מאמר שיטה

מכשיר מיליליפלואידי מתרבות רציפה לחקר אשריכיה קולי בתנאים תזונתיים נמוכים ומשתנים

DOI:

10.3791/70652

⸱

7 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department of Mechanical Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), 3Department of Plant and Environmental Sciences, Institute of Life Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, 4Department of Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול למכשיר תרבית רציפה מיליפלואידי (MCCD), המאפשר גידול אוכלוסיות חיידקים בתנאים קבועים עם דלי חומרים מזינים (עד למאות ריכוזים ננומולריים) או בתנודות תזונה זמניות בקנה מידה זעיר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתי גידול מיקרוביאליים בטבע מאופיינים לעיתים בריכוזים נמוכים של חומרים מזינים מעורבים, הטרוגניות מרחבית ותנודות זמניות. עם זאת, שיטות גידול מעבדה מסורתיות אינן מצליחות לשחזר תנאים אלו. תרביות אצווה אינן יכולות לשמר צמיחה בסביבות דלות תזונת, בעוד כימוסטטים שומרים על גדילה יציבה עם רכיב מזין מגביל יחיד, אך קשה ליישם כאשר המטרה היא לשמור על ריכוזים מוגדרים של תערובות מזינים נמוכות או להכניס תנודות מהירות. מערכות מיקרופלואידיות יוצרות סביבות דינמיות אך מניבות ביומסה לא מספקת לניתוחים אומיים ברמת אוכלוסייה. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, אנו מציגים את מכשיר התרבית הרציפה המיליפלואידית (MCCD), פלטפורמה רב-שימושית לחקר תגובות מיקרוביאליות לתנאים יציבים ומשתנים של חומרים מזנים. ה-MCCD מאחסן אוכלוסיות חיידקים בתוך מסנן סטרייבקס (ממברנת סינון נקבובית של 0.45 מיקרון פוליווינילידן פלואוריד [PVDF]), שם זרימה רציפה של מדיום שומרת על תנאי תרבית יציבים תוך מניעת דלדול חומרי המזון. מערכת שסתום סולנואידים תלת-כיוונית, הנשלטת באמצעות תוכנת Matlab מותאמת אישית, מאפשרת תנודות תזונתיות מדויקות בקנה מידה זערי. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב להפעלת ה-MCCD בשני מצבים: (1) תנאים קבועים עם דלי חומרים מזינים ו-(2) תנאי תנודתיות של חומרים מזינים. באמצעות מערכת זו, אשריכיה קולי גדלה באופן מעריכי בתערובת של חומצות אמינו ונוקלאובזים הנמצאים בעשרות עד מאות ריכוזים ננומולריים, והגיעה לריכוזי תאים בסדר גודל של 109 תאים למ"ל. על ידי שחזור מאפיינים מרכזיים של בתי גידול מיקרוביאליים טבעיים, ה-MCCD מאפשר חקר צמיחת חיידקים ופיזיולוגיה בתנאים מבוקרים אך רלוונטיים אקולוגית ב-E. coli ובמינים מיקרוביאליים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים בבתי גידול טבעיים נתקלים בנוף מזינים שלעיתים משתנה הן בהרכב והן בריכוז, ויכול להשתנות לאורך טווח רחב של טווחי זמן 1,2,3,4. בסביבות כמו האוקיינוס5, הקרקע3 והמעי6, צמיחת המיקרובים מוגבלת לעיתים קרובות על ידי אחד או יותר מהחומרים המזינים החיוניים, וזמינות החומרים המזינים יכולה להשתנות עקב תהליכים פיזיקליים, כימיים וביולוגיים4. תערובות התזונה הללו והתנודות שלהן מניעות אסטרטגיות מיקרוביאליות להישרדות וצמיחה, ומעצבות תגובות ברמות שונות של ארגון ביולוגי4.

התאמות מיקרוביאליות לדינמיקת חומרים מזינים מתרחשות ברמות הקהילה, האוכלוסייה והתא היחיד. ברמת הקהילה, תנודות יכולות לקדם קיום משותף של מינים7, לתאם את הרכב הקהילה והפעילות המטבולית עם שונות זמנית8, וליצור הזדמנויות למינים חדשים להתיישב9. ברמת האוכלוסייה, שינוי תנאי התזונה יכול להאיץ את האבולוציה על ידי בחירת שינויים גנטיים10 או לגרום לשונות פנוטיפית, כולל אסטרטגיות גידור הימור11, שמשפרות את ההישרדות בתנאים בלתי צפויים. ברמת התא היחיד, חיידקים מתאימים את הפיזיולוגיה שלהם בתגובה לסביבת החומרים התזונתיים12,13. דוגמה שדווחה לאחרונה היא פיזיולוגיה ספציפית שמעניקה לחיידקים יתרון גדילה בתנאים משתנים14. מכיוון שחיידקים נתקלים לעיתים קרובות במגבלות תזונתיות, חקר האופן שבו הם מגיבים לתנאים דלים ומשתנים של חומרים מזינים — הן כתאים בודדים והן בתוך אוכלוסיות או קהילות — הוא חיוני להבנת התנהגותם בסביבתם הטבעית.

כימוסטטים מתאימים במיוחד לחקר צמיחה תחת מגבלה של מזון יחיד, אך קשה להשתמש בהם כאשר המטרה היא לשלוט בריכוזי מספר חומרים מזינים בתערובות בריכוז נמוך. כימוסטטים היו כלים חשובים לחקר הסתגלות חיידקים למגבלת חומרים מזינים על ידי מתן סביבה מבוקרת ויציבה. עם זאת, פעולתם מגבילה אותם לתנאים שבהם הצמיחה מוגבלת על ידי יסוד תזונתי חיוני אחד. בכימוסטט, קצב הדילול מותאם כך שגדילת התאים תאזן את אספקת המזון המגביל היחיד, ובכך תקבע את קצב הגדילה במקום ריכוזי החומרים המזיניםהבודדים. מסגרת זו אינה מתפשטת בקלות לסביבות המכילות תערובות של חומרים מזינים ניתנים להחלפה — כגון מקורות פחמן מרובים — משום שקצב הדילול שולט רק בקצב הצמיחה הכולל, ולא בריכוזים של כל רכיב במדיום16,17. כתוצאה מכך, ריכוזי החומרים המזינים הבודדים ודפוסי השימוש המשותף שלהם נובעים משימוש מיקרוביאלי במקום לקבל מרשם חיצוני16,17.

בנוסף, בעוד ששינויים בחומרים מזינים יכולים להיגרם בכימוסטטים, תנודות מהירות או הזזות בודדות בקנה מידה של דקות קשות להשגה בשל נפחי התרבית הגדולים בדרך כלל. מכשירים מיקרופלואידיים הפכו לכלים רבי עוצמה ליצירת סביבות תזונתיות מדויקות, בריכוז נמוך ומשתנות14. כאשר הם משולבים עם מיקרוסקופיית וידאו, הם מאפשרים מדידת גדילה של תא יחיד. למרות שמערכות מיקרופלואידיות מאפשרות כימות של ביטוי חלבונים נבחרים באמצעות מדווחי פלואורסצנט, בניגוד לכימוסטטים, מכשירים מיקרופלואידיים טיפוסיים קטנים מדי כדי לייצר את הביומסה הנדרשת לניתוחי אום, לדוגמה, לחקר הפרוטאום של אוכלוסיית חיידקים. כדי לגשר על הפער הזה, פיתחנו את מכשיר התרבית הרציפה המיליפלואידית (MCCD).

ה-MCCD מאפשר צמיחת חיידקים בתנאי תזונה מבוקרים, כולל תנאים קבועים עם דלדול מינימלי או ללא דלדול, וכן תנאי תזונה משתנים, תוך שימוש במערכת תרבית זרימה רציפה המסוגלת לייצר ביומסה מספקת לניתוחים במורד הזרם. ה-MCCD משתמש במסנן PVDF של 0.45 מיקרון ככלי גידול, שבו המדיום מתמלא ברציפות על ידי משאבה פריסטלטית המספקת מדיום טרי ממאגר (איור 1A). הממברנה הנקבובית של המסנן שומרת על חיידקים תוך מתן זרימה מוגדרת של חומרים מזינים, מה שמונע דלדול חומרים מזינים גם בריכוזי תזונה נמוכים (מאות ננומולר עד מיקרומולר). מכיוון שביומסה נשמרת בזמן שמדיום טרי זורם ברציפות דרך המכשיר, ל-MCCD יש דמיון עם רטנטוסטטים18, שבו תאים נשמרים בזמן שהמדיום מתחדש. עם זאת, ה-MCCD שונה מרטנטוסטטים קלאסיים בארכיטקטורה ובאופן אספקת החומרים המזינים שלו. הרטנדוסטט פועל בדרך כלל ככור נפח מעורבב, שבו התאים תלויים בנפח תרבית מעורב היטב. בתנאים כאלה, זמינות החומרים המזינים תלויה באיזון בין ערבוב, דיפוזיה וספיגת תאים, ויכולים להיווצר דלדול מקומי או גרדיאנטים, במיוחד בריכוזי חומרים מזינים נמוכים ובצפיפויות תאים גבוהות. לעומת זאת, ב-MCCD, התאים מתאספים ישירות על הממברנה בתוך מחסנית סטריבקס בנפח קטן, ויוצרים שכבות בעובי של כמה תאים בלבד, החשופות ברציפות למדיום זורם. לא מוטלת ערבוב פעיל בתוך המחסנית; במקום זאת, התווך עובר הומוגני במעלה הזרם ומועבר בזרימה רציפה. החומרים המזינים מסופקים באמצעות הובלה קונבקטיבית דרך שכבות התא הדקות, ומכיוון שמרחק הדיפוזיה קטן וקצב הזרימה גבוה, גרדיאנטים מקומיים של חומרים מזינים מצטמצמים. כתוצאה מכך, תנאי החומרים התזונתיים שהאוכלוסייה חווה נקבעים בעיקר על ידי הרכב התווך הנכנס, מה שמאפשר תנאים עקביים ומוגדרים היטב עם דלי חומרים מזינים מאשר במערכות אחזקה מעורבבות.

figure-introduction-1
איור 1: מכשיר תרבית רציפה מיליפלואידי (MCCD) לתרבות חיידקים בתנאי ריכוז נמוך או משתנים של חומרים מזינים משתנים. (א) סכמטי של MCCD לתנאי תזונה קבועים. משאבה פריסטלטית מניעה את זרימת המדיום הטרי ממאגר דרך פילטר PVDF של 0.45 מיקרון המכיל תאי חיידקים. הממברנה הנקבובית במסנן שומרת על החיידקים תוך שהיא מאפשרת למדיום לעבור. זרימה רציפה בתווך שומרת על תנאי תזונה קבועים בתוך המסנן, גם בריכוזי חומרים מזינים נמוכים מאוד. (B) סכמטי של MCCD לתנאי תזונה משתנים. שסתום סולנואיד תלת-כיווני מבוקר תוכנה במעלה הזרם של משאבת הפריסטלטיקה מחליף בין הזרימה הבינונית בין שני מאגרים (למשל, ריכוז תזונה גבוה, Cגבוה, וריכוז נמוך של חומרים מזינים, Cנמוך). התוכנה שולטת במיקום הבוכנה של השסתום כדי לקבוע את מקור הזרימה הפעיל. (ג) הרכבה נוזלית לתנאי תזונה קבועים. פקק עם שלושה צינורות סיליקון החוצים אותו אוטם את הבקבוק המכיל מדיום טרי. צינור אחד מחובר למסנן אוורור לאוורור, בעוד השניים האחרים נושאים מדיום אל המסננים. חיבורי Barb-to-Male Luer מחברים את הצינורות הללו לצינור הפריסטלטיקה, ומחברים כל צינור פריסטלטי לשסתום בדיקה חד-כיווני, המשמש כנקודת הכניסה למסנן. יציאת המסנן מצוידת גם בשסתום בדיקה חד-כיווני. התמונה מציגה שתי דגימות, כל אחת כלולה במסנן אחד. (ד) הרכבה נוזלית לתנאי תזונה משתנים. פלטפורמת המתכת מכילה את המיקרו-בקר ואת הרכיבים האלקטרוניים השולטים בשני שסתומי סולנואידים באמצעות תוכנת MATLAB מותאמת אישית. חיבורי הברג לברברב מחברים גם את הכניסות וגם את היציאות של שסתומי הסולנואיד לצינור. לכל שסתום יש שני פתחים לשני המדיה החלופית, כאן מדיום בעל ריכוז תזונה גבוה, CHigh, צינורות מסומנים באדום, ומדיום עם ריכוז נמוך של חומרים מזינים, C Low, עם תווית כחולה. המדיה נמצאת בתוך בקבוקים עם כיסוי עם מסנן אוורור, כמו ב-(C). היציאות משסתומי הסולנואיד מתחברות למסננים באמצעות צינור פריסטלטיקה, כמו במכלול הסטדי-סטסט (C). התמונה מציגה שתי דגימות, כל אחת כלולה במסנן אחד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בנוסף, שילוב שסתום סולנואיד תלת-כיווני מבוקר תוכנה במעלה מסנן Sterivex מאפשר למשתמש להחליף את זרימת המדיום בין שני מדיומים הכלולים במאגרים שונים (איור 1B). כתוצאה מכך, ניתן להשתמש במכשיר לחקר תגובת החיידקים לסביבה יציבה בתנאי תזונה קבועים (כולל ריכוז נמוך) או לתנודות תזונה, עם טווחי זמן של כמה דקות או יותר.

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של MCCD לחקר חיידקים בתנאים של דלי תזונה ותנאי תזונה משתנים. לדוגמה, פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לביצוע ניסוי גידול באמצעות אשריכיה קולי NCM3722 בשני מצבי פעולה של MCCD: תנאים קבועים עם דלי חומרים מזינים ותנאי תזונה משתנים. מערכת MCCD ניתנת להתאמה בקלות לתנאי תזונה אחרים ולמינים מיקרוביאליים, מה שהופך אותה לפלטפורמה רב-שימושית לחקר פיזיולוגיה חיידקית בסביבות תזונה אופייניות לאלו שנפגשות בטבע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צמיחת חיידקים בתנאי תזונה קבועים

הערה: פרוטוקול זה מתאר את ההליך לביצוע עקומת גדילה של E. coli NCM3722 במצב מדולל מאוד Rich-Defined Medium ("RDM נמוך"). עקומת הצמיחה הזו נמשכת 12 שעות, עם דגימה אחת שנאספת כל 2 שעות (סה"כ 6 נקודות זמן). העיקרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שכל נקודת זמן מתאימה למסנן Sterivex יחיד (שמעתה, נקרא מסנן PVDF של 0.45 מיקרון). כדי לאסוף דגימה, התרבית שבתוך המסנן נשלפת על ידי צנטריפוגה הפוכה, מספר התא מכומת, והמסנן נזרק. כל מסנן PVDF של 0.45 מיקרון מניב דגימה אחת בלבד. הכנת הניסוי דורשת הגדרה של שלושה פרמטרים מרכזיים לניסוי: קצב הזרימה של המשאבה הפריסטלטית, משך הניסוי, ומספר הדגימות הרצוי (כלומר, מספר מסנני PVDF של 0.45 מיקרון). הגדר את קצב הזרימה ההתחלתי ל-2 מ"ל לדקה. כוון פרמטר זה לפי הצורך (למשל, הגבר את קצב הזרימה כדי לשמור על אספקת חומר מזין מדולל מאוד).

  1. הכנת מדיום וחומרים
    הערה: מכיוון שכל מסנן מתאים לדגימת נקודת זמן אחת, זמן הריצה הניסיוני של כל מסנן PVDF של 0.45 מיקרון משתנה בהתאם לזמן האיסוף שלו (למשל, 2 שעות לנקודת זמן ראשונה, 4 שעות לנקודת זמן שנייה, וכן הלאה).
    1. הערך את נפח המדיום הנדרש של תרבית באמצעות הנוסחה
      figure-protocol-1,
      כאשר n הוא מספר הדגימות (מסנני PVDF של 0.45 מיקרון), Q הוא קצב הזרימה (במיליטר/דקה), ו-ti הוא זמן הריצה הניסיוני (בדקות) עבור כל דגימה.
    2. הכפל ב-1.2 כדי לכלול נפח נוסף של 20% כדי לקחת בחשבון את שינוי קצב הזרימה. לדוגמה זו, חשב
      figure-protocol-2
    3. עגלו את הנפח המחושב כלפי מעלה (למשל, הכינו 6,200 מ"ל בדוגמה זו).
    4. הכינו חומר לעיקור (ראו טבלה 1).
      הערה: יש להכין ולחטא את החומרים יום לפני הניסוי כדי להבטיח מוכנות ולהפחית עיכובים. אוטוקלב לחומרים אלו, למעט שסתומי Luer חד-כיווניים; חטא את השסתומים עם 70% אתנול.
      1. חבר את שני קצות שישה צינורות פרסטלטיים מסיליקון לחיבורי פלסטיק מסוג "Male Luer to Barb" על ידי הכנסת קצה הברב של החיבור לתוך הצינור. כסה את קצות ה-Luer הזכר בנייר אלומיניום כדי למנוע זיהום.
        הערה: שישה צינורות פריסטלטיים מוכנים כי הניסוי משתמש בשישה פילטרים PVDF של 0.45 מיקרון. כל הצינורות יורכבו מאוחר יותר על אותו ראש משאבה פריסטלטית כך שכל המסננים יקבלו זרימה זהה.
      2. הניחו את הצינור בתוך מיכל סגור וניתן לחיטוי.
      3. הניחו את מסנני האוורור בתוך מיכל סגור וניתן לסטריליזציה.
      4. הניחו את פקקי הבקבוקים עם צינור סיליקון שעובר דרך הפקקים בתוך מיכל סגור וניתן לחיטוי.
        הערה: פקקי הבקבוקים הצינורות המשמשים בפרוטוקול זה מצוידים בשלושה צינורות החוצים את הפקקים: שני צינורות בקוטר שווה להעברת מדיום למסנני PVDF של 0.45 מיקרון, וצינור שלישי בקוטר רחב יותר. צינורות אלו מחוברים היטב לכובסים ואינם ניתנים להסרה.
      5. טבלו 12 שסתומי לואר חד-כיווניים בתמיסת 70% אתנול והשאירו אותם לחיטוי כל הלילה.
        הערה: (נקודת הפסקה) חומרים מעוקרים יכולים להיאחסן טבולים ואטומים בטמפרטורת החדר עד 24 שעות לפני הניסוי. לפני השימוש, הסר את השסתומים מהאתנול ושוטף במים סטריליים וטהורים במיוחד כדי להסיר שאריות אתנול. לחילופין, ניתן להדפיס שסתומי בדיקה בתלת-ממד באמצעות חומרים אוטוקלביים כדי לאפשר עיקור באמצעות אוטוקלבינג במקום טיפול באתנול.
    5. אוטוקלב את הצינורות הפריסטלטיים, מסנני האוורור, פקקי הבקבוקים, הצילינדר המדורג והבקבוקים באמצעות הגדרות מעבדתיות סטנדרטיות.
    6. הכינו 6,200 מ״ל של מדיה בעלת עושר נמוך (RDM; ראו טבלת חומרים) על ידי ערבוב החומרים המפורטים בטבלה 2.
      הערה: הכינו את המדיום ביום הניסוי, במהלך תקופת ההמתנה של כ-5 שעות לאחר תחילת הקדם-תרבות (ראו שלב 1.2.1). זה שומר על טריות בינונית ומפחית את הסיכון לזיהום.
  2. הכנת טרא-תרבית חיידקית
    הערה: השתמשו בפרה-תרבית בשלב האקספוננציאלי כדי להתחיל את הניסוי. במהלך שלב זה, החיידקים גדלים בקצב קבוע, מסנתזים את רכיבי התאים בצורה מאוזנת ומתחלקים במסת תא מוגדרת. השתמשו בתאי פאזה מעריכית כדי למזער שונות ולתקן את המצב הפיזיולוגי ההתחלתי.
    1. ביום שלפני הניסוי, יש להכין תרבית לילה (ON) כך: החסן 3 מ"ל RDM מלא עם מלאי גליצרול קפוא של NCM3722 E. coli בצינור תרבית סטרילי בנפח 15 מ"ל. דגרו את התרבית במהלך הלילה (~16 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם ניעור ב-200 סל"ד בתנור ניעור.
      הערה: (נקודת הפסקה) ברגע שתרבות ה-ON נמצאת באינקובטור, לא ננקטים צעדים נוספים ביום זה. המשך את הפרוטוקול למחרת על ידי התקדמות לשלב 1.2.2.
    2. ביום הניסוי, הכינו את הטרום-תרבית כך: הוסיפו 6 מיקרוליטר תרבית ON ל-6 מ"ל RDM מלא. חלקו שווה בשווה לשני צינורות תרבית בנפח 15 מ"ל וסמנו את הצינורות כ-A ו-B. דגרו את שני הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד.
      הערה: הפרה-תרבית בדרך כלל דורשת כ-5 שעות להגיע לשלב האקספוננציאלי (OD600 ≈ 0.5). השתמש בתקופה זו להכנת המדיום הטרי (ראה שלב 1.1.6). אל תמשיך לשלב 1.2.3 עד ש-OD600 יגיע לכ-0.5.
    3. מעקב אחרי צפיפות אופטית (OD) ב-600 ננומטר באמצעות צינור B. המשך בניסוי כאשר OD600 מגיע לכ-0.5, מה שמעיד על גדילה מעריכית ב-RDM מלא עבור NCM3722 E. coli (ראו סעיף 1.4).
      הערה: התחל את הניסוי עם תאי פאזה אקספוננציאלית כדי לשפר את השחזוריות ולתקן את תנאי ההתחלה.
  3. הכנת ניסוי ב-MCCD עם תנאי תזונה קבועים
    הערה: בצע את השלבים 1.3.1 עד 1.3.5 בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי מיד לאחר תחילת הגידול המוקדם.
    1. הקצה את הנפח הבינוני הכולל לכל בקבוק.
      הערה: השתמש בבקבוקים כמאגרים בינוניים. השתמש בפקקי בקבוקים המצוידים בשני צינורות בינוניים, כאשר כל צינור מספק מסנן PVDF בינוני עד 0.45 מיקרון. הקצה את נפח הביניום הכולל (שהוכן בשלב 1.1.6) בין הבקבוקים בהתאם לכמות הנדרשת לכל דגימת נקודת זמן (כלומר, כל מסנן PVDF של 0.45 מיקרון) במהלך הניסוי.
      1. השתמש בנוסחה שסופקה בשלב 1.1.1 כדי לקבוע את נפח המדיום הנדרש לכל מסנן PVDF של 0.45 מיקרון. לדוגמה, באמצעות המונחים הבאים:
        figure-protocol-3
        נפחי הביניים הכוללים הנדרשים לכל נקודת זמן, בסדר כרונולוגי, הם 288, 576, 864, 1152, 1440 ו-1728 מ"ל.
      2. פזר את נפחי הביניים המחושבים בין בקבוקים, וקבץ את הנפחים הנדרשים לשתי נקודות זמן לבקבוק אחד. לדוגמה: ~900 מ"ל בבקבוק אחד של 1 ליטר (לנקודות זמן 1 ו-2), ~2,100 מ"ל בבקבוק אחד של 2.5 ליטר (לנקודות זמן 3 ו-4), ~3200 מ"ל של המדיום בבקבוק אחד של 4 ליטר (לנקודות זמן 5 ו-6).
    2. אטום כל בקבוק עם פקקי הבקבוקים הצינורות (איור 1C). הדק את הפקקים היטב כדי למנוע דליפות.
    3. חבר מסנן אוורור של 0.2 מיקרון לצינור הסיליקון הרחב ביותר היוצא מכסה הבקבוק הצינור (איור 1C). זה מאפשר חילופי אוויר סטריליים במהלך הניסוי.
    4. חברו קצה אחד של כל צינור פריסטלטי (עם חיבורים שכבר מחוברים; ראו סעיף 1.1.4 על הכנת חומר) לצינורות הסיליקון בקוטר הקטן יותר היוצאים מכסי הבקבוקים הצינורות (איור 1C). הבטיחו חיבורים בטוחים לשמירה על סטריליות. השאירו את מכסה האלומיניום של מחבר מנעול Male Luer החופשי במקום עד שהניסוי מתחיל כדי למנוע זיהום.
    5. הניחו את הבקבוקים עם הצינורות שהורכבו ואת המשאבה הפריסטלטית באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אבטח את הצינור לתעלות ראש המשאבה הפריסטלטית.
      הערה: כל צינורות הפריסטלטיקה מותקנים על אותו ראש משאבה של משאבה פריסטלטית אחת, כך שכל מסנני PVDF של 0.45 מיקרון מקבלים מדיום מאותה משאבה. שימוש במשאבה אחת מבטיח שקצב הזרימה זהה בין המסננים ומונע שונות שעלולה להיגרם מהבדלים בין משאבות.
  4. פרוטוקול ניסוי ב-MCCD עם תנאי תזונה קבועים
    1. מדלל את הפרה-תרבות (OD = 0.5) ביחס 1:10 על ידי הוספת 600 מיקרוליטר של טרום-תרבות ל-5.4 מ"ל של RDM נמוך טרי.
    2. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הכנס 1 מ"ל של טרום-התרבות המדוללת לכל אחד מששת מסנני PVDF של 0.45 מיקרון.
    3. שטוף את שסתומי הבדיקה חד-כיווניים במים אולטרה-טהורים מאוטוקלביים וחבר אחד לכל קצה של כל מסנן PVDF של 0.45 מיקרון.
    4. הסר את מכסי האלומיניום מהחיבורים של הצינורות הפריסטלטיים.
    5. חבר כל אחד מששת מסנני PVDF של 0.45 מיקרון לחיבור Male Luer בצינור הפריסטלטי (איור 1C).
    6. הגדר את קצב הזרימה ל-2 מ"ל לדקה במשאבה הפריסטלטית והתחל את הזרימה. הגדר את הרגע הזה כזמן 0.
    7. הניחו שקע פסולת מתחת למסנני PVDF של 0.45 מיקרון כדי לאסוף את הזרימה.
      הערה: איור 2A מציג את ההרכבה המלאה של הניסוי בתוך קופסת האינקובטור.
  5. איסוף דגימות
    1. אחרי שעתיים, נתק אחד משני מסנני PVDF של 0.45 מיקרון שמחוברים לבקבוק של 1 ליטר.
    2. הברג את שסתומי הבדיקה חד-כיווניים והניח את מסנן PVDF של 0.45 מיקרון בתוך צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל כשהכניסה פונה כלפי מטה.
    3. צנטריפוגה את צינור הצנטריפוגה המכיל את מסנן PVDF של 0.45 מיקרון בעוצמה של 2,000 × גרם למשך 2 דקות.
    4. באמצעות חותך צינורות, יש להפעיל לחץ עדין על המעטפת הפלסטית בקצה הקרוב ביותר ליציאה כדי לפתוח את מסנן PVDF של 0.45 מיקרון.
      הערה: חטא את חותך הצינורות לפני השימוש (למשל, על ידי ניקוי עם 70% אתנול) כדי למנוע זיהום בעת פתיחת מסנן PVDF של 0.45 מיקרון.
    5. שחררו את הצילינדר הפנימי המכיל את הממברנה הנקבובית והשליכו את החלק של המסנן שמחזיק את הממברנה.
    6. שטוף את הדפנות הפנימיות של מסנן PVDF בקוטר 0.45 מיקרון (אלו המאונכות לכיוון הזרימה) עם מדיום התרבית שנאסף בצינור הצנטריפוגה.
      הערה: שלב זה מבטיח שכל תא שנתקע על הקירות במהלך הצנטריפוגה ייאסף.
    7. מדוד את הנפח הכולל שנאסף באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
    8. בנקודות זמן מאוחרות יותר (4 שעות, 6 שעות, 8 שעות, 10 שעות ו-12 שעות), נתק את מסנני PVDF המתאימים של 0.45 מיקרון וחזור על השלבים 1.5.2–1.5.6. עקבו אחרי הסדר הספציפי הבא:
      1. ב-4 שעות, נתק את מסנן PVDF השני של 0.45 מיקרון שמחובר לבקבוק של 1 ליטר.
      2. ב-6 שעות ו-8 שעות, נתק את מסנני PVDF של 0.45 מיקרון שמחוברים לבקבוק 2.5 ליטר.
      3. ב-10 שעות ו-12 שעות, נתק את מסנני PVDF של 0.45 מיקרון שמחוברים לבקבוק של 4 ליטר.
        הערה: עקבו אחרי סדר זה כדי להתאים את נקודות זמן הדגימה לנפחי הביניים המפוזרים בשלב 1.3.1.
  6. ניתוחים במורד הזרם
    1. קח שלושה אליקוות של 100 מיקרולטר מכל דגימה וקבע עם גלוטראלדהיד לריכוז סופי של 1.5%.
      אזהרה: גלוטראלדהיד הוא רעיל, מגרה חזק ועלול להיות רגיש. לטפל בתוך מכסה אדים כימי תוך כדי רכישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות). הימנעו ממגע עור ושאיפה. להשליך פסולת המכילה גלוטראלדהיד בהתאם לתקנות מוסדיות לפסולת כימית מסוכנת.
    2. השתמש בדגימות הקבועות כדי לספור את מספר התאים למיקרוליטר באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר סימון עם צבע DNA פלואורסצנטי.
      אזהרה: צבעי DNA פלואורסצנטיים עשויים להיות מוטגניים. לבש כפפות ולהיפטר מפסולת המכילה צבע בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
      הערה: כחלופה לצביעת DNA וציטומטריית זרימה, ניתן להעריך את צפיפות התאים על ידי ציפוי נפח קטן של הדגימה על לוחות אגר עשירים-בינוניים (למשל, אגר LB) וספירת יחידות יצירת מושבות (CFUs).
    3. הכפל את מספר התאים למיקרוליטר בנפח הכולל שנמדד בשלב 1.5.7 כדי לחשב את סך התאים הכלולים במסנן PVDF של 0.45 מיקרון.
    4. צנטריפוגה את הנפח הנותר בצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ב-10,000 × גרם למשך 4 דקות.
    5. הסר את הסופרנטנט.
    6. אחסן את הכדורים של התאים בטמפרטורה של -80°C לניתוחים עתידיים (למשל, טרנסקריפטומיקה).

figure-protocol-4
איור 2: הרכבה ניסיונית של MCCD. (א) צילום של מערכת MCCD לתנאי תזונה קבועים. המערכת ממוקמת בתיבת אינקובטור לשמירה על טמפרטורה קבועה, עם מיכל פסולת שאוסף את מדיום הזרימה. (B) צילום של הגדרת MCCD לתנאי תזונה משתנים. הבקבוק המסומן בסרט אדום מכיל מדיום בעל ריכוז תזונה גבוה (Cגבוה), בעוד שהבקבוק המסומן בסרט כחול מכיל מדיום ריכוז תזונה נמוך (Cנמוך). פלטפורמת המתכת במרכז תומכת ברכיבים השולטים בתנודות התזונה, בהתאם לאלו המתוארים באיור 1D. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. צמיחת חיידקים בתנאי תזונה משתנים

  1. הרכבת בקר לשסתום סולנואיד
    הערה: שלטו בשסתום הסולנואיד התלת-כיווני באמצעות מעגל החלפה מבוסס מיקרו-בקר המחובר למחשב שמריץ ממשק משתמש גרפי מותאם אישית (GUI) שפותח ב-MATLAB.
    1. הרכיבו את מעגל הבקרה של שסתום הסולנואיד (איור 3A).
      1. חבר פין פלט דיגיטלי של המיקרו-בקר לבסיס טרנזיסטור NPN באמצעות נגד של 1 kΩ.
      2. חבר את האספן של הטרנזיסטור לקצה השלילי של שסתום הסולנואיד.
      3. חבר את הפולט של הטרנזיסטור לאדמה.
      4. חבר את הטרמינל החיובי של שסתום הסולנואיד לספק כוח DC חיצוני התואם למתח השסתום.
      5. הנח דיודה על טרמינלי הסולנואיד. חבר את הצד המפוספס של הדיודה לקו האספקה החיובי.
        הערה: הדיודה מדכאת קפיצות מתח שנוצרות כאשר הסולנואיד נכבה.
    2. חבר חיבורי פלסטיק "מושחלים לצינור" לשסתומי הסולנואיד, כדי להבטיח שהקצה של הברב יוצא החוצה.
    3. התקן MATLAB R2022b או מאוחר יותר על מחשב עם חיבור USB.
    4. התקן את חבילת התמיכה של MATLAB הנדרשת לתקשורת סריאלית עם חומרת מיקרו-בקר.
    5. חבר את לוח המיקרו-בקר למחשב באמצעות כבל USB כדי ליצור תקשורת סריאלית.
    6. פתח את הממשק הגרפי המבוסס MATLAB המשמש ליצירת תנאי תזונה משתנים ב-MCCD (זמין בקישור https://github.com/juanitaLara/MCCD).
    7. אמת את החיבור בין שסתומי הסולנואיד לפלטפורמת הממשק הגרפי של MATLAB:
      1. פתח את פלטפורמת המעבד ב-Matlab ולחץ על כפתור החיבור (איור 3B). חכה עד שההודעה ש-Controller התחבר בהצלחה תופיע בחלון הפקודות.
      2. הזן ערך עבור שלב הזמן (למשל, 5 שניות לשלבים הגבוהים והנמוכים) תחת לוח ההפעלה האוטומטי .
      3. התבונן בשסתומי הסולנואיד והאזין לצליל הקליק שהם מפיקים במהלך המעבר בין שני המדיות.
      4. באמצעות שעון, ודאו ששסתומי הסולנואיד מתחלפים בדיוק במרווח שנקבע (למשל, כל 5 שניות).
        הערה: בצע אימות זה לפני כל ניסוי כדי לאשר תקשורת ולתקן את החלפת השסתומים. (נקודת הפסקה) לאחר אימות הפעלת שסתום הסולנואידים, המערכת יכולה להישאר מורכבת בתוך האינקובטור במשך מספר שעות לפני תחילת הניסוי.
  2. הכנת מדיה וחומרים
    הערה: פרוטוקול זה כולל חילופי תנאי תזונה בין RDM נמוך לגבוה עם תקופה של שעה (30 דקות ב-RDM גבוה ואחריה 30 דקות ב-RDM נמוך). הניסוי נמשך שלוש שעות של תנודות, עם שתי דגימות: (1) ב-3 שעות ו-1 דקה (פאזה RDM גבוהה, מיד לאחר המעבר מ-Low ל-High), ו-(2) ב-3 שעות ו-31 דקות (שלב RDM נמוך, מיד לאחר המעבר מ-High ל-Low Phase).
    1. הערכו את נפחי מדיום התרבית הנדרשים לפי שלבי ניסוי.
      1. ראשית, חשב את הנפחים הנדרשים לשלוש השעות הראשונות (שלוש תקופות תנודות מלאות):
        נפח RDM נמוך = 1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0.45 מיקרומטר מסנני PVDF] = 432[mL]
        נפח RDM גבוה = 1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0.45 מיקרומטר מסנני PVDF] = 432[mL]
      2. חשב את הנפח הנדרש לשלב הסופי של 30 הדקות:
        נפח RDM גבוה =1.2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[0.45 מיקרומטר מסנני PVDF] = 72[mL]
      3. עגל את הנפחים לערכים נוחים (למשל, 500 מ"ל RDM נמוך ו-600 מ"ל RDM גבוה).
    2. הכינו חומרים לעיקור אוטוקלאב (ראו טבלה 3) באמצעות שלבים 1.1.4 – 1.1.5.
      הערה: יש להכין ולסטריליזציה את החומרים ביום שלפני הניסוי כדי להבטיח מוכנות ולמזער עיכובים ביום הניסוי (שלבים 2.2.3 ו-2.2.4). הגדרה זו, בהשוואה לניסויים עם חומרים קבועים, דורשת צינורות נוספים לחיבור בקבוקי מדיה ישירות לשסתום הסולנואיד (איור 1B,D). צינורות אלו דורשים רק חיבור אחד "Barb to Male Luer", שכן חיבורי שסתומי הסולנואיד מורכבים מראש. כסו את קצות הצינורות בנייר אלומיניום לפני האוטוקלוב.
    3. סטריליזציה של צינור הפריסטלטיקה, מסנני אוורור, פקקים, גליל מדורג ובקבוקים באוטוקלאב.
    4. טבלו 4 שסתומי לואר חד-כיווניים בתמיסת 70% אתנול והשאירו אותם ללילה לחיטוי.
      הערה: (נקודת הפסקה) שסתומי בדיקה מעוקרים יכולים להישאר טבולים באתנול למשך הלילה ומאוחסנים אטומים בטמפרטורת החדר עד 24 שעות. לפני השימוש, שטוף את השסתומים במי Milli-Q סטריליים.
    5. נקה וסטריליזציה של שסתומי הסולנואיד על ידי שטיפתם עם 70% אתנול 3–5 פעמים, ואחר כך מים אולטרה-טהורים 3–5 פעמים.
    6. ביום הניסוי, במהלך תקופת ההמתנה של כ-5 שעות לאחר הכנת הטרום-תרבית (ראו שלב 2.3), הכינו 500 מ"ל של RDM נמוך ו-600 מ"ל RDM גבוה על ידי ערבוב התגובות המפורטות בטבלה 4.
      הערה: הכנת המדיה ביום הניסוי מבטיחה רעננות ומפחתת סיכוני זיהום.
  3. הכנת טרא-תרבית חיידקית
    1. עקבו אחרי השלבים המתוארים בשלב 1.2.
  4. הכנת ניסוי ב-MCCD עם תנאי תזונה משתנים
    הערה: בצע שלבים 2.4.1–2.4.4 בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי מיד לאחר תחילת הגידול המוקדם.
    1. שים כל מדיום בבקבוק של 1 ליטר.
    2. אטום את הבקבוקים עם פקקים מורכבים מראש עם שלושה פתחים וצינורות סיליקון מותקנים מראש. הדק את הפקקים היטב כדי למנוע דליפות.
    3. חבר פילטר אוורור של 0.2 מיקרון לצינור הסיליקון הרחב היוצא מאחד היציאות בכל פקק בקבוק.
    4. חבר את "צינור הכניסה" (המוצג באיור 1D) לצינורות הסיליקון היוצאים מפקקי הבקבוקים הצינורות לפני חיבורו לשסתומי הסולנואיד:
      1. חבר קצה אחד של צינור הסיליקון (עם חיבור אחד בלבד) לצינור שיוצא מהפקק הנמוך של RDM.
      2. השאר את מכסה נייר האלומיניום על מחבר הנעילה החופשי של Male Luer עד שהבקבוקים מועברים לאינקובטור כדי למנוע זיהום.
      3. חזור על שלב 2.4.4.1 עבור בקבוק RDM גבוה.
    5. הניחו את הבקבוקים עם "צינור הכניסה" שהורכב, המשאבה הפריסטלטית ושסתומי הסולנואיד עם הבקר בתוך אינקובטור שמכוון ל-37 מעלות צלזיוס.
    6. חבר את "צינור הכניסה" (מחובר בשלב 2.4.4) לכניסות של שסתומי הסולנואיד בדרך הבאה:
      1. חבר את שני הצינורות מבקבוק ה-RDM הנמוך לאחד משני הכניסות בכל שסתום סולנואיד (צינורות המסומנים בסרט כחול באיור 1D).
      2. חבר את שני הצינורות מבקבוק ה-RDM הגבוה לאחד משני הכניסות בכל שסתום סולנואיד (צינורות המסומנים בסרט אדום באיור 1D).
    7. חבר צינור סיליקון תואם משאבה פריסטלטית (עם חיבור אחד בלבד) ליציאה של כל שסתום סולנואיד (איור 1D). השאירו את מכסה האלומיניום על חיבור הנעילה החופשי של Male Luer עד שהניסוי מתחיל לשמור על סטריליות.
  5. פרוטוקול ניסוי ב-MCCD עם תנאי תזונה משתנים
    1. אמת את החיבור בין שסתומי הסולנואיד לתוכנת Matlab על ידי ביצוע שלב 2.1.7.
    2. הזן את ערכי צעד הזמן הרצויים עבור התנודות לפלטפורמת הממשק הגרפי של Matlab: הזן צעדי זמן של 1800 שניות ב-RDM גבוה (30 דקות) ו-1800 שניות ב-Low RDM (30 דקות).
    3. בחר נמוך בתפריט התחל כדי להתחיל במצב Low RDM (איור 3).
    4. זרע את שני מסנני PVDF של 0.45 מיקרון כפי שמתואר בשלב 1.4.
    5. תתחיל את הניסוי.
      הערה: איור 2B מציג את כל ההרכבה הנוזלית של ניסוי זה.
  6. איסוף דגימות
    1. אסוף דגימות כמו בשלב 1.5. קצור את מסנן PVDF הראשון של 0.45 מיקרון ב-3 שעות ודקה ו-3 שעות ו-31 דקות.
      הערה: נתק קודם כל אחד מהמסננים; שני המסננים מוזנים מאותה מדיה.
  7. ניתוחים במורד הזרם
    1. עקבו אחר השלבים המתוארים בשלב 1.6 כדי לספור את מספר התאים באמצעות ציטומטריית זרימה ולעבד ולאחסן דגימות לניתוחים בהמשך הזרם (למשל, טרנסקריפטומיקה).

figure-protocol-5
איור 3: בקר שסתומי הסולנואיד להטלת תנודות בחומרים מזינים. (א) דיאגרמת חיווט של המעגל האלקטרוני המשמש לשליטה בשסתום הסולנואיד. המעגל מורכב מלוח מיקרו-בקר, טרנזיסטור המשמש כאלמנט מיתוג, נגד שמחובר לבסיס הטרנזיסטור, ודיאודה פליבק הממוקמת על שסתום הסולנואיד כדי להגן על המעגל מפני קפיצות מתח שנוצרות במהלך החלפת שסתומים. המיקרו-בקר שולט בטרנזיסטור, אשר בתורו מחליף את החשמל המסופק לשסתום הסולנואיד. מותאם באישור מהפניה 20 . (ב) לאחר חיבור לוח המיקרו-בקר הן למחשב שמפעיל את הממשק הגרפי והן למקור כוח עם המתח הנדרש לשסתומי הסולנואיד, התקשורת מתבצעת על ידי לחיצה על כפתור התחבר . ניתן להפעיל את השסתומים ידנית באמצעות לוח הפעלה ידנית , שבו המשתמש בוחר את המדיום להטיס (למשל, "גבוה" או "נמוך"). חלופה נוספת היא שלוח ההפעלה האוטומטית מאפשר למשתמש לציין את המדיום ההתחלתי ואת שלבי הזמן (בשניות) לכל שלב (גבוה ונמוך), ולהתחיל את הפעולה על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה . המוניטור בזמן אמת מציג פונקציית שלב (0 = נמוך, 1 = גבוה) לאורך זמן, המציינת איזה מדיום זרם דרך שסתומי הסולנואיד אל המסננים בשניות שקדמו לכך. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה השתמשנו ב-MCCD כדי לכמת את קצב הגידול של NCM3722 E. coli בתנאים קבועים של דלי חומרים מזינים בשלושה ריכוזי RDM. ריכוזים אלו נגזרו מנוסחת המדיום העשיר (RDM) שתוארה על ידי ניידהארט19, כאשר תוספי חומצות האמינו והנוקלאובז מדוללו ל-0.5%, 0.25% ו-0.01% מהנוסחה המקורית, בהתאמה.

נערכו ניסויי צמיחה שכפולים בכל מדיום כדי לכמת את קצבי הגידול. בתנאים של 0.5% RDM ו-0.25% RDM, ערכנו שלושה ניסויים משוחזרים, כל אחד באמצעות ארבעה מסנני ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות גידול חיידקים שתופסות את מורכבות החומרים התזונתיים של סביבות טבעיות הן חיוניות לקידום חקר הפיזיולוגיה המיקרוביאלית מעבר לתנאי מעבדה פשוטים. מערכות אקולוגיות טבעיות מכילות תערובות של חומרים מזינים בטווח ריכוזים רחב, שלרוב אינם תומכים בקצבי גדילה מרביים 1,3,4,21,22,23. יתרה מזאת, זמינות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים במימון מפרס החוקר של קרן גורדון ובטי מור ביוזמת הסימביוזה במערכות ימיות (GBMF9197; https://doi.org/10.37807/GBMF9197), קרן סימונס באמצעות שיתוף פעולה עקרונות מערכות אקולוגיות מיקרוביאליות (PriME) (מענק 542395FY22), ומענק הקרן הלאומית למדע שווייץ 205321_207488 ל-R.S. K.S.L. מכיר בתמיכה מהמכון למדעי היסוד של קוריאה (מרכז המחקר והציוד הלאומי; גרנט מס' RS2025-00554860) והקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF; גרנט מס' RS2025-23523643), שניהם ממומנים על ידי ממשלת קוריאה (MSIT), ומקרן המחקר לשנת 2025 (1.260002.01) של UNIST.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1K Ohm ResistorBC RoboticsELC-021Power Rating: 1/6 W
1N4001 DiodeBC RoboticsELC-001DC Reverse Voltage: 50 V; Average Rectified Current: 1 A
3-stop platinum-cured silicone peristaltic tubingInnofluidSE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8Inner diameter 0.8 mm; outer diameter 2.4 mm; compatible with peristaltic pump used
3-way Solenoid valvesEmerson Electric Co. 0055A301L0T00F312 V DC, 1 W
Aluminum foilSuitable for autoclaving
Arduino Uno Rev4ArduinoSKU ABX00173
AutoclaveSystecD-200או חברה אחרת
Cap closure with three ports – for 1 and 2 L bottlesNalgene2162-0531או חברה אחרת (לוודא שהם מתאימים לבקבוקים שנבחרו)
Cap closure with three ports – for 4 L bottleNalgene2162-0830או חברה אחרת (לוודא שהם מתאימים לבקבוקים שנבחרו)
Cell density meter CO8000WPA biowaveOD meter
CentrifugeEppendorf5804RCentrifuge that fits 50 mL Falcon tubes
CentrifugeEppendorf5424RCentrifuge that fits 1.5 and 2 mL eppendorf tubes
Conical centrifuge tube - 50 mLFischer Scientific10788561Falcon tube
Culture tubes (14 mL, sterile)Greiner bio-oneCulture tubes
EthanolSigma Aldrich493511Dilute to 70%
Flow cytometerBeckmanC09756CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%Sigma AldrichG5882או חברה אחרת
Graduated cylinder - 500 mLNalgene3662-0500 או חברה אחרת
Incubator boxCustom-built incubator box – contact corresponding authors for construction details
LabV1 Intelligent Low Flow Rate Peristaltic PumpInnofluidSE-LABV1-AMC12(10)Available at Darwin Microfluidics
Male Luer-to-barb fittingAldrichZ277142Male Luer-to-barb adapter compatible with 0.8 mm ID tubing (see Figure 1C)
Male Luer-to-threaded fittingAldrichZ277142Used to connect the solenoid valve to the "inlet tubing" (see Figure 1D)
MatlabMathworksR2022b or laterSoftware to run the custom-made software for the solenoid valves
MOPS EZ Rich Defined Medium KitTeknovaM2105MOPS medium for Enterobacteria
One-way Luer check valveMasterflex30505-92Prevents backflow into medium reservoirs
Pipe cutter - 0-37 mmKS Tools2222051או חברה אחרת
Pipette setFisher Scientific05-403-151או חברה אחרת
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/16 inNalgene8060-0020Inner diameter 1/16 in (1.6 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/8 inNalgene8060-0030Inner diameter 1/8 in (3.2 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Polypropylene copolymer bottle - 1 L Nalgene2126-1000או חברה אחרת
Polypropylene copolymer bottle - 2 LNalgene2126-2000או חברה אחרת
Polypropylene copolymer bottle - 4 LNalgene2126-4000או חברה אחרת
Serological pipette - 5 mLCorningCLS4487או חברה אחרת
Solderless BreadboardBC RoboticsPROTO-001
Sterivex-HV filter - 0.45 µm PVDFMilliporeSVHV01015
SYBR Green I Nucleic Acid Gel StainInvitrogenS7563Nucleic acid stain for cell counting in flow cytometer
TIP120 Darlington TransistorBC RoboticsTRN-005
Tubes - 1.5 mLEppendorf3810XTubes for centrifuging cell cultures and storing pellets
Vent filterMillexSLFG050000.2 µm hydrophobic vent filter
Waste receptacleVolume capacity should be at least the total media volume to be used in the experiment

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  2. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  3. Or, D., et al. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30 (6–7), 1505-1527 (2007).
  4. Nguyen, J., et al. Environmental fluctuations and their effects on microbial communities, populations and individuals. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), (2021).
  5. Moore, C. M., et al. Processes and patterns of oceanic nutrient limitation. Nat Geosci. 6 (9), 701-710 (2013).
  6. Doranga, S., et al. Nutrition of Escherichia coli within the intestinal microbiome. EcoSal Plus. 12 (1), eesp-0006(2024).
  7. Rodríguez-Verdugo, A., et al. The rate of environmental fluctuations shapes ecological dynamics in a two-species microbial system. Ecol Lett. 22 (5), 838-846 (2019).
  8. Thaiss, C. A., et al. Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis. Cell. 159 (3), 514-529 (2014).
  9. Kearney, S. M., et al. Orthogonal dietary niche enables reversible engraftment of a gut bacterial commensal. Cell Rep. 24 (7), 1842-1851 (2018).
  10. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4 (6), 457-469 (2003).
  11. Beaumont, H. J. E., et al. Experimental evolution of bet hedging. Nature. 462 (7269), 90-93 (2009).
  12. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced growth of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  13. Ballesta, J. P. G., Schaechter, M. Effect of shift-down and growth inhibition on phospholipid metabolism of Escherichia coli. J Bacteriol. 107 (1), 251-258 (1971).
  14. Nguyen, J., et al. A distinct growth physiology enhances bacterial growth under rapid nutrient fluctuations. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  15. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112 (2920), 715-716 (1950).
  16. Egli, T., Lendenmann, U., Snozzi, M. Kinetics of microbial growth with mixtures of carbon sources. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 289-298 (1993).
  17. Lendenmann, U., Snozzi, M., Egli, T. Kinetics of the simultaneous utilization of sugar mixtures by Escherichia coli in continuous culture. Appl Environ Microbiol. 62 (5), 1493-1499 (1996).
  18. Tappe, W., et al. Cultivation of nitrifying bacteria in the retentostat, a simple fermenter with internal biomass retention. FEMS Microbiol Ecol. 19 (1), 47-52 (1996).
  19. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  20. Controlling a solenoid valve with Arduino. , Available from: https://bc-robotics.com/tutorials/controlling-a-solenoid-valve-with-arduino/ (2015).
  21. Egli, T. The Ecological and Physiological Significance of the Growth of Heterotrophic Microorganisms with Mixtures of Substrates. Advances in Microbial Ecology. , Plenum Press. New York. (1995).
  22. Koch, A. L. Oligotrophs versus copiotrophs. BioEssays. 23 (7), 657-661 (2001).
  23. Muenster, U. Concentrations and fluxes of organic carbon substrates in the aquatic environment. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 243-274 (1993).
  24. Murugan, A., et al. Roadmap on biology in time varying environments. Phys Biol. 18 (4), (2021).
  25. Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Bacterial mechanosensors. Annu Rev Physiol. 80 (1), 71-93 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233Millifluidics

מאמרים קשורים