הקמת קו-תרבות אפיתליאלית-אנדותליאלית ריאה על שבב למחקר במצבים בריאים ו-COPD

Lucia Aversa; Janne Verhaegen; Lynn Willems; Vincent Geudens; Phéline Kortleven; Martina Mercurio; Emanuela E. Cortesi; Marjolein M. Ensinck; Celine Aelbrecht; Marianne S. Carlon; Rozenn Quarck; Bart M. Vanaudenaerde; Ghislaine Gayan-Ramirez

doi:10.3791/70687

מאמר שיטה

הקמת קו-תרבות אפיתליאלית-אנדותליאלית ריאה על שבב למחקר במצבים בריאים ו-COPD

196 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70687

⸱

30 ביוני 2026

Lucia Aversa¹ , Janne Verhaegen¹ , Lynn Willems¹ , Vincent Geudens¹ , Phéline Kortleven¹ , Martina Mercurio¹ , Emanuela E. Cortesi¹ , Marjolein M. Ensinck¹ , Celine Aelbrecht¹ , Marianne S. Carlon¹^,² , Rozenn Quarck¹^,³ , Bart M. Vanaudenaerde¹ , Ghislaine Gayan-Ramirez¹

¹Laboratory of Respiratory Diseases and Thoracic Surgery (BREATHE), Department of Chronic Diseases and Metabolism (CHROMETA), KU Leuven, ²Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, KU Leuven, ³Clinical Department of Respiratory Diseases, University Hospital Leuven

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מקים מערכת קו-קולטורציה דינמית של ריאות על שבב, המשלבת תאי אנדותל מיקרווסקולריים ראשוניים של נתיב האוויר הראשוני ותאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים לשני מודלים: מודל בריא ומודל COPD. המערכת משחזרת אינטראקציות בין דרכי הנשימה לכלי דם בממשק וזרימת אוויר-נוזל, ומספקת הערכת מחסום, פנוטיפינג תאים וניתוח RNA.

תקציר

פותחו שני מודלים דינמיים של קו-קולטורטורציה ריאתית על שבב כדי לשחזר את הממשק בין דרכי הנשימה לכלי דם על ידי שילוב תאי אנדותל מיקרווסקולריים ראשוניים של דרכי האוויר הראשוניות. מודל אחד משתמש בתאים זמינים מסחרית מתורמים בריאים, בעוד שהשני משתמש בתאים שמקורם בחולים עם מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מה שמאפשר השוואה ישירה בין תנאים בריאים לחולים תחת אותם תנאי תרבית. שני המודלים תומכים בהבדלה אפיתלית בתנאי פרפוזיה רציפה וממשק אוויר-נוזל (ALI), מה שמוביל למחסום אפיתל פיזיולוגי רלוונטי הנתמך על ידי שכבת אנדותל בסיסית. תהליך העבודה כולל ציפוי מטריצה חוץ-תאי, זריעת תאים, הקמת ALI, הערכת תפקוד מחסום, פנוטיפינג של תא והפקת RNA ספציפי לסוג התא. בדיקות חדירות הראו שלמות מחסום חזקה בשתי המערכות, בעוד שאימונופלואורסצנציה אישרה מיקום רציף של Zonula Occludens-1 (ZO-1) וקדרין אנדותל וסקולרי (VE-cadherin) בצמתים התאים. הבחנה אפיתלית אושרה על ידי צביעת β-tubulin IV והדמיית פעימות סיליאריות. RNA איכותי התקבל בנפרד מכל תא, ותמך בניתוחים מולקולריים ספציפיים לסוג התא. מודל ה-COPD סיכם תכונות מרכזיות של המחלה, במיוחד הגברת ייצור הריר, מבלי לפגוע בתפקוד המחסום או בחיוניות התאים. השימוש בתאי אפיתל ואנדותל שמקורם במטופל שומר על מאפיינים פתולוגיים אישיים, ומאפשר חקירת מנגנונים בין-תאיים ב-COPD. גישה זו מספקת אלטרנטיבה פיזיולוגית רלוונטית למודלים סטטיים במבחנה ולמודלים של בעלי חיים, ותומכת במחקרים פרה-קליניים של תרופות שנשאפו, חשיפה לפתוגנים ואינטראקציות אפיתליאליות–אנדותליות. חשוב לציין, שניתן להשתמש במודלים בריאים ו-COPD לריאות על שבב בשילוב למחקרים השוואתיים ישירים או באופן עצמאי לחקירות מכניות, בדיקות טיפוליות וגילוי תרופות. המערכת יכולה להיות מותאמת גם למצבים נשימתיים אחרים הכוללים שינויים בתאי אפיתל או אנדותל, ומציעה פלטפורמה ורסטילית ותרגומית למחקר נשימתי.

מבוא

האינטראקציה בין תאי האפיתל של דרכי האוויר לתאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים חיונית לשמירה על הומאוסטזיס ריאתי ולתיאום תגובות לפציעות, זיהום ודלקת. יחד, סוגי התאים הללו יוצרים מחסום פונקציונלי המווסת את חילופי הגזים, ניטור מערכת החיסון וחדירות כלי דם. השיחה הדינמית ביניהם כוללת איתות פרקריני, אינטראקציות ישירות בין תאים לתא ותגובות לגירויים מכניים, כולם קריטיים לתפקוד הריאה ולשלמות מבנית¹.

במחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), הפרעה ריאתית מתקדמת המתאפיינת בדלקת כרונית, שינוי דרכי הנשימה והרס הממשק האלוואולרי-קפילרי, תפקוד המחסום של אפיתל דרכי הנשימה ושל האנדותל הווסקולרי הריאתי נפגע ומלווה בשחרור ציטוקינים חריג ובמנגנוני תיקון רקמתי לא מוסדר ^2,3. עם זאת, האינטראקציה בין תאי האנדותל המיקרווסקולריים של דרכי הנשימה לבין תאי האנדותל המיקרווסקולריים עדיין אינה מובנת היטב. מגבלה זו נובעת בחלקה מהחסרונות של מודלים קיימים בחוץ-גופית ובתחום-חיים. למרות שמודלים בעלי חיים סיפקו תובנות חשובות על פיזיולוגיית הנשימה והפתולוגיה, הרלוונטיות שלהם מוגבלת על ידי הבדלים בין-מינים בתפקוד מערכת החיסון, ארכיטקטורת הריאות, איתות תאים ומטבוליזם תרופות, מה שעלול להקשות על תרגום לביולוגיה האנושית.

מערכות חוץ-גופיות קונבנציונליות, כגון תרביות דו-ממדיות (2D) של קווי תאים אפיתל שננצחו בדרכי האוויר, אינן מצליחות לשחזר תכונות מרכזיות של אפיתל דרכי הנשימה, כולל התמיינות נכונה ותגובתיות ביומכנית. למרות שמונוקולטורות תלת-ממדיות (ALI) של ממשק אוויר-נוזל (ALI) של תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה משפרות את הרלוונטיות הפיזיולוגית, הן נשארות סטטיות וחסרות אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים וגירויים מכניים⁴. הריאה היא איבר דינמי החשוף כל הזמן לזרימת אוויר, למתח גזירה, לנוקשות מטריצה חוץ-תאית ולמתיחה מחזורית הנוצרת על ידי נשימה. גורמים אלו משפיעים מאוד על התנהגות תאים ועיצוב רקמות⁵. לכן, מודלים סטטיים אינם מספיקים כדי לשחזר תהליכים כמו הידבקות לויקוציטים, סחר בתאי מערכת החיסון ותגובות בזמן אמת לחשיפה לסמים.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פלטפורמות איבר-על-שבב צצו כמערכות מתקדמות למידול אינטראקציות תאיות מורכבות. מודלים של ריאה על שבב משלבים טכנולוגיית מיקרופלואידיק עם תאים שמקורם באדם כדי לשחזר תכונות מבניות ומכניות מרכזיות של מיקרו-סביבת הריאה. פלטפורמות אלו מאפשרות קו-קולטורציה של תאי אנדותל אפיתל וכלי דם ריאתיים בתוך סביבה דינמית תלת-ממדית המדמה יותר את תנאי ה-vivo ⁶. שילוב תנועות נשימה פיזיולוגיות, זרימת נוזלים וניטור בזמן אמת משפר את חקר התקשורת האפיתליאלית-אנדותליאלית^{בתנאים תקינים} וחולים כאחד^.

למרות ההתקדמות הזו, רוב מערכות הריאות על שבב הקיימות מסתמכות על תאים שמקורם בתורמים^{בריאים 10}, מה שמגביל את יכולתן למודל אינטראקציות ספציפיות למחלה. בנוסף, פלטפורמות רבות חסרות את הגמישות לשלב תאים שמקורם במטופל או לשחזר את המיקרו-סביבה המורכבת של COPD. יתרה מזאת, פרוטוקולים מפורטים לגידול משותף של תאי אנדותל אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה ותאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים—בין אם ממקורות מסחריים או מחולי COPD—באמצעות ציפויי מטריצה חוץ-תאית (ECM) ספציפיים לסוג תא נותרו מוגבלים.

במחקר זה נעשה שימוש בפלטפורמת ריאה מיקרופלואידית דו-ערוצית על שבב מסחרית ליצירת שני מודלים של קו-קולטורציה הכוללים תאי אנדותל מיקרווסקולריים ראשוניים בדרכי הנשימה ותאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים. מודל בריא נוצר באמצעות תאים זמינים מסחרית שמקורם בתורמים שונים, בעוד שמודל COPD הוקם באמצעות תאי אפיתל דרכי הנשימה ותאי אנדותל שהתקבלו מאותו מטופל. שני הדגמים משתמשים בציפוי ECM ייעודי לסוג תא כדי לחקות טוב יותר את המיקרו-סביבה הריאתית בתוך החיים. מערכות אלו מאפשרות חקירת אינטראקציות אפיתליות–אנדותליות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. מודלים בריאים ו-COPD יכולים לשמש בשילוב למחקרים השוואתיים ישירים או באופן עצמאי לחקירות מכניות ובדיקות טיפוליות.

מערכת קו-קולטורה זו משקפת את הארגון האנטומי של אפיתל דרכי הנשימה וכלי הדם הריאתיים, המשמשים כיחידה משולבת בין אפיתל לאנדותל. אפיתל דרכי הנשימה הוא שכבה פסאודוסטרטיבית המורכבת מתאים בסיסיים, מופרשים וריסניים, הממוקם מעל שכבת רקמת חיבור וסקולרית (למינה פרופריה) ומופרד מהאנדותל באמצעות ממברנת בסיס. במודל זה, ציפוי ה-ECM (קולגן סוג I, פיברונקטין ולמינין) מקרב את הרכב ממברנות הבסיס האפיתל והאנדותל. הממברנה הנקבובית המפרידה בין שני התעלות מחקה את רקמת החיבור התת-אפיתלית, אף על פי שחסרה לה מורכבות כלי דם. מנגנונים רבים תורמים לתקשורת אפיתליאלית-אנדותלית, כולל איתות פאראקריני, ויסות מתואם של חדירה, גיוס תאי חיסון ותגובות לגירויים מכניים כגון מתיחה הנגרמת על ידי נשימה, המשפיעים על ההתנגדות הוסקולרית ומסלולי המכנוטרנסדוקציה.

מחקר מתודולוגי זה מפרט את השלבים הנדרשים להקמת אפיתל דרכי נשימה ממויינים לחלוטין המגודל בתנאי ממשק אוויר-נוזל (ALI) עם אנדותליום מיקרווסקולרי ריאתי בסיסי. המערכת מאפשרת הערכה איכותית ופונקציונלית של שלמות המחסום, ומשיגה ערכי חדירות נראית לשחזור (Papp) ≤ 1 × 10⁻⁶ ס"מ/ש. בנוסף, מסופקים פרוטוקולים לפנוטיפינג תאים ולחילוץ וכימות של RNA מכל תא, ומניבים באופן עקבי RNA איכותי (מספר שלמות RNA > 7). שיטה זו אינה מיועדת לניתוח mRNA כמותי או להערכה מפורטת של ייצור ריר, ואינה חוקרת את השפעות המתיחה המכנית, אף על פי שיישומים כאלה אפשריים במערכת זו.

פרוטוקול

כל השימוש בתאים אנושיים ראשוניים אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית למחקר UZ Leuven (S51577/S57114/S70453). תאי אפיתל ברונכיאלי ראשוניים (HBEC) ותאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים (HPMEC) זמינים מסחרית התקבלו משני תורמים שאינם מעשנים (טבלאות משלימות 1, 2). התאים הראשוניים למודל ה-COPD בודדו מרקמת ריאה שהופרשה משלושה חולי COPD עם היסטוריה של עישון (טבלה משלימה 3), בהתאם לפרוטוקול מבוסס היטב (אישור אתי S51577) ונשמרו בבנק הביולוגי BREATHE. גם HBEC וגם HPMEC נלקחו מאותו מטופל COPD.

כדי להקים מודל בריא של ריאה על שבב, נעשה שימוש ב-HBEC ו-HPMEC מסחריים. במודל ה-COPD, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים של הברונכיאלים והריאות בודדו מרקמת ריאה שהופרשה מאותו מטופל לאחר השתלת ריאות. מערכת הריאות על שבב ששימשה במחקר זה היא פלטפורמה מיקרופלואידית דו-ערוצית הכוללת מיקרו-תעלות נשימה מקבילות (עליונה) וערוצים וסקולריים (תחתונים) המופרדים על ידי ממברנה חוץ-תאית מצופה מטריצה (איור 1). אותו פרוטוקול שימש לבניית מודלים בריאים ומודלים של COPD. הכימיקלים, המגבים והערכות המשמשים בפרוטוקול מופיעים בטבלת החומרים.

1. הקמת מודלים של קו-קולטורה ריאה על שבב תחת זרימה למינרית

הכנת שבב
1. מניחים את עריסת השבבים בתוך צלחת תרבית תאים מרובעת בגודל 120 מ"מ, כשהפינות פונות כלפי מעלה, כדי להבטיח כיוון נכון, ואז מניחים את השבבים בתוך העריסה. ודאו שכל השבבים ממוקמים כראוי לפני שלב ההפעלה (איור 2).
2. הכינו את תמיסת ההפעלה על ידי המסה של אבקת התגובה בבופר המתאימה לה, שניהם מסופקים על ידי היצרן, כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל.
3. הפעל את המשטחים הפנימיים של תעלות השבב כדי לקדם חיבור מטריצה חוץ-תאית (ECM) על ידי הכנסת כ-35 מיקרו-ליטר של תמיסת ההפעלה בזהירות דרך פתח הערוץ התחתון. פיפט עד שהתמיסה מתחילה לצאת מיציאת הערוץ התחתון. חזור על ההליך על ידי הכנסת כ-50 מיקרוליטר של התמיסה לכניסת הערוץ העליון.
  הערה: אבקת התגובה להפעלה רגישה לאור. הכינו את תמיסת ההפעלה מיד לפני השימוש וזרוק כל תמיסה שנותרה שעה לאחר הבנייה מחדש.
4. הסר את כל תמיסת ההפעלה העודפת משטח השבב באמצעות שאיבה עדינה. ודא להסיר רק את תמיסת ההפעלה ממשטח השבב — אל תשאוף אותה מהערוצים.
  הערה: לפני הפעלת האולטרה סגול (UV), יש לבדוק את התעלות תחת מיקרוסקופ כדי לזהות בועות. אם יש כאלה, יש להסיר אותן בעדינות עם תמיסת הפעלה עד שכל הבועות מוסרות.
5. חשפו את השבבים למנורת UV למשך 10 דקות, ואז שטפו כל ערוץ פעמיים עם 200 מיקרוליטר של הבופר המתאים.
6. תמיסת הפעלה חדשה של Pipette לשני הערוצים כפי שתואר לעיל, וחשיפה את השבבים ל-UV למשך 5 דקות נוספות.
7. שאופים את התמיסה במלואה משני הערוצים, שטפו כל תעלה פעמיים עם 200 מיקרוליטר של בופר מתאים, ואז שטפו כל תעלה פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של מלח קר סטרילי עם בופר זרחן ללא Ca²⁺ ו-Mg²⁺ (DPBS -/-).
8. הכינו תמיסת ציפוי ECM ב-DPBS (-/-) המכילה קולגן אנושי מסוג I (100 מיקרוגרם/מ"ל), פיברונקטין אנושי (50 מיקרוגרם/מ"ל) ולמינין אנושי (50 מיקרוגרם/מ"ל). השתמש ב-100 מיקרוליטר תמיסה כנפח ייחוס לכל שבב.
9. הוסיפו 50 מיקרוליטר לתעלה העליונה ו-35 מיקרוליטר לתעלה התחתונה, תוך שאפירת הזרימה החוצה דרך פתחי היציאה.
  הערה: בדוק את התעלות תחת מיקרוסקופ כדי לזהות בועות. אם קיים, שטוף בעדינות עם תמיסת ECM כדי להסיר אותם.
10. השאירו טיפות קטנות של תמיסת ECM על שני פתחי הכניסה והיציאה כדי למנוע אידוי במהלך הדגירה הלילית (ON).
11. דגרו את השבבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. למחרת, שאיפת תמיסת ה-ECM ושוטפת את שני הערוצים עם 200 מיקרוליטר DPBS מחוממים מראש (-/-) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
זריעת תאים ותרבות מתחת למים
הרחבת HBEC בבקבוקי T25 ס"מ² מצופים בקולגן אנושי מסוג IV (150 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS (-/-)) באמצעות מדיום התרחבות תאי האפיתל של דרכי הנשימה עד להגעה למפגש של 60%–70%.
במקביל, הרחיב את HPMEC בבקבוקים בגודל T75^{ס"מ 2} מצופים בג'לטין (2 מ"ג/מ"ל ב-DPBS (-/-)) באמצעות מדיום גדילה של תאי אנדותל (EC) עד שמגיעים למפגש של 90%–100%.
עיין בטבלה משלימה 4 להרכב המגיבים המרכזיים ומדיה תרבותית.
זריעה של HPMEC
1. שאפו את המדיום. שטוף תאים עם 10 מ"ל DPBS (-/-).
2. הוסף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-אדטה (1X). דגירה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר (RT).
3. הוסיפו 12 מ"ל מדיום צמיחה EC (4× נפח הטריפסין בשימוש) כדי לנטרל את הטריפסין. הוסיפו 5 מ"ל מדיום גדילה EC כדי לאסוף כל תא שאריתי (נפח סופי = 20 מ"ל).
4. אשר ניתוק תאים מלא תחת המיקרוסקופ.
5. קח ~20 מיקרוליטר כדי לספור תאים חיים באמצעות טריפאן בלו.
6. צנטריפוגה את מתלה תא הנשיאה ב-900 × גרם למשך 5 דקות ב-RT בצינור קוני של 50 מ"ל.
7. החזירו את הכדור לתוך מדיום הצמיחה של EC. כוון ל-7 ×^{10 6} תאים למ"ל.
8. הזרעה HPMEC (מעבר 5) לתעלה התחתונה (~20 מיקרוליטר; 1.4 × 10⁵ תאים לתעלה).
9. הפוך מיד את השבבים ודגר במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ (איור 3).
10. החזר את השבבים לכיוון המקורי.
11. שטוף עם מדיום צמיחה EC חם של 200 מיקרוליטר (37°C).
12. בדוק את החיבור תחת המיקרוסקופ. האריך את הדגירה במידת הצורך.
זריעה של HBEC
1. שאפו את המדיום. שטוף עם 5 מ"ל DPBS חמים (-/-).
2. הוסף 1 מ"ל טריפסין. דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
3. לעקוב אחרי ניתוק תחת מיקרוסקופ.
4. הוסף מעכב טריפסין מוגדר (DTI) של 1 מ"ל ביחס של 1:1 כדי לנטרל את הטריפסין.
5. הוסף 8 מ"ל תווך התרחבות תאי האפיתל בדרכי האוויר (נפח סופי = 10 מ"ל).
6. העבר לצינור של 50 מ"ל.
7. קח ~20 מיקרוליטר לספירת תאים באמצעות Trypan Blue.
8. צנטריפוגה את המתלה התא שנותר ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
9. זרוק את הסופרנטנט.
10. החזירו את הכדור לתווך התרחבות תאי האפיתל בדרכי הנשימה. כוון ל-3.5 × 10⁶ תאים/מ"ל.
11. הוסיפו למדיום התרחבות תאי האפיתל של דרכי הנשימה ב-50 ננומטר חומצה רטינואית סינתטית יציבה באור ו-10 ng/mL פקטור גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי (rhEGF).
12. זרע HBEC (מעבר 2) לתעלה העליונה (~35 מיקרוליטר; 1.2 × 10⁵ תאים לערוץ).
13. דגרו במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ (איור 4).
14. החלף מדיום בשני הערוצים.
15. דגרו בלילה (ON) בתנאים סטטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
  הערה: מהשלב הזה ואילך, השתמש רק במדיום ללא גזים בכל השלבים. יש לבצע פינוי גזים באמצעות יחידת Steriflip המחוברת למערכת ואקום כדי למזער את הסיכון להיווצרות בועות בשבב.
חיבור לזרימה
1. הוסיפו מדיום התרחבות אפיתל חמים (37°C) בדרכי הנשימה בתוספת חומצה רטינואית סינתטית יציבה לאור ו-rhEGF למאגר הכניסה העליון.
2. הוסיפו מדיום צמיחה חמים (37°C) EC למאגר הכניסה התחתון.
3. מלאו כל מיכל כניסה במדיום של 3 מ"ל וכל מיכל יציאה ב-300 מיקרוליטר.
4. הניחו את המודולים הניידים בתוך מודול התרבות (איור 5).
5. לחץ על החוגה כדי לבחור את מחזור ה"פריים" באמצעות החוגה הסיבובית.
6. לחץ על החוגה כדי להתחיל את המחזור.
7. תן למחזור לפעול (~1 דקה).
8. בדוק את תחתית כל מודול לטיפות בכל ארבעת הפתחים הנוזליים.
9. חזור על מחזור ה"פריים" אם הטיפות אינן נראות.
10. שטוף את שני ערוצי השבב פעם אחת עם המדיום המתאים.
11. השאירו טיפה על כל כניסה ויציאה כדי למנוע היווצרות בועות.
12. החזק את השבב ביד הדומיננטית ואת המודול הנייד ביד השנייה.
13. החליק את השבב לתוך המסילות עד שיישב לגמרי.
14. הכניסו את היחידה המורכבת למודול התרבית.
15. הגדר את קצב הזרימה ל-30 מיקרוליטר/שעה לשני הערוצים באמצעות הדיאל הסיבובי.
16. שמירה על תנאי ממשק נוזל-נוזל (LLI).
17. שמרו את השבבים למודול בממשק נוזל-נוזל (LLI) כדי לאפשר יצירת שכבות אפיתל ואנדותל אחידות
18. החלף את הבינוני כל 3 ימים. שאיבת מדיום ממאגרי היציאה. הוסף 3 מ"ל מדיום טרי לכל מיכל כניסה.
  הערה: עקוב אחרי בועות מתחת למיקרוסקופ. אם קיים, נתק את השבב, שטף ערוצים עם מדיום וחבר מחדש.
התמיינות תאי אפיתל ותרבות ממשק נוזלי אוויר
1. עוקבים אחרי תאים מדי יום תחת מיקרוסקופ.
2. אשר היווצרות שכבת תאים אפיתליאלית הומוגנית ללא רווחים (בדרך כלל 3–5 ימים).
3. הקמת ממשק אוויר-נוזל (ALI).
4. שאיפת מדיום ממאגרי הכניסה והיציאה העליונים.
5. שטוף את המדיום שנותר מהתעלה העליונה על ידי הגדלת קצב הזרימה ל-600 מיקרוליטר/שעה באמצעות השעון הסיבובי
6. שואף במהירות מדיום ממאגרי היציאה העליונים.
7. שאיפת מדיום ממאגרי הכניסה התחתונים.
8. הוסף 3 מ"ל מדיום התמיינות אפיתל עם תוספת של 10 ng/mL גורם גדילה אנדותליאלי וסקולרי (VEGF) ו-1 מיקרוגרם/מ"ל ויטמין C.
9. הגדר את הערוץ העליון ל"אוויר" באמצעות החוגה הסיבובית.
10. הגדר את קצב זרימת התעלה התחתונה ל-30 מיקרוליטר לשעה.
11. שמור על תרבות ALI במשך שבועיים.
12. התבוננו בהתפתחות ההתמיינות האפיתל תחת המיקרוסקופ.
13. אשר היווצרות אפיתל פסאודוסטרטיפיקד. לעקוב אחרי פעימות הריסים וייצור הריר.
14. מעקב אחרי מורפולוגיית תאי האנדותל באזורים הכניסה והיציאה.

figure-protocol-1
איור 1: פלטפורמת ריאה על שבב מיקרופלואידית. חתך רוחב (משמאל) ותצוגה עליונה (מימין) של מכשיר המיקרופלואידי דו-ערוצי ריאה על שבב. האיורים הסכמטיים מסופקים למטרות המחשה בלבד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-2
איור 2: מיקום השבב בעריסת השבב. תמונה מייצגת המציגה את הכיוון הנכון של עריסת השבב ומיקום השבב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-3
איור 3: זריעה של תאי אנדותל בשבב המיקרופלואידי. תמונות מייצגות של תאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים מיד לאחר הזרעה (A) ואחרי שעתיים של דגירה (B). פס קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

figure-protocol-4
איור 4: זריעת תאי אפיתל בדרכי הנשימה בשבב המיקרופלואידי.
תמונות מייצגות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה מיד לאחר הזרעה (A) ואחרי 4 שעות של דגירה (B). פס קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

figure-protocol-5
איור 5: תצורת מערכת ריאות על שבב מיקרופלואידית.
החלק העליון של האיור מציג את המודול הנייד עם ארבעה מאגרים (שני כניסות ושני יציאות) המשמשים לאספקה בינונית ואיסוף שפכים. מכשיר המיקרופלואיד מחובר למודול תרבית שמווסת קצבי זרימה ולמודול מרכז שמספק גז, אוויר וחשמל. הייצוג הסכמטי מסופק למטרות המחשה בלבד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. הערכת שלמות המחסום

שלמות המחסום הוערכה בשתי דרכים: ראשית, פונקציונלית, על ידי הערכת חדירות לדקסטרון מסומן פלואורסצנטי לאורך זמן (לפני ALI ואחרי 10 ימים של ALI), ושנית, באופן איכותני, על ידי זיהוי חיסוני של Zonula Occludens-1 (ZO-1) באפיתל הסימפונות ואנדותליה-קדרין וסקולרי (VE-cadherin) באנדותליום הווסקולרי הריאתי.

פונקציית מחסום
1. מתחת לזרימה הלמינרית, הוסף 1 מ"ל מדיום התמיינות אפיתליאלי בתוספת VEGF וויטמין C ומכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל דקסטרן מסומן פלואורסצנטית למאגר הכניסה העליון של תעלת הנשימה. במקביל, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום נטול עקבות למאגר הכניסה התחתון של תעלת כלי הדם.
2. הכניסו את המדיום המכיל את העוקב לתעלה העליונה. באמצעות החוגה הסיבובית, כוונו את קצב הזרימה בשני הערוצים ל-600 מיקרוליטר לשעה למשך 3 דקות, ואז שאיבו מדיום משני המאגרים העליונים והתחתונים.
3. החזר את השבב, שמחובר למודול הנייד, למודול התרבות. באמצעות החוגה הסיבובית, כוון את שני הערוצים לקצב זרימה של 45 מיקרו-ליטר לשעה ושמור על קצב זרימה זה למשך 3 שעות.
4. אספו 100 מיקרוליטר מדיום ממאגרי היציאה העליונים והתחתונים ומדדו עוצמת פלואורסצנציה באמצעות קורא לוחות.
5. חשב חדירות נראית (Papp) באמצעות משוואת החדירה:
  
  כאשר SA מייצג את שטח הפנים של תעלת הקו-קולטור (0.17 ס"מ²), Q_R ו-Q_D מציינים את קצב זרימת הנוזל בערוצי המינון והקבלה בהתאמה (cm³/s) ו-C_R,0 & C_D,0 מתאימים לריכוזים שהוחזרו בערוצי המינון והקבלה, בהתאמה.
  הערה: ערך Papp מתחת ל-1 x ^10-6 ס"מ/שנייה מצביע על שלמות מחסום חזקה, המשקף חדירות נמוכה של שכבת האפיתל לעוקב. סף זה נקבע על ידי יצרן המערכת כאמצעי בקרת איכות פנימי.
זיהוי חיסוני של צמתים הדוקים והדבקים
1. אחרי שבועיים של ALI, הסר בזהירות את השבב מהמודול הנייד.
2. תקבע את התאים על ידי הוספת 50 מיקרו-ליטר של 4% פאראפורמלדהיד (PFA) לשני הערוצים למשך 20 דקות ב-RT.
  אזהרה: PFA הוא רעיל; בצע את כל השלבים עם מכסה אדים כימי מוסמך.
3. שטפו את שני הערוצים פעמיים עם 200 מיקרוליטר DPBS (-/-) ואחסנו את השבבים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצביעה.
4. חדירה לתאים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X-100 ב-DPBS (-/-) למשך 5 דקות ב-RT. לאחר מכן בלוק עם 50 מיקרוליטר טריטון X-100 ב-DPBS (-/-) המכיל 10% סרום עזים, לכל ערוץ למשך שעה אחת ב-RT.
5. דגרו את התעלה העליונה (אפיתל הברונכיאלי) ב-50 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מונוקלונלי אנטי-אנושי מסוג ZO-1 (1:100), ובערוץ התחתון (אנדותל ריאתי ווסקולרי) ב-50 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מונוקלונלי ארנב אנטי-אנושי VE-cadherin (1:600).
6. לדלל את שני הנוגדנים בתמיסת נוגדנים (0.1% טריטון X-100 ב-PBS (-/-) עם 1% סרום עזים) ולדגור ON ב-4°C בתנאים סטטיים.
7. שטוף את השבבים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר DPBS (-/-). לאחר מכן דגרו כל תעלה למשך שעה אחת ב-RT עם 50 מיקרוליטר של נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור מתאימים המדוללים בתמיסת נוגדנים (1:500): נוגדן משני נגד עכבר עז בתעלה העליונה ונוגדן משני נגד ארנב עז בערוץ התחתון.
8. שטוף את שני הערוצים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר DPBS (-/-). בצע צביעה גרעינית עם 50 מיקרוליטר לכל תעלה של 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI, 1 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS (-/-)) למשך 10 דקות ב-RT.
9. בצע שטיפה סופית עם 200 מיקרוליטר DPBS (-/-) ואחסן את השבב ב-DPBS (-/-) בטמפרטורה של 4°C בחושך עד להדמיה.
10. ציינו את השבבים על כיסויי כיסוי (20x60 מ"מ בעובי 0.16-0.19 מ"מ) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד במודול דיסק מסתובב, מצלמה רגישה גבוהה ואובייקטיב 20X (NA 0.8). השתמש בתוכנות רכישת וניתוח תמונות מתאימות לעיבוד לאחר מכן.

3. פנוטיפינג

הכנת מקטעי שבב
1. תקן את השבבים עם 4% PFA כפי שמתואר בסעיף 2.2.2.
2. חתוך את הפולידימתילסילוקסן (PDMS) מסביב מהשבב בעזרת להב גילוח.
3. מלאו את שני הערוצים ב-50 מיקרוליטר של אגרוז עם התכה נמוכה של 2% ב-DPBS (-/-), ואפשרו לאגרוז להתקשה ב-RT.
4. חתכו את השבב לרוחב לשני חצאים באמצעות להב גילוח, הטמיעו כל חצי במדיום הטמעה אופטימלית (OCT) ואחסן בטמפרטורה של −80°C עד לחתיכה.
קריוסקציה
1. הכינו קריוסטט וחתכו 200 מיקרון מחלקי שבב.
2. אספו קטעי שבבים עם פינצטה לבארות של פלטה בת 48 בארות מלאה ב-DPBS (-/-) ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצביעת חיסונים.
צביעת אימונופלואורסצנטי
הערה: בצע כל שלב בלוח עם 48 בארות, תוך שימוש בנפח 400 מיקרו-ליטר כנפח ייחוס.
1. לחדור את התאים ולחסום קישור לא ספציפי כפי שתואר קודם בסעיף 2.2.4.
2. דגרו כל חתך ON בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לתאי ריסים אפיתליאליים (β-tubulin IV, 1:2000) או לתאי אנדותל (CD31, 1:25), מדוללים בתמיסת נוגדנים (0.1% Triton X-100 ב-DPBS עם 1% סרום עז).
3. שטוף מקטעים שלוש פעמים עם DPBS (-/-).
4. דגרו חתכים למשך שעה ב-RT עם נוגדנים משניים מתאימים נגד עכברים עם פלואורופור (1:500) עבור β-tubulin IV ו-CD31, מדוללים בתמיסת נוגדנים, מוגנים מאור.
5. שטוף את החלקים שלוש פעמים עם DPBS (-/-), ובצע צביעה גרעינית עם DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS (-/-)) למשך 10 דקות ב-RT.
6. שטוף את החלקים פעם אחת עם DPBS (-/-) לפני ההרכבה.
7. באמצעות פינצטה, הניחו מרווח אחד על כל שקופית מיקרוסקופ, ואז הניחו קטע במרכז. הוסיפו 1–2 טיפות של מדיום התקנה והניחו כיסוי עגול.
8. תן להם להתייבש בחושך ב-RT, ואז לאטום את קצוות הכיסוי עם לק שקוף.
9. אחסן את המחסניות בטמפרטורה של 4°C בחושך עד להדמיה.
10. דמיינו את חלקי השבבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך, המצויד במודול דיסק מסתובב, מצלמה ברגישות גבוהה ומטרה 40X (NA 1.25). עבד תמונות באמצעות תוכנת מיקרוסקופיה מתאימה.

4. הפקת RNA וכימות

איסוף תאים משבבים תחת זרימה למינרית
1. לאחר שבועיים של תרבית ALI, נתק את השבבים מהמודולים הניידים, ושוטף את שני הערוצים פעמיים עם 200 מיקרוליטר DPBS (-/-) מחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.
2. הוסיפו 35 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-אדטה (1X) לתאי האנדותל בתעלה התחתונה ודגרו כ-30 שניות ב-RT.
3. בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא ניתוק מוחלט. אחר כך לאסוף את תליית התא לתוך צינור וצנטריפוגה ב-900 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
4. החזירו את כדור התא ל-50 מיקרוליטר של תגובת בידוד RNA מבוססת פנולים ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד להפקת ה-RNA.
5. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תגובת בידוד RNA מבוססת פנול ישירות לתעלה העליונה כדי לפרק תאי אפיתל, לאטום את הפתחים בקצוות ולדגור על קרח למשך 3-4 דקות.
6. יש פיפטה עדינה כדי להבטיח ליליזה מלאה, לאסוף ליזאט לצינור ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80°C עד להפקת RNA.
7. בדוק את שני הערוצים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר איסוף תאים מלא.
חילוץ RNA
1. הוסיפו כלורופורם (0.2 נפח לנפח אחד של תגובת בידוד RNA מבוססת פנול המשמש לליסיס; 10 מיקרוליטר לדגימה), ערבבו צינורות היטב על ידי ניעור ודגרו על קרח למשך 2-3 דקות.
2. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להפרדת פאזות והעברת הפאזה המימית העליונה בזהירות לצינור חדש מבלי להפריע לאינטרפאזה. לאחר מכן, מוסיפים 5 מיקרוגרם גליקוגן ללא RNA לשלב המימי כנשא.
3. הוסף איזופרופנול (0.5 נפח לנפח אחד של תגובת ליזיס; 25 מיקרוליטר לדגימה), דגירה דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. להשליך את הסופרנטנט תוך שמירה על כדור ה-RNA.
שטיפה והשעיה מחדש של RNA
1. שטוף את כדור ה-RNA עם 75% אתנול (נפח אחד לכל נפח אחד של תגובת ליזיס; 50 מיקרוליטר לדגימה), מערבולת בקצרה וצנטריפוגה ב-7,500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. השליכו את הסופרנטנט ותנו לכדור להתייבש באוויר במשך 5–10 דקות.
3. החזירו את ה-RNA ב-30 מיקרוליטר מים ללא RNase באמצעות פיפטינג עדין ואחסנו RNA בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
4. הערכת שלמות ה-RNA וכימות באמצעות מערכת הפרדת חומצות גרעין מבוססת שבב מיקרופלואידי.

תוצאות

הקמת מודלים של קו-קולטורה ריאה על שבב

הדמיית ברייטפילד חשפה הידבקות וגידול של תאים לאורך זמן במערכת הקו-קולטורציה ריאה על שבב. תאי אפיתל בדרכי הנשימה התרבו בתרבות טבועה בממשק נוזל-נוזל (LLI), ויצרו שכבה אחידה לאורך התעלה העליונה (איור 6A), בעוד שתאי אנדותל וסקולריים ריאתיים התרחבו לכסות את כל התעלה התחתונה, ויצרו שכבה מונו-שכבה מתחברת (איור 6B).

לאחר שהקולטורה המשותפת הוקמה, תאי אנדותל נבדקו באזורים הכניסה והיציאה של התעלה התחתונה, שהם האזורים היחידים הנגישים לבדיקה מיקרוסקופית. כפי שמוצג באיור 7, תאי האנדותל נשארו חיוניים והציגו מורפולוגיה מוארכת המותאמת לכיוון הזרימה. לאחר 14 ימים של תרבית ALI, שכבת האפיתל במודלים בריאים ו-COPD הראתה פעימות סיליאריות נראות לעין (סרטון משלים). כצפוי, מודל ה-COPD הראה ייצור ריר מוגבר משמעותית בהשוואה למודל הבריא (איור 8), וסיכם תכונות מרכזיות של פתולוגיית COPD.

figure-results-1
איור 6: קו-קולטורה של תאי אפיתל ואנדותל בדרכי הנשימה במכשיר המיקרופלואידי.
תמונות מייצגות של תאי אפיתל ברונכיאלי ראשוניים על פני השטח העליון (A) ותאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים ראשוניים על פני השטח התחתון (B) של הממברנה הנקבובית בתנאי ממשק נוזל-נוזל (LLI). פס קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

figure-results-2
איור 7: תאי אנדותל בערוץ המיקרופלואידי התחתון במהלך ממשק אוויר-נוזל.
תמונות ברייטפילד מייצגות המציגות תאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים בכניסה (עליונה) וביציאה (תחתונה) של התעלה התחתונה במהלך ממשק אוויר-נוזל (ALI). פס קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

figure-results-3
איור 8: הצטברות ריר בערוץ דרכי האוויר.
תמונות מייצגות המראות ייצור ריר לאחר 14 ימי ממשק אוויר-נוזל (ALI) במודלים בריאים של קו-קולטורה (A) ו-COPD (B). השכבה החומה בתא דרכי הנשימה מייצגת ריר מצטבר. פס קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

הערכה כמותית של שלמות המחסום

הערכה פונקציונלית של שלמות המחסום הראתה חדירות נמוכה יותר (Papp) הן במודלים בריאים והן במודלים של COPD בהשוואה לביקורת חיובית (שבב מצופה ECM ללא תאים) (איור 9).

בהיעדר תאים, ערכי Papp גבוהים הצביעו על יצירת מחסום מינימלי. לעומת זאת, בנוכחות שכבות אפיתל ואנדותליאל, המעקב הפלואורסצנטי דקסטרן לא חצה את ה-ECM, מה שהוביל לירידה משמעותית בחדירות ולהעיד על מחסום חזק. אפקט זה נצפה הן לפני ALI והן לאחר 10 ימים של ALI, מה שמראה כי תפקוד המחסום נקבע מוקדם במהלך ההתמיינות.

כפי שמוצג באיור 10, במודל הבריא, ערכי Papp הממוצעים לפני ALI כבר היו מתחת לסף המציד שלמות מחסום עמידה (1 × 10⁻⁶ ס"מ/ש) וירדו עוד במהלך תרבית ALI. במודל COPD, ערכי Papp הממוצעים היו גם הם בטווח המחסום החזק לפני ALI, ולמרות שעלה מעט לאחר 10 ימים של ALI, שלמות המחסום נותרה יציבה.

figure-results-4
איור 9: הערכת פונקציית מחסום במודל ריאה על שבב.
חדירות נראית לעין (Papp) נמדדה בשבבים מצופים ECM ללא תאים (בקרה חיובית לדליפה; שחור), ובמודלים בריאים (ורודים) ו-COPD (ירוקים) לפני ואחרי 10 ימי ממשק אוויר-נוזל (ALI). כל נקודה מייצגת שבב בודד. המודל הבריא כולל תאים מתורמים נפרדים, בעוד שמודל ה-COPD משתמש בתאים שמקורם במטופל יחיד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 10: השוואה בין פונקציית מחסום במודלים בריאים ומודלים של COPD.
חדירות נראית לעין (Papp) נמדדה לפני ואחרי 10 ימי ממשק אוויר-נוזל (ALI) במודלים בריאים (שמאל) ו-COPD (מימין). כל נקודה מייצגת שבב בודד. הערכים הם ממוצעים ± SD. מודל ה-COPD כולל תאים משלושה מטופלים, בעוד שהמודל הבריא משלב תאים מתורמים שונים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

זיהוי חיסוני של צמתים הדוקים והדבקים

ניתוח אימונופלואורסצנציה אישר את הארגון המבני של חלבוני צומתים. ZO-1 הראה מיקום רציף לאורך גבולות תאי האפיתל הברונכיאליים, מה שמעיד על מחסום אפיתל שלם (איור 11A). באופן דומה, צביעת VE-קדרין חשפה התפלגות אחידה בצמתים האנדותליים, בהתאם לשכבה מונותלית מתאחדת. תאי האנדותל הציגו מורפולוגיה מוארכת המיושרת עם כיוון הזרימה (איור 11B).

לא נצפו הבדלים בין המודלים הבריאים למודלים של COPD במיקום חלבוני החיבור ההדוקים והדבקים. ממצאים אלו תואמים את נתוני המחסום הפונקציונלי, ותומכים בקיומו של ממשק אפיתל ואנדותל רלוונטי פיזיולוגית עם שלמות צומת נשמרת בשני המודלים.

figure-results-6
איור 11: ביטוי חלבון צומם במודל הקו-קולטורציה ריאה על שבב.
תמונות אימונופלואורסצנציה מלמעלה שהתקבלו לאחר 14 ימים של ממשק אוויר-נוזל (ALI) המראות מיקום ZO-1 במחלקת האפיתל של דרכי הנשימה (A) ומיקום VE-קדרין במחלקת האנדותל (B). הגרעינים מוצבעים ב-DAPI. החץ מציין את כיוון הזרימה. פס קנה מידה: 100 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

פנוטיפינג

צביעת אימונופלואורסצנטי בחתכי קירור שבבים חשפו תאי β-טובולין IV חיוביים בצד האפיקלי של הממברנה, מה שמעיד על התמיינות תאי אפיתל דרכי הנשימה לתאים ריסיים, תכונה מגדירה של אפיתל ברונכיאלי בוגר (איור 12A). צביעת CD31 אישרה את נוכחות שכבת מונותל אנדותלית מתאחדת לאורך הצד הבסיסי של הממברנה (איור 12B). תוצאות אלו מראות כי מערכת הקו-קולטורה תומכת בהקמת פנוטיפים אפיתליים ואנדותליים רלוונטיים פיזיולוגית בשני המודלים.

figure-results-7
איור 12: תמונות אימונופלואורסצנציה של חתכי ריאה על שבב. צביעת אימונופלואורסצנטי ייצוגית של חתכי שבב לאחר 14 ימים של ממשק אוויר-נוזל (ALI) המראה ביטוי β-tubulin IV במחלקת האפיתל של דרכי הנשימה (A) וביטוי CD31 במחלקת האנדותל (B). הגרעינים מוצבעים ב-DAPI. פס קנה מידה: 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

חילוץ וכימות RNA

RNA שבודד מתאי אפיתל דרכי הנשימה הניב ריכוזים שנעים בין 59 ל-135 ng/μL, עם מספרי שלמות RNA (RIN)¹¹ של 7.4–9.6, בעוד ש-RNA מתאי אנדותל מיקרווסקולריים נע בין 12 ל-46 ng/μL, עם ערכי RIN של 9.6–10, בשני המודלים. הנתונים הצביעו על כך ששני המודלים השיגו כמויות מספקות של RNA איכותי, המתאים לניתוחים מולקולריים במורד הזרם.

טבלה משלימה 1: מידע על תורמים לתאי אפיתל בדרכי הנשימה הברונכיאליים. הטבלה מייצגת תאי אפיתל של דרכי הנשימה הברונכיאלית המשמשים במודל הבריא. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 2: מידע על תורם לתאי האנדותל המיקרווסקולריים הריאתיים. מידע על תורמים לתאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים המשמשים במודל הבריא. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 3: מידע על מטופל. הטבלה מציגה מידע על תאי אנדותל אפיתל בדרכי הנשימה ותאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים המשמשים במודל COPD. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 4: סקירה של מגבים מרכזיים ומדיה תרבותית המשמשים בפרוטוקול.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

סרטון משלים 1: פעימות ציליאריות בערוץ דרכי האוויר (דגם בריא).
וידאו מייצג המראה פעימות ריסניות לאחר 14 ימים של ממשק אוויר-נוזל (ALI). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

סרטון משלים 2: מכות ציליארי בערוץ האוויר (מודל COPD).
וידאו מייצג המראה פעימות ריסניות לאחר 14 ימים של ממשק אוויר-נוזל (ALI). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט להקמת מערכת קו-קולטורטורציה ריאתית על שבב ליצירת מודל בריא, המשתמש בתאי אנדותל מיקרווסקולריים של הסימפונות הזמינים מסחרית, ומודל COPD המשתמש בתאים שמקורם במטופלים מהריאות שהופרשו. בשני המודלים, שני סוגי התאים מופרדים על ידי ממברנה נקבובית ומתמתחת המצופה במטריצה חוץ-תאית ספציפית לסוג התא (ECM), מה שמאפשר מיקרוסביבה הדומה יותר לריאה בתוך החיים . הפרוטוקול כולל גם שיטות להערכת שלמות מחסום, פנוטיפינג של תאים וחילוץ RNA מכל תא. שני המודלים נשמרו בהצלחה בתנאי פרפוזיה דינמית וממשק אוויר-נוזל (ALI), מה שהוביל למחסום אפיתליאלי-אנדותליאלי רלוונטי פיזיולוגית עם אפיתל דרכי אוויר פסאודו-שכבתיים מובחנים לחלוטין. תאי האנדותל היו מיושרים לכיוון הזרימה, כפי שנצפה ב-vivo, ו-RNA איכותי התקבל משני התאים.

מספר צעדים קריטיים חיוניים להקמת מערכת הקו-תרבות הזו בהצלחה. נדרש זריעה מדויקת של תאי אפיתל להשגת כיסוי אחיד, שכן התפלגות לא אחידה עלולה לגרום לכיסוי שטח לא מלא ולהיווצרות מחסום פגועה. במקרים כאלה, יש לשאוף בעדינות את תא האפיקל ולזרוע מחדש את תאי האפיתל. הקמת ALI צריכה להתבצע רק כאשר שכבות האפיתל והאנדותל יוצרות שכבות מונו-שכבות רציפות, שכן חשיפה מוקדמת ל-ALI עלולה לגרום לדליפת מדיום כלי דם לתא דרכי הנשימה ולפגיעה בהתמיינות. אם לא יושג מפגש אחד, יש לעכב את הקמת ALI.

הסרה לא מלאה של מדיום אפיקלי או חשיפה לא עקבית ל-ALI עלולה להוביל לבגרות אפיתלית הטרוגנית. ניתן להסיר את התווך שנותר בתעלה העליונה על ידי הגדלת קצב הזרימה ל-600 מיקרוליטר לשעה למשך 3–4 דקות. היווצרות בועות, שמפריעות לזרימה ומשפיעה על חיוניות התאים, עלולה להתרחש עקב איזון לא מספק. ניתן להסיר בועות על ידי הגדלת הזרימה זמנית ל-600 מיקרולטר/שעה למשך 3-4 דקות, או, אם הן מתמשכות, על ידי ניתוק השבב והחזרתן ידנית באמצעות פיפטה. במודל COPD, ייצור ריר מופרז עלול לחסום את ערוץ דרכי הנשימה ולפגוע בזרימה; במקרים כאלה, מומלץ לשטוף בעדינות עם DPBS ואחר כך להחזיר את ALI.

רוב מערכות הקו-קולטורציה הקיימות, המשלבות תאים אפיתל דרכי הנשימה ותאי אנדותל ריאתיים, מסתמכות על תאים ראשוניים זמינים מסחרית וציפויים גנריים של ECM כגון קולגן או פיברונקטין ^10,12. בעוד שהן תומכות בהיצבות, הן משחזרות רק חלקית את התכונות הביוכימיות והמכניות של המשלב בין דרכי הנשימה לכלי דם. לעומת זאת, המערכת הנוכחית עושה שימוש בציפויי ECM ייחודיים לסוג תאים, המספקים מיקרוסביבה המדמה יותר את רקמת הריאות האנושית¹³.

תפקוד המחסום מוערך בדרך כלל באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית/טרנס-אנדותלית (TEER), אם כי שיטה זו יכולה להיות מושפעת מארגון רב-שכבתי אפיתל¹⁴. במחקר זה, נעשה שימוש בחדירות דקסטרן להערכת שלמות פונקציונלית. ערכי Papp שנצפו היו מתחת לסף לשלמות המחסום החזקה (1 × 10⁻⁶ ס"מ/שנייה), מה שמעיד על ממשק אפיתליאלי-אנדותלי חזק. אפיתל דרכי הנשימה הציג תכונות התמיינוניות כולל פעימות ריסיניות וייצור ריר, לצד מיקום רציף של ZO-1 ו-VE-קדרין בצמתים של התאים. בנוסף, RNA איכותי התקבל בעקביות משני התאים, מה שאפשר ניתוחים ספציפיים לסוג התא במורד הזרם.

התקדמות מרכזית בעבודה זו היא פיתוח מודל ריאה על שבב ל-COPD, שבו תאי אפיתל ותאי אנדותל נגזרים מאותו מטופל. למיטב ידיעתו האחרונה, לא דווח בעבר על תרבות משותפת מותאמת למטופל. מחקרים קודמים שילבו תאי אפיתל שמקורם ב-COPD ^7,8 אך הסתמכו על תאי אנדותל ממקורם המסחרי, מה שהגביל את חקירת האינטראקציות האפיתליאליות-אנדותליות הספציפיות למחלה. המודל הנוכחי מתגבר על מגבלה זו על ידי שמירה על אינטראקציות תאיות ספציפיות למטופל.

מודל ה-COPD סיכם מחדש מאפיינים מרכזיים של המחלה, כולל עלייה בייצור ריר³, תוך שמירה על יישור אנדותליאלי ושלמות החיבור בזמן זרימה. חשוב לציין כי השילוב של תאי אפיתל ותאי אנדותל שמקורם במטופל לא פגע בתפקוד או בחיוניות המחסום, למרות ייצור ריר מוגבר. המערכת נשארה יציבה בתנאי ALI ובפרפוזיה רציפה, ותמכה בשימוש בה למחקרים ארוכי טווח. בנוסף, הפלטפורמה מאפשרת מתיחה מכנית, מה שמגביר עוד יותר את הרלוונטיות הפיזיולוגית שלה.

חוזקה חשובה של תהליך עבודה זה היא היכולת להעריך מצבים בריאים ו-COPD באותה פלטפורמה תחת פרמטרים ניסיוניים דומים. דבר זה מאפשר הערכה ישירה של הבדלים הקשורים למחלה בהבדלות אפיתלית, תפקוד אנדותל ושלמות המחסום. המודלים יכולים לשמש גם באופן עצמאי, בהתאם לשאלת המחקר. המודל הבריא מתאים למחקרים מכניים ולמודולציה של מסלולים, בעוד שמודל ה-COPD מספק פלטפורמה להערכה טיפולית ובדיקות סמים. היכולת להפיק RNA איכותי מכל תא בנפרד מאפשרת עוד יותר פרופיל מולקולרי ספציפי לסוג תא. שימוש בתאים מותאמים למטופל במודל COPD שומר על אינטראקציות רלוונטיות למחלה שהיו אובדות בשילוב מקורות תאים לא קשורים.

למרות היתרונות הללו, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. השימוש במערכות ריאה על שבב דורש ציוד מיוחד ומומחיות טכנית, מה שעלול להגביל את הנגישות. בנוסף, המודל אינו כולל כיום סוגי תאי ריאה רלוונטיים אחרים, כגון תאי חיסון או תאי סטרומל, שעשויים להשפיע על תגובות לפתוגנים ותרופות. עם זאת, ניתן להתאים את הפלטפורמה לשילוב תאי מערכת החיסון במחזור הדם, מה שמאפשר חקירת האינטראקציות שלהם עם תאי האפיתל והאנדותל. הגישה לחומר COPD שמקורו במטופלים עשויה להיות מוגבלת, והשונות בין המטופלים עשויה להשפיע על השחזוריות. יתרה מזאת, ייצור ריר מופרז עלול להפריע לפרפויה.

השפעת המתיחה המכאנית המחזורית לא נחקרה במחקר זה, אך היא מייצגת כיוון עתידי חשוב. הממברנה המתמתחת מאפשרת סימולציה של כוחות מכניים הקשורים לנשימה, הידועים כמשפיעים על תפקוד התאים, תיקון והומאוסטזיס ^15,16. מחקרים קודמים הראו כי מאמץ מכני יכול לשפר את קליטת הננו-חלקיקים והעברתם דרך מחסום האפיתל¹⁰.

לסיכום, מודלי הריאה על השבב הבריאים ו-COPD המוצגים כאן מספקים פלטפורמה פיזיולוגית רלוונטית לחקר אינטראקציות אפיתליאליות-אנדותליות בבריאות ובמחלה. האופי הדינמי של המערכת מאפשר שליטה מדויקת בתנאי הזרימה ותומכת ביישומים כגון בדיקות סמים וחשיפה לפתוגן. פרוטוקול זה מציע אלטרנטיבה איתנה למודלים המסורתיים במבחנה ולמודלים בעלי חיים ומהווה כלי חשוב לקידום מחקר נשימתי תרגומי.

גילויים

אין לסופרים ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר (G065221N) מקרן המחקר בפלנדריה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% trypsin-EDTA (1X) (לתאי אנדותל)	Gibco	25200-056	משמש להתנעה אנזימטית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים.
צלחת גידול תאים מרובעת 120 מ"מ על 120 מ"מ	VWR	688161	משמש להחזקת מעמד שבבים במהלך הכנת השבבים וטיפול בהם.
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939A	משמש להערכת איכות ותקינות RNA.
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516	משמש להפקעת RNA במהלך מיצוי.
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306	משמש לצביעת גרעין התא במהלך אימונופלואורסצנציה.
צינורות חרוטיים 50 מ"ל	Cellstar	227261	משמשים לאיסוף תאים, צנטריפוגה והכנת מתלים של תאים.
ערכת Agilent RNA 6000 Nano	Agilent	5067-1511	משמשת לניתוח איכות RNA באמצעות Bioanalyzer.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	משמש למניעת זיהום פטרייתי במהלך גידול תאים.
מונה תאים אוטומטי	NanoEntek	EVE PLUS	משמש לקביעת ריכוז תאים וכדאיות לפני זריעה.
צלחות מולטי-וול מגודלות תאים, 48 באר, סטריליות	Falcon	353078	משמשות להחזקת חתכים במהלך נהלי צביעה.
צנטריפוגה	Hettich	320R	משמשת לפליטת תאים לפני זריעה.
מעמד שבבים	Emulate	support@emulatebio.com	משמש לתמיכה והחזקת שבבים במהלך הפעלת משטח, ציפוי והזרעת תאים.
כלורופורם	Sigma-Aldrich	366927	משמש להפרדת פאזות במהלך מיצוי RNA.
מודול צילום דיסק מסתובב של Cicero	CrestOptics S.p.A.		משמש לביצוע הדמיית פלואורסצנציה קונפוקלית במהירות גבוהה.
משטחי מכסה	Epredia	BB02400600AC13MNZ0	משמשים לתמיכה בשבבים במהלך הדמיית קונפוקל. תיאור: 24 על 60 מ"מ, #1.5
קריו-סטט	Thermo Fisher Scientific	NX70	משמש לחיתוך דגימות מוטמעות ב-OCT.
מודול תרבות (Zoë-CM)	Emulate	support@emulatebio.com	משמש לבקרה על תנאי הסביבה לגידול תאים במערכת מיקרו-נוזלית.
מעכב טריפסין מוגדר (DTI)	Thermo Fisher	R007100	משמש לנטרול פעילות הטריפסין לאחר התנעה של תאי אפיתל.
Dextran Cascade Blue 3KDa	Thermo Fisher	D7132	משמש כסמן פלואורסצנטי להערכת חדירות המחסום.
ערכת מדיום גידול תאים אנדותליאליים Growth Medium MV2	PromoCell	C-22022	משמש לתחזוקה והתרבות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים.
ER-1 חומר הפעלת משטח (חומר הפעלה רגיש לאור)	Emulate	support@emulatebio.com	משמש להפעלת משטחי השבבים להמשך ציפוי.
ER-2 חומר הפעלת משטח (חיץ)	Emulate	support@emulatebio.com	משמש כחיץ במהלך הפעלת משטח השבב.
אתנול מוחלט	Thermo Fisher Scientific	437433T	משמש לשטיפת גרעינים של RNA במהלך מיצוי.
קורא צלחות פלואורסצנטי	Agilent	קורא מיקרו-צלחות BioTek Sinergy H1	משמש למדידת עוצמת הפלואורסצנציה עבור מבחני חדירות.
ג'לטין מעור פרה	Sigma-Aldrich	G9391	משמש לציפוי משטחי תרבות לקידום הדבקת תאים אנדותליים.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (ל-ZO-1 ו-β-tubulin IV)	Thermo Fisher	A11001	משמש לזיהוי נוגדנים עיקריים של עכברים עם זוהר ירוק.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 (ל-CD31)	Thermo Fisher	A11005	משמש לזיהוי נוגדנים עיקריים של עכברים עם זוהר אדום.
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (ל-VE-cadherin)	Thermo Fisher	A21429	משמש לזיהוי נוגדנים עיקריים של ארנבים עם זוהר אדום-כתום.
מודול רכזת (Orb-HM)	Emulate	support@emulatebio.com	משמש לאספקת גז וכוח למודול התרבות.
תאי אפיתל ברונכיאלי אנושי (HBEC)	Lonza	CC-2540S	משמשים כתאי אפיתל דרכי נשימה להקמת מודל התרבות המשותפת הבריא.
קולגן אנושי IV	Sigma	C5533	משמש לצי

מקורות

Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immun Inflamm Dis. , (2017).
Sakao, S., Voelkel, N. F., Tatsumi, K. The vascular bed in COPD: pulmonary hypertension and pulmonary vascular alterations. Eur Respir Rev. , (2014).
Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease: smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. , (2014).
Blume, C., Davies, D. E. In vitro and ex vivo models of human asthma. Eur J Pharm Biopharm. , (2013).
Lin, C., et al. Mechanotransduction regulates the interplays between alveolar epithelial and vascular endothelial cells in lung. Front Physiol. , (2022).
Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Crit Rev Biotechnol. , (2020).
Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Methods. , (2016).
Benam, K. H., et al. Matched-comparative modeling of normal and diseased human airway responses using a microengineered breathing lung chip. Cell Syst. , (2016).
Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. J Cyst Fibros. , (2022).
Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. , (2010).
Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. , (2006).
Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab Chip. , (2015).
Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung. Eur Respir J. , (2017).
Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. , (2015).
Fang, Y., Wu, D., Birukov, K. G. Mechanosensing and mechanoregulation of endothelial cell functions. Compr Physiol. , (2019).
Santus, P., et al. The airways' mechanical stress in lung disease: implications for COPD pathophysiology and treatment evaluation. Can Respir J. , (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביולוגיה גיליון 232 גיליון 232 החודש ב-JoVE גיליון מודל תלת-ממדי קרוס-טוק (Cross-talk)