מאמר שיטה

יצירת תת-מטריצות חוץ-תאיות פוליאקרילאמיד וסיליקון עם קשיחות מוגדרת ליישומים בביולוגיה תאית

DOI:

10.3791/70626

⸱

26 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Snyder Institute for Chronic Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Department of Surgery, University of California, San Francisco, 4Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, University of California, San Francisco, 5UCSF Helen Diller Comprehensive Cancer, University of California, San Francisco, 6Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, Eli and Edythe Broad Center for Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שנוקשות המטריקס החוץ-תאית (ECM) היא רגולטור מרכזי להתנהגות התא, מנגנוני החישה והטרנסדוקציה הבסיסיים נותרו לא ברורים. כדי להתמודד עם זה, אנו מספקים פרוטוקולים ליצירת סובסטרטים מבוססי פוליאקרילאמיד וסיליקון עם קשיחות מכוונת, כדי לקדם את הבנתנו את הקשר בין תא ל-ECM.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטריצה החוץ-תאית (ECM) היא רגולטור קריטי של התנהגות התא, כאשר קשיחות ה-ECM משמשת כרמז מכני מרכזי השולט באיתות תאי, מורפולוגיה וגורל. עם זאת, חקירה ניסיונית של תגובות תאיות התלויות בקשיחות מוגבלת לעיתים קרובות על ידי זמינות פלטפורמות תרביות ניתנות לשחזור, חסכוניות ונגישות, עם תכונות מכניות מדויקות שניתן לכוונן. פרוטוקול זה מתאר שיטות מבוססות פוליאקרילאמיד (PA) וסיליקון לייצור תת-קרקעי ECM עם קשיחות ניתנת לכיוונון. ההליכים מתארים הכנת סובסטרט, פונקציונליזציה של פני השטח וקונוגציה של חלבוני ECM כדי להבטיח הידבקות תאית עקבית בטווח קשיחות פיזיולוגי רלוונטי. סובסטרטים מבוססי PA תואמים לבדיקות ביוכימיות במורד הזרם, כולל חילוץ חלבון ו-RNA, וכן עם הדמיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה. סובסטרטים מבוססי סיליקון מותאמים למיקרוסקופיית פלואורסצנציה פנימית מלאה (TIRF), המאפשרת הדמיית אינטראקציות בין תא ל-ECM בקרום הבסיסי. בנוסף, ניתן להתאים את הסובסטרטים הרכים לתמוך בתרבויות ספרואידיות הממוקמות במישור הדמיה עקבי, מה שמקל על רכישת תמונה עקבית. שיטות אלו מספקות פלטפורמות חזקות, חסכוניות וניתנות לשחזור לחקירה שיטתית של האופן שבו קשיחות ECM מווסתת תהליכים תאיים, ומקדימות תובנות מכניות לגבי שיחת צולב בין תא ל-ECM הן בהקשרים פיזיולוגיים והן בהקשרים מחלתיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטריצה החוץ-תאית (ECM) היא פיגום מבני וביוכימי בסיסי שמגדיר את התכונות המכניות של הרקמות ותומך בתפקודים הביולוגיים שלהן. לדוגמה, רקמות אלסטיות כמו הריאות והעורקים מועשירות ב-ECM מבוסס קולגן ואלסטין, המספק את העמידות המכנית הנדרשת למחזורי מתיחה-רתע חוזרים במהלך הנשימה. לעומת זאת, מערכת העצבים המרכזית מכילה ECM עשיר בגליקוזאמינוגליקן, היוצר סביבה תואמת מאוד המותאמת להתמיינות ואיתות נוירונים1. ברקמות מגוונות בגוף, נוקשות הרקמה נעה על פני כמה סדרי גודל, החל ממאות פסקלים ברקמות רכות כמו המוח והריאות ועד לרמות מגהפסקל וג'יגפאסקאל של נוקשות בגידים ובעצם, בהתאמה 2,3. הבדלים מכניים אלו אינם רק מבניים אלא גם ממלאים תפקיד קריטי בוויסות התנהגות התא 4,5. לדוגמה, תאי גזע מזנכימליים עוברים הגדרת שושלת תלויה בקשיחות, מאמצים גורלות נוירונים על מצעים רכים, גורלות מיווגניים על סובסטרטים ביניים, וגורלות אוסטאוגניים על מצעים קשים6. שינויים פתולוגיים בנוקשות ECM יכולים גם להניע תגובות תאיות חריגות ולתרום להתחלה והתקדמות המחלה 7,8,9. באופן דומה, שינויים בתכונות ה-ECM סביב תאים משנים גם הם את תפקוד האברונים ואת התנהגויות התא השונות10,11. למרות החשיבות המוכרת של ECM בהכוונת אותות, תפקוד האברונים ופתוגנזה של המחלה, המנגנונים שבהם תאים חשים וממירים אותות ECM לאותות ביוכימיים עדיין אינם מובנים במלואם.

ההתקדמות בהבנת הקשר בין תא ל-ECM הוגעה בין היתר בשל זמינות מוגבלת של פלטפורמות ניסוי המציעות שליטה מדויקת על תכונות ECM תוך שמירה על תאימות מלאה לבדיקות ביוכימיות סטנדרטיות ולזרימות דימות. בנוסף, חקר אינטראקציות בין תא ל-ECM נתפס לעיתים כאתגר טכני, שכן הוא דורש מומחיות בין-תחומית הכוללת מדעי החומרים, ביולוגיה תאית והנדסה ביולוגית. שיטה זו שואפת להתמודד עם אתגרים אלה על ידי מתן פרוטוקולים שלב אחר שלב לייצור תת-קרקעי ECM מבוססי PA וסיליקון עם תכונות מכניות מוגדרות, שניתן להכין בקלות ברוב מעבדות רטובות.

הידרוג'לים PA עם קשיחות ניתנת לכיוון הם מרכיבים בסיסיים במכנוביולוגיה; עם זאת, השימושיות שלהם לעיתים קרובות נפגעת בשל עלות גבוהה של מגיבים לקונוגציה של ECM, פונקציונליזציה לא עקבית של פני שטח, ותאימות לקויה עם תהליכי עבודה ביוכימיים בקנה מידה גדול. בנוסף, גישות מעשיות וסטנדרטיות לאיסוף דגימות והדמיה על פני מצעים בעלי קשיחות משתנה אינן מבוססות היטב. צווארי בקבוק אלו ניתנים לטיפול באמצעות פלטפורמת הג'ל PA שתוארנו, המתאפיינת בארבעה חידושים מרכזיים: (i) הפחתת עלויות משמעותית, (ii) כימיה פונקציונליזציה שחוזרת, (iii) ייצור ניתן להרחבה באמצעות חומרה רב-פעמית, ו-(iv) אינטגרציה חלקה עם בדיקות ביולוגיה וביוכימיות קונבנציונליות רבות של תאים. גישה זו עושה שימוש ביחסים שונים של אקרילאמיד וביסקרילאמיד ליצירת הידרוגלים בעלי תכונות מכניות שונות (טבלה 1). ג'לי PA הם אינרטיים ואינם מצמידים ישירות לחלבוני ECM. לכן, תגובת פולימריזציה רדיקלית חופשית המופעלת על ידי UV משמשת ליצירת רשת דקה ומקושרת של טטראקרילט די(טרימתילולפרופאן), אסטר N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS-אקרילט) וביסקרילאמיד על פני ג'לי PA (איור 1). רשת זו יוצרת משטח דבק דו-פעולתי לחלבוני ECM: ה-NHS-אקרילט מספק עיגון קוולנטי יציב לחלבוני ECM, בעוד הטטראקרילט מסייע בספיגה אחידה של חלבוני ECM12. בנוסף, אנו מספקים שיטות המדגימות כיצד ניתן לקצור חלבונים וחומצות גרעין כמו RNA מהסובסטרטים הללו באופן התואם לניתוחים ביולוגיים של תאים במורד הזרם כגון Western blotting ותגובת שרשרת פולימראז כמותית הפוכה (RT-qPCR). יתרה מזאת, הסובסטרטים התואמים של PA תומכים גם ביצירת ספרואידים ומיקומם במישור מוקד עקבי, מה שמאפשר ניתוח שיטתי של התנהגויות תאיות תלת-ממדיות13.

לעומת זאת, מגבלות האופטיקה של הידרוג'לים PA מגבילות את השימוש בהם בשיטות דימות מתקדמות, במיוחד במיקרוסקופיית פלואורסצנציה פנימית כוללת (TIRF)14. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו סובסטרטים מבוססי סיליקון מסוג ECM מכווננים מכנית, מותאמים להדמיית TIRF. חומרים אלו מציגים מקדם שבירה הדומה לזכוכית תוך שמירה על קשיחות מכוונת בטווח רחב (איור 2A). שכבה דקה של ג'ל סיליקון, עם יחסי חלקים משתנים, מצופה בספין על זכוכית כיסוי לפני הצמדת ECM (איור 2B וטבלה 2). עם זאת, ההידרופוביות הפנימית והאינרטיות הכימית של הסיליקון מונעות הצמדת ECM ישירה. לכן אנו מיישמים אסטרטגיית שינוי משטח שתאפשר חיבור קוולנטי של ליגנדים מסוג ECM. טיפול בפלזמת חמצן מכניס קבוצות הידרוקסיל למשטח הסיליקון (איור 2C). בהמשך, (3-אמינופרופיל)טריאתוקסילן (APTES) ממיר קבוצות הידרוקסיל אלו לאמין ריאקטיבי. 1-אתיל-3-(3-דימתילאמינופרופיל) קרבודוליד הידרוכלוריד (EDC), מקשר קרבודימיד באורך אפס, מסייע ביצירת קשרי אמיד קוולנטיים בין קבוצות האמינים על פני הג'ל לבין קבוצות הקרבוקסיל בחלבוני ECM.

ביחד, פלטפורמות ECM אלו מספקות מערכות חסכוניות, שכפוליות וניתנות להרחבה לבדיקת מנגנוני איתות התלויים בקשיחות ECM. הגמישות שלהם מאפשרת שילוב חלק עם בדיקות ביוכימיות, הדמיה ברזולוציה גבוהה ותהליכי עבודה בקצב גבוה, ומאפשרים חקירת האופן שבו נוקשות ה-ECM משפיעה על התנהגות התאים ומניעה התקדמות מחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת הידרוג'לים ECM מבוססי PA

  1. פונקציונליזציה של משטחי זכוכית לחיבור ג'ל PA
    הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר על רועיד אורביטלי. שטוף היטב במים איכותיים בין השלבים.
    1. נקה את משטחי הזכוכית עם 10% אקונומיקה במשך 3 שעות בצלחת עמידה לכימיקלים (למשל, פוליסטירן). השתמש בנפח מספיק כדי לכסות את הכוס במלואה וודא שאין בועות או אזורים יבשים כלואים.
      אזהרה: אקונומיקה היא חומר כימי קורוזיבי ומגיב מאוד. פעל לפי הוראות הבטיחות של היצרן.
    2. דגרו את הכיסויים ב-0.2 מטר חומצה הידרוכלורית (HCl) למשך 16 שעות עם ערבוב עדין על שייקר.
      אזהרה: HCl הוא חומר קורוזיבי מאוד ועלול לגרום לכוויות עור. לבשו ציוד מגן אישי מתאים.
    3. הוסף 0.1 מיליון NaOH ודגר במשך שעה.
      זהירות: תמיסות NaOH הן קורוזיביות ועלולות לגרום לכוויות בעור. לבשו ציוד מגן אישי מתאים.
    4. דגרו את הכיסויים ב-APTES של 0.5% במים איכותיים למשך 30 דקות.
      אזהרה: APTES הוא רעיל. תעבוד עם APTES על מכסה אדים עם ציוד מגן מתאים.
    5. שטוף את הכיסוי עם כמות גדולה של מים כדי להסיר שאריות APTES.
      הערה: שטיפה לא מלאה תגרום לתגובה בין APTES לגלוטראלדהיד בשלב הבא ותוביל למשקעים לבנים שיפגעו בהפעלת פני הזכוכית.
    6. דגרו את הכיסוי ב-0.5% גלוטראלדהיד ב-PBS למשך שעה.
      אזהרה: גלוטראלדהיד הוא רעיל. עבד עם גלוטראלדהיד במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים.
    7. ייבשו את הכיסוי על חומר סופג (למשל, מגבות נייר) למשך הלילה. אחסן את הכיסוי במיכל נקי ואטום עד לשימוש.
  2. הכנת תמיסת הידרוג'ל PA ויציקת ג'ל
    הערה: הנוסחאות הנדרשות להשגת הידרוג'לים עם מודול האלסטי המוגדר מוצגות בטבלה 1. נפחי ג'ל מומלצים ומידות זכוכית ליישומים ניסיוניים שונים מוצגים בטבלה 3.
    1. מערבבים רכיבי הידרוג'ל PA בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מ"ל, ללא אמוניום פרסולפט (APS) וטטרמתילתילנדיאמין (TEMED).
      הערה: אל תכין נפחים גדולים כי ג'לים עם קשיחות גבוהה מתפוגגים במהירות ועלולים להתקשות לפני סיום היציקה.
    2. הסר גזים מתערובת הג'ל של PA, ה-APS וצינורות TEMED בתא ואקום בעומק של 25 מ"מ כספית למשך 30 דקות.
    3. הכינו את כיסויי הכיסוי העליונים הידרופוביים על ידי מריחת ציפוי דוחה מים לנקות את הכיסוי באמצעות מטלית כותנה. ודאו שכיסויי הכיסוי נקיים מכתמים כדי לשמור על פולימריזציה עקבית של ג'ל.
    4. הוסף APS ו-TEMED לתמיסה המנותקת, ואז פיפט עדין את התערובת על הכיסוי המופעל.
    5. הנח את הכיסוי ההידרופובי מעל התמיסה ליצירת שכבת הידרוג'ל דקה ואחידה. תן לג'לים להתגבר במשך 35 דקות בטמפרטורת החדר. ודאו שאין בועות שנלכדו בין הכיסויים ושהתמיסה לא נשפכת מעבר לקצוות.
      הערה: יש לעקוב אחרי נפחים מומלצים ליציקת ג'ל כדי להבטיח עובי נכון; ג'לים דקים מדי מאפשרים לתאים לחושאת הזכוכית שמתחת. לפני פירוק סנדוויץ' הג'ל, בדוק את התערובת השארית בצינור המיקרוצנטריפוגה כדי לאשר את הפולימריזציה.
    6. טבלו את סנדוויץ' ההידרוג'ל ב-PBS כדי להפריד בין השכבות. ודאו שההידרוג'ל נשאר מחובר לכיסוי התחתון המופעל, והחלקה העליונה הידרופובית מתנתקת בקלות.
  3. פונקציונליזציה של הידרוגלים עם ליגנדים של ECM
    הערה: כל השלבים בסעיף זה חייבים להתבצע בתנאים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    1. חטא את ההידרוג'לים על ידי טבילה ב-70% אתנול, ואז העבר אותם לכלי פלסטיק לתרבות רקמות עם PBS סטרילי.
      הערה: אל תשאירו הידרוג'לים באתנול לפרק זמן ממושך כי זה ייבוש את הג'לים ויפגע בהצמדת ECM.
    2. הכינו תמיסת פונקציונליזציה לתערובת ראשית המורכבת ממים, אתנול, HEPES וביסקרילאמיד (טבלה 4).
      אזהרה: ביסקרילמיד רעיל בעת שאיפה או בליעה.
    3. הכינו תמיסות מדוללות של פוטוניזטור UV וטטראקרילט. שני החומרים מומסים באתנול (טבלה 4).
      הערה: יש לבצע דילול סדרתי של טטראקרילט בכל פעם, שכן כמויות מופרזות עלולות לגרום לפולימריזציה מופרזת ולהצטברות שטח שחור נראים לעין (ראו איור 3A).
    4. שקלו את הכמות הנדרשת של NHS-אקרילט באמצעות איזון אנליטי. החזירו את NHS-אקרילט ל-50% אתנול/50% מים מיד לפני השימוש.
      הערה: כמות מופרזת של NHS-אקרילט תוביל להיווצרות משקעים שחורים נראים לעין ועלולה להוביל לציפוי ECM לא אחיד (איור 3B).
    5. הוסף לתערובת הראשית שהוכנה בשלב 1.3.2 עם פוטו-יוזם UV, טטראקרילט ותמיסות NHS-אקרילט. שאף את ה-PBS והוסיף את המיקס הראשי לג'לים, כדי לוודא שהם מכוסים במלואם.
    6. חשפו את ההידרוגלים (ללא מכסי כלים לתרבות רקמות) לאור UV למשך 400 שניות (מקור אור UV עם אורך גל קטן מ-365 ננומטר).
      אזהרה: יש לשים מגן עיניים מתאים בעת עבודה עם אור UV.
    7. הסר את הג'לים והניח אותם על הקרח. שואף את תמיסת הפונקציונליזציה, ואז שטוף את הג'לים שלוש פעמים עם HEPES סטרילי מקורר מראש של 25 מ"מ (pH 6.0), ואחר כך שלוש שטיפות עם NaCl סטרילי מקורר מראש 0.9%.
    8. דגרו את ההידרוגלים עם רצועת ECM המועדפת ב-HEPES סטרילי מקורר מראש של 100 מ"מ (pH 8.0) עם 100 מ"מ NaCl בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על מתנדנד אורביטלי.
      הערה: ניתן לבחור את ריכוז הליגנדים של ECM לפי שיקול דעתו של המשתמש; עם זאת, חשוב לשמור על ריכוזי ליגנד זהים בכל המצע עם קשיחות משתנה באותה אצווה.
    9. שאפו בזהירות את תמיסת הליגנד של ECM 16 שעות לאחר מכן. שטפו את ההידרוג'לים שלוש פעמים עם PBS והוסיפו בסיס ללא סרום (PBS) כדי לשמור על הלחות שלהם. דגרו את הג'לים למשך הלילה באינקובטור תרבית רקמה כדי לוודא את הסטריליות לפני זריעת התאים.
      הערה: המדיה תיראה מעוננת לאחר דגירה בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במדיה של תרבית בסיס אם יש זיהום.
    10. השתמשו בג'לים מיד לזרעת תאים או שמרו אותם בטמפרטורה של 4°C בבסיס לא יותר מ-3 שבועות.

2. יצירת מצעי ECM מבוססי סיליקון הניתנים לכיוון מכני

  1. הכנת כיסויי זכוכית לציפוי ג'ל סיליקון
    1. כיסויי זכוכית נקיים עם 3 מיליון NaOH למשך 20 דקות.
    2. שטפו היטב עם מים איכותיים חמש פעמים ושאבו את המים בסוף. תנו להם להתייבש באוויר והשתמשו בסילון אוויר חנקן כדי להסיר טיפות או פסולת שנותרו.
  2. הכנת ג'ל סיליקון
    1. שקלו את רכיב A ורכיב B של האלסטומר הסיליקוני הדו-רכיבי בהתאם ליחס המשקל שמצוין בטבלה 2, באמצעות איזון אנליטי. השתמש בקצה פיפטה חתוך כדי לשאוב את התמיסות הצמיגות.
    2. ערבבו היטב את רכיב A ורכיב B באמצעות קצה פיפטה כדי להבטיח שילוב מלא.
    3. דה-גז מהתערובת בתא ואקום ב-25 מ"מ כספית למשך 10 דקות.
  3. יציקת ג'ל על כיסויי זכוכית
    1. הניחו כיסוי על משטח גומי הממוקם על מגן הספין, כדי לוודא שהוא ממוקם היטב.
      הערה: שטיח הגומי מבטיח אטימת ואקום תקינה. ללא אטימה מספקת, הכיסוי עלולה להיזז ולהישבר. מרכז לא נכון עלול לגרום לציפוי לא אחיד.
    2. הפעל את השואב כדי לאבטח את הכיסוי.
    3. הוסיפו 100 מיקרוליטר מתערובת הג'ל למרכז הכיסוי. ספין קואט ב-500 סל"ד ל-10 שניות, ואחריו 8,000 סל"ד ל-60 שניות.
    4. לאפות את הכיסוי המצופה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. תן לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
      הערה: שמרו בטמפרטורת החדר עד חודש לפני השימוש.
  4. פונקציונליזציה של ג'ל הסיליקון עם ליגנדים של ECM
    1. חשפו את הכיסוי המצופה בג'ל סיליקון לפלזמת חמצן למשך 5 דקות בעוצמה של 11 וואט.
      הערה: חשיפה ממושכת לפלזמת חמצן או בעוצמה גבוהה עלולה לגרום לסדק בג'לים. השילוב האופטימלי של הספק וזמן עשוי להיבדק בהתאם לציוד בו משתמשים.
    2. הכינו תמיסת סילניזציה המכילה 95% אתנול, 0.5% APTES ו-4.5% dH2O.
      הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
      אזהרה: APTES הוא רעיל. תעבוד עם APTES על מכסה אדים עם ציוד מגן מתאים.
    3. דגרו את הכיסוי המצופה בג'ל עם תמיסת הסילניזציה למשך 10 דקות.
    4. שטוף היטב עם PBS חמש פעמים.
    5. הכינו את תמיסת ה-ECM המכילה 100 מיקרוגרם/מ"ל EDC ואת ה-ECM המועדף בריכוז הרצוי ב-PBS.
      הערה: EDC אינו יציב בתמיסה ורגיש ללחות. הכינו אותו טרי לפני השימוש ואחסנו אותו סגור היטב במקום קריר ויבש, מוגן מלחות ואור שמש ישיר.
      אזהרה: EDC מזיק אם נבלע ורעיל אם נשאפ. ללבוש ציוד מגן מתאים ולעבוד עם קפוצ'ון אדים.
    6. דגרו את הכיסוי עם תמיסת ה-ECM למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. שטוף את הכיסוי עם PBS חמש פעמים. שטוף עם מדיום בסיסי והוסיף תאים.
      הערה: צפיפות תאים אופטימלית תלויה בקו התאים הספציפי ובמטרות הניסוי (למשל, תת-מתכנסת למורפולוגיה או חד-שכבה להידבקות תא-תא). לדוגמה, צפיפות של 0.1 x 106 תאים לס"מ רבוע משמשת בדרך כלל לפיברובלסטים להשגת 50% חיבור בתוך 48 שעות.

3. הכנת מצע ECM לצביעת חיסון ודימות

  1. צביעת חיסון והדמיה על סובסטרטים מבוססי PA
    הערה: הידרוג'לים PA בגודל 18 מ"מ בדרך כלל מספקים שטח דימוי מספק לניתוח כמותי. ליישומים של הדמיה, יצוק את ההידרוגלים ובצע צביעת חיסון ב"תאי כתום" שהוכנו מצינורות של 15 מ"ל. השתמש מחדש בתאים הכתומים למספר סבבים של יציקת ג'ל וצביעה, בתנאי שהם שומרים על שלמות מבנית.
    1. לטבעת ניקוב מסרט פוליקרבונט וסרט גומי סיליקון באמצעות קוטר חיצוני של 18 מ"מ וחורים פנימיים בקוטר 14 מ"מ להכנת מרווחים ואטמים.
    2. חותך פתח במרכז פקק צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל באמצעות מספריים ליצירת תא ליציקת ג'ל וצביעה.
    3. ראיתי את צינור הצנטריפוגה בסימן של 14 מ"ל. חתוך קצוות לא אחידים עם סכין מנגל ושייף את שפת המכסה כדי לוודא שהוא נכנס לפלטת 12 וולים סטנדרטית.
    4. הרכיבו את כריך ההידרוג'ל-כיסוי (כפי שמתואר בסעיף 1), והניחו את טבעת המרווח על הכיסוי המופעל.
    5. פירקו את הסנדוויץ' לאחר שהג'לים פולימריזציה מלאה.
    6. חטא את ההידרוגלים בקוטר 18 מ"מ והעבר אותם לפלטת תרבית רקמה עם 12 בארות עם PBS סטרילי.
    7. בצע פונקציונליזציה של הליגנדים של ECM כפי שמתואר בסעיף 1.
    8. תאי זרעים ומקבעים אותם עם 4% פורמלדהיד.
      הערה: הימנעו מקיבועים מבוססי אלכוהול, שכן הם מייבשים את הג'לים ופוגעים בשלמות המבנית.
      אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל ויש להשתמש בו תמיד בתוך מכסה אדים.
    9. (אופציונלי) הרכיבו מחדש את הדגימות על תא מכסה צינור הצנטריפוגה. השתמש באטם סיליקון כדי לאטום את התא.
      הערה: בצע בדיקת דליפה עם PBS למשך מספר שעות לפני הצביעה. למרות ששיטה זו עשויה להיראות מייגעת יותר, היא מקדמת צביעה אחידה ומפחיתה את צריכת הנוגדנים.
    10. יש לבצע צביעת אימונופלואורסצנציה בהתאם לפרוטוקולים המועדפים על ידי המשתמש.
    11. לאחר הצביעה, יש לאחסן דגימות ב-PBS עם תוספת של 50% גליצרול. תדמיין את הדגימות בהקדם האפשרי.
      הערה: הימנע ממדיות התקנה סטנדרטיות שמתקשות, שכן הן עלולות לסדוק הידרוגלים עם הזמן ולפגוע בדגימות. עוצמת הפלואורסצנציה פוחתת עם הזמן; תמונה תוך שבוע לאיכות אות אופטימלית.
    12. הניחו טיפה קטנה של PBS (או מדיום התקנה) על פני המשטח הזכוכית-תחתית של צלחת תרבית רקמות. הפכו בזהירות את ההידרוגלים הצבועים אל הטיפה כך שהתאים פונים אל זכוכית הכיסוי והמשיכו בהדמיה.
  2. צביעת חיסון והדמיה על סובסטרטים מבוססי סיליקון של ECM
    1. מקבע את הדגימות באמצעות פורמלדהיד 4% וצביע אותן ישירות על צלחת זכוכית לפי פרוטוקול אימונופלואורסצנציה סטנדרטי. הימנע מקיבועים מבוססי אלכוהול כי הם עלולים לסדוק את מצעי ה-ECM.
    2. דגימות תמונה ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה מסורתי.

4. איסוף חלבונים ו-RNA מתאים מצופים על תת-קרקעי ECM

  1. באמצעות מלקחיים, הסר בזהירות את הג'לים מהצלחת וטובל אותם ב-PBS סטרילי כדי לשטוף את שאריות המדיה והסרום.
    הערה: טפל בעדינות בכיסויי הכיסוי, כי הם עדינים מאוד ועלולים להישבר בקלות.
  2. טפחו בעדינות את קצה ההידרוג'ל במגבונים דלי סיבים כדי להסיר עודפי PBS.
  3. הוסיפו נפח מתאים של בופר להפקת RNA למכסה של צלחת תרבית רקמה.
    הערה: מגיבים מבוססי פנול-גואנידין תואמים להפקת RNA מג'לים של PA. ניתן להשתמש במאגרי פירוק חלבונים בהתאם לדרישות הניסוי. הצג דגימות תחת מיקרוסקופ לאחר דגירה של בופר ליזיס כדי להבטיח הפרעה מלאה של התא.
  4. הנח את הכיסוי (צד הג'ל כלפי מטה) על תמיסת הליזיס. הרימו והורדו בזהירות את ההידרוג'ל מספר פעמים כדי להבטיח פירוק אחיד של כל התאים.
  5. גרדו בעדינות את פני הג'ל כדי לשחרר את הליזאט.
    הערה: אין להשתמש במגרדים מסחריים לתאי פלסטיק, שכן הפלסטיק הקשיח עלול להזיק להידרוג'לים הרכים ולזהם את הליזאט בחתיכות ג'ל. הפלסטיק הרך המשמש לייצור מרווחים (ראו שלב 3.1.1) מתאים למטרה זו וניתן להשתמש בו מחדש לייצור מגרדים מותאמים אישית.
  6. אחסן את ה-RNA או הליזטים של החלבון בטמפרטורה של -80°C עד להמשך העיבוד בשיטות ביוכימיות קונבנציונליות או להשתמש בהם מיד.

5. יצירת תרבות ספרואיד חד-מישורית

  1. הכינו את ההידרוג'ל של 75 Pa PA על כיסויי כיסוי בקוטר 18 מ"מ והפכו את המשטח לתמצית ממברנת בסיס (BME) או ליגנד ECM מתאים אחר להקל על חיבור התאים.
  2. תאי זרע על הידרוג'לים מצופים ECM או ג'לים סיליקון בצפיפות הרצויה.
  3. אחרי שעתיים, הסר בעדינות תאים לא מחוברים והוסיף שכבת BME מדוללת בבסיס מקורר.
    הערה: ה-BME מפולימר כשהוא מתחמם. קרר לפני פיפטינג. אחוז ה-BME המשולב נקבע לפי השלמות והיציבות המכנית הרצויה של הפיגום התלת-ממדי שנוצר.
  4. דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה למשך 1.5 שעות כדי לאפשר פולימריזציה של BME.
  5. הוסיפו בעדינות מדיום תרבית תאים כדי לכסות לגמרי את הג'לים התלת-ממדיים.
  6. לשמור על תרביות בתנאים סטנדרטיים. התאים ימשיכו לגדול ולהרכיב את עצמם לספרואידים תלת-ממדיים לאורך זמן עד שיגיעו לנקודת הניסוי הרצויה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קשיחות ג'ל PA שנוצרה באמצעות הנוסחאות בטבלה 1 נבדקה בניסוי באמצעות ריאומטר. נבחרו ג'לים עם ערכי קשיחות נומינליים של 0.4 kPa, 6 kPa ו-60 kPa, בשלושה סדרי גודל. ערכי הקשיחות שנמדדו היו 363 ± 76 פסקל לג'לים של 400 פסקל, 6.41 ± 0.50 קילופסקל לג'לים של 6 קילופסקל, ו-36 ± 8 קילופסקל לג'לים של 60 קילופסקל (איור 4A). כדי להעריך את החיבור האחיד של ECM לג'לים של ה-PA, פיברונקטין מסומן בפלואורסצנטי הוצמד על פני הג'ל. חמישה שדות ראייה אקראיים לכל ג'ל צוירו, ועוצמת ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ייצור ה-ECM המתואר מספק זרימת עבודה ניתנת לשחזור, ניתנת להרחבה וחסכונית, וניתן ליישם אותה בקלות ברוב המעבדות. למרות שכלי תרבית מסורתיים מזכוכית ופלסטיק נוחים ומאפשרים איסוף נתונים מהיר, המצעדים הסינתטיים אינם מצליחים לשחזר את הקשיחות הפיזיולוגית הרלוונטית לרקמות. סובסטרטים אלטרנטיביים הניתנים לכיוון מכני כמו פולידימתילסילוקסן (PDMS) או מתקרילויל ג'לטין (GelMA) קלים יותר לייצור, אך בדרך כלל אינם יכולים להשיג ערכי קשיחות בטווח תת-קילופסקלי, מה שמגביל את ההתאמה שלהם למידול רקמות רכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מפרס CIHR Research Excellence, Diversity, and Independence Early Career Transition Award 202305ED8-509143-244657 (ל-F.B.K.) וממכון הסרטן הלאומי לבריאות R35 CA242447-01A1 ל-V.M.W. K.J. הוא עמיתת לויס א. סינלי של קרן מחקר הסרטן דיימון רוניון (DRG-2547-25).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)919-30-2-Thermo Fisher Scientific
1.7 mL microcentrifuge tubes-LMCT1.7BFroggaBio
12-well tissue culture-treated plates-83.3921Sarstedt
15 mL centrifuge tubes (for orange chamber)-CLS430790Corning
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure)106797-53-9-Thermo Fisher Scientific
2% Bisacrylamide solution110-26-9-Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)25952-53-8-Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride28718-90-3-Sigma
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)-D1306Invitrogen
40% Acrylamide solution01/06/1979-Bio-Rad
50% Glutaraldehyde111-30-8-Thermo Fisher Scientific
6 cm tissue culture-treated dishes-83.3901Sarstedt
A549 cells-CCL-185ATCC
Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester38862-24-7-Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit antibody-A11008Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(triethylammonium salt))-A37572Invitrogen
Ammonium persulfate7727-54-0-Bio-Rad
Clear impact-resistant polycarbonate film (0.005 in.; spacer)-85585K72McMaster-Carr
CY 52-276 silicone gel, Components A and B2624028-Dow
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-11995-065Thermo Fisher Scientific
Ethanol, anhydrous64-17-5-Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix-4385612Thermo Fisher Scientific
Fetal bovine serum-A52567-01Thermo Fisher Scientific
Fibronectin-356008Corning
Formaldehyde (16%)-28908Thermo Fisher Scientific
HEPES7365-45-9-BioShop
High-temperature silicone rubber sheet (0.020 in.; gasket)-86435K452McMaster-Carr
Hydrochloric acid7647-01-0-BioShop
Large hollow hole punch tool set-66000Mayhew Pro
Matrigel-356234Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 250 mL-CLS1395250Corning
Media storage borosilicate glass bottle, 500 mL-CLS1395500Corning
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate-4346906Thermo Fisher Scientific
Microscope slide coverslips, 18 mm diameter-72222-01Electron Microscopy Sciences
Microscope slide coverslips, 50 mm diameter-1.84E+16eBay
PBS (1×)-14190144Thermo Fisher Scientific
PBS (10×)-70011044Thermo Fisher Scientific
Phalloidin17466-45-4-Biotium
Phospho-FAK (Tyr397) antibody-85567Cell Signaling Technology
Phospho-MLC (Ser19) antibody-3671Cell Signaling Technology
Plasma cleaner-PDC-32GHarrick Plasma
qPCR primers (forward and reverse)-N/AIntegrated DNA Technologies
qScript cDNA Synthesis Kit-95047QuantaBio
Rain-X--Rain-X
Screw-cap tubes, conical base, 15 mL-62.554.101Sarstedt
Screw-cap tubes, conical base, 50 mL-62.547.205Sarstedt
Serological pipette, 10 mL-170356NThermo Fisher Scientific
Serological pipette, 25 mL-170357NThermo Fisher Scientific
Serological pipette, 5 mL-170355NThermo Fisher Scientific
Serological pipette, 50 mL-170358NThermo Fisher Scientific
Sodium hydroxide1310-73-2-BioShop
SYPRO Ruby protein gel stain-S12000Invitrogen
TEMED110-18-9-Bio-Rad
TRIzol reagent-15596026Thermo Fisher Scientific
UV chamber-165-5031Bio-Rad

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BiologyAllAllExtracellular matrixstiffnessmechanotransductionhydrogelsfibrosis
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים