סינון ואימות רכיבים פעילים בעזרת מחשב של תרופות דונג לחקר חום ושיעול

סיכום

כאן בנינו רשת רב-ממדית של "רכיב-מטרה-מסלול-מחלה", המשלבת סקר פרמקולוגי רשתי, עגינה מולקולרית ואימות מודלים של עכבר המושרה על ידי LPS. על ידי קביעת פרמטרים מרכזיים ברורים, היא מאפשרת זיהוי יעיל של המרכיבים הפעילים ברפואה האתנית של טונג, לנגיושיאו טאנג, ואימות של תהליך שניתן לחזור על עצמו.

תקציר

לסנן ולאמת באופן שיטתי את המרכיבים הפעילים ברפואה האתנית של דונג Lengyuxiao Tang (LYXT; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L., ו-Zingiber officinale Roscoe) לטיפול בחום ושיעול, שיטה זו הקימה תהליך מתודולוגי המשלב חיזוי פרמקולוגיה ברשת ואימות ניסיוני. ראשית, באמצעות מאגר הנתונים והניתוח של מערכות פרמקולוגיה מסורתית ברפואה סינית מסורתית (TCMSP), עם זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 30% ודמיון תרופה (DL) ≥ 0.18 כקריטריונים, נבדקו המרכיבים הפעילים המרכזיים של LYXT, והיעדים הקשורים לחום ולשיעול נאספו ממאגרי מחלות שונים. בהמשך, נבנתה רשת האינטראקציה "רכיב-מטרה-מחלה", ובאמצעות ניתוח טופולוגי ואונטולוגיית גנים (GO) והעשרת מסלולי האנציקלופדיה של קיוטו לגנים וגנומים (KEGG), זוהו יעדי פעולה מרכזיים (CYP3A4, POR) ונתיבי איתות מרכזיים (מסלול MAPK). טכנולוגיית עגינה מולקולרית שימשה לאימות יכולת הקישור של רכיבים מרכזיים למטרות הליבה. לבסוף, מודל ברונכיטיס כרוני של עכבר הוכח באמצעות הזרעה תוך-אפית של ליפופוליסכרידים (LPS), ואומת היעילות האנטי-דלקתית של הרכיבים הפעילים העיקריים החזויים. התוצאות הראו כי רכיבים כמו β-קרוטן וספרנול, שנבדקו על ידי פרמקולוגיה רשתית, הראו דרגות שונות של השפעות אנטי-דלקתיות בניסויים בבעלי חיים, והמנגנונים שלהם עשויים לכלול עיכוב מסלול האיתות MAPK/p38. תכנית זו מספקת דוגמה חוזרת לסקר ולמחקר מנגנונים של רכיבים פעילים ברפואה אתנית מסורתית.

מבוא

רפואת דונג היא מערכת אתנו-רפואית במסגרת הרפואה הסינית המסורתית (TCM), המופעלת על ידי קבוצת האתניות דונג בגוויז'ואו, חונאן וגואנגשי. הוא מייצג את הידע האמפירי המצטבר שלהם, שהתפתח לאורך דורות. מערכת זו משלבת רפואה צמחית, דיקור, הקמת עצמות, עיסוי, טיפול תזונתי ופרקטיקות רוחניות. המאפיינים הייחודיים שלה נובעים מהבידוד הגאוגרפי ההיסטורי של הקבוצה וממסורת שבעל פה, שטיפחו פרמקופיאה ייחודית מבוססת פרקטיקה המותאמת לסביבה המקומית ולאמונות תרבותיות.

חום מתמשך, מצב המתפתח כאשר הגוף אינו שולט בטמפרטורה שלו, הוא סימן לכך שהגוף מתפקד בצורה לקויה ותפקיד חיוני של הגנה עצמית בתאי אדם¹. קיימות שיטות רבות ושונות לטיפול ברפואת חימום של לאום דונג. ביניהם, חום מחולק לחום פנימי וחום חיצוני. חום פנימי מתייחס לחום הנגרם ממחלות פנימיות, וחום חיצוני מתייחס לחום הנוצר מקור או טראומה². חום חיצוני בדרך כלל משפיע על תפקוד מערכת העיכול³. רופאים ארציים של דונג משתמשים בטיפול נגד חום קור לטיפול בחום. מבין מרשמים שונים לתרופות דונג, לנגיושיאו טאנג (LYXT) הוא תרסיס סטנדרטי המשמש לחום וכאב, הכולל זרע פארביטידיס, ורבנה אופיצינליס L. וזינגיבר אופיצינלה רוסקו, אותם נטחנים ומעורבבים^{במים ללא} הפסקה. הוא משמש בעיקר לטיפול בחום וכאבי ראש הנגרמים מהצטננות.

עם זאת, הרכיבים הפעילים של LYXT והמנגנונים המולקולריים הבסיסיים שלהם עדיין אינם מובנים היטב. כדי להתמודד עם פער זה, המחקר הנוכחי השתמש בגישה של פרמקולוגיה רשתית לחיזוי רכיבים פעילים פוטנציאליים ויעדים. כדי לאמת תחזיות אלו, נבחר מודל עכבר מבוסס היטב שנגרם על ידי ליפופוליסכרידים (LPS) לדלקת ריאות, שכן הוא מחקה את התגובות הדלקתיות המרכזיות הקשורות לחום ולשיעול, כולל חדירת לויקוציטים וייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים.

בתהליך גילוי התרופות, מחקרים שונים חשפו כי תרכובות יכולות לקיים אינטראקציה עם מספר מטרות חלבון. לכן, הפרדיגמה של "תרופה אחת, מטרה ביולוגית אחת" עוברת לפרדיגמת פרמקולוגיה מערכתית. תרכובת שמגיבה עם מספר חלבוני מטרה ביולוגיים של וירוסים או חיידקים יכולה לספק השפעות פרמקולוגיות מועילות⁵. ניתוח פרמקולוגיה ברשת הוא דרך מעשית ועוצמתית להפחית את תהליך גילוי התרופות היקר והארוך. היא יכולה לסייע לנו להבין טוב יותר אינטראקציות בין תרופות, לחזות מנגנונים הגורמים למחלה, להמליץ על רכיבי תרופות חלופיים להשפעות הפרמקולוגיות המיועדות ללא תופעות לוואי, ולחזות פעילות ביולוגית של הרפואה המסורתית. גישות כימואינפורמטיות, עגינה מולקולרית ומודלים מבוססי נתונים יושמו בהצלחה לחיזוי פעילויות ביולוגיות ולניתוח מנגנונים. שיטות אלו מסייעות בגילוי מהיר של תרכובות אנטי-ויראליות ואנטיבקטריאליות עם פוטנציאל קליני, וגישות אלו משמשות גם להסבר היעילות והתופעות הלוואי של תרופות⁶. לדוגמה, imatinib mesylate, מולקולה קטנה, היא מעכבת את הגורם הסיבתי בלוקמיה מיאלוגנית כרונית, חלבון המיזוג Bcr-Abl, אך היא גם חוסמת את פעילותם של מספר קינאזים טירוזינים כגון Abl, Kit ו-PDGFR⁷. לכן, מחקר על זיהוי תרופות ומטרותיהן עדיין חיוני לטיפול פוטנציאלי במחלות, מה שעוזר לנו להבין את המנגנונים שבאמצעותם תרכובות תרופות פועלות לטיפול במחלות ברמה המולקולרית. גישות למידול חישובי וניתוח רשתות יכולות לסנן במדויק תרופות ומטרות פוטנציאליות, וניתוח אינטראקציה כפולה יכול לספק בסיס תיאורטי והנחיה מעשית לאימות ניסויים. במאמר זה, באמצעות כלי חיפוש ל-STRING (STRING), מאגר נתונים לאנוטציה, ויזואליזציה וגילוי משולב (DAVID), ומאגרי מידע נוספים, בשילוב עם ניתוח אונטולוגיה גנטית דינמית (GO) וניתוח מסלולים, נאספו הנתונים לגבי רכיבים פעילים וחלבוני פעולה קשורים של תרופת דונג LYXT לחום ולשיעול, ונבחנו מנגנון הטיפול המשולב ברכיבים פעילים, שיכול לספק מקור תיאורטי ספציפי למחקר נוסף על תרופת דונג LYXT, מספק אסטרטגיה שכפולה לחקר המנגנונים הפרמקולוגיים של נוסחאות אתנו-רפואיות ומציע תובנות על פיתוח תרופות אנטי-דלקתיות חדשות.

פרוטוקול

תוכנית הניסויים בבעלי חיים נבדקה על ידי ועדת האתיקה הניסיונית של בעלי החיים של אוניברסיטת לנג'ואו (D2024-292). הוא עומד בעקרונות הגנת בעלי החיים, רווחת בעלי חיים ואתיקה, וכן בהוראות הרלוונטיות של האתיקה הלאומית לרווחת בעלי חיים ניסיונית.

1. הכנת מסד הנתונים והתוכנה

1. סינון רכיבים פעילים ואיסוף גנים ממוקדים
   1. גש למסד הנתונים ולפלטפורמת הניתוח של מערכת הפרמקולוגיה הסינית הסינית (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) ובצע חיפושים נפרדים תוך שימוש בשמות הלטיניים של כל צמח בנוסחת LYXT, כלומר Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. ו-Zingiber officinale Roscoe, כמפתח מפתח לאיסוף כל התרכובות הכימיות הקשורות לכל עשב.
   2. יש ליישם את קריטריוני הסינון לסינון התרכובות שנאספו מכל צמח כך: עבור Verbena officinalis L., להגדיר זמינות ביולוגית דרך הפה (OB) ≥ 30.1% ודמיון תרופה (DL) ≥ 0.12; ל-Zingiber officinale Roscoe, קבעה OB ≥ 60% ו-DL ≥ 0.13; עבור זרע פארביטידיס, קבעו ≥ OB ל-16.93% ו-DL ≥ 0.50. לאחר מכן, למזג את רשימות התרכובות המסוננות מכל שלושת הצמחים ולהסיר רשומות כפולות המבוססות על מזהי TCMSP ייחודיים כדי ליצור את הרשימה הסופית של התרכובות הפעילות ב-LYXT.
   3. ייצא את כל חלבוני היעד הקשורים לתרכובות הפעילות הללו ממסד הנתונים של TCMSP כטבלה המכילה מזהי תרכובות ושמות חלבוני יעד, ואז ייבא את רשימת החלבונים היעד הזו למסד הנתונים UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. השתמשו בכלי המיפוי UniProtKB ID כדי להמיר את כל שמות חלבוני היעד לסמלים גנטיים אנושיים רשמיים עם הגדרת כיוון המיפוי משם חלבון לגן, והסרת כל ערך שחסר בו סמל גן תקף כדי ליצור את הרשימה הסופית של הגנים המטרה הקשורים לרכיבים פעילים ב-LYXT.
2. איסוף גנים וניתוח חפיפות במטרה למחלה
   1. הורידו גנים הקשורים לחום ולשיעול ממסד הנתונים GeneCards (www.genecards.org) על ידי חיפוש נפרד עם מילות המפתח "חום" ו"שיעול", שמרו גנים עם ציון רלוונטיות ≥ 5, ומיזוג התוצאות משני החיפושים בתוך מסד הנתונים.
   2. הורידו גנים הקשורים לחום ולשיעול ממאגר היעד הטיפולי (TTD) (db.idrblab.net/ttd) על ידי חיפוש נפרד עם מילות המפתח "חום" ו"שיעול", הורד את כל הגנים הקשורים ליעד, ומיזוג התוצאות משני החיפושים בתוך המאגר.
   3. הורידו גנים הקשורים לחום ולשיעול ממאגר PharmGkb (www.pharmgkb.org) על ידי חיפוש נפרד עם מילות המפתח "חום" ו"שיעול", הורד את כל הגנים הקשורים, ומיזוג התוצאות משני החיפושים בתוך מסד הנתונים.
   4. הורד גנים הקשורים לחום ולשיעול ממסד הנתונים המקוון של תורשת מנדלית באדם (OMIM) (www.omim.org) על ידי חיפוש נפרד עם מילות המפתח "חום" ו"שיעול", הורד את כל הגנים הקשורים, וממזג את תוצאות שני החיפושים בתוך מסד הנתונים.
   5. הורידו גנים הקשורים לחום ולשיעול ממאגר DrugBank (go.drugbank.com)⁸ על ידי חיפוש נפרד עם מילות המפתח "חום" ו"שיעול", הורד את כל הגנים הקשורים, ומיזוג התוצאות משני החיפושים בתוך מסד הנתונים.
   6. מאחדים את רשימות הגנים שהושגו מכל חמשת מאגרי המידע לרשימה מקיפה אחת והסרו סמלי גנים כפולים ליצירת הרשימה הסופית של גנים המטרה הקשורות למחלות חום ושיעול.
   7. השווה את רשימת יעדי המחלה משלב 1.2.6 עם רשימת הגנים הפעילים של רכיבי היעד של LYXT משלב 1.1.4 כדי לבחור את הגנים החופפים המשותפים לשתי הרשימות, ולייצא את רשימת הגנים החופפת הזו כקובץ CSV.
3. המרת ID וניתוח חתך רוחב
   1. טען את רשימת הגנים החופפת משלב 1.2.7 לסביבת R וגש לאתר DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. העלה את רשימת הגנים החופפת ל-DAVID כאשר המין מוגדר להומו ספיאנס וסוג הרשימה מוגדר לסמל גן, ואז הפעל את כלי ההערות הפונקציונלי לביצוע ניתוח חתך.
   3. המרו את מזהי הסמלים של החלבונים החוצים למזהי אנסמבל באמצעות פונקציית המרת מזהה גנים בתוך DAVID, כאשר כיוון ההמרה מוגדר מסמל גן למזהה אנסמבל.
   4. ייצא את רשימת מזהי האנסמבל המומרת יחד עם סמלי הגנים המקוריים כקובץ CSV לניתוח העשרה במורד הזרם.

2. סינון המרכיבים הפעילים החיוניים וחלבוני המטרה

1. בניית רשת מטרה מורכבת
   1. טענו את רשימת הגנים החותכים משלב 1.2.7 ואת רשימת הגנים הפעילים של רכיבי היעד של LYXT משלב 1.1.4 לסביבת R, ואז לבצע ניתוח השוואה לזיהוי תרכובות הקשורות גם לגנים המטרה וגם לגנים המצטלבים.
   2. ייבא את נתוני הקשר בין תרכובות למטרה לגרסה 3.8.1 של Cytoscape ויצר את דיאגרמת הרשת "LYXT-Fever ו-cough-target" כדי להמחיש את האינטראקציות בין רכיבים פעילים למטרות הקשורות אליהם.
2. רכישת נתוני אינטראקציה בין חלבון לחלבון
   1. ייבא את קובץ מזהה הגנים עבור החיתוך בין מטרות רכיבי LYXT לבין יעדי חום ושיעול שהושגו בשלב 2.1.1 למסד הנתונים של STRING ב-https://stringdb.org/, בחר את Homo sapiens כמין, ואת מספר חלבונים כשיטת עיבוד הנתונים.
   2. סינון האינטראקציות בין חלבון לחלבון על ידי קביעת סף האמון ל-≥ 0.90 ובידוד חלבונים עם קורלציה נמוכה מאוד, ואז יצירת קובץ TSV המכיל את נתוני האינטראקציה המסוננת לניתוח במורד הזרם.
3. אישור ניתוח חיתוך
   1. השתמשו בשפת R כדי לנתח את החיתוך בין חלבוני המטרה של המרכיבים הפעילים לחלבוני המטרה של חום ושיעול, ולאשר את מערך הגנים החופף שזוהה בשלב 1.2.7.
   2. הכינו את מערך הגנים החופף המאושר הזה לניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) לאחר מכן.

3. סקר של חלבוני יעד מרכזיים

1. ויזואליזציה של רשת PPI
   1. ייבא את נתוני האינטראקציה המסוננים משלב 2.2.2 לגרסה 3.8.1 של Cytoscape והשתמש בכלי ההמחשה של הרשת כדי לצייר את דיאגרמת רשת PPI.
   2. התקן ופתח את תוסף CytoNCA בתוך Cytoscape, ואז השתמש בתוסף זה לביצוע ניתוח טופולוגי על ידי חישוב הפרמטרים הבאים עבור כל צומת ברשת: מרכזיות דרגה (DC), מרכזיות בין-מרכזיות (BC), מרכזיות קרבה (CC), מרכזיות וקטור עצמי (EC), מרכזיות רשת (NC) וקישוריות ממוצעת מקומית (LAC).
2. זיהוי חלבוני יעד מרכזיים באמצעות סקר מבוסס חציון
   1. ייצא את טבלת הפרמטרים הטופולוגית המחושבת מ-CytoNCA כקובץ CSV המכיל את כל מזהי הצמתים וערכי DC, BC, CC, EC, NC ו-LAC המתאימים להם.
   2. חשב את הערך החציוני של דרגת מרכזיות (DC) בכל הצמתים ברשת וזהה את כל הצמתים עם DC גבוה מכפול מהערך החציוני.
   3. חשב את ערכי החציון של מרכזיות הקרבה (CC) ומרכזיות הביניים (BC) בכל הצמתים ברשת, ואז מתוך הצמתים שזוהו בשלב 3.2.2, שמור רק את הצמתים שמקיימים בו זמנית CC גבוה מהערך החציוני ו-BC גדול מהערך החציוני, בהתאם לגישת הסינון שתוארה על ידי Kibble ואחרים^.
3. קומפילציה סופית למטרה של מפתח
   1. הרכיבו את מזהי הצמתים השמורים משלב 3.2.3 לרשימת חלבוני יעד מרכזיים וייצאו רשימה זו כקובץ CSV.
   2. יישמו את כלל הסינון המבוסס על חציון (DC גדול מכפול מהחציון, CC גדול מהחציון, ו-BC גדול מהחציון) כקריטריון היחיד לזיהוי יעדים מרכזיים לאורך כל כתב היד, תוך הבטחת עקביות עם גישת הסינון המאוחדת שנקבעה בפרוטוקול.

4. ניתוח העשרת GO וניתוח מסלולי KEGG

1. ניתוח העשרה פונקציונלית באמצעות מסד הנתונים של DAVID
   1. בהתאם לשיטה שתוארה על ידי Tanabe ואחרים. ¹⁰, העלה את רשימת הגנים החוצה משלב 1.3.4 בפורמט סמל גנים למסד הנתונים של DAVID ב-https://david.ncifcrf.gov/, הגדר את המין ל-Homo sapiens, ואת סוג הרשימה לסמל גן.
   2. לבצע ניתוח העשרת GO על ידי בחירת GOTERM_BP_DIRECT לתהליך ביולוגי, GOTERM_CC_DIRECT לרכיב תאי ו-GOTERM_MF_DIRECT לתפקוד מולקולרי, ולבצע ניתוח העשרת מסלולי KEGG על ידי בחירת KEGG_PATHWAY.
   3. הגדר את סף המובהקות ל-p < 0.05 והחלה את תיקון שיעור הגילוי השגוי של בנג'מיני-הוכברג (FDR) לבדיקות מרובות, ואז הורידו את תוצאות ההעשרה כקבצי CSV המכילים שמות מונחים, ספירת גנים, ערכי p, ערכי p מותאמים ל-FDR וגנים נלווים.
2. יצירת תרשים בועות באמצעות פלטפורמת הענן OmicShare
   1. ייבא את תוצאות העשרת GO משלב 4.1.3 לפלטפורמת הענן OmicShare ב-https://www.omicshare.com/tools ובחר בכלי תרשים בועות העשרת GO.
   2. העלה את קובץ התוצאות המכיל שמות מונחים, ספירת גנים וערכי p, ואז הגדר את הכלי להציג את 20 האיברים המובילים עם ערכי p הנמוכים ביותר.
   3. הגדר את ציר ה-x לייצג את יחס ההעשרה, את ציר ה-y שיציג את תנאי ה-GO, את גודל הבועה לייצג את מספר הגנים, ואת צבע הבועה לייצג ערך p.
   4. יצר את תרשים הבועות והורד אותו כקובץ תמונה ברזולוציה גבוהה.
3. המחשת מסלול KEGG באמצעות KEGG mapper
   1. מיין את תוצאות העשרת מסלולי KEGG לפי ערך p בסדר עולה ובחר את 20 המסלולים המובילים עם הערכים הקטנים ביותר p.
   2. עבור כל מסלול נבחר, יש לגשת למסד הנתונים של KEGG ב-https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html כדי לקבל את דיאגרמת המסלול.
   3. זהה את חלבוני היעד מרשימת הגנים החוצה שנמצאים בכל מסלול על ידי הצלבה עם קבוצות הגנים של המסלולים מתוצאות ההעשרה.
   4. גש לכלי המיפוי KEGG ב-https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, בחר את פונקציית מסלול הצבע , הזן את רשימת סמלי הגנים המצטלבים ומזהה מסלול KEGG, ויצר דיאגרמת מסלול מקודדת בצבעים עם חלבוני המטרה המזוהים באדום.
   5. להרכיב את כל פלטי ניתוח ההעשרה, כולל קבצי CSV של העשרת GO לשלוש קטגוריות, קובץ CSV של העשרת מסלולי KEGG, תמונת תרשים בועות, ודיאגרמות המסלולים המקודדות בצבעים עבור 20 הנתיבים המובילים, ואז ייצא את הקבצים הללו לניתוח במורד הזרם.

5. אימות עגינה מולקולרית

1. הורידו את המבנים התלת-ממדיים של חלבונים חיוניים (כגון CYP3A4 ו-POR שזוהו כמטרות מרכזיות בניתוח הרשת) ממסד הנתונים של RCSB PDB ב-https://www.rcsb.org/, ובחרו מבנים ברזולוציה ≤ 2.5 Å מהומו ספיינס המכילים ליגנד קו-גבישי כדי להגדיר את האתר הפעיל, והורידו את קבצי נתוני המבנה של תרכובות פעילות (כולל בטא-קרוטן, spathulenol, ו-beta-sitosterol) מתוך מאגר PubChem בפורמט SDF.
2. הכינו את מבני החלבונים באמצעות AutoDockTools על ידי הסרת מולקולות מים והליגנד הקו-קריסטליזי, הוספת מימן קוטבי והקצאת מטעני גסטיגר, ואז שמירת החלבונים המוכנים בפורמט PDBQT, המרת קבצי SDF מורכבים לפורמט PDB באמצעות Open Babel, זיהוי קשרים סיבובים לכל ליגנד ב-AutoDockTools, ושומרי את הליגנדים בפורמט PDBQT.
3. הגדר את תיבת רשת העגינה עם ממדים של 60 × 60 × 60 Å שמרכזות בקואורדינטות אתר הקישור של הליגנד המגובש, ואז לבצע עגינה מולקולרית באמצעות AutoDock Vina עם מיצוי מוגדר ל-8 ו-num_modes מוגדר ל-10 ליצירת 10 תנוחות קישור לכל זוג ליגנדה-חלבון.
4. ייבא את קבצי העגינה המתקבלים ואת קבצי היעד המתאימים להם ל-PyMOL, זהה ושמור את מודל העגינה עם אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר (הערך השלילי ביותר) בתנוחה מייצגת.
5. לאחר מכן, יש להגיש מודל זה למסד הנתונים של PLIP ב-https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ כדי לנתח את האינטראקציות בין מולקולות קטנות לחלבונים, כולל קשרי מימן, אינטראקציות הידרופוביות, ערימת π וגשרי מלח.
6. חשב ואוסף את אנרגיות הקישור לכל הרכיבים הפעילים ב-LYXT מול חלבוני היעד הקשורים לחום ולשיעול, ואז יצר טבלה מסכמת הכוללת שמות תרכובות, חלבוני יעד, אנרגיות קישור (kcal/mol) וסוגי אינטראקציות מרכזיים להצגה בסעיף התוצאות.
   הערה: מרשם ה-R המשמש לניתוח פרמקולוגיה רשתית זמין בקובץ משלים 1.

6. ניסוי בבעלי חיים

1. ציר זמן ניסיוני
   1. התאגלות בעלי החיים לשבוע, לאחר מכן ביצוע LPS או מתן תמיסת מלח ביום ה-0, מתן טיפולים תרופתיים יומיים מהיום השביעי עד היום ה-20 למשך שבועיים, וביצוע המתת חסד עם איסוף דגימות ביום ה-21.
2. רכישת בעלי חיים וקיבוץ
   1. קנו 60 עכברים זכרים בוגרים C57BL/6 במשקל 25 ±± 4 גרם, האכלו אותם במשך שבוע, ואז חלקו אותם באקראי לקבוצת מלח רגילה (6 עכברים) וקבוצה פצועה של LPS (54 עכברים).
   2. ביום השביעי לפני תחילת הטיפול, חלקו באקראי את קבוצת הפצועים ל-LPS לשבע תת-קבוצות עם 6 עכברים כל אחת: קבוצת המודל, הקבוצה החיובית (דקסמתזון, 50 מ"ג·ק"^ג-1·^יום-1), קבוצת הטיפול ב-LYXT (200 מ"ג·ק"^ג-1·^יום-1), קבוצת בטא-קרוטן (50 מ"ג·ק"^ג-1·^יום-1), קבוצת הספתולנול (50 מ"ג·ק"^ג-1·^יום-1), וקבוצת בטא-סיטוסטרול (50 מ"ג·ק"^ג-1·^ד-1).
      הערה: מתן הטיפול והערכות התוצאה היו עיוורות.
3. מודל דלקת ריאה המושרה על ידי LPS
   1. מתן 2% פנטוברביטל נתרן באמצעות הזרקה תוך-צפיקית במינון של 60 מ"ג/ק"ג להרדמה. אשר עומק הרדמה בינוני בהיעדר תגובה של צביטת זנב. לבסוף, בהתבסס על משקל הגוף שנרשם, יש לחשב את נפח ההזרקה הנדרש של LPS בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.
   2. הכן את עצמך למתן אף על ידי משיכת נפח ה-LPS המחושב במדויק אל תוך הפיפטה. החזק את העכבר בחוזקה על ידי אחיזה בבסיס הזנב ביד ימין, תוך שימוש באגודל ובאצבע המורה של יד שמאל כדי לקבע בעדינות את ראשו באוזניים.
   3. הוציא את הנוזל באיטיות עד שנוצרת טיפה קטנה (כ-2 מיקרוליטר) בקצה הפיפטה. קרב בזהירות את הטיפה לנחיר הימני של העכבר עד שהיא נוגעת. הרימו מיד ובמהירות את היד השמאלית כלפי מעלה ב-30–40 ס"מ, ואז מחזירים בעדינות את היד השמאלית ואת העכבר למצב ההתחלתי.
      הערה: יש לשים לב לנחיריו של העכבר כדי לשמור על מצב העלייה (כלפי מעלה).
   4. השתמש באותה שיטה להזרקת טיפות נוזליות קטנות לנחיר השמאלי של העכבר, והוסף אותן לנחיריים השמאלי והימני ברצף עד להשלמת ההזלפה הנוזלית.
   5. אחר כך שחרר את העכבר, מקבע את העכבר על לוח העכבר עם סרט דבק, ושמור על המיקום עם הבטן למעלה והראש מוטה למעלה במשך יותר מ-4 שעות. לאחר שהעכבר מתעורר, מחזירים אותו לכלוב לתצפית, בהתאם לשיטה שתוארה על ידי לורנץ ואחרים^.
4. איסוף נוזלי שטיפה ברונכואלוואולרי
   1. הפרדו באקראי את עכברי קבוצת הפצועים LPS לשבע קבוצות: קבוצת ביקורת שלילית, קבוצת מודל, קבוצה חיובית (דקסמתזון, 50 ^mg.kg-1.d-1), קבוצת טיפול ב-LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1), קבוצת בטא-קרוטן (50 ^mg.kg-1.d-1), קבוצת ספתולנול (50 ^mg.kg-1.d-1), וקבוצת בטא-סיטוסטרול (50 ^mg.kg-1.d-1), עם שישה עכברים בכל קבוצה.
      הערה: יש להכין את LYXT כך: ערבב את אבקת Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L., ו-Zingiber officinale Roscoe ביחס מסה של 5:3:2.  מערבבים את האבקה עם מים ב-1:30 (גרם/מ"ל) וריפלוקס ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. מסננים ומרוכזים את התמיסה (30 °C, 0.01–0.08 מגה-פסקל) וממיסים אותה במים להכנת תמיסה של 2 גרם למ"ל. בטא-קרוטן, בטא-סיטוסטרול וספתולנול שימשו כתקני ייחוס לאימות ניסוי. נתנו את התרופות לכל קבוצה פעם ביום במשך שבועיים, החל משבוע לאחר הטיפול ב-LPS. הורד את בעלי החיים באמצעות מנת יתר של תיופנטל (100 מ"ג/ק"ג), לפי ג'ין ואח' ¹².
   2. יש להטמיע את החדר עם קנולה מספר 23. לאחר מכן, הזריקו באיטיות 10 מ"ל PBS לרקמת הריאה תחת לחץ של 25 ס"מ H₂O, וחזרו על השטיפה הזו כ-6 פעמים כדי לקבל נוזל שטיפה ברונכואלואולרי (BALF), בהתאם לשיטה שתוארה על ידי פיניירו ^{ואחרים.}
5. ניתוח לויקוציטים וציטוקינים ב-BALF ובסרום
   1. צנטריפוגה את ה-BALF שנאסף ב-500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החזירו את כדור התא ל-1 מ"ל של PBS, מדללים 1:10 עם כחול טריפן, וספרו את סך הלויקוציטומטרים באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 400×.
   2. אסוף את דגימות הסופרנטנט והסרום של BALF מניקור לב.
   3. מדדו ריכוזי TNF-α, IL-1β ו-IL-18 באמצעות ערכות ELISA מסחריות לפי הוראות היצרן, קריאת ספיגה ב-450 ננומטר עם קורא מיקרופלט, וחישוב ריכוזים מעקומות סטנדרטיות. קבעו את ריכוז החלבון ב-BALF באמצעות בדיקת BCA.
6. אימות רכיבים פעילים באמצעות ניתוח HE ו-WB
   1. כדי לזהות רכיבים פעילים התורמים ליעילות LYXT, יש להקים מחדש את מודל הדלקת הריאתית הנגרמת על ידי LPS לפי סעיף 6.3.
   2. רכשו 60 עכברים, הסתגלו לשבוע אחד, וחלקו באקראי לחמש קבוצות (n = 12 כל אחת): קבוצת מודל, קבוצת LYXT (200 מ"ג·ק"^ג-1·^יום-1), קבוצת בטא-קרוטן (50 מ"ג·ק"^ג-1·^ד-1), קבוצת ספתולנול (50 מ"ג·ק"^ג-1·^יום-1), וקבוצת השילוב (25 מ"ג·ק"^ג-1·^יום-1 כל אחת).
   3. לתת LPS ביום 0 וטיפולים מהיום השביעי ועד ה-20 כפי שמתואר בשלב 6.3. ביום ה-21, אספו רקמת ריאה¹⁴.
7. ניתוח היסטולוגי
   1. לקבע את האונה העליונה של הריאה השמאלית ב-4% פאראפורמלדהיד למשך 24 שעות, להטמיע בפרפין, לחתוך חתכים של 5 מיקרון, ולבצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE).
   2. בדקו חתכים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 200× ו-400× להערכת חדירת תאים דלקתיים ועיבוי דופן האלוואולרי. לצלם תמונות מייצגות.
8. ניתוח כתמים מערביים
   1. הומוגניזציה של רקמת הריאה במבחן רדיואימונופרציפיטציה (RIPA) עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס וקבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA).
   2. העמיסו 30 מיקרוגרם חלבון בכל באר על ג'לים אלקטרופורזה של סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), העבירו לממברנות פוליווינילידין פלואוריד (PVDF), וחסמו עם חלב דל שומן של 5%.
   3. דגרו נוגדנים ראשוניים נגד p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 ו-β-אקטין במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C, ואז עם נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP.
      הערה: דילול הנוגדנים מופיע בטבלת החומרים.
   4. המחישו רצועות באמצעות מצע ECL, תפסו תמונות וכמת עוצמות באמצעות ImageJ. נרמול ביטוי חלבון המטרה ל-β-אקטין או סך כל p38.

תוצאות

מאגר הנתונים של TCMSP שימש לאיסוף 409 מרכיבי LYXT פעילים. מתוכם, 58 מרכיבים הגיעו מ-Verbena officinalis L., 86 מ-Semen Pharbitidis, ו-265 מרכיבים פעילים מ-Zingiber officinale Roscoe. עשרים ושישה מרכיבים פעילים מרכזיים נבדקו לפי המדד: OB ≥ 30.1% ו-DL ≥ 0.12 עבור Verbena officinalis L., OB ≥ 60%, ו-DL ≥ 0.13 עבור Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16.93%, ו-DL ≥ 0.50 עבור זרע פרביטידיס (טבלה 1).

מאתיים ושבעה חלב...

דיון

מאמר זה זיהה בהצלחה 26 מרכיבים פעילים ו-207 מטרות פוטנציאליות של LYXT, תרופת דונג מסורתית המשמשת לחום ולשיעול. הממצאים המרכזיים כוללים זיהוי CYP3A4 כחלבון יעד קריטי באמצעות ניתוח טופולוגיית רשת, ואימות ניסויי של LYXT, בטא-קרוטן וספתולנול כתרכובות פעילות עם השפעות אנטי-דלקתיות משמעותיות במודל דלקת ריאה המושרה על ידי LPS. ממצאים אלו הושגו באמצעות גישה משולבת המשלבת פרמקולוגיה רשתית (סקר מסדי נתונים, ניתוח רשת PPI ועגינה מולקולרית) עם אימות ניסויי in vivo (ספירת לויקוציטים BALF, מד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אנטי-IL-18	פרויטנטק, ווהאן, סין	27095-1-AP	ארנב פוליקלונל, 1:500
אנטי-IL-1 ובטא;	פרויטנטק, ווהאן, סין	66737-1-Ig	מונוקלונל עכבר, 1:500
אנטי-p38	פרויטנטק, ווהאן, סין	14064-1-AP	ארנב פוליקלונל, 1:1000
אנטי-פ-פ38	פרויטנטק, ווהאן, סין	28796-1-AP	ארנב פוליקלונל, 1:1000
אנטי-TNF-& אלפא;	פרויטנטק, ווהאן, סין	80258-6-RR	מונוקלונל ארנב, 1:500
אנטי-&בטא;-אקטין	פרויטנטק, ווהאן, סין	66009-1-Ig	מונוקלונל עכבר, 1:2000
אוטודוק וינה	https://vina.scripps.edu/	גרסה 1.5.6	תוכנת עגינה מולקולרית
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	גרסה 1.5.6	כלי להכנת עגינה מולקולרית
ערכת בדיקת חלבון BCA	תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב	23225	לקביעת ריכוז החלבון
בטא-קרוטן	סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	83-46-5	תקן טוהר גבוה, >95%
בטא-סיטוסטרול	סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	83-46-5	תקן טוהר גבוה, >95%
עכברים C57BL/6	מרכז בעלי חיים רפואיים של אוניברסיטת לנז'ואו	-	גבר בוגר, בן 25 ומעלה; 4 גרם
ציטוסקייף	https://cytoscape.org/	גרסה 3.8.1	תוכנות לוויזואליזציה וניתוח רשת
דקסמתזון	סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	D4902	שליטה חיובית
מצע ECL	מיליפורסיגמא, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב	WBKLS0500	לזיהוי כתמים מערביים
ערכות ELISA
פריזמת GraphPad	https://www.graphpad.com/	גרסה 8.0 ומעלה	תוכנת ניתוח סטטיסטי וגרפים
המטוקסילין ואאוסין (H&) ה) ערכת צביעה	מדעי הסולארביולוגיה של בייג'ינג חברת טכנולוגיה בע"מ, בייג'ינג, סין	G1120	לצביעת רקמות ריאה
היסטולוגיה
אנטי-עכבר מצומד HRP	פרויטנטק, ווהאן, סין	SA00001-7G	נוגדן משני, 1:5000
אנטי-ארנב מצורף-HRP	פרויטנטק, ווהאן, סין	SA00001-7H	נוגדן משני, 1:5000
ערכת IL-18 אליסה	מדעי הסולארביולוגיה של בייג'ינג חברת טכנולוגיה בע"מ, בייג'ינג, סין	SEKH-0016	למדידת IL-18 ב-BALF ובסרום
IL-1 ובטא; ערכת אליסה	מדעי הסולארביולוגיה של בייג'ינג חברת טכנולוגיה בע"מ, בייג'ינג, סין	SEKM-0004	למדידת IL-1 ובטא; ב-BALF ובסרום
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	גרסה 1.53	תוכנת ניתוח תמונות
ליפופוליסכריד (LPS)	סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	L2630	מ-  Escherichia coli  O111:B4
חומרי גלם LYXT	אוניברסיטת חואיחואה	-	תערובת אבקה של  Pharbitis nil  (L.) Choisy,  Verbena officinalis L., ו  Zingiber officinale  רוסקו (5:3:2, עם שבוע)
חומרים נוספים
פנטוברביטל נתרן	סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	P3761	תמיסה של 2% להרדמה
פליפ	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	פרופילר אינטראקציה חלבון-ליגנד
ממברנות PVDF	מיליפורסיגמא, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב	IPVH00010	להעברת כתם מערבי
PyMOL	https://pymol.org/	גרסה 2.5	תוכנת ויזואליזציה מולקולרית
R	https://www.r-project.org/	גרסה 4.0 ומעלה	מחשוב סטטיסטי ותוכנות גרפיקה
ספאתולנול	MedChemExpress, מונמות' ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"ב	HY-N1205	תקן טוהר גבוה, >95%
מיתר	https://stringdb.org/	-	כלי חיפוש לשליפת גנים/חלבונים אינטראקטיביים
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	מאגר מערכות פרמקולוגיה של רפואה סינית מסורתית
תיופנטל	סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	T102	להמתת חסד
TNF-α ערכת אליסה	מדעי הסולארביולוגיה של בייג'ינג חברת טכנולוגיה בע"מ, בייג'ינג, סין	SEKM-0034	למדידת TNF-ו-alpha; ב-BALF ובסרום
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	רצף חלבונים ומסד נתונים של הערות