פרופילינג ליזוזומי באמצעות LysoTracker להערכה כמותית של הזדקנות תאית בפיברובלסטים אנושיים

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול LysoTracker של תאים חיים למדידת שיקום ליזוזומי במהלך הזדקנות בפיברובלסטים אנושיים מסוג IMR-90.

תקציר

הזדקנות תאית היא מצב יציב של עצירה במחזור התא המקושר לפנוטיפים אופייניים, כולל מורפולוגיה מוגדלת של התאים, שינוי באיתות הפרשה ושינוי ליזוזומלי בולט. תאי הזקנה מציגים לעיתים קרובות התרחבות של התא החומצי האנדוליזוזומלי, מלווה בשינויים בחומציות האור וביכולת הפירוק, מה שיוצר הזדמנות לקריאות פשוטות של תאים חיים של עיצוב אברונים הקשור להזדקנות. עבודה זו מתארת פרוטוקול הדמיה של תאים חיים המשתמש ב-LysoTracker Deep Red, צבע פלואורסצנטי חומצי, כדי לספק תחליף עקיף התלוי ב-pH למחלקת האברונים החומציים כמתאם לעומס ההזדקנות. השיטה מודגמת בפיברובלסטים של ריאות IMR-90 האנושיים העוברים הזדקנות שכפולה לאורך מעבר סדרתי. הפרוטוקול מפרט מעקב אחר תרבית תאים ומעבר, צביעת LysoTracker, הדמיית פלואורסצנציה וכימות מבוסס תמונה של עוצמת האות הליזוזומלית ושטח האות החיובי לכל תא. צביעת β-גלקטוזידאז (SA-β-Gal) הקשורה להזדקנות על תרבויות מקבילות כלולה כסמן אישור אופציונלי ולא כתקן ייחוס. תוצאות מייצגות מראות אות צבע פלואורסצנטי חומצי גבוה יותר ואזורים ליזו-חיוביים גדולים יותר בתרביות מעבר מאוחר מאשר בביקורת במעבר מוקדם, בהתאם להתרחבות תא האברונים החומציים במהלך ההזדקנות. מכיוון שהקריאה תלויה בנפח התאים, גרדיאנט הפרוטונים וזמינות הצבע, היא מתפרשת בצורה הטובה ביותר כקורלציה עקיפה של שיפוץ ליזוזומי ולא כמדד ישיר למספר הליזוזום או ביוגנזה. הפרוטוקול פשוט לאימוץ וניתן להתאים אותו לסוגי תאים אחרים או ללחצים הגורמים להזדקנות, ומספק השלמה מעשית וכמותית לבדיקות קצה קונבנציונליות.

מבוא

הזדקנות תאית היא תוכנית עמידה לעצירת מחזור תאים המופעלת על ידי לחצים שונים וטריגרים הקשורים להזדקנות 1,2,3,4. תאים מזדקנים מזוהים קלאסית על ידי קונסטלציה של סמנים, שכן אין סמן יחיד שהוא ספציפי לחלוטין. המאפיינים כוללים מורפולוגיה מורחבת ושטוחה של תאים, פעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-Gal) הקשורה להזדקנות, יצירת מוקדי נזק ל-DNA, ופרופיל הפרשה פרו-דלקתי (SASP)^2,4,5. מבין המאפיינים הללו, שיפוץ ליזוזומי התגלה כתכונה בולטת ופונקציונלית משמעותית של הזדקנות ^6,7. תאי הזקנה מציגים שינויים ליזוזומליים עמוקים, כולל התרחבות דרמטית בגודל ובמספר הליזוזום יחד עם שינוי בתפקוד (לעיתים כולל ניטרול חלקי של pH הליזוזומי והצטברות חומר לא מתפרק)6,7,8,9. התפשטות הליזוזומלית הזו תורמת לעלייה בפעילות SA-β-Gal, סמן הזדקנות מבוסס המשקף פעילות מוגברת של β-גלקטוזידאז ליזוזומלי בתאים זקנים 10,11,12. למעשה, צביעת SA-β-Gal מנצלת תופעה זו באמצעות דגירה תת-אופטימלית של pH (6.0) כדי להשקיע צבע באופן סלקטיבי בליזוזומי תאי הזקנה, שצברו את האנזים ומציגים pH גבוה יותר מתאים צעירים 10,12,13.

ליזוזומים ממלאים תפקידים מרכזיים במחלוקת חלבונים ובאיתות, והדיסרגולציה שלהם נחשבת כיום לסימן היכר של הזדקנות והזדקנות 1,2,4,6. תאים מזדקנים לעיתים קרובות מציגים דיספונקציה ליזוזומלית, כפי שניתן לראות ב-pH לומינלי גבוה, פעילות אנזימית משתנה והצטברות ליפופוסין (פיגמנט אוטופלואורסצנטי של מקרומולקולות מחומצנות)^6,14. ביוגנזה ליזוזומלית מוסדרת או משתנה לעיתים קרובות באמצעות רשת הביטוי והוויסות הליזוזומלית המתואמת (CLEAR) תחת שליטת פקטור שעתוק EB (TFEB) וגורמים קשורים ^6,7,15. תהליך זה יכול להגדיל את המסה הליזוזומלית בתאים מזדקנים כאשר הם מסתגלים למתח על ידי הרחבת תא הפירוק ^6,7,10. לעומת זאת, תאים זקנים עשויים גם לחוות ירידה בתפקוד הליזוזומי (למשל, ירידה בחוממציות), מה שיכול להשפיע על תהליכים כמו אוטופגיה ולגרום לעמידות ללחצים מסוימים, כולל מוות תאי פרופטוטי ^6,8. מדידת תוכן ותפקוד הליזוזומים היא לכן מרכזית להבנה וזיהוי הזדקנות ^6,16.

LysoTracker Deep Red הוא גלאי פלואורסצנטי ממברנה שמצטבר באופן סלקטיבי באברונים חומציים דרך לכידה מונעת פרוטונטציה על פני ממברנת הליזוזום^16,17. האות המתקבל משקף את נפח התא החומצי המשולב, עוצמת גרדיאנט הפרוטונים וזמינות הצבע המקומי במקום את המסה הליזוזומלית, ויכול להשתנות עם שינויים ב-pH הליזוזומי או במצב הממברנה המתרחשים באופן עצמאי ממספר הליזוזום הכולל ^6,16. בהקשר של הזדקנות תאית, תאים מציגים תאים מורחבים ומסומנים בעוצמה רבה יותר עם תאי LysoTracker חיוביים בהשוואה למקבילים לפני הזדקנות⁹, בהתאם להתרחבות תא האברונים החומציים ולביוגנזה הליזוזומלית המוגברת כפי שדווח על ידי מחקרים ביוכימיים ואולטרסטרוקטורליים ^6,7,10. גישה זו של תאים חיים מציעה מספר יתרונות על פני צביעת SA-β-Gal המסורתית בנקודת קצה: היא מאפשרת ניתוח כמותי ומרחבי של תאים בודדים, ניתנת לשילוב עם מדווחי פלואורסצנט אחרים, אינה דורשת קיבוע ומספקת הטרוגניות על ידי דיווח על תכונות רציפות במקום נקודת קצה בינארית ^6,16. במהלך הפרוטוקול הזה, אות LysoTracker משמש כקריאה של תא האברונים החומציים בתאים חיים, ושינויים תלויי תנאי מפורשים בהתאם ולא מטופלים כמדד מוחלט למספר הליזוזום ^6,16.

פרוטוקול זה מפרט את השימוש ב-LysoTracker Deep Red לפרופיל שינויים ליזוזומליים בפיברובלסטים של IMR-90 העוברים הזדקנות שכפולית. IMR-90 הוא קו פיברובלסטים דיפלואידי אנושי תקין (נקבה, מקור ריאה עוברי) המשמש רבות במחקר הזדקנות; כמו פיברובלסטים דמויי ראשוניים אחרים (למשל, WI-38), תאי IMR-90 נכנסים להזדקנות לאחר הכפלת אוכלוסייה ~50–60 (גבול הייפליק) עקב קיצור טלומרים ונזק ל-DNA שמסמנים^{אותות 18,19}. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל תאי IMR-90 כדי לגרום להזדקנות באמצעות מעבר סדרתי, לאמת הזדקנות לפי מורפולוגיה וצביעת SA-β-Gal, ולצבוע תרביות חיות עם LysoTracker Deep Red להדמיית פלואורסצנציה 5,10,12,13. רכישת תמונה וניתוח נכללים, עם קריאות כמותיות כגון ספירת ליזוזום לתא, שטח ליזוזומי כולל לתא, ועוצמת פלואורסצנציה ממוצעת. מודגשים בקרות ניסיוניות ושיקולי בטיחות, כולל טיפול זהיר בצבעים וקיבוסים, צמצום פוטוטוקסיות במהלך ההדמיה, והתחשבות באוטופלואורסצנציה תאית בתאים מבוגרים. השיטה מודגמת באמצעות הזדקנות שכפולה אך ניתנת להתאמה למודלים נוספים, כולל הזדקנות הנגרמת על ידי תרופות (למשל, טיפול בדוקסורוביצין או אטופוסיד) או הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ (SIPS) על ידי מחמצנים 2,3,4,19,20. בכל מקרה, יש להשוות קריאות מבוססות LysoTracker לבקרות מתאימות (תאים מתרבים או דוממים) וכאשר ניתן, לעבור אימות צולב עם לפחות סמן הזדקנה מסורתי אחד (כגון SA-β-Gal או ביטוי p16INK4a)3,5,12,13.

פרופיל ליזוזומי של תאים חיים ממלא פער מעשי בבדיקות הזדקנות על ידי מתן מדידת רזולוציה חד-תאית לשחזור של פנוטיפ מרכזי של האברון—התרחבות ליזוזומלית—המקושרת ישירות לתפקוד תאי הזקנה (למשל, קיצור פירוק מוגבר ופעילות הפרשה)2,3,4,6 . מכיוון שצביעת LysoTracker תואמת להדמיה בתפוקה גבוהה ולציטומטריית זרימה, ניתן להרחיב את הפרוטוקול ליישומים כמו סקר סמים (למשל, בדיקת סנוליטיים או מודולטורים של פונקציה ליזוזומלית)^2,3,6. ככיוון עתידי, תכונות ליזוזומליות לכל תא שנוצרות על ידי פרוטוקול זה מתאימות לגישות סיווג בהמשך, כולל מודלים של למידת מכונה; אימון ואימות מסווגים כאלה חורגים מהיקף פרוטוקול זה. בסך הכול, שיטה זו (איור 1) מאפשרת הדמיה וכימות של הממד הליזוזומי של ביולוגיית ההזדקנות, ומספקת תובנות כיצד ביוגנזה ומורפולוגיה ליזוזומליים משתנים במהלך הזדקנות או לחץ ומספקת פלטפורמה לבדיקת התערבויות המיועדות לליזוזומים בתאים מזדקנים. תהליך ניתוח התמונה המשמש לסגמנט גרעינים, הסקת אזורים קשורים לתאים, סף וכימות תכונות LysoTracker, ושחזור ניתוחים לכל באר ולכל תא המוצגים כאן, מיושם כחבילת נלווה בקוד פתוח (SenTrackLite v0.5.0), המסופקת כקובץ משלים 1 ונשמרת בארכיון DOI מתמשך לציטוט ולשימוש חוזר²¹.

איור 1: סקירה של מבחן הזדקנות ליזוזומלית של תאים חיים. (א) זרימת עבודה ניסיונית. התאים נצבעים בשידור חי עם LysoTracker Deep Red וצבע גרעיני, המדומים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, ומעובדים במקביל לצביעת SA-β-Gal לצורך אימות. (ב) מדידות לפי תא שמקורן בתמונה בלבד. הערוץ הגרעיני משמש לזיהוי תאים בודדים, וההתרחבות המעוגנת בגרעין מגדירה אזור לכל תא להפקת מדידות הקשורות לליזוזום מערוץ LysoTracker. מדידות מייצגות לכל תא כוללות את שטח הליזוזומל, עוצמת הליזוטרקר הממוצעת וספירת הליזוזומים. צביעת SA-β-Gal יכולה לשמש כתווית אימות אופציונלית בעת יצירת או אישור מאגרי נתוני ייחוס. (ג) כימות ותפוקים. מדידות ליזוזומליות לכל תא משולבות לציון הזדקנות או הסתברות יחיד לכל תא באמצעות שיטת ניקוד פשוטה. הפלטים כוללים ערכים לכל תא וסיכומים ברמת באר או רמת תנאי של נטל ההזדקנות, שניתן להשוות בין תנאי השראת הזדקנות או טיפול סנוליטיק. נוצר עם BioRender.com
אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרוטוקול

תאי IMR-90 הם קו תאי פיברובלסטים אנושי מבוסס ואינם מהווים מחקר של נבדקים אנושיים. לא נדרשה אישור אתי או הסכמה מדעת. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת אולבני, אוניברסיטת מדינת ניו יורק, לעבודה עם קווי תאים שמקורם בבני אדם בתנאי רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).

1. סקירה כללית של הכנה ותהליכי עבודה

1. הגדר את המטרה הניסוייתית כבדיקת פרופיל ליזוזומלי של תאים חיים באמצעות צביעת LysoTracker Deep Red וצבע גרעיני חי לכימות שיחזור הליזוזומי כקריאה רציפה של נטל הזדקנות בתאי IMR-90. הגדר את ההשוואה הביולוגית הראשית כאחד מהעיצובים הבאים:
   1. השראה מזדקנת לעומת שליטה לא מושרה תואמת.
   2. מצבים של הזדקנות גבוהה לעומת הזקנה נמוכה לאורך מינון או סדרת זמן.
   3. מצב זקנה גבוה מטופל עם סנוליטי לעומת ברכב מטופל - בקרה גבוהה של הזדקנות.
   4. סדרות טיפולים סנוליטיים הכוללות גם קבוצת בסיס זקנה נמוכה וגם קבוצת הזדקנות גבוהה.
2. קבע את מבנה הבקרה המינימלי לכל הניסויים.
   1. כלול קבוצת ביקורת עם הזדקנות נמוכה מותאמת לצפיפות ציפוי, תזמון צביעה והגדרות הדמיה.
   2. כלול קבוצה עם הזדקנות גבוהה שנוצרת על ידי טריגר זקנה מוגדר או על ידי הזדקנות משכפלת מאוחרת.
   3. כלול שכפולים ביולוגיים לכל מצב ובצע צביעה ודימות בתזמון זהה בין מצבים.
3. הגדר קריאות בדיקה כמדדים ישירים מבוססי תמונה של שיפוץ ליזוזומלי:
   1. מדוד את עוצמת ה-LysoTracker הממוצע לכל תא בתוך המסכה הליזו-חיובית באמצעות סף עוצמה עקבי כקריאת הבדיקה הראשית. ברמת התא היחיד, מדד זה מפריד בין הזדקנות נמוכה לתנאים בעלי גודל השפעה גבוה ביותר ואינו רגיש לצפיפות גרעינית ברמת השדה (איור משלים 1).
   2. רשמו את הבאים כקריאות משניות, המתעדות את התפשטות התא אך רגישות יותר לבחירות סגמנטציה או צפיפות גרעינית ברמת השדה: שטח מועשר בליזוזום לכל תא ועוצמת LysoTracker משולבת לכל גרעין ברמת השדה. עוצמה משולבת לכל גרעין היא אינפורמטיבית בשדות מאוכלסים היטב אך הופכת לבלתי יציבה כאשר שדה מכיל מספר קטן של גרעינים, שכן הנורמליזציה לכל גרעין נשלטת על ידי תאים בודדים.
   3. יש לרשום מדדים אופציונליים של מספר וגודל פנקטות כאשר רזולוציית הדמיה תומכת בהבחנה בין פונקטים.
4. השתמש בצביעת β-גלקטוזידאז (SA-β-Gal) הקשורה להזדקנות כשלב אימות אופציונלי המתבצע על בארות מקבילות או דגימות תואמות, בהתאם למגבלות הניסוי. השתמשו באימות זה כדי לאשר שתרבויות מעבר מאוחר מציגות חיוביות מוגברת ל-SA-β-Gal בהשוואה לתרבויות במעבר מוקדם.
5. סטנדרטיזציה של המבחן בין התנאים על ידי קביעת המשתנים הבאים לפני איסוף הנתונים:
   1. ריכוז העבודה של LysoTracker (75 ננומטר) ומשך הצביעה (30 דקות).
   2. זהות צבע גרעיני וטווח ריכוז העבודה (למשל, Hoechst 33342 ב-1 מיקרוגרם/מ"ל עד 2 מיקרוגרם/מ"ל).
   3. פרמטרי הדמיה, כולל הגדלה אובייקטיבית, זמן חשיפה, עוצמת תאורה, שיגור ואסטרטגיית מיקוד.
   4. פורמט לוח ותצורת הדמיה (לוחות הדמיה עם תחתית שקופה או צלחות עם תחתית זכוכית), כולל פריסת באר שכפול.
   5. בחירת סף ונירמול עוצמה.
      1. יש להחיל סף עוצמה קבועה יחיד על ערוץ LysoTracker בכל הבארות בתוך הניסוי כדי להגדיר את המסכה החיובית של הליזו.
      2. בחר את הסף פעם אחת במהלך הקמת הבדיקה באמצעות קבוצת כיול של שדות החוצה את טווח העוצמה הצפוי (למשל, שני שדות זקנה-נמוכים ושני שדות זקנה-גבוהים), והחזיקו אותו קבוע בכל הבארות בתוך אותו מפגש; מתן אפשרות לשינוי הסף לכל באר יוצר תלות מעגלית בין מדידה לתוצאה.
      3. להשוואות בין ניסויים, רכוש את כל התנאים במפגש אחד תחת אותן עוצמת לייזר, חשיפה ורווח ודווח על ההגדרות הללו באגדת האיורים.
      4. אם נדרשת השוואות עוצמה מוחלטת בין מפגשים, יש לכלול תקן ייחוס פלואורסצנטי (למשל, פלטת חרוז ייחוס או באר ייחוס קבועה) ולנרמל את העוצמות הנמדדות בהתאם.
         הערה: אל תשווה ערכי עוצמה גולמיים בין סשנים ללא הגדרות רכישה זהות או נרמול מבוסס ייחוס.
   6. נרמול צפיפות גרעינית.
      הערה: מכיוון שתרביות זקנה בדרך כלל מציגות הפצה מופחתת וצפיפות גרעינית נמוכה יותר בזריעות מקבילות7,10, מדדים ברמת השדה המבוססים על ספירת פיקסלים מוחלטת (למשל, שטח ליזו-חיובי כולל) עשויים להיות מושפעים ממספר התאים לכל שדה.
      1. דווח הן על ערכים גולמיים והן ערכים מנורמלים לכל גרעין (ערך גולמי חלקי מספר הגרעינים המחולקים ל-Hoechst).
         הערה: בקרות נורמליזציה לכל גרעין עבור בלבולים הקשורים לצפיפות וזו ההשוואה המתאימה לפרשנות לכל תא. בקריאות מבוססות אזור, הערך המנורמל משמש כמדד הראשי, בעוד שהסך הכולל הלא מנורמל נשמר לצורך שלמות.
6. לצלם תמונות בתנאים ששומרים על איכות האות של תא חי וממזערים שונות טכנית. שמרו על לוחות מעבר מוקדם ומאוחר מוגנים מאור במהלך הצביעה וההובלה, ומזערו את הזמן מחוץ לתנאי תרבית מבוקרים במהלך ההדמיה.
7. שמור תמונות פלואורסצנציה כקבצי TIFF חד-מישוריים, חד-ערוצי, ללא אובדן. השתמשו בשיטת שמות עקבית ששומרת על ההתאמה בין תמונות גרעיניות לתמונות LysoTracker ושומרת על מעקב לפלטה, באר, מצב ושכפול. השתמש בשם בסיס משותף עם סיומות ערוץ (למשל, _Hoechst.tif ו-_Lyso.tif). אחסן תמונות בתיקייה ייעודית המאורגנת לפי ניסוי, עם תתי-תיקיות לפי הצורך.
   הערה: נקודת עצירה מעשית היא לאחר קביעת קוהורטות בתחילת ומאוחר ואישור שתרבויות המעבר המאוחר מראות צמיחה איטית ומורפולוגיה דמוית הזדקנות.
8. (אופציונלי) כלול חמצן כמשתנה ניסויי על ידי שמירה על קוהורטים תואמים של IMR-90 בתנאי סביבה ותנאי חמצן נמוכים. עבד את כל הקבוצות באותה צורה.

2. תרבית תאים והשראת הזדקנות שכפולה

1. הפשרה של פיברובלסטים ריאתיים IMR-90 לפי שיטות תרביות תאים סטנדרטיות והרחבת תאים במדיום חיוני מינימלי (MEM) בתוספת 10% סרום עוברי בקר. הוסף פניצילין-סטרפטומיצין ב-1% אם תואם את הפרקטיקה המעבדתית ועיצוב הניסוי. שמור על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂.
2. שמור על תרביות בצמיחה לוגריתמית ומעבר לפני מפגש של 70% עד 80%. השתמש בלוחות זמנים עקביים של טיפול במדיה ובהזנה כדי להפחית שונות בין ריצות ניסוי. החליף את כל מדיום התרבות כל יומיים-שלושה בין הקטעים.
   הערה: אין לאפשר למדיום להישאר ללא שינוי יותר מ-72 שעות, שכן דלדול חומרים מזינים והצטברות גורמים מופרשים עלולים לקדם פנוטיפים הנגרמות מלחץ שמבלבלים הזדקנות שכפולה.
3. הגדירו את קבוצת הבסיס הנמוכה של הזדקנות כתרביות IMR-90 המתרבות באופן פעיל, הנשמרות בתנאים השומרים על התנהגות גדילה תקינה. התאם את צפיפות הציפוי והטיפול לכל קבוצות הניסוי.
4. ליצור קבוצה בעלת הזדקנות גבוהה באמצעות אחת מהגישות הבאות, שנבחרו על בסיס מטרות ניסוי.
   1. השרתו הזדקנות שכפולה באמצעות מעבר סדרתי עם מעקב הכפלת האוכלוסייה עד להאטת התרבות ומורפולוגיה הקשורה להזדקנות.
      הערה: רמת הכפלת האוכלוסייה (PDL) ומספר המעבר הם מדדים נפרדים ומעקבים בנפרד. PDL מתייחס להכפלות מצטברות לאחר הפשרה ומחושב בכל קטע כך:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂(תאים שנקטפו / זרעו)¹⁸,
      בעוד שמספר מעבר סופר את מספר תת-התרבויות מאז הפשרה. מכיוון שהתרביות מחולקות בדרך כלל 1:4 בכ-70%–80% מפגש באזור, כל מעבר תורם לכ-2 הכפלות אוכלוסיית, כך שמספר הקטעים ו-PDL המצטבר אינם ניתנים להחלפה.
      הערה: תרביות עם הזדקנות גבוהה נצפות בדרך כלל ברמות מתקדמות של הכפלת אוכלוסייה, כאשר ההתרבות מאטה ומורפולוגיה הקשורה להזדקנות מתגלה. יש לקבוע את הספים המדויקים באופן אמפירי עבור כל מגרש IMR-90, שכן ה-PDLs משתנים בין ספקים.
   2. הזדקנות המונעת מלחץ על ידי יישום טריגר הזדקנות מוגדר ומתן חלון התפתחות פנוטיפי מתאים.
   3. הזדקנות המושרה על ידי טיפול על ידי חשיפת תאים למצב הנבדק, כאשר המטרה היא לבדוק האם מצב זה גורם להזדקנות.
5. אימות שהגישה הנבחרת מייצרת פנוטיפ זקנה גבוה באמצעות לפחות קריאה אורתוגונלית אחת המתבצעת על בארות מקבילות. בצע צביעת SA-β-Gal כשיטת אימות אופציונלית ותעד את שיעור התאים החיוביים לכל תנאי כאשר הכלל.
   1. תרבית נחשבת להזדקנה גבוהה כאשר לפחות 50% מהתאים מראים צביעת SA-β-Gal כחולה חד-משמעית לאחר דגירה של 12 עד 16 שעות ב-pH 6.0, בעוד שבבקרה המותאמת עם הזדקנות נמוכה לא עולה על 10% תאים חיוביים בתנאי צביעה זהים¹³.
   2. ערכים מחוץ לגבולות אלו מצביעים על אינדוקציה לא שלמה של הזדקנות או רקע מוגבה, ודורשים אופטימיזציה מחודשת לפני המשך ההדמיה.
      הערה: הפסקה לאחר קביעת קוהורטות זקנה נמוכה וזקנה גבוהה ואישור הבדל פנוטיפי ברור באמצעות מורפולוגיה וצביעת אימות אופציונלית.
6. אופציונלי: עיצוב טיפול סנוליטי
   1. תנאי הזדקנות נמוכה והזדקנות גבוהה בבארות משכפלים ומאפשרים לתאים להידבק ולהתאושש לפני הטיפול.
   2. לטפל בבארות עם הזדקנות גבוהה בתרכובת(ות) סנוליטיות ולכלול בקרה גבוהה של הזדקנות מטופלת על ידי רכב.
   3. לכלול קבוצה עם הזדקנות נמוכה שטופלה באותו רכב, וכאשר רלוונטי, את אותו ריכוז של תרכובות לניטור רגישות לא-זקנה.
   4. המשיכו לפעול עם LysoTracker וצביעה גרעינית בזמן קבוע לאחר הטיפול בכל התנאים.
7. עקב אחרי תרביות במהלך המעבר המאוחר/התקדמות הטיפול ותעד מורפולוגיה ודפוסי גדילה. לזהות תרביות זקנה על ידי האטת התפשטות, מורפולוגיה מוגדלת ושטוחה, והגברת הגרנולריות הציטופלזמית. כאשר עצור הגדילה ברור, שמור על התרבית כקבוצה בעלת זקנה גבוהה לצביעה והדמיה במקום לעבור הלאה.
8. הפחת גורמי לחץ מבלבלים במהלך תחזוקת התרבית באמצעות הכנת מדיה עקבית, לוחות הזנה עקביים וזמן טיפול עקבי מחוץ לאינקובטור. לטפל בתנודות טמפרטורה, זמן ממושך מחוץ ל-CO₂ מבוקר, והתחממות לא עקבית במדיה כגורמים לשונות טכנית שניתן למנוע.
9. אופציונלי: לשמור על תרביות תואמות תחת חמצן סביבתי וחמצן נמוך. לשמור תרביות מתחת ל-21% O₂ ומתחת ל-5% O₂ כקבוצות נפרדות ולשמור כל קבוצה תחת תנאי החמצן שהוקצה לה במהלך טיפול שגרתי בתרבית, כאשר הדבר אפשרי. להגביל חשיפה לחמצן סביבתי במהלך העברות והכנות להדמיה עבור קבוצות עם חמצן נמוך.
   הערה: נקודת עצירה מעשית היא לאחר הגדרת וייצוב של קבוצות מעבר מוקדם ומאוחר ואישור שתרבויות מעבר מאוחר מראות צמיחה איטית עקבית ומורפולוגיה הקשורה להזדקנות.

3. צביעת ליזוזום וגרעין של תאים חיים עם LysoTracker Deep Red וצבע גרעיני

1. תאי IMR-90 לצלחת לכל תנאי הניסוי בלוחות הדמיה שקופים או בכלים עם תחתית זכוכית. כלול תנאי שליטה עם זקנה נמוכה ולפחות תנאי זקנה גבוה אחד שנוצר על ידי הטריגר הנבחר, וכלול שכפולים ביולוגיים לכל מצב.
2. תאי זרעים להשגת שכבה אחת תת-משולבת ביום הצביעה. רשמו את צפיפות הזריעה ואת הזמן בין הציפוי לצביעה בכל ניסוי כדי לתמוך בהשוואה בין ריצה.
3. תרבית חמה מלאה בטמפרטורה בינונית עד 37 מעלות צלזיוס. הכינו תמיסת עבודה של LysoTracker Deep Red בטמפרטורה של 75 ננומטר במדיום מחומם והגנו עליו מהאור. הפתרון העובד מוכן על ידי דילול קת LysoTracker Deep Red בנפח 1 mM (מסופק על ידי היצרן ב-DMSO) במידה 1:13,333 במדיום תרבית מלאה מחומם (לדוגמה, 0.75 מיקרוליטר של חומר 1 mM לכל 10 מ"ל מדיום מחומם).
   הערה: תאי הזדקנות מאוחרים ומונעים מלחץ מצטברים ליפופוסין וחומר אוטופלואורסצנטי לא ספציפי נוסף שפולט לאורך טווחי גל רחבים ויכול לתרום לאות LysoTracker נראה בבקרות לא מוצבעות¹⁴. כדי להעריך את תרומת האוטופלואורסצנציה בניסוי נתון, יש לכלול לפחות באר אחת לא מוצבעת לכל מצב ולרכוש אותה באותן הגדרות הדמיה. הפחת את אות הממוצע של באר לא מוכתמת ממדידות באר מוצבעת, או דווח על ערכים גולמיים וחסרי רקע.
   הערה: בפועל, אות ערוץ LysoTracker הלא מוצבע בתרביות IMR-90 קטן יחסית לאות זקנה מוצבע (כ-5% עד 10% מהממוצע של הסנסנציה המוצבעת במאגר הנתונים הנוכחי), אך התרומה גדלה עם מספר המעבר ויכולה להיות משמעותית (יותר מ-20%) בתרבויות זקנה עמוקות או מונעות אונקוגן ^6,14. תמיד יש לאמת את עוצמת האוטופלואורסצנציה בעת אימוץ פרוטוקול זה עבור סוג תא חדש או מודל הזדקנות-אינדוקציה.
4. הכן מספיק פתרון עבודה של LysoTracker לכל הבארות שיוכתם במהלך הריצה. ערבבו את התמיסה העובדת בהיפוך עדין ושמרו עליה מוגנת מאור עד השימוש.
5. שאיבת מדיום מכל באר. הוסיפו תמיסת עבודה של LysoTracker בעדינות לאורך קיר הבאר כדי לא להפריע לשכבה היחידה ולשמור על נפח צביעה אחיד בין הבארות.
6. הדגר תאים עם LysoTracker למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂. שמרו על כל קבוצות הניסוי תחת אותו משך וטמפרטורה של דגירה.
7. הוסיפו צבע גרעיני חי במהלך 10 הדקות האחרונות של דגירה של LysoTracker. הוסף את Hoechst 33342 ישירות למדיום המכיל את LysoTracker בריכוז העבודה המומלץ על ידי היצרן, למשל 1 מיקרוגרם/מ"ל עד 2 מיקרוגרם/מ"ל, וערבב על ידי נדנוד עדין של הלוח.
8. הסר את מדיום הצביעה בסוף הדגירה. שטוף תאים פעם אחת עם מלח מחומם מראש בפופר פוספט כדי להפחית פלואורסצנציה ברקע.
9. הוסף חומר תרבית פנול אדום מחומם מראש או בופר הדמיה מיד לאחר השטיפה. המשיכו ישירות להדמיה חיה ושמרו על זמן עקבי בין החלפת המאגר לרכישת תמונה בכל הבארות בניסוי.
10. להגן על הלוחות מפני אור במהלך ההעברות והקמת הדמיה. למזער את הזמן שמוקדש מחוץ לתנאי טמפרטורה ו-CO₂ מבוקרים במהלך הטיפול ואיסוף התמונה.
    אזהרה: לטפל בצבעים פלואורסצנטיים באמצעות כפפות והגנה לעיניים. השליכו נוזלים המכילים צבע וצרכים מזוהמים בהתאם לנהלי בטיחות כימיים מוסדיים.
    הערה: השתמש בנקודת עצירה לאחר שלב 3.9 אם ההדמיה דורשת סידור מספר לוחות. שמרו על לוחות מוגנים מאור ב-37 מעלות צלזיוס וחזרו להצלמות בהקדם כדי להגביל את סחף הכתמים.
    הערה: אם תכנון הניסוי כולל חמצן כמשתנה, שמור על כל קוהורט תחת תנאי החמצן שהוקצה לו במהלך הצביעה והדגירה, ותיעד את זמן הטיפול מחוץ למצב שהוקצה.

4. צביעת SA-β-Gal לצורך אימות (אופציונלי)

1. השתמש בצביעה ב-SA-β-Gal כשלב אימות אופציונלי כדי לוודא שמצב ההזדקנות הגבוה מראה פעילות מוגברת של SA-β-Gal ביחס לבקרה עם הזדקנות נמוכה. לבצע אימות על בארות מקבילות המעובדות באותו פורמט לוח ובאותו לוח זמנים כמו בארות ההדמיה.
2. הדמיה חיה מלאה לבארות האימות לפני הקיבוע. כאשר נדרשים השוואות לפני ואחרי קיבוע תואמים לאותו שדה (איור 2), יש לרשום את קואורדינטות השלב בעת הרכישה, למקם מחדש כל שדה ידנית לאחר קיבוע וצביעה, ולבדוק ויזואלית מיקום גרעיני ומורפולוגיית תאים כדי לוודא שהשדות התואמים תואמים לפני הכללתם בניתוח הזרם המורד.
3. תיקון תאים באמצעות תמיסת קיבוע שמסופקת בערכת הצביעה SA-β-Gal שהוכנה בריכוז עבודה פי 1 המומלץ ומכילה 2% פורמלדהיד ו-0.2% גלוטראלדהיד. דגרו במשך 10 דקות עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשם השוואה, תמיסת הקיבוע מכילה 2% (w/v) פורמלדהיד ו-0.2% (w/v) גלוטראלדהיד במי מלח עם בופר פוספט. תמיסת הצביעה SA-β-Gal ב-pH 6.0 מכילה 1 mg/mL X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) המומס בדימתילפוראמיד מיד לפני השימוש, 40 mM חומצה ציטרית / בופר נתרן פוספט ב-pH 6.0, 5 mM אשלגן פרוציאניד, 5 mM אשלגן פריציאניד, 150 mM NaCl, ו-2 mM MgCl^₂12,13. ערכות מסחריות התואמות את המפרטים הללו עשויות לשמש לסירוגין, בתנאי ש-pH הבופר של הצביעה מאומת כ-6.0.
4. הסר מקבע ושטוף בארות פעמיים עם מי מלח עם בופר פוספט. הוסף לכל באר תמיסת צביעה SA-β-Gal ב-pH 6.0 המכילה מצע X-gal.
5. אטום את הפלטה כדי להגביל את האידוי במהלך הדגירה. הנח את הפלטה בתנור חממה של 37 מעלות צלזיוס, ללא CO, למשך 12-16 שעות.
6. בדוק בארות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ותעד את דפוס הצביעה. רכשו תמונות מייצגות לכל מצב ודווחו על חלק התאים SA-β-Gal-חיוביים לבאר בעת אימות התוצאות.
   אזהרה: פורמלדהיד וגלוטראלדהיד הם רעילים ונדיפים. הכינו והשתמשו בתמיסת קיבוע בתוך מכסה אדים כימי ולבשו ציוד מגן אישי מתאים כולל כפפות, מגן עיניים וחלוק מעבדה.
   הערה: אם צביעת SA-β-Gal מראה רקע גבוה בשליטה נמוכה של הזקנה או צביעה חלשה במצב של הזדקנות גבוהה, יש לחזור על האימות לאחר התאמת צפיפות הציפוי, משך הקיבוע, משך הדגירה ועקביות הטמפרטורה תוך שמירה על pH בופר של 6.0.

תוצאות

יישום פרוטוקול זה על פיברובלסטים של IMR-90 בתנאים של הזדקנות נמוכה והזדקנה גבוהה מניב קריאות ליזוזומליות כמותיות שניתן לסכם ברמת התא היחיד וכאשר רצוי, ברמת השדה כולו.

מערך הנתונים המייצג המוצג באיורים ובטבלאות נובע מניסוי ביולוגי יחיד שהשווה תרביות IMR-90 במעבר 13 (P13; זקנה-נמוך, ~PDL 26) וקטע 23 (P23; הזדקנות גבוהה, ~PDL 46). צולמו שתי בארות לכל מצב, כאשר 44 שדות נרכשו בכל באר (176 שדות בסך הכל; 88 לכל תנאי). המתאם לבאר באיור 2D מחושב מהממוצע של 44 השדות הלל...

דיון

פרוטוקול זה מתאר תהליך הדמיה של תאים חיים שמודד הזדקנות באמצעות עיצוב מחדש של ליזוזום ומפיק קריאות כמותיות לכל תא ובאר של נטל ההזדקנות. מספר שלבים חשובים במיוחד לקבלת מבחן אמין. ראשית, המודל הביולוגי עצמו חייב להיות נשלט היטב. השראת הזדקנות שכפולה בפיברובלסטים IMR-90 דורשת מעקב קפדני אחר הכפלת האוכלוסייה ושמירה מקבילה של תרביות מעבר מוקדמות כהפניה הלא-זקנה ^2,3,18. סטיות קטנות בהיסטוריית המעבר או...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית רקמה 24-חלקים (תחתית שטוחה, מטופל ב-TC)	CellTreat Scientific Products	229124	כל צלחת תרבית רב-חלקית עם תחתית שקופה התואמת לדימות פלואורסצנטי של תאים חיים (למשל, צלחות פוליסטירן מטופלות ב-TC של 6-, 12- או 24-חלקים; צלחות דימות עם תחתית זכוכית עשויות להיות מועדפות לדימות ברזולוציה גבוהה יותר).
ערכת צביעת בטא-גלקטוזידאז (מבחן הזדקנות)	Cell Signaling Technology	9860	כל ערכת SA-β-גלקטוזידאז מסחרית עם מאגר צביעה מאומת ב-pH 6.0. לצורך התייחסות, תמיסת הקיבוע מכילה 2% פורמלדהיד ו-0.2% גלוטראלדהיד ב-PBS, ותמיסת הצביעה מכילה 1 מ"ג/מ"ל X-gal ב-DMF, 40 מ"מ ציטרט/פוספט pH 6.0, 5 מ"מ אשלגן פרוציאניד, 5 מ"מ אשלגן פריאציאניד, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl2.
BioRender (תוכנת איור מדעי)	BioRender	N/A — אפליקציית אינטרנט	משמשת ליצירת דיאגרמות סכמטיות (איורים 1–3). https://www.biorender.com
גז דו-חמצן פחמן (CO2), גליל דחוס	Airgas (או ספק דומה)	N/A	CO2 מדרגה רפואית המשמש לשמירה על אטמוספירה של 5% במדחס תרבית תאים ובתא דימות בשלב.
סרום בקר עוברית (FBS), מחוטא בחום	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	כל FBS מדרגת תרבית תאים, מחוטא בחום ב-56 °C; משמש ב-10% v/v במדיום תרבית מלא.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יכולת תאים חיים	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה או קונפוקלי עם בקרת טמפרטורה ו-CO2 לתאים חיים, סט מסננים לערוצים אדום רחוק (עוררות ~647 ננומטר / פליטה ~670 ננומטר) ו-DAPI/Hoechst (עוררות ~405 ננומטר / פליטה ~460 ננומטר), ועדשה 20×-40× עם NA מספק לרזולוציה של מאפייני ליזוזומים. מערכת הדימות EVOS M7000 שימשה במחקר זה.
צביעת גרעין Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	צבע DNA חדיר לתאים לצביעת גרעין תאים חיים (פלואורסצנציה כחולה, עוררות ~405 ננומטר). לא ניתן להחליף עם DAPI, שאינו חדיר לתאים בתנאים פיזיולוגיים.
תוכנת ניתוח תמונות	קרן התוכנה Python	N/A	כל סביבת מחשוב מדעית התומכת בפילוח גרעין, הרחבת אזור גרעין לתא, סף עוצמה וסטטיסטיקת תמונות בסיסית (למשל, Python עם scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). צינורת SenTrack (ראה קובץ משלים S1) פותחה למחקר זה.
פיברובלסטים ריאתיים אנושיים IMR-90 (קו תאים)	ATCC	CCL-186	קו תאים פיברובלסטיים דיפלואידים תקינים מעובר אנושי, המשמשים לדגמן הזדקנות רפליקטיבית; ניתן להחליף בכל קו פיברובלסטים אנושי מאפיין דומה.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	צבע פלואורסצנטי אסידוטרופי לצביעת תאים חיים של אברונים חומציים; מסופק כמלאי 1 מ"מ ב-DMSO. ריכוז עבודה הוא 75nM במדיום תרבית תאים מוכן.  פליטה אדומה רחוקה (עוררות 647 ננומטר / פליטה 668 ננומטר) ממזערת את החפיפה עם פלואורסצנציה אוטומטית של ליפופוסצין אך אינה מבטלת אותה.
מדיום מינימלי חיוני (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	מדיום תרבית בסיסי לפיברובלסטים IMR-90; משלים עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. ניתן להחליף בכל ניסוח סטנדרטי של מדיום מינימלי חיוני של איגל עם מלחי ארל ול-גלוטמין.
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	תוסף אנטיביוטי למדיום תרבית מלא; משמש ב-1% v/v (ריכוז סופי 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין). ניתן להחליף בכל תמיסת פן-ס