שילוב הזרקות קולגנאז עם עומס מכני שנגרם על ידי פעילות גופנית: מודל עכבר המדמה אוסטיאוארתריטיס ברך פציעת עומס יתר

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הקמת מודל עכבר לדלקת מפרקים ברך הנגרמת מעומס יתר על ידי שילוב הזרקות קולגנאז תוך-מפרקי עם מאמץ יתר שנגרם מפעילות גופנית, ומספק פלטפורמה זעיר-פולשנית לחקר פתוגנזה ניוונית.

תקציר

אוסטיאוארתריטיס בברך (KOA) היא מחלת מפרקים ניוונית רב-גורמית המונעת על ידי האינטראקציה המורכבת של התדרדרות ביולוגית ברקמה ועומס מכני מתמשך. מודלים כירורגיים קונבנציונליים לעיתים גורמים להרס מפרקים פוסט-טראומטיים על ידי טריגר, שאינו מצליח לשחזר במדויק את הפתוגנזה ההדרגתית והצטברה של KOA ניוונית אנושית. כדי לגשר על הפער התרגומי הזה, המחקר הנוכחי מקים מודל עכבר חדשני וניתן לשחזור המדמה KOA הנגרמת מעומס יתר על ידי סינרגיה של התדרדרות קלה של סחוס אנזימטי עם עומס מכני מתמשך. בפרט, הזרקות תוך-מפרקיות סטנדרטיות של קולגנאז מסוג II שולבו עם מאמץ מכני יומי באמצעות מכשיר עייפות מסוג רוטטור מכויל בקפדנות במשך תקופה של ארבעה שבועות. יעילות ההתערבות הדו-פקטורית הזו אושרה באמצעות ניתוחים התנהגותיים, היסטולוגיים ומולקולריים מקיפים. ניתוח הליכה אוטומטי חשף ליקויים מוטוריים חמורים בקבוצה המשולבת. אלו התאפיינו בקיצורים משמעותיים באורך הצעד, רוחב הצעד ושטח כף הרגל בעמידה שיא. הערכות היסטומורפולוגיות באמצעות צביעת ירוק O-fast סאפרנין אישרו ליקויים תפקודיים אלו, והראו נזק מבני מתקדם לסחוס, פגמים במשטח וציונים גבוהים משמעותית של החברה הבינלאומית למחקר דלקת מפרקים אוסטאוארטריטיס (OARSI) המשקפים בנאמנות את המאפיינים הפתולוגיים של KOA בשלב מוקדם עד בינוני בבני אדם. יתרה מזאת, הערכות אימונוהיסטוכימיות הראו עלייה משמעותית בוויסות של הערוץ הרגיש לערוץ הקולטן החולף Vanilloid Potential Vanilloid 4 (TRPV4) והפחתה מקבילה בחלבון המטריקס הקריטי Collagen Type II Alpha 1 (COL2A1) בכונדרוציטים מפרקיים. על ידי שילוב חוסר יציבות מקומית במפרקים עם מתח מכני מבוקר, אסטרטגיה זעיר-פולשנית זו מונעת את הטראומה החריפה הקשורה למודלים כירורגיים. פרוטוקול זה יוצר פלטפורמה ניסיונית רלוונטית קלינית למעקב אחר מנגנונים מולקולריים דינמיים, הערכת פנוטיפים של כאב כרוני ובדיקת התערבויות טיפוליות ארוכות טווח לאוסטיאוארתריטיס בשלבים מוקדמים.

מבוא

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא מצב ניווני רב-גורמי המאופיין בכאב, נפיחות, נוקשות ותפקוד פגוע, הנובעים מגורמים כמו השמנת יתר, מאמץ מכני וטראומה¹. אוסטיאוארתריטיס בברך (KOA) נפוץ מאוד ונפוץ יותר עם הזדקנות, אך ניסויים קליניים לעיתים מוגבלים בהיקף בשל תסמינים קליניים מגוונים. לכן, פיתוח טיפולים יעילים מחייב מודלים מתאימים של בעלי חיים². בהינתן ההטרוגניות הפנימית של OA, אין מודל "תקן זהב" שמקובל באופן אוניברסלי, המחייב חוקרים לזהות מודלים ספציפיים התואמים את חקירתם המדעית.

KOA מאופיין כיום ברפואה המודרנית כמצב הכולל אינטראקציה בין גורמים מכניים וביולוגיים לסחוס המפרקי ולרקמת הפרכונדרה. התוצאה של האינטראקציה המורכבת הזו היא בעיקר התדרדרות של הסחוס המפרקי והמטריצה הסובבת אותו³. מאמץ מכני משמש כאות טרנסדוקציה קריטי השולט בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים בתאי המפרקים וברקמות⁴. שמירה על סחוס מפרקי במצב בריא דרשה עומס מכני מתאים בטווח הפיזיולוגי. לעומת זאת, עומס יתר גורם לעיתים להתדרדרות הסחוס ולהופעת KOA⁵. מודלים ספונטניים מוגבלים על ידי השקעות זמן וכסף משמעותיות⁶, בעוד שמודלים מונעים בניתוח משתמשים בגישה הרסנית שמייצגת בעיקר KOA בשלב בינוני עד מאוחר, תוך סטייה מהתקדמות ניוונית^{טבעית 7,8}. לעומת זאת, מודלים מונעים כימית מכוונים למטריצת הקולגן אך אינם מצליחים ללכוד את השינויים המקיפים של OA ניוונית אנושית כאשר משתמשים בהם^{ללא מאמץ} מכני. שילוב של התדרדרות אנזימטית עם מאמץ מכני יתר פותר פערים אלו על ידי סיכום נאמן יותר של הפתוגנזה ההדרגתית של פציעות עומס יתר. מטרת מחקר זה היא לבסס ולאמת מודל עכבר חדש של KOA על ידי שילוב הזרקות קולגנאז תוך-מפרקי מסוג II עם מאמץ יתר באמצעות מכשיר עייפות גלגל מסתובב.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית. הניסויים בוצעו תחת רישיון פרויקט (מס' PZSHUTCM201016022) שניתן על ידי מרכז בעלי החיים הניסיוניים של אוניברסיטת שנגחאי לאתיקה ברפואה סינית מסורתית, בהתאם לוועדת המועצה הלאומית למחקר (ארה"ב) לעדכון המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה.

1. פרוטוקול ייצור דגמי בעלי חיים

1. חלק באקראי 32 עכברים בני 10 שבועות C57BL/6 לארבע קבוצות: ביקורת, קולגנאז, פעילות גופנית מופרזת וקולגנאז + פעילות גופנית מופרזת.
   1. הכנו את כל העכברים לשבוע בתנאי האכלה והמגורים הסטנדרטיים לפני תחילת הליכי המידול.
2. השראה את מודלי בעלי החיים במשך תקופה של 4 שבועות לפי קבוצות הניסוי שהוקצו להן.
   1. מתן קולגנאז מסוג II באמצעות הזרקה תוך-מפרקית לעכברים בקבוצת הקולגנאז.
   2. חשפו את העכברים בקבוצת האימון המוגזמת לאימון באמצעות מכשיר גלגל מסתובב.
   3. הפעילו גם את הזרקת הקולגנאז התוך-מפרקי וגם את אימון הגלגל המסתובב על העכברים בקבוצת הקולגנאז + פעילות גופנית מופרזת.
   4. שמור על אותו תדירות ומשך אימונים באותה תדירות ומשך בכל קבוצות האימון הרלוונטיות.

2. פרוטוקול הזרקה תוך-מפרקית מסוג II

1. הרדמה
   1. השרה הרדמה באמצעות איזופלוראן המסופק דרך מכונת הרדמה גזית מכוילת. לבצע השראה מהירה בריכוז של 2%–3% איזופלורן.
   2. לשמור על הרדמה של 1.5%–2% איזופלורן. להבטיח את תפקוד מערכת ההרדמה הנכונה כדי למנוע חשיפה מקצועית.
   3. יש לעקוב באופן רציף אחרי קצב הנשימה והרפלקסים של העכבר לאורך כל ההליך.
2. הכנת עור
   1. מרחו קרם להסרת שיער באזור שמסביב למפרק הברך השמאלית. להסיר את השיער לגמרי בעזרת מגרדת.
   2. נקה היטב את העור החשוף. שמור על תנאים אספטיים לאורך כל תקופת ההכנה.
3. הכנת קולגנאז מסוג II
   1. איזון את אבקת הקולגנאז מסוג II לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בארון בטיחות ביולוגית סטרילי. השתמשו במי מלח סטרילי עם בופר פוספט (PBS, pH 7.2–7.4) כממס ובופ בלעדי לתהליך ההפיסה.
   2. שקלו בדיוק את המסה הנדרשת של אבקת הקולגנאז באמצעות איזון אנליטי. הוסף לאט את ה-PBS הסטרילי לאבקה כדי להגיע לריכוז עבודה סופי של 0.04 U/μL.
   3. ערבבו את התמיסה בעדינות על ידי פיפסת התערובת למעלה ולמטה עד שהיא נקייה וללא חלקיקים גלויים. הימנעו ממערבולות אלימות בשלב זה כדי למנוע אובדן פעילות אנזימטית.
   4. צנטריפוגה את תמיסת ה-0.04 U/μL המוכנה ב-1,000 סל"ד למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C. זה מסיר חלקיקים מיקרו-לא מומסים ומונע חסימת מחט במהלך ההזרקה הבאה.
   5. שאיפת הסופרנטנט לצינורות סטריליים ואחסנו אותם באמבט קרח בטמפרטורה של 4°C לשימוש מיידי. הכינו את התמיסה טרייה לכל מפגש כדי להבטיח פעילות אנזימטית מקסימלית.
4. הזרקה תוך-מפרקית
   1. אחוז בעור הגבי של העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה של היד הלא-דומיננטית. אבטח את שתי הגפיים התחתונות עם הטבעת והאצבעות הקטנות כדי להאריך את מפרקי הברך באופן טבעי ולחשוף במלואו את אזור ההזרקה.
   2. החזק מיקרו-מזרק בנפח 10 מיקרוליטר המצויד במחט של 30 גרם. הכניסו את המחט במקביל לפני העור לשכבת העור השטחית למשך כ-0.2 ס"מ בנקודת הכניסה.
   3. כוון את כיוון המחט באיטיות לכיוון מאונך ביחס לעור כאשר התנגדות הרקמה יורדת.
   4. המשך לקדם את המחט כ-0.3–0.5 ס"מ עד שאובדן התנגדות מציין כניסה לחלל המפרק. משכו את הבוכנה לאט כדי לאשר את היעדר רפלוקס הדם.
   5. הזרקו 5 מיקרוליטר מתמיסת הקולגנאז מסוג II (ריכוז: 0.04 U/μL) לחלל המפרק במהירות קבועה¹⁰.
   6. שמור על מיקום המחט מיד לאחר ההזרקה. לחצו בעדינות על העור סביב אתר ההזרקה למשך 10–15 שניות.
   7. משוך את המחט לאט. לחץ בעדינות על נקודת הכניסה עם גזה סטרילית למשך 30 שניות כדי למנוע דליפת תרופות.
   8. שים את העכבר בכלוב ביתי חם ויבש. אפשרו לבעל החיים להתאושש באופן טבעי מההרדמה, שלרוב אורכת 5–10 דקות.
   9. חזרו לתנאי המגורים והאכילה הסטנדרטיים לאחר שהעכבר התאושש לחלוטין.
   10. בצע את ההזרקות התוך-מפרקיות פעמיים בשבוע עם מרווח של 3–4 ימים בין ההזרקות, אך ורק במהלך תקופת המודלים של 4 שבועות (לאחר ההסתגלות הראשונית של שבוע אחד).
   11. השליכו את כל החריצים מיד במיכלים ביוסיכניים מאושרים.
       הערה: ודא שהצוות המיומן מבצע את כל ההזרקות כדי למזער פגיעות מפרקים ושונות ניסיונית.

3. פרוטוקול מאמץ יתר שנגרם על ידי גלגל מסתובב

1. הכנת ציוד ובדיקת בטיחות
   1. הגדר את מהירות מכשיר העייפות מסוג רוטטור ל-12 סל"ד (שווה ערך לכ-0.063 מ"ש) ואת משך הזמן ל-2 שעות לכל מפגש.
   2. הפעל את מודול הגירוי החשמלי. ודאו שהפלט הנוכחי נמצא בטווח הבטוח המוקדם של 0.1–0.3 mA. אל תעלה את עוצמת הזרם ידנית.
      אזהרה: השתמש במודול הגירוי החשמלי אך ורק כדי להכווין את העכברים חזרה לגלגל, ולא כגירוי עונשי. בדוק את חיווט המכשיר לנזקים וודא מגע טוב עם האלקטרודות לפני ההפעלה כדי למנוע קצר חשמלי ופגיעות התחשמלות.
2. הכשרת הסתגלות
   1. ודא שתאי הגלגלים המסתובבים של מכשיר העייפות נקיים, יבשים ונקיים מפסולת. נטרל את אלקטרודות הגירוי החשמלי בכניסה לגלגל כדי לבטל כל עומס אפשרי הקשור לגירוי.
   2. טפלו בכל עכבר בעדינות בבסיס הזנב או חטפו אותו באמצעות רקמה רכה סטרילית. הניחו את העכברים בנפרד באזור המרכזי של משטח הגלגל המסתובב.
   3. מקם את העכבר בעמידה טבעית של ארבע רגליים על משטח הריצה האופקי. כיוון את הגוף במקביל לציר הסיבוב המרכזי של הגלגל, כאשר הכפות הקדמיות קדימה והאחוריות מעט אחורה.
   4. השתמש במחסום רך זמני ולא מגביל כדי למנוע מהעכבר להיכנס לאזור האלקטרודות הצר במהלך הדקות הראשונות. הסר את המחסום לאחר תקופה זו כדי לאפשר לעכבר לחקור את כל התא בחופשיות.
   5. השאירו את העכברים במכשיר הנייח למשך 10 דקות ביום בשלושת הימים הראשונים. אל תתחיל את סיבוב הגלגל או תתחיל גירוי חשמלי במהלך תקופה זו.
   6. עקבו אחרי העכבר לסימני לחץ חמור כמו הקפאה מתמשכת או הרמה מופרזת. הזזו את העכבר בעדינות לאזור הגלגל המרכזי אם הוא מפגין התנהגות חריגה, כדי להחזיר יציבה טבעית.
   7. הפעל את ההגה במהירות של 5 סל"ד למשך 30 דקות ביום הרביעי. שלב זה מתרגל את העכברים לקצב התנועה של המכשיר ללא שימוש ברמזים חשמליים.
   8. הנח את העכברים ידנית חזרה למרכז הגלגל אם הם נופלים או עוצרים במהלך שלב ההסתגלות הקצבית. ודא שהגירוי החשמלי נשאר מנותק לאורך כל תקופת ההסתגלות בת 4 הימים.
      זהירות: הימנעו משימוש בגירוי חשמלי במהלך שלב ההסתגלות כדי למנוע תגובות לחץ שנגרמו מפחד ולהבטיח עמידה בדרישות האימון בעתיד.
3. ביצוע תרגיל פורמלי
   1. קיימו את ההכשרה הרשמית בשעה קבועה בכל יום (למשל, 9:00–11:00). לבש כפפות מבודדות כדי להכניס את העכברים למכשיר עייפות מסוג רוטטור.
   2. סגור את דלת המכשיר. הפעל את הפרמטרים המוגדרים מראש של 12 סל"ד (~0.063 מ"ש) למשך מרבי של 2 שעות לכל סשן (ראו איור 1).
      אזהרה: יש לעקוב אחרי העכברים באופן רציף במהלך האימון. עצרו את האימון ל-5 דקות אם עכבר נופל ברציפות (יותר מ-3 פעמים בתוך דקה) כדי למנוע תשישות חמורה ופציעה שנגרמה מלחץ.
4. קביעת נקודת קצה עייפות וגירוי
   1. עקבו אחרי העכברים באופן רציף כדי להעריך את מצב העייפות שלהם. סיימו את האימון מוקדם, מבלי להכריח את משך האימון המלא, אם העכבר עומד לפחות בשניים מתוך ארבעת הקריטריונים הספציפיים לעייפות כדי להימנע מלחץ יתר.
   2. הגדר קריטריון 1 כחוסר יכולת להישאר על ההגה ליותר מ-5 שניות לפני הנפילה. הגדר קריטריון 2 כתדירות נפילות מוגברת משמעותית של 3 פעמים או יותר בתוך דקה אחת.
   3. הגדר קריטריון 3 כחוסר כוונה רצונית לחזור לגלגל, שבו העכבר נשאר לא נייד או זז רק לזמן קצר למרות גירוי חשמלי.
   4. הגדר קריטריון 4 כהצגת תנוחות תנועה חריגות. חפש סימנים ברורים כמו גרירה של גפיים או הליכה מתנדנדת.
   5. אפשר למכשיר להפעיל גירוי חשמלי קל אוטומטית כאשר עכבר נופל לפתח הספינר. ודאו שהגירוי החשמלי נעצר מיד לאחר שהעכבר חוזר^לגלגל.
      אזהרה: סיימו את האימון מיד אם העכבר מציג מצבים חריגים כמו עוויתות או קוצר נשימה. הוציאו את העכבר מהמכשיר וספקו טיפול סימפטומטי במידת הצורך.
5. עיבוד לאחר ההכשרה ותדירות
   1. כבה את החשמל של המכשיר אחרי סיום האימון. לבש כפפות מבודדות כדי להוציא את העכברים ולהחזירם לכלובים הביתיים שלהם.
   2. ספק לעכברים מים מתאימים לשתייה. התבוננו בבעלי החיים לכל פעילות חריגה, מצב נפשי או בעיות בגפיים (למשל, קלאודיקציה או רעידות שרירים).
   3. תעד כל חריגות ותספק טיפול בזמן.
   4. שמרו על תדירות האימונים הזו של פעם ביום, 2 שעות בכל מפגש, במשך 4 שבועות רצופים. שמור על פרמטרי האימון וניטור הבטיחות עקביים לאורך כל התקופה.
      הערה: ודאו שמכשיר העייפות ומודול הגירוי החשמלי פועלים כראוי לפני כל אימון יומי כדי להבטיח עוצמת גירוי עקבית.

4. ניתוח הליכה

1. סקירת מערכת
   1. בצע את רכישת ההליכה והניתוח באמצעות מערכת הדמיית הליכה אוטומטית.
   2. בצע את כל הליכי ההליכה על 32 עכברים בני 10 שבועות C57BL/6 לאחר תקופת המודלים של 4 שבועות.
   3. מקם את המצלמה המהירה מתחת לחגורת ההליכון השקופה כדי ללכוד תמונות בטן בזמן תנועה.
2. הסתגלות והקמה
   1. הסתגל כל העכברים למכשיר ההליכון לפני איסוף נתונים פורמלי כדי למזער לחץ.
   2. כוון את מהירות ההליכון ל-20 ס"מ/שנייה כדי להתאים לקצב ההליכה הפיזיולוגי של העכברים.
   3. רשמו שלושה ניסויים תקפים עצמאיים לכל עכבר עם מרווח מנוחה של 2 דקות בין הניסויים.
3. הקלטת ניסוי ובחירת צעדים
   1. אפשר לעכבר ללכת ברציפות במשך 60 שניות במהלך כל ניסוי.
   2. בצע ניסוי חלופי אם הקלטה אינה תקפה עקב "קפיאה", קפיצה או פנייה.
   3. התחל איסוף נתונים רק לאחר שהעכבר משיג תנועה יציבה ועקבית למשך לפחות 10 שניות.
   4. בחרו מינימום של 4 צעדים מלאים רצופים מכל ניסוי בן 60 שניות לניתוח.
   5. ודא ששני צופים עיוורים עצמאיים מבצעים את בחירת הצעד כדי ביטול הטיה סובייקטיבית.
   6. ודאו שהעכבר שומר על יציבה טבעית של ארבע רגליים ללא דילוג או תנודות מהירות פתאומיות.
   7. וודא שהצעידה כוללת גם שלב עמידת משקל וגם שלב הנעה קדימה.
   8. בדוק תמונות ברורות של מגע חגורת כפות הרגל ללא אובדן מעקב, טשטוש או זיהום.
4. עיבוד תמונה וחילוץ פרמטרים
   1. השתמש באלגוריתמים המובנים של תוכנת המערכת כדי לדיגיט תמונות שצולמו ולזהות נקודות מגע עם חגורת כפות הרגליים.
   2. חשב את יחס הנדנדה/עמידה כיחס בין משך פאזה לבין משך פאזה של העמידה.
   3. מדוד את אורך הצעד (ס"מ) כמרחק הליניארי שנעבר במהלך צעד מלא אחד.
   4. מדוד רוחב צעד (ס"מ) כמרחק אופקי בין הקצוות המדיאליים של כפות האחוריות הנגדיות בעמידה שיא.
   5. קבעו את שטח הכף במצב שיא (ס"מ²) המייצג את שטח המגע הכולל במשקל מקסימלי.
   6. חשב את שונות שטח הכפות (ס"מ²) כמקדם השונות של שטח המגע לאורך צעדים עוקבים.
   7. חשב את הערך הממוצע של שלושת הניסויים התקפים עבור כל עכבר בודד וייצא את מערכי הנתונים הסופיים.
      הערה: החריגו ניסויים עם התנהגויות עצירות, קפיצה או פנייה לא סדירות מהניתוח.

5. היסטולוגיה

1. איסוף וקיבוע רקמות
   1. הורד את כל העכברים באופן הומני באמצעות פריקה צווארית לאחר תקופת ההשראה של 4 שבועות. נתח בזהירות את מפרק הברך השמאלית והסר את הרקמות הרכות העודפות שמסביב.
   2. טבלו את הדגימה מיד בחומר קיבוע פרפורמלדהיד (PFA) מקורר מראש (w/v). ודאו שנפח הקיבעון הוא פי 10–15 מנפח הדגימה כדי לטבול את הרקמה לחלוטין.
   3. תקבע את הרקמה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. ערבבו בעדינות את מיכל הקיבוע כל 8 שעות כדי להבטיח חדירה מספקת של קיבוע מספק.
2. דה-קלציפיקציה של רקמות
   1. שטוף את הדגימה המתוקנת במים זורמים לאט במשך 10 דקות. חזור על תהליך השטיפה שלוש פעמים כדי להסיר את שאריות ה-PFA.
   2. העבר את הדגימה לתמיסת דה-קלציפיקציה של 0.5 מול/ליטר אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) (pH 7.2–7.4). שמרו על נפח תמיסת הדקלציפיקציה פי 20 מנפח הדגימה ואחסנו אותה ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. דהקלציפיקציה של הרקמה למשך 14–21 ימים. החלף את הנוזל הישן בתמיסת דה-קלסיפיקציה EDTA טרייה כל 3 ימים.
   4. בדקו את נקודת הדקאלציפיקציה על ידי ניקוב עדין בעצם התת-כונדרלית עם מחט סטרילית. סיים את תהליך הדקלציפיקציה כאשר המחט חודרת בצורה חלקה וללא התנגדות.
   5. שטפו את הדגימה המפורקת לחלוטין במים זורמים במשך שעתיים כדי להסיר את שאריות ה-EDTA. שטפו את הדגימה לאחר מכן עם מלח מפוזר בפוספט (PBS) שלוש פעמים, למשך 5 דקות כל פעם.
3. הטמעה וחתך
   1. ייבשו את הדגימה המפורקת ברצף באמצעות סדרת אתנול מדורגת (70%, 80% ו-90% ל-2 שעות כל אחד; 95% לשעה אחת; אתנול מוחלט פעמיים לשעה כל אחד).
   2. נקה את הרקמה המיובשת בקסילן פעמיים למשך 10 דקות כל אחד. הטמיעו את הרקמה שנוקה בפרפין.
   3. חתכו את הרקמה הטבועה בפרפין לחתכים רציפים בעובי 5 מיקרון של סגיטל באמצעות מיקרוטום. התקן את החלקים על מחסניות זכוכית מצופות פולי-L-ליזין ואופה אותם בפלטת חימום לייבוש שקופית בטמפרטורה של 60°C למשך שעתיים.
4. הערכה היסטומורפולוגית
   1. צבעו את החתכים בירוק ספרנין O-fast כדי להעריך את ההיסטומורפולוגיה של הסחוס המפרקי.
   2. הערכת ניוון הסחוס באמצעות מערכת הדירוג של החברה הבינלאומית למחקר אוסטיאוארתריטיס (OARSI) בתנאים כפול-סמיות¹².
5. תהליך הליבה של אימונוהיסטוכימיה (IHC)
   1. דה-פרפין את החלקים בקסילן פעמיים למשך 10 דקות כל אחד. הידר מחדש את החלקים ברצף דרך סדרת אתנול מדורגת למים דה-יוניים.
   2. טבלו את החתכים בבופר ציטראט של 0.01 מול/ליטר (pH 6.0) לצורך שחזור אפיטופים בחום המושרה במיקרוגל. חממו את הבופר לרתיחה בעוצמה גבוהה, ואז שמרו על רתיחה עדינה בעוצמה בינונית למשך 15 דקות.
   3. קרר את החלקים באופן טבעי לטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת
   4. דגרו את החתכים בתמיסת מתנול עם 3% מי חמצן (H2O2) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
   5. מרח תמיסת חסימת סרום של 5% עזים על האזורים. דגרו במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים.
   6. להשליך את תמיסת החסימה בלי לשטוף אותו. יש להחיל את תמיסת הנוגדן הראשונית הספציפית (קולטן חולף פוטנציאל ונילואיד 4 (TRPV4) ב-1:100, קספאז-3 ב-1:200, או קולגן סוג II אלפא 1 (COL2A1) בדילול של 1:150).
   7. דגרו את החלקים עם הנוגדן הראשי בתא לח בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה למשך 12–16 שעות.
   8. איזון את החלקים לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ביום הבא, ואז שטוף עם PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת. יש להחיל נוגדן משני מסוג IgG נגד ארנבות או עכבר עם פרוקסידאז חזרת (HRP) (דילול 1:500).
   9. דגרו את החלקים עם הנוגדן המשני למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחת.
   10. מרחו תמיסת כרוגן 3,3' דיאמינובנזידין (DAB) ודגרו בחושך למשך 3–5 דקות בטמפרטורת החדר. עצרו את התגובה מיד עם מים דה-יוניים כאשר מופיע אות חום ברור תחת תצפית מיקרוסקופית.
   11. צבעי נגד את החלקים עם תמיסת המטוקסילין למשך 5 דקות. שטוף במים זורמים במשך 10 דקות כדי לאפשר לכתם להפוך לכחול.
   12. הפריד בין החלקים באמצעות תמיסת אלכוהול חומצית 1% למשך 30 שניות. שטוף את המגלשות במים זורמים במשך 5 דקות.
   13. ייבשו את החתכים במהירות באמצעות סדרת אתנול מדורגת ונקו את הרקמה בקסילן פעמיים למשך 10 דקות כל אחד.
   14. התקן את המחסניות באמצעות בלסאם נייטרלי וכסה אותן בכיסויי שרף אופטיים. תן למחסניות המותקנות להתייבש בטמפרטורת החדר.
6. בקרות IHC וניתוח תמונות
   1. הקמת שליטה שלילית על ידי החלפת הנוגדן הראשי ב-PBS במהלך הליך הצביעה. כלול חתך רקמת סחוס חיובי ידוע כבקרה חיובית כדי לאמת את יעילות הנוגדנים.
   2. צלם את הקטע המוצבע באמצעות סורק שקופיות שלם בהגדלות של 40× ו-100×.
      הערה: לבצע את כל ההערכות ההיסטולוגיות באופן עצמאי על ידי לפחות שני צופים עיוורים כדי להפחית הטיה סובייקטיבית.

6. ניתוח סטטיסטי

1. טיפול בנתונים ובדיקות כלליות
   1. לבצע את כל איסוף וניתוח הנתונים בתנאים עיוורים כדי למזער הטיה ניסויית.
   2. נתח את המשתנים הרציפים בין ארבע קבוצות הניסוי באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) כדי לבדוק הבדלים כלליים.
   3. החלו את מבחן Kruskal-Wallis H על משתנים שאינם עומדים בהנחות הפרמטריות הנדרשות.
2. בדיקות לאחר הוק וספי מובהקות
   1. בצע השוואות זוגיות לאחר מכן באמצעות מבחן טוקי כדי לזהות הבדלים ספציפיים בקבוצות אם ה-ANOVA הראשוני מצביע על מובהקות סטטיסטית.
   2. תסתמכו אך ורק על מבחן Tukey כדי לשלוט בשיעור השגיאות המשפחתי. אל תשלב זאת עם שיטות תיקון נוספות של השוואה מרובה.
   3. הגדר מובהקות סטטיסטית באופן אחיד כ-p < 0.05

תוצאות

ניתוח הליכה
פרמטרי מחזור הליכה: יחס הנדנדה/עמידה—המוגדר כיחס משך שלב הנדנדה שאינה נושאת משקל לבין שלב עמידת המשקל של צעד יחיד—הוערך כדי לשקף את האיזון בין נשיאת משקל להנעה. בהשוואה לקבוצת הביקורת (2.10 ± 0.06), עכברים שקיבלו הזרקה תוך-מפרקית של קולגנאז (1.45 ± 0.05) או שעברו פעילות גופנית מופרזת (1.68 ± 0.05) הראו יחסי תנודה/עמידה נמוכים באופן משמעותי. ראוי לציין כי הירידה הזו הייתה בולטת במיוחד בקבוצת הקולגנאז + פעילות גופנית מופרזת (0.93 ± 0.05) בהשוואה לקבוצת הקולג...

דיון

במחקר זה פיתחנו מודל עכבר חדשני של KOA המדמה את השפעות הלחץ המופרז על המפרק על ידי שילוב הזרקה תוך-מפרקית של קולגנאז עם אימון גופני מבוסס גלגלים הגורם לעייפות. ממצאים אלו מחזקים שוב את הרעיון ש-KOA נובע מהאינטראקציה בין גורמים ביולוגיים ומכניים. הבנה וזיהוי גורמים אלו מבטיחים לפיתוח תוכניות טיפול מותאמות אישית ואסטרטגיות מניעה להקלה על תסמינים ולשיפור איכות החיים של אנשים הסובלים מאוסטיאוארתריטיס בברך¹³. יתרה מזאת, קולגנאז עלול גם לפגוע במטריצת הקולגן בגידים וברצו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4% פאראפורמלדהיד קבוע	ביוטיים	P0099
חומצה אצטית	סינופארם	631-61-8
מערכת דימות DigiGait לעכברים	RWD מדעי החיים	MSI-DIG-MS
פתרון EDTA	פרוסל	PB180320
קלטת הטמעה	לייקה	IP C
אתנול	סינופארם	64-17-5
כתם ירוק מהיר	ליאן	1085995
קרם להסרת שיער	Veet	G20161330
המטוקסילין	אדמאס	61753A
צנטריפוגה מקוררת מהירה	הרמל	Z366K
חממה	TAITEC	M-210FN
מכונת הרדמה בשאיפה	ריינג'ר	RZ-Viking
איזופלוראן	וביו	W100
מיקרוטום	טד פלה	10180-220
מכשיר עייפות מסוג סיבוב עכבר	בייג'ינג ג'ישו דואובאו טכנולוגיה ביולוגית	YLS-10B
בלסם נייטרלי	סינופארם	96949-21-2
סאפרנין או כתם	ביולוגיה	S0062
מרכז הטמעת רקמות חצי-אוטומטי	תרמו פישר	היסטוסטאר
פלטת חימום לייבוש שקופית	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	XH-2002
אמבט מים בציפה לרקמות	ביובייס	BT-I
קולגנאז סוג II	סיגמא-אלדריץ'	C4-22-1G
סורק שקופיות שלם	לייקה	Aperio VERSA
קסילן	סינופארם	1330-20-7