (3), 623-630 (2009).
- Byun, S., et al. Response splicing quantitative trait loci in primary human chondrocytes identify putative osteoarthritis risk genes. Nat Commun. 16 (1), 1-17 (2025).
- Yang, B., Li, X., Su, Y. Single-cell sequencing and machine learning-based prediction of spliceosome-associated factor 2 may represent potential targets for osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage Open. 8 (2), (2026).
- Will, C., Lührmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Nakaya, T. Dissection of FUS domains involved in regulation of SnRNP70 gene expression. FEBS Lett. 594 (21), 3518-3529 (2020).
- Zhou, C., et al. Microenvironmental stiffness mediates cytoskeleton re-organization in chondrocytes through laminin-FAK mechanotransduction. Int J Oral Sci. 14 (1), 1-13 (2022).
- Shin, H., et al. Focal Adhesion Assembly Induces Phenotypic Changes and Dedifferentiation in Chondrocytes. J Cell Physiol. 231 (8), 1822-1831 (2016).
- Li, G., et al. Zyxin-involved actin regulation is essential in the maintenance of vinculin focal adhesion and chondrocyte differentiation status. Cell Prolif. 52 (1), 1-14 (2018).
- Bowden, J., et al. Core and adjunctive interventions for osteoarthritis: efficacy and models for implementation. Nat Rev Rheumatol. 16 (8), 434-447 (2020).
- Chen, S., et al. Epidemiological trends and characteristics of osteoarthritis in China during 1990–2021. J Orthop Translat. 51, 218-226 (2025).
- Luo, P., et al. The role of cells and signal pathways in subchondral bone in osteoarthritis. Bone Joint Res. 12 (9), 536-545 (2023).
- Ming, L., Nafiza, H., Jingyi, H., Guangju, Z. Osteoarthritis year in review 2023: metabolite and protein biomarkers. Osteoarthritis Cartilage. 31 (11), 1437-1453 (2023).
- Zeyu, H., Ketao, W., Shenglong, D., Mingzhu, Z. Cross-talk of inflammation and cellular senescence: a new insight into the occurrence and progression of osteoarthritis. Bone Res. 12 (1), 1-17 (2024).
- Ma, J., et al. GYY4137-induced p65 sulfhydration protects synovial macrophages against pyroptosis by improving mitochondrial function in osteoarthritis development. J Adv Res. 71, 173-188 (2025).
- Kiebler, M., Ninkovic, J. RNA biology: Alternative splicing hits synaptic function and behavior. Curr Biol. 32 (23), R1314-R1316 (2022).
- Nikolaou, N., et al. Cytoplasmic pool of U1 spliceosome protein SNRNP70 shapes the axonal transcriptome and regulates motor connectivity. Curr Biol. 32 (23), 5099-5115.e8 (2022).
- Hu, Z., et al. U1 snRNP proteins promote proximal alternative polyadenylation sites by directly interacting with 3' end processing core factors. J Mol Cell Biol. 14 (8), (2022).
- Jobbins, A., et al. Pre-RNA splicing in metabolic homeostasis and liver disease. Trends Endocrinol Metab. , (2023).
- Zheng, Y., Zhong, G., He, C., Li, M. Targeted splicing therapy: new strategies for colorectal cancer. Front Oncol. 13, 1222932(2023).
- Zhang, Y., Hu, W., Li, H. RNA modification-mediated translational control in immune cells. RNA Biol. 20 (1), 603-613 (2023).